.

Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование

Язык: русский
Формат: курсова
Тип документа: Word Doc
76 3846
Скачать документ

44

Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование

После отбора клонированных рекомбинантных молекул нужно охарактеризовать
содержащуюся в них вставку. Для этого необходимо ответить на несколько
вопросов. Прежде всего – действительно ли рекомбинантная молекула
содержит нужный сегмент ДНК? Далее – включился ли сегмент целиком или
только частично? Соответствует ли он во всех деталях геномной ДНК, из
которой происходит? Является ли нужная последовательность
функциональной? Мы рассмотрим разные подходы к характеризации
клонированных фрагментов ДНК. Прежде всего нужно очистить рекомбинантную
ДНК от ДНК клеток хозяина, РНК и белков. Эта процедура довольно проста и
включает экстракцию, физическое разделение компонентов и ферментативное
расщепление РНК и белков. Так, плазмидную ДНК можно отделить от геномной
благодаря ее малому размеру и кольцевой структуре. Фаговую ДНК можно
получить в свободном от клеточной ДНК виде путем очистки фаговых частиц
и последующего выделения из них ДНК.

макроструктура клонированной вставки

Для определения макроструктуры вставки сначала устанавливают ее размер и
положение сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз. Поскольку
клонированные фрагменты геномной ДНК часто бывают длиннее или короче,
чем интересующая нас область, необходимо также определить положение и
длину нужного сегмента внутри вставки.

а. Размер вставки

Размер векторной молекулы обычно бывает известен, поэтому размер вставки
можно оценить, зная полную длину рекомбинантной молекулы и предположив,
что никакого делетирования во время клонирования не произошло. Размер
многих рекомбинантных молекул можно определить с помощью
гель-электрофореза. Чтобы получить точные данные, кольцевые
рекомбинантные молекулы превращают в линейные, поскольку
электрофоретическая подвижность кольцевых структур зависит от степени их
сверхспиральности. Стандартные электрофоретические методы непригодны для
тестирования молекул, длина которых превышает 15 т.п. н, поскольку
крупные молекулы мигрируют в геле слишком медленно. Поэтому размер
многих рекомбинантных молекул не поддается прямому определению с помощью
электрофореза, если только не используется импульсный электрофорез.
Альтернативный способ оценки размера рекомбинантных молекул состоит в
измерении их длины с помощью электронной микроскопии. Здесь тоже очень
важны стандартные размеры, поскольку число пар оснований в сегменте
определенной длины на электронной микрофотографии может зависеть от
конфигурации молекулы и способа приготовления препарата.

Другой подход к определению размера вставки состоит в обращении тех
реакций, которые использовались при конструировании рекомбинантных
молекул, т.е. в вырезании вставок с помощью соответствующих эндонуклеаз
рестрикции. Размер линейной вставки определяют с помощью
гель-электрофореза. Поскольку карта сайтов для эндонуклеаз рестрикции в
векторной молекуле обычно бывает известна, идентифицировать встроенный
фрагмент довольно легко. Если при лигировании произошла элиминация
эндонуклеазных сайтов на концах вставки, можно использовать
альтернативную процедуру: разрезать векторную молекулу по сайтам,
находящимся в участках, которые фланкируют вставку; в этом случае
вставка будет вырезана вместе с сегментами вектора известных размеров.
Иногда ситуация осложняется тем, что сама вставка содержит сайты
узнавания для используемой эндонуклеазы. В таком случае сумма размеров
всех фрагментов, образующихся из вставки, даст ее общую длину. Если
вставка слишком велика, то ее разрезание и суммирование могут оказаться
даже необходимыми для более точного определения длины.

б. Картирование сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз

В тех случаях, когда вектор имеет небольшие размеры и не слишком сложен,
положение сайтов иногда можно определить непосредственно в самой
рекомбинантной молекуле. Однако часто оказывается необходимым сначала
вырезать вставку и очистить ее от векторных сегментов.

в. Субклонирование

Длинные клонированные вставки, входящие в состав Х – или космидного
вектора, часто бывают весьма неудобными для манипулирования. Поэтому
после построения частичной рестрикционной карты вставку можно разделить
на более мелкие фрагменты путем субклонирования. В принципе
субклонирование не отличается от других методов создания рекомбинантных
ДНК, просто в этих случаях в качестве исходного генома используют
рекомбинантный клон. Для субклонирования обычно применяют
рестриктирующие эндонуклеазы, сайты узнавания которых состоят из четырех
пар оснований, поскольку они способны разрезать ДНК во многих местах.

г. Определение положения интересующего нас сегмента во вставке

Для определения положения сегментов в небольших рекомбинантных геномах
используются те же подходы, что и при нахождении специфических сегментов
в больших геномах до клонирования. После построения рестрикционной карты
вставки установить точную локализацию нужного сегмента не составляет
труда. Для этого нужен только подходящий меченый зонд, аналогичный ДНК –
или РНК-зонду, используемому для отбора клона в начале клонирования.

Овальбумин-это белок, состоящий из одной полипептидной цепи; он
синтезируется в яйцеводе курицы после стимуляции стероидным гормоном
эстрогеном и накапливается в яичном белке. У кур-несушек стимуляция
гормоном происходит в естественных условиях, а у цыплят образование
яйцевода и синтез овальбумина индуцируются при введении эстрогена.
Гормон индуцирует транскрипцию гена овальбумина, в результате чего
содержание овальбуминовой мРНК в клетке увеличивается практически от
нуля до 50000 молекул через две-три недели и падает до 10 молекул на
клетку после прекращения воздействия эстрогена. Яйцеводы кур-несушек
представляют собой хороший источник овальбуминовой мРНК, поскольку она
составляет в них около 50% суммарной мРНК. Очищенную мРНК используют
затем для приготовления радиоактивного зонда, применяемого для
идентификации клонированного гена овальбумина. Зондом может служить
радиоактивно меченная одноцепочечная кДНК, синтезированная
непосредственно на мРНК с помощью обратной транскиптазы, или
клонированная дуплексная кДНК. С помощью таких зондов из популяции
Х-векторов, содержащих вставки геномной ДНК курицы, полученные при
ограниченном гидролизе эндонуклеазой EcoRI, были отобраны клонированные
последовательности овальбуминового гена. Вставка, имела длину 6,8 т.п.
н. Из нее образовались три EcoRI-фрагмента, при этом только фрагмент
длиной 2,35 т.п. н. отжигался с овальбуминовым кДНК-зондом.

Положение искомой последовательности в клонированном сегменте можно
определить также с помощью электронной микроскопии. Для этого зонд и
рекомбинантную ДНК смешивают, денатурируют и отжигают, а затем готовят
препарат для микроскопирования. Комплементарные участки зонда и
исследуемой молекулы образуют дуплексы, которые на электронных
микрофотографиях выглядят как относительно толстые нити, а
некомплементарные участки остаются одноцепочечными и имеют вид более
тонких нитей. Гетеродуплекс, образующийся между овальбуминовым
рекомбинантом формируются при условиях, благоприятных для гибридизации
типа РНК’ДНК, а не ДНК’ДНК. В сегменте ДНК размером 2,35 т.п. н.,
который гибридизовался с мРНК, в образовании двухцепочечной структуры
участвовали только около 550 п. н. Таким образом, гетеродуплексный
анализ гораздо более информативен, чем определение положения кодирующих
последовательностей в клоне. Он показывает, что, хотя мРНК содержит
около 1800 п. н., в клонированном сегменте ДНК представлено менее трети
длины кодирующих последовательностей гена овальбумина. Кроме того, 550
п. н. в клонированной ДНК, комплементарные мРНК, не образуют одну
непрерывную последовательность, а распределены по четырем участкам,
разделенным одноцепочечными петлями, т.е. кодирующие последовательности
геномной ДНК чередуются с некодирующими. Как описано в разд.8.5, такие
промежуточные последовательности, или интроны, типичны для
эукариотических генов.

Тонкая структура клонированной вставки: нуклеотидная последовательность

Чтобы до конца выяснить структуру, функцию и происхождение
клонированного сегмента ДНК, необходимо установить его первичную
структуру – нуклеотидную последовательность. Быстрые и точные методы
определения последовательностей ДНК были созданы вскоре после разработки
методов, используемых в работе с рекомбинантными молекулами. В принципе
сейчас можно провести секвенирование молекулы ДНК любой длины.
Определение последовательности сегментов ДНК протяженностью в сотни и
даже тысячи нуклеотидов представляет собой рутинную процедуру, а
примерно до 1975 г. это была очень трудная задача. Для этого с помощью
РНК-полимеразы сначала получали РНК-копии ДНК, а затем определяли
нуклеотидную последовательность кРНК. Точность и полнота процесса
копирования часто были недостаточны, а секвенирование РНК занимало много
времени. Сейчас секвенируют саму ДНК, а для секвенирова-ния РНК обычно
вначале получают кДНК-копии.

а. Общие принципы

Методы секвенирования ДНК можно разбить на две категории. В основе одних
лежат химические реакции, в которых используются непосредственно
фрагменты очищенной ДНК. Во втором случае используют ДНК-копии очищенных
сегментов, полученные ферментативным путем. Эти подходы имеют и
некоторое сходство. Прежде всего фрагменты ДНК обычно очищают, что легко
осуществить с помощью клонирования. Далее, и в том, и в другом случае за
один раз секвенируется только одна цепь ДНК. Для повышения точности
лучше провести секвенирование каждой цепи дуплексной молекулы и сравнить
результаты. За один раз используют только одну из цепей, помеченную
радиоактивным изотопом. Определяют нуклеотидную последовательность
только этой цепи, и именно о ней мы будем говорить в последующих
разделах. Третья общая особенность указанных методов состоит в том, что
в обоих случаях образуется набор радиоактивно меченных одиночных цепей
всех возможных длин – от единицы до п, где п – полная длина
секвенируемой молекулы.

В обоих подходах, химическом и ферментативном, полный набор фрагментов
на самом деле бывает представлен в виде четырех отдельных наборов. В
идеале каждый такой набор содержит все возможные фрагменты, берущие
начало на одном конце цепи и продолжающиеся до очередного местоположения
определенного нуклеотида. Так, один из наборов содержит все возможные
цепи, начинающиеся в одном сайте и оканчивающиеся в тех местах, где
встречается дезоксиаденозин. Второй набор содержит все возможные цепи,
начинающиеся в том же сайте, а заканчивающиеся на всех встречающихся
поочередно дезоксицитидиновых остатках. Третий и четвертый наборы
представлены фрагментами, оканчивающимися на остатках тимидина или
дезоксигуанозина.

Химический и ферментативный методы отличаются друг от друга способом
получения четырех наборов фрагментов. В первом случае этот набор
получают путем разрезания предварительно радиоактивно меченной цепи
четырьмя разными способами, а во втором четыре радиоактивно меченных
набора фрагментов получают путем копирования немеченой цепи ДНК.
Последним этапом в обоих методах является разделение фрагментов,
составляющих каждый из наборов, по длинам с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. При этом удается
разделить полинуклеотидные цепи, отличающиеся друг от друга только одним
нуклеотидным остатком. Поскольку фрагменты несут радиоактивную метку, их
легко выявить с помощью радиоавтографии, при этом достаточно лишь
небольшого количества ДНК – порядка пикомолей или даже меньше. Все
четыре набора, полученные из одного фрагмента

ДНК, подвергают одновременному электрофорезу на параллельных дорожках
одной пластины геля. Сканируя каждую дорожку, расшифровывают всю
последовательность. Используя специальные электрофоретические методы,
можно разделить цепи размером от 1 до 300 или более нуклеотидных
остатков. Молекулы, длина которых превышает несколько сотен нуклеотидов,
фрагментируют и затем определяют нуклеотидную последовательность каждого
фрагмента.

б. Химическое секвенирование

Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Химическое
секвенирование основано на специфической модификации различных пуриновых
и пиримидиновых оснований. Эти модифицированные основания выщепляют
затем из полимерной цепи с сохранением сахарофосфатного остова. Далее
гидролизуют относительно нестабильные фосфодиэфирные связи,
соседствующие с сайтом, где находилось удаленное модифицированное
основание, в результате чего цепь разрывается. Все эти реакции, где в
качестве примера рассмотрена модификация гуаниновых остатков.
Представлены две реакции, одна из которых специфична в отношении только
гуанина, а другая – только цитозина, и две реакции, специфичные в
отношении либо пуринов, либо пиримидинов. Каждую из четырех реакций
проводят с использованием отдельного препарата ДНК, в результате чего
получают четыре набора фрагментов, необходимых для точного определения
последовательности. Глубина каждой реакции строго ограничена, так что в
каждой молекуле ДНК данного препарата в реакцию вступает в среднем
только одно из чувствительных оснований. В результате популяция
идентичных молекул ДНК превращается в ходе реакций, в которых участвуют
случайные реакционно способные основания, в набор цепей, начинающихся в
данном сайте на одном конце цепи и заканчивающихся на одном из
реакционно способных оснований. Разрезание цепи происходит только по
дезоксицитидиновым остаткам.

Каждая из четырех реакционных смесей на самом деле представлена двумя
наборами цепей, получающихся в результате гидролиза препарата ДНК. Один
включает все фрагменты, начинающиеся на 5′-конце исходной цепи, другой –
все фрагменты, начинающиеся на 3′-конце. Нужную нам информацию о
последовательности можно получить, используя любой из наборов, и выбор
одного из них зависит от того, как был помечен исходный фрагмент – с 3′
– или 5′-конца – перед проведением химических реакций, специфичных в
отношении определенного основания. Немеченый материал нельзя
визуализировать с помощью радиавтографии. Если исходным материалом
является дуплексная ДНК, то помечена должна быть только одна из двух
цепей, в противном случае конечные продукты будут представлены двумя
разными наборами меченых цепей и данные будет трудно интерпретировать.

Введение метки в 5′-конец осуществляют с помощью полинуклеотидкиназы и
у-32Р. Если присутствуют 5′-концевые фосфомоноэфирные группы, то их
необходимо предварительно удалить с помощью фосфомоноэстеразы.
Одноцепочечные молекулы секвенируют сразу после введения метки.
Дуплексную ДНК после осуществления киназной реакции разделяют на две
комплементарные цепи с помощью денатурации и электрофореза. Меченый
двухцепочечный фрагмент можно также разрезать на две части по
определенному внутреннему эндонуклеазному сайту и образовавшиеся
фрагменты разделить с помощью электрофореза. В этом случае секвенируемые
молекулы на самом деле являются двухцепочечными, но одна из цепей не
содержит метки и поэтому остается “невидимой”.

Введение метки в 3′-концы дуплексных цепей целесообразно проводить в том
случае, когда на 5′-концах имеются выступы. Удлинение более коротких
3′-концов катализируется либо ДНК-полимеразой I, либо обратной
транскриптазой, использующими выступающий 5′-конец как матрицу; 32Р
включается в цепь в составе соответствующего а-32Р-меченного
дезоксинуклеозидтрифосфата. Мечение по З’-концу происходит в каждой из
цепей двухцепочечной ДНК, а для секвенирования необходимо иметь
препарат, в котором все молекулы несут метку только на одном конце.
Поэтому меченые двухцепочечные фрагменты расщепляют рестриктазой и
фракционируют субфрагменты с помощью гель-электрофореза или разделяют
цепи ДНК. Однако, если концы дуплексного фрагмента не идентичны, часто
оказывается возможным прямое получение одноцепочечного 32Р-меченного
конца. Например, если один из концов тупой, то его удлинения не
происходит, и при соответствующем подборе а-32Р-меченного
дезоксинуклеозидтрифосфата можно пометить только один из концов.

в. Ферментативное секвенирование

Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Для секвенирования
ДНК с помощью ферментативного копирования необходимо иметь
одноцепочечную ДНК, а также короткий полидезокси-нуклеотидный праймер,
комплементарный небольшому участку ДНК. Одиночная цепь служит матрицей,
а новая цепь наращивается, начиная с 3′-гидроксильной группы праймера
путем присоединения дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. При секвенировании
проводят четыре типа реакций копирования, в результате чего образуются
четыре набора цепей, синтез которых остановлен на остатках А, С, G или
Т. Остановка синтеза происходит в результате присоединения
дидезоксинуклеотида, у которого отсутствует 3′-гидроксильная группа, что
препятствует дальнейшему удлинению цепи. Реакции проводят таким образом,
чтобы вероятность остановки синтеза на любом другом остатке, кроме
заданного, была очень мала.

ДНК-полимераза I может утилизировать
2′,3′-дидезоксинуклео-зидтрифосфатные аналоги нормальных
дезоксинуклеозидтрифосфатных субстратов. Как и при обычной
полимеризации, соответствующий дидезоксинуклеотид присоединяется к
3′-гидроксильному концу праймерной цепи, однако образующийся при этом
продукт не может служить праймером для дальнейшего роста цепи, и реакция
останавливается.

Для проведения четырех разных реакций копирования комплекс
“матрица-праймер” инкубируют в присутствии всех четырех обычных
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и какого-то определенного
дидезоксинуклеозидтрифосфата. Например, в одной реакции используют
ddATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, в другой – dATP, ddGTP, dGTP, dCTP, dTTP
и т.д. Удлинение цепи с помощью матричного копирования происходит до тех
пор, пока вместо очередного дезоксинуклеотида не присоединится
дидезоксинуклеотид; в этот момент рост цепи прекращается. Поскольку
терминация синтеза происходит в случайных сайтах, образуется набор цепей
всех возможных длин, начиная с 5′-конца праймера до сайтов,
соответствующих положению присоединенного дидезоксинуклеотида.
Новосинтезированные цепи являются радиоактивно меченными, поскольку в
реакции используется по меньшей мере один радиоактивно меченный
дезоксинуклеозидтрифосфат. Часто им является
а-32-Р-дезоксинуклеозидтрифосфат, но это может быть также
358–дезоксинуклеозидтрифосфат. Иногда используется радиоактивно
меченный праймер. Продукты четырех реакций подвергают одновременному
электрофорезу на отдельных дорожках, как при химическом секвенировании.
Последовательность считывают с радиоавтографа, который выглядит так же,
как и радиоавтограф, полученный при использовании химического метода
секвенирования.

Получение одноцепочечной ДНК для секвенирования с помощью
дидезокситерминаторов. Молекулы ДНК обычно являются двухцепочечными;
исключение составляют лишь одноцепочечные ДНК некоторых бактериофагов.
Как мы уже говорили, физическое разделение цепей дуплекса не всегда
осуществимо. Для разделения цепей дуплекс денатурируют нагреванием или
обработкой щелочью и проводят гель-электрофорез или хроматографию.
Разделение двух комплементарных цепей происходит, по-видимому, благодаря
различиям их конформаций, обусловленным различиями во вторичной
структуре. Если разделения не произошло, применяют другие методы
получения одиночных цепей. Наиболее эффективный из них состоит в
клонировании фрагмента ДНК в векторе, сконструированном на основе
бактериофага М13. Любая клонируемая вставка всегда будет фланкирована
одними и теми же последовательностями векторной ДНК, что позволяет
использовать стандартные праймеры. Их синтезируют химическими методами,
и всегда можно выбрать удобный праймер. Кроме того, не составляет труда
получить отдельные клоны, каждый из которых содержит одну из двух
комплементарных цепей ДНК, благодаря чему легко осуществить
секвенирование обеих цепей.

Комбинируя клонирование в М13 и секвенирование с помощью
дидезокситерминатора, мы можем получить эффективный способ определения
последовательностей молекул ДНК, длина которых достигает нескольких
тысяч пар нуклеотидов. Для секвенирования длинных дуплексных молекул их
разрезают механически на фрагменты и затем проводят клонирование. Каждая
образующаяся бляшка содержит определенные фрагменты или цепи. Случайно
отбирая клоны, определяют последовательность вставок. Поскольку вставки
образуются в результате разрыва исходной молекулы ДНК в случайных
местах, некоторые фрагменты содержат перекрывающиеся последовательности.
С помощью компьютера сравнивают последовательность каждого фрагмента с
последовательностями других фрагментов, выявляют перекрывающиеся области
и располагают отдельные фрагменты в определенном порядке. Таким способом
были определены последовательности митохондриальной ДНК человека и ДНК
Х-фага.

Другое применение методов секвенирования. Секвенирование с помощью
дидезокситерминаторов может применяться для прямого определения
последовательностей РНК или ДНК, причем даже в том случае, если в смеси
помимо секвенируемой цепи присутствуют неродственные молекулы. Важным
элементом при этом является праймер, комплементарный небольшому
интересующему нас участку и лишь с малой вероятностью ассоциирующий с
другими молекулами, присутствующими в смеси. Подобной специфичностью
обычно обладает праймер длиной 20 оснований с уникальной
последовательностью. При таких условиях с помощью обратной транскриптазы
синтезируют кДНК. Этот метод применим только в том случае, если мы уже
достаточно много знаем об интересующих нас РНК или ДНК, но круг таких
систем все время расширяется.

Метод химического секвенирования может применяться для анализа
специфических последовательностей ДНК, присутствующих в смеси наряду с
большим числом разных молекул ДНК, в том числе даже если речь идет об
одном гене в суммарной геномной ДНК млекопитающих. Прежде всего ДНК
разрезают с помощью рестриктирующей эндонуклеазы, так что интересующий
нас сегмент оказывается во фрагменте длиной в несколько сотен пар
оснований. Затем проводят химические реакции, специфичные к определенным
основаниям, в результате чего образуются четыре набора фрагментов. Такие
наборы включают все возможные по длине фрагменты с интересующей нас
областью, начинающиеся в сайте рестрикции, по которому была разрезана
ДНК. Здесь же присутствует множество других фрагментов из остальной
части генома. Фрагменты разделяют путем электрофореза в секвенирующем
геле, затем переносят на нейлоновый фильтр и отжигают с 32Р-меченным
зондом, который комплементарен последовательности-мишени, находящейся
вблизи одного из сайтов разрезания. Зонд ассоциирует со всеми
фрагментами, образовавшимися начиная с одного конца
последовательности-мишени, в результате чего на радиоавтограмме
образуется типичная “секвенирующая лестница”. Таким методом можно
определить, например, нуклеотидную последовательность мутантных форм
ранее клонированного гена. Он может использоваться также для определения
характера метилирования специфической, уже клонированной области генома,
поскольку гидразин реагирует с 5′-метилцитозиновыми остатками менее
эффективно, чем с цитозиновыми и тиминовыми. О наличии 5′-метилцитозина
в геле можно судить по отсутствию цитозинового остатка, представленного
в соответствующем фрагменте ДНК, выделенном после клонирования и
репликации в клетках Е. coli.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК

Простота разделения сегментов ДНК путем клонирования и их последующий
анализ позволили определить нуклеотидную последовательность многих ДНК.
Но хотя стремление биологов к получению точных в химическом отношении
данных продолжало стимулировать эти исследования, информация оказывалась
бесполезной, если не были выявлены какие-то особенности этих
последовательностей. На первый взгляд длинные ряды оснований кажутся
совершенно загадочными и не поддающимися расшифровке. К счастью,
проблему расшифровки можно решить с помощью высокоэффективных
компьютерных программ и для рутинного использования имеются программы на
нескольких стандартных компьютерных языках. Возможности различных
программ в значительной степени перекрываются. Их можно использовать при
работе как на больших компьютерах, так и на мини – и микрокомпьютерах.
Вообще говоря, эти программы пригодны для поиска как структурных, так и
биологических особенностей последовательностей.

а. Хранение информации о первичной структуре

Для ввода и хранения данных о последовательностях и последующего поиска,
проводимого исследователем вручную или с помощью специальной
аналитической программы, используются стандартные процедуры
редактирования. Большинство этих процедур предусматривают также
возможность коррекции хранящейся информации. Ввод данных часто
осуществляют путем типирования последовательности в компьютерном
терминале после прочтения и регистрации данных секвенирующего геля.
Однако имеются также программы для прямого ввода исходных данных. В
принципе такие программы позволяют свести к минимуму ошибки, допускаемые
при неправильном считывании гелей или неточной регистрации данных.
Существует два подхода к такой автоматизации. В первом случае детектор
автоматически сканирует радиоавтографы и передает данные непосредственно
в компьютер. Во втором данные автоматически регистрируются от сенсора,
управляемого вручную. При втором подходе исследователь является арбитром
при любых затруднениях.

б. Структурный анализ

Первичная структура. Если имеются данные о нуклеотидной
последовательности одной цепи, то большинство программ позволяют
построить комплементарную цепь, вычислить нуклеотидный состав, выявить
участки, богатые пуринами, пиримидинами или определенными сочетаниями
оснований, и определить частоту встречаемости различных динуклеотидов.
Могут быть выявлены специфические субпоследовательности в пределах
определенного сегмента, что часто используется для нахождения сайтов для
рестриктирующих эндонуклеаз. В программу введена информация о сайтах
узнавания для известных ферментов, и по одной команде выдаются сведения
о положении этих сайтов для каждого из ферментов, числе ожидаемых
фрагментов, образующихся при расщеплении ими ДНК, размере каждого
фрагмента в парах оснований и его процентном отношении к общей длине
сегмента, а также о нуклеотидных остатках, соответствующих концам
каждого фрагмента. Существуют также программы, которые могут
предсказать, какие продукты будут получены при совместном действии двух
или нескольких эндонуклеаз. При этом предсказания делаются как для
линейных, так и для кольцевых молекул. Полученная информация может
использоваться для подтверждения данных секвенирования путем
сравнительного анализа ожидаемого и реального результатов действия
эндонуклеаз.

Имеющиеся программы осуществляют также поиск характерных особенностей
последовательностей, включая прямые и обратные повторы. Выявляются не
только полностью совпадающие сегменты, но и сегменты с той или иной
степенью несовпадения; для этого допускаются определенные отклонения
параметров, заложенных в программу, от фиксированного значения. В
примере перечислены все повторы длиной не менее шести пар оснований и
гомологичные не менее чем на 75%. Предполагается, что максимальный
размер образующихся петель равен двум основаниям.

Можно получить данные о гомологии или частичной гомологии различных
последовательностей. Эти данные могут касаться структуры одного и того
же гена у двух разных организмов или родственных генов одного организма.
Такой сравнительный анализ широко используется при изучении эволюции на
молекулярном уровне. Для сравнения двух последовательностей между собой
или одной последовательности с группой других последовательностей
разработаны специальные алгоритмы. Может использоваться описанный ранее
вероятностный анализ. По результатам сравнения информации о
последовательностях, полученной в разных лабораториях, был создан
центральный банк данных, из которого всегда можно затребовать информацию
о тех или иных последовательностях. К 1989 г. в банках имелась
информация о последовательностях более 20 миллионов пар оснований,
представляющая данные о многих генах и организмах.

Помимо этого общего применения, обнаружение сходства различных
последовательностей является составной частью секвенирования очень
длинных последовательностей с помощью дидезокси-метода, объединенного с
клонированием в фаге М13. Используя компьютер для обнаружения
перекрывающихся последовательностей, мы не только делаем работу менее
утомительной, но и можем быстро решить, следует ли нам пытаться получить
дополнительные данные.

Вторичная структура. Разработаны программы, позволяющие предсказать
стабильную внутримолекулярную вторичную структуру одноцепочечных РНК или
ДНК. Они позволяют, например, построить модель укладки цепи тРНК и рРНК,
и многие из таких моделей получили экспериментальное подтверждение в
опытах с использованием нуклеаз, специфичных к одноцепочечным участкам.
Расчеты основаны на предположениях о вероятности образования
определенных пар оснований, на термодинамических свойствах разных пар
оснований и данных о стабильности спирали.

в. Биологическое значение

С помощью компьютерных программ можно перевести информацию с языка
нуклеотидов на язык аминокислот в соответствии с правилами генетического
кода. При этом указываются все три возможные рамки считывания и
стоп-кодоны трансляции. В тех случаях, когда аминокислотная
последовательность кодируемого полипептида известна, идентифицировать
правильную рамку считывания не составляет труда. В противном случае
правильную рамку можно выбрать, исходя из ее длины. Рамки, в которых
часто встречаются стоп-кодоны, вряд ли могут считаться правильными.
Показаны часть генома SV40, кодирующая участок вблизи гГИ2-конца малого
и большого Т-антигенов, и полученные с помощью компьютера аминокислотные
последовательности для всех трех рамок считывания. Правильной является
третья рамка. Можно также рассчитать частоту, с которой встречается
каждый кодон, и таким образом выявить предпочтительные кодоны для
определенных аминокислот. Обращение этой процедуры позволяет воссоздать
возможные нуклеотидные последовательности, исходя из известной
аминокислотной последовательности полипептида, хотя эта задача не имеет
однозначного решения вследствие вырожденности генетического кода.
Центральный банк данных содержит информацию об аминокислотных
последовательностях всех проанализированных полипептидов, что позволяет
сравнивать последовательности изучаемого и известных белков.

С помощью компьютеров можно вести поиск специфических нуклеотидных
последовательностей, например промоторов или участков связывания с
рибосомами. Они позволяют также обнаружить последовательности со
специфическими свойствами. Например, наличие сходных последовательностей
в разных неродственных во всех других отношениях генах или вблизи них
наводит на мысль об их возможной регуляторной роли. Точно так же
присутствие гомологичных последовательностей в кодирующих областях
различных генов может свидетельствовать об общности эволюционного
происхождения этих генов. Данный вопрос детально рассмотрен в ч. III
книги. Однако важно осознавать, что статистический анализ еще не
является достаточным для того, чтобы делать вывод о биологической роли
той или иной последовательности. Об этом можно говорить только после
проведения независимого биологического исследования.

Определение положения клонированных сегментов в геномах

В идеале установление положения клонированного сегмента ДНК означает
определение фланкирующих его последовательностей и того хромосомного
сайта, по которому этот сегмент был включен в хромосому. Конечная цель
такого картирования состоит в полном описании структуры хромосомы.

а. Молекулярная локализация

Характеристика клонированного сегмента. Прежде всего необходимо
доказать, что клонированный сегмент действительно является репликой
определенного геномного сегмента. Существует ли в геноме гомологичный
сегмент с точно так же расположенными сайтами для рестриктирующих
эндонуклеаз? Этот вопрос имеет важное значение, поскольку во время
репликации в системе хозяин-вектор иногда происходит клонирование
случайных последовательностей, образовавшихся в результате рекомбинаций,
делеций или мутаций. Основной подход состоит в использовании
клонированной ДНК в качестве зонда для анализа продуктов эндонуклеазного
расщепления суммарной геномной ДНК, из которой произошел данный
клонированный сегмент. Такой подход аналогичен описанному в разд.6.1. б
с тем отличием, что зондом в данном случае является клонированная
вставка, меченная 32Р. В эксперименте Б, клонированный зонд представлял
собой субклонированный сегмент овальбуминового гена; материал,
подвергнутый электрофорезу, – это coRI-гидролизат ДНК курицы. С зондом
гибридизовался материал только одной полосы, представляющий собой
фрагменты длиной 2,35 т.п. н. Этот эксперимент показывает, что 1)
клонированная вставка в самом деле является фрагментом ДНК курицы;

2) в геноме гибридизующийся сегмент расположен между двумя
EcoRI-сайтами, находящимися друг от друга на расстоянии 2,35 т.п. н.;

3) ни один из фрагментов любого другого размера не гибридизуется с
зондом. Таким образом, клонированный фрагмент длиной 2,35 т.п. н.,
по-видимому, представляет собой истинную геномную последовательность и
два аллеля в диплоиде являются идентичными, поскольку локализация этих
EcoRI-сайтов совпадает.

Еще одна последовательность овальбуминового гена обнаружена в
EcoRI-фрагменте длиной 1,8 т.п. н. После того как он был клонирован и
использован в качестве зонда для анализа EcoRI-гидролизата ДНК курицы,
были обнаружены три гибридизующихся фрагмента длиной 1,8; 1,3; 0,5 т.п.
н. соответственно. Эти данные свидетельствуют о неидентичности двух
аллельных овальбуминовых генов. Один из них содержит дополнительный
EcoRI-сайт, разделяющий фрагмент длиной 1,8 т.п. н. на две части.
Интересно, что столь простая процедура лежит в основе генетического
анализа. Наследование двух или более аллелей легко прослеживается с
помощью эндонуклеазного расщепления, электрофореза, ДНК-блоттинга и
гибридизации между соответствующим зондом и ДНК, выделенной из разных
источников. Единственным требованием является наличие полиморфных
эндонуклеазных сайтов в аллелях любого гена или сегмента ДНК. Для
проведения таких экспериментов достаточное количество ДНК можно получить
из очень небольшого кусочка ткани или из нескольких миллилитров крови,
поэтому метод может использоваться для анализа ДНК большинства видов, в
том числе и человека.

Построение карты молекулы. Имея сравнительно короткие сегменты молекулы
ДНК, такие, например, как ранее описанный субклонированный фрагмент
длиной 2,35 т.п. н., можно построить детальную карту молекулы вплоть до
установления ее нуклеотидной последовательности. Более длинные
клонированные последовательности, подобные тем, которые присутствуют в
Х-векторах или космидах, часто содержат несколько генов, а также другие
сегменты ДНК, и могут использоваться для расширения карты. Так,
субклонированный фрагмент овальбуминового гена длиной 2,35 т.п. н.
служил зондом для поиска гомологичных последовательностей в космидной
библиотеке, сконструированной из геномной ДНК курицы. Были отобраны две
космиды с перекрывающимися последовательностями только в области зонда;
вместе они составляли участок генома длиной 46 т.п. н., из которых 7,7
т.п. н. принадлежали самому гену овальбумина. Область, содержащая
овальбуминовый ген, была идентифицирована благодаря образованию
гетеродуплекса с овальбуминовой кДНК. Неожиданно обнаружилось, что два
других участка сегмента длиной 46 т.п. н. также гибридизуются с
овальбуминовой кДНК, хотя и в меньшей степени. При отжиге РНК из
яйцевода курицы с космидами эти два участка гибридизовались также с
двумя другими мРНК, отличными от овальбуминовой. Было высказано
предположение, что в сегменте длиной 46 т.п. н. локализованы еще два
гена, последовательность которых сходна с последовательностью гена
овальбумина. Данное предположение получило подтверждение после
проведения рестрикционного и гетеродуплексного анализа, а также после
определения нуклеотидной последовательности. Эти два гена, обозначенные
как X и Y, транскрибируются, как и овальбуминовый ген, в присутствии
стероидных гормонов.

Методы, использующиеся при картировании овальбуминового гена и генов X и
Y, лежат в основе широко распространенного подхода к построению
детальных генетических карт, получившего название прогулки по хромосоме.
Уникальный сегмент ДНК, примыкающий к одному из концов клонированного
фрагмента, очищают и используют для зондирования библиотеки геномной
ДНК. Одни гибридизующиеся клоны полностью перекрываются с исходным
клонированным сегментом, другие же включают новые сегменты, в результате
чего карта расширяется. При повторении этой процедуры совершается
“прогулка” на большее расстояние. Данный метод не очень удобен для
картирования тех геномов, которые содержат большое число рассеянных
повторов, поскольку в этом случае трудно очистить уникальные
последовательности, используемые в качестве зондов.

б. Хромосомная локализация

Классическое генетическое картирование основывается на получении
определенных мутаций и анализе частот рекомбинаций. У Drosophila
генетические карты удалось расширить и уточнить путем установления
корреляций между генетическими данными и хромосомными аберрациями типа
делеций, инверсий и транслокаций, которые визуально проявляются как
изменения в характере исчерченности политенных хромосом. Однако подобные
методы непригодны для анализа хромосом большинства растений и животных.
Генетический анализ немногочисленных популяций с большим периодом
генерации весьма затруднителен, поскольку политенность встречается
редко, а хромосомы довольно многочисленны, имеют небольшие размеры и с
трудом поддаются идентификации. Например, у млекопитающих установление
корреляции между фенотипическими изменениями и делециями, транслокациями
и инверсиями позволяет локализовать лишь ограниченное число генов в
специфических хромосомах или отдельных их областях. С развитием методов
получения клонированных сегментов ДНК были разработаны универсальные
процедуры картирования, которые не зависят от фенотипического проявления
мутаций. Удалось локализовать многие гены, в том числе и гены человека,
в специфических областях хромосом.

Мы рассмотрим два наиболее распространенных метода. С помощью одного из
них положение клонированного сегмента ДНК устанавливают по его
способности гибридизоваться со специфическим участком в практически
интактных хромосомах. Второй позволяет идентифицировать хромосому,
которая несет определенную последовательность, путем гибридизации
подходящего меченого зонда с гибридными клетками, содержащими различные
наборы лишь из нескольких хромосом данного вида. В третьем методе,
описанном во введении к ч. IV, используются клонированные фрагменты ДНК
для выявления полиморфизма рестрикционных сайтов. Такой полиморфный
маркер применяют затем в качестве генетического маркера для построения
карт сцепления эукариотических хромосом – аналогично тому, как в
классическом генетическом анализе используют фенотипические маркеры.

Картирование хромосом с помощью гибридизации. РНК-зонды или
денатурированные ДНК-зонды могут гибридизоваться с соответствующими
последовательностями денатурированной ДНК, входящими в состав хромосом с
характерными морфологическими признаками. Положение радиоактивно
меченного зонда определяют, нанеся на препарат, подготовленный для
микроскопического исследования, чувствительную эмульсию; в том месте
эмульсии, которое контактирует с гибридным участком, появляются темные
зерна серебра. Проведя микроскопическое исследование всего препарата,
можно локализовать зонд. Довольно точные данные удается получить в
случае больших политенных хромосом Drosophila в основном благодаря тому,
что положение темных областей можно соотнести с характером исчерченности
хромосом.

Однако определение положения единичных генов в небольших и весьма
многочисленных хромосомах растений и позвоночных путем гибридизации in
situ затруднено по двум причинам. Во-первых, не всегда легко
идентифицировать отдельные хромосомы.

Это зависит от их размера, положения центромеры и характерного рисунка
из темных и светлых полос, образующегося после окрашивания фиксированных
метафазных хромосом определенными красителями. Кроме того, сами полосы
захватывают слишком большие отрезки ДНК. Например, 3″109 пар нулеотидов
гаплоидного генома человека содержатся менее чем в 1000 различных
полосах, а у растений это число даже меньше. В результате с помощью
чувствительной эмульсии можно установить лишь, в какой области хромосомы
находится интересующий нас сегмент. Более того, размер зерен серебра и
его разброс уменьшают разрешающую способность примерно до 107 пар
оснований.

Вторая проблема-чувствительность зондов. Масса одной копии фрагмента
дуплексной ДНК длиной 1 т.п. н. составляет примерно 10-12 мкг.
Радиоактивно меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, редко
имеют удельную радиоактивность, значительно превышающую 108 расп. /мин
на 1 мкг. Гибридизация такого зонда с одним сопоставимым сегментом в
хромосоме дает только 10-4 расп. /мин на 1 мкг, или примерно один распад
в неделю. Чтобы достичь необходимой чувствительности, следует
одновременно использовать несколько специальных приемов. Например, чтобы
получить зонды с удельной радиоактивностью примерно 109 расп. /мин на 1
мкг, можно провести ник-трансляцию с использованием в качестве субстрата
1251-5-йодСТР. Гибридизацию следует проводить в присутствии
декстрансульфата, что увеличивает скорость процесса примерно в 100 раз,
в результате чего усиливается сигнал. Число зерен также может возрасти,
если одноцепочечные последовательности векторной ДНК, которые сцеплены с
гибридизуемой эукариотической последовательностью в клонированном зонде,
будут в свою очередь гибридизоваться с избытком молекул зонда. Для
увеличения числа зерен серебра можно увеличить время экспозиции до
нескольких недель. Таким способом удается определить положение единичных
копий генов в специфических, но весьма обширных областях хромосом
млекопитающих.

Картирование хромосом, основанное на получении гибридных соматических
клеток. Для локализации клонированного сегмента в определенной хромосоме
используют межвидовые соматические гибриды. Обычно такие гибридные
соматические клетки содержат полный набор хромосом одного вида и только
одну или небольшое число хромосом второго вида. Чтобы судить о наличии
данного гена в определенной донорной хромосоме, анализируют группу
разных линий гибридных клеток и устанавливают корреляцию между
присутствием тестируемого гена и наличием специфической хромосомы.

Гибридные соматические клетки образуются при 1) слиянии клеток двух
разных видов;

2) слиянии клеток одного вида с мини-клетками другого, содержащими одну
или несколько донорных хромосом;

3) трансфекции реципиентных клеток препаратом очищенных хромосом донора.
Чтобы элиминировать неслившиеся донорные и реципиентные клетки,
применяют соответствующие селективные условия. Например, донорные клетки
могут проявлять чувствительность к определенным лекарственным веществам,
а реципиентные клетки могут быть мутантами, растущими лишь в особых
условиях. В присутствии таких препаратов и в среде HAT растут только
гибридные клетки, несущие в донорной хромосоме функциональный ген
тимидинкиназы.

Если отобранные гибридные клетки выращивать в неселективных условиях, то
донорные хромосомы в конце концов утратятся в силу более или менее
случайных причин. Но клоны гибридных клеток можно получить в любой
момент и идентифицировать резидентные донорные хромосомы по характеру
исчерченности, выявлению ранее картированных последовательностей ДНК или
ферментативных маркеров либо с использованием всех трех методов. Таким
способом можно получить банки различных линий гибридных клеток, каждая
из которых содержит определенный набор донорных хромосом.

Альтернативный подход состоит в сохранении селективных условий.
Поддерживая условия, благоприятные для данного гена, в течение многих
клеточных генераций, можно получить линии клеток только с одной
стабильной донорной хромосомой. Другой способ получения гибридных клеток
с одной донорной хромосомой состоит в трансфекции препаратом,
обогащенным этой хромосомой.

При конструировании гибридов возникает вопрос, какой из видов будет
служить донором, а какой – реципиентом. Ответ на него обычно можно найти
лишь экспериментальным путем. Как правило, гибридные клетки
“человек-мышь” утрачивают хромосомы человека.

После идентификации чужеродных хромосом в соматических клетках гибридов
используют три подхода, для того чтобы установить, присутствует ли
тестируемый ген в определенной хромосоме. Первый основан на выявлении
корреляции между наличием этой хромосомы и экспрессией тестируемого гена
с образованием определенного продукта. Для этого измеряют ферментативную
активность или выявляют взаимодействие со специфическими антителами; при
этом необходимо, чтобы используемые методы позволяли различать продукты
генов донорных и реципиентных клеток. Например, два белка-продукта генов
могут иметь разную электрофоретическую подвижность, как, например, в
случае галактокиназ грызунов и приматов. При втором подходе используют
гибридизацию между клонированным зондом и набором хромосом гибрида in
situ; этот подход имеет уже описанные ограничения. Третий и наиболее
общий подход связан с идентификацией искомого гена путем отжига
соответствующего ДНК – или РНК-зонда с ДНК, выделенной из гибридных
клеток и перенесенной на нитроцеллюлозный фильтр. Отжиг с
эндонуклеазными фрагментами часто позволяет выявить донорный ген во
фрагментах, имеющих размеры, типичные для донорного генома, даже в тех
случаях, если гены донора и реципиента являются перекрестно
гибридизующимися. Поскольку трудно получить гибриды с одной донорной
хромосомой, обычно исследуют целый набор гибридных клеток, которые
содержат разные донорные хромосомы. Если этот набор достаточно обширен,
то присутствие последовательности зонда обычно можно связать с
присутствием определенной хромосомы.

Используют также гибридные соматические клетки, содержащие лишь часть
определенной хромосомы донора. Например, некоторые линии донорных клеток
содержат хромосому с делецией или хромосому, несущую небольшой
транслоцированный участок из другой хромосомы, и за прошедшие годы были
выделены и охарактеризованы многие линии гибридных клеток, содержащие
делетированные или составные донорные хромосомы. Например, с помощью
таких гибридных клеток гены тяжелой цепи иммуноглобулина человека были
локализованы в положении 32 длинного плеча хромосомы 14. Были
проанализированы две линии гибридных клеток мыши и человека, каждая из
которых содержала одну из пары реципрокных транслокаций между хромосомой
14 и Х-хромосомой. Зонд, представляющий собой клонированный ген
иммуноглобулина, гибридизовался только с ДНК из гибрида, содержащего
часть хромосомы 14, соответствующую q32.

В результате анализа клонов из библиотек, содержащих ДНК одной
хромосомы, были получены детальные карты участков индивидуальных
хромосом. Наиболее прямой путь получения таких библиотек состоит в
использовании отдельных очищенных хромосом. Другой подход основан на
использовании ДНК из гибридных соматических клеток, содержащих только
одну донорную хромосому. Из такой библиотеки могут быть отобраны
рекомбинанты, содержащие последовательности донорной ДНК, по их
способности гибридизоваться с видоспецифичными зондами.

в. Нестабильность при клонировании

Как правило, клонированные вставки представляют собой точные реплики
геномных последовательностей, однако иногда во время клонирования в этих
последовательностях происходят изменения. Несоответствие размеров
клонированной вставки и сегмента геномной ДНК чаще всего бывает
обусловлено рекомбинациями, делециями или вставками, произошедшими во
время клонирования. Нередко наблюдаются вариации в размерах вставки или
в ее рестрикционной карте при повторном выделении. Если клонированный
фрагмент содержит тандемные повторы, то при расщеплении рекомбинантной
ДНК часто получается сложная смесь рестрикционных фрагментов. Например,
некоторые фрагменты могут быть представлены в количестве меньшем, чем
моль-эквивалент. Это тоже свидетельствует о происшедших во время
репликации рекомбинантной молекулы перестройках, что приводит к
образованию смешанной популяции рекомбинантов. Перестройка состоит в
гомологичной рекомбинации, сопровождающейся делециями и амплификациями
клонированных тандемно повторяющихся единиц. Подобная нестабильность
клонированных повторов в Е. сой-системах хозяин-вектор уменьшается, но
не устраняется полностью в клетках, мутантных по функциям рекомбинации.

Определение числа копий данной последовательности в геноме

Ген овальбумина присутствует в гаплоидном геноме курицы в единственном
экземпляре, однако многие гены и некоторые другие сегменты ДНК
встречаются в геноме множество раз. Типичными примерами геномов с
многократно повторяющимися последовательностями ДНК являются
эукариотические геномы. Иногда несколько копий в таком геноме бывают
абсолютно идентичны, и тогда при отжиге смеси рестрикционных фрагментов
геномной ДНК с меченым гомологичным зондом на электрофореграмме
наблюдается одна полоса, четко видимая даже в том случае, когда
количество расщепляемой ДНК не превышает 1 мкг. Обычно для обнаружения
сегмента, представленного в геноме млекопитающих лишь однократно,
требуется не менее 10 мкг ДНК, поэтому появление полосы при количестве
ДНК 1 мкг и менее свидетельствует о том, что данный сегмент представлен
в геноме многократно. Если разные копии последовательности различаются
по одной или нескольким парам оснований, то у них могут быть и
неодинаковые сайты для рестриктирующих эндонуклеаз. В результате на
радиоавтограмме будет присутствовать множество полос или она будет
представлять собой одно размытое темное пятно; это зависит от числа
копий повторяющейся последовательности.

а. Оценка числа копий с помощью гибридизации ДНК-ДНК

Число копий можно оценить, проведя денситометрический анализ
радиоавтограммы. При этом для повышения точности в отдельные лунки на
этой же пластине геля вносят известное количество немеченой
клонированной ДНК как образец геномной ДНК. Плотность радиоавтографа
линейно зависит от количества ДНК в геле, поскольку зонд присутствует в
избытке. Сравнивая между собой эти показатели для геномной ДНК и ДНК
стандарта, мы можем оценить число копий.

б. Оценка числа копий по кинетике реассоциации ДНК

Более точную информацию о числе копий можно получить, исследуя кинетику
реассоциации ДНК. Кинетические методы стали применяться в этой области
по крайней мере на десять лет раньше методов, описанных в разд.7.5. а, и
именно с их помощью были получены первые данные о том, что
эукариотические геномы содержат много повторов. Для того чтобы понять
суть кинетического метода, необходимо вывести несколько уравнений.

Скорость реассоциации отдельных комплементарных цепей в растворе зависит
от концентрации ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. Если

С0 и С-это суммарные концентрации денатурированной ДНК в момент времени
t0 и в момент времени t после начала гибридизации соответственно, то
скорость реакции описывается уравнением
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picscalex100010009000003a22a000000007d2a00000000040000000301080005000000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Хотя, чем больше размер генома, тем меньше истинная концентрация каждого
гибридизующегося фрагмента. Другими словами, в более сложном геноме
каждый гибридизующийся фрагмент составляет меньшую часть суммарной ДНК и
поэтому гибридизуется при более высоких значениях Cot. Таким образом,
кинетические кривые позволяют оценить размер генома, если у нас имеется
препарат геномной ДНК известного размера, который может служить
стандартом, и если кривые соответствуют кинетике второго порядка. Если
Na и Nb-размеры геномов а и b, то

где С – число молей мононуклеотидов на 1 л, t – время в секундах.

Величина обычно обозначается словом, которое пишется и произносится как
“Cot”.

Как и во многих экспериментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и
реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар
оснований. Обратите внимание на то, что шкала Cot логарифмическая; это
облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых
простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90%
укладывается в интервал значений Cot, охватывающий два порядка величины.

Конкретные значения Cot0.5 зависят от общего размера генома, поскольку С
– это суммарная кон-

Характер кинетических кривых второго порядка для ДНК SV40, Т4 и E. coli
позволяет сделать вывод о том, что каждый геномный сегмент представлен в
геноме только один раз. Аналогичные кривые для эукариотической геномной
ДНК имеют более сложную форму. В качестве примера приведены данные для
ДНК Drosophila. Гибридизация протекает в широком диапазоне значений Cot,
поскольку многие сегменты ДНК повторяются, причем одни из них
многократно, другие менее часто, а третьи – лишь несколько раз. Те
сегменты, которые встречаются в геноме только один раз, имеют низкую
концентрацию и гибридизуются при самых высоких значениях Cot.
Большинство высокоповторяющихся последовательностей, концентрация
которых наиболее высока, гибридизуются очень быстро и характеризуются
самыми низкими значениями Cot. Предположив, что гибридизация сегментов
ДНК, представленных в единственном числе, следует кинетике второго
порядка, можно из сложных Cot-кривых с помощью метода наименьших
квадратов выделить отдельную кривую для однокопийной последовательности
и оценить ее Cot.

Для таких последовательностей Drosophila значение Cot05 равно 28,6
моль”с/л при экспериментальных условиях, которые использовались в
случае. Это значение принято за стандартное; сравнивая с ним значение
Cot0.5 для какого-то клонированного фрагмента ДНК Drosophila, можно
рассчитать число копий этого фрагмента по формуле.

Вторая кривая относится к гибридизации клонированного фрагмента в
присутствии суммарной геномной ДНК Drosophila. Клонированный фрагмент
помечен радиоизотопом, благодаря чему кинетику его гибридизации можно
регистрировать отдельно. Заметим, что концентрация фрагмента достаточно
мала, так что его самогибридизацией можно пренебречь. Эффективная
концентрация клонированной последовательности обеспечивается
соответствующими последовательностями геномной ДНК. Поэтому значение C0t
по оси абсцисс, используемое для получения значения Cot для фрагмента,
рассчитывается из концентрации геномной ДНК Drosophila, а С и С0 по оси
ординат относятся к фракции клонированной ДНК, которая гибридизовалась.
Вот почему значения C0t действительно относятся к геномной ДНК. Значение
Cot0.5 для клонированной последовательности равно 1,06, а число копий
составляет 28,6/1,06 = 27.

Для определения числа копий от одной до десяти этот метод малопригоден,
поскольку для достижения высоких значений Cot требуется длительное время
или очень высокие концентрации ДНК. Эта проблема еще более усложняется,
если геном имеет большой размер, поскольку увеличивается значение Cot0 5
для однокопийных сегментов. Значение Cot0 5 для таких
последовательностей в геноме Drosophila, имеющем размер 1,7*108 пар
нуклеотидов, равно 28,6, а соответствующее значение Cot0.5 для генома
млекопитающих по меньшей мере в десять раз выше.

На самом деле кинетический анализ гибридизации несколько более сложен,
чем это здесь представлено. Скорость гибридизации зависит не только от
концентрации ДНК, но и от температуры, ионной силы, вязкости раствора и
размера гибридизующихся фрагментов. Все эти параметры должны быть строго
фиксированными.

Процент гибридизовавшейся ДНК измеряют разными способами. Во-первых,
можно использовать тот факт, что при определенных условиях с
гидроксилапатитом связывается дуплексная, но не одноцепочечная ДНК.
Во-вторых, можно определять в разные моменты времени процент ДНК,
которая становится устойчивой к нуклеазе, специфичной в отношении
одноцепочечной ДНК. Результаты, получаемые с помощью этих двух методов,
различаются, если анализируются сложные эукариотические геномы.
Нуклеазный метод позволяет определять только количество дуплексной ДНК,
образовавшейся при реассоциации, а метод осаждения на гидроксилапатите
дает не только количество дуплексной ДНК, но и ДНК с неспаренными
одноцепочечными хвостами. Такие дуплексы образуются, в частности, в
результате случайных разрывов одиночных цепей еще до реассоциации с
образованием фрагментов подходящих размеров, а также благодаря наличию
повторяющихся последовательностей. Нуклеаза S1 расщепляет все одиночные
нереассоциировавшие цепи, а также все одноцепочечные концы дуплексов.
Гидроксилапатит связывает все дуплексные цепи, включая и цепи с
одноцепочечными хвостами, и поэтому дает более высокую оценку доли
гибридизовавшихся цепей, чем нуклеазный метод. Иными словами, в опытах с
применением гидроксилапатита мы получаем большую степень реассоциации
ДНК и большую скорость реассоциации, чем в опытах с 81-нуклеазой. Эти
различия уменьшаются, если используются относительно короткие фрагменты
ДНК.

в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения

Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего
количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным
количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в
избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке
присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно
полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в
очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.

Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата
радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с
фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной
ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время
реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы
меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его
самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для
получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные
сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число
гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать
исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения
точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к
препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого
клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося
радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на
гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты
денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном
фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую
концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным
количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.

Изменение клонированных сегментов: получение мутантов

а. Общие положения

В основе классического генетического анализа лежит получение случайных
мутаций, вызывающих наследуемые фенотипические изменения. Разработка
новых молекулярно-генетических методов привела к созданию так называемой
обратной генетики. В охарактеризованные клонированные гены вносят
специфические мутации и затем устанавливают корреляцию между изменениями
в определенных участках этих генов и изменением фенотипа или локализуют
регуляторные элементы. Например, если в кодирующую часть гена внести
мутации, то на нем будет синтезироваться модифицированный полипептид.
Это позволяет изучать влияние аминокислотной последовательности белка на
его кон-формацию или ферментативную активность. Аналогично нуклеотидная
замена в предполагаемом регуляторном участке может привести к подавлению
или стимуляции транскрипции, что подтвердит предположение о
функциональной роли данного участка.

Существуют разные способы внесения мутаций в клонированные фрагменты или
небольшие геномы, но мы рассмотрим лишь немногие из них. Во всех случаях
успех зависит от двух условий. Во-первых, должна быть хорошо известна
структура исходной ДНК. Как минимум, необходимо знать подробную карту
сайтов рестрикции, но еще лучше, если известна вся последовательность
изучаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все методы дают некую смесь
продуктов, нужный элемент следует очистить с помощью клонирования,
амплифицировать и охарактеризовать. При некоторых типах мутагенеза
мутации образуются в случайных местах, при других – в определенных
сайтах; о последних говорят как о сайт-специфических мутациях.

б. Делеционные мутанты

Использование рестриктирующих эндонуклеаз. Внести делецию в определенный
участок можно в том случае, если клонированный фрагмент ДНК содержит два
близко расположенных уникальных сайта рестрикции в интересующей нас
области. После эндонуклеазного расщепления фрагмента образующиеся
“хвосты” отщепляют с помощью специфичной к одноцепочечным участкам
нуклеазы и тупые концы вновь сшивают. Однако столь простой подход
применим лишь в редких случаях. Чаще используют другой метод, при
котором делецию создают в окрестности одного уникального сайта
рестрикции. После эндонуклеазного разрезания фрагмента соседние
нуклеотиды удаляют с помощью эндонуклеазы Bal 31 или какой-либо
экзонуклеазы, например ехоШ E. coli, совместно с нуклеазой S1. При
последующем лигировании образуется семейство молекул с делециями,
расположенными вокруг исходного эндонуклеазного сайта. Делеционные
мутанты очищают с помощью молекулярного клонирования. В одном из
вариантов этого метода перед образованием кольцевой молекулы к концам
присоединяют рестриктазные линкеры. При этом в молекулу вводятся
эндонуклеазные сайты, которые могут оказаться полезными для исследования
ее свойств, секвенирования и последующего моделирования.

При помощи более сложных манипуляций может быть получен целый набор
делеций разной длины, берущих начало от одного исходного сайта. Для
этого рекомбинантную молекулу обрабатывают двумя способами. Из одной ее
части удаляют с помощью двух рестриктирующих эндонуклеаз большой
сегмент, включающий мишень для делеций. Вторую часть линеаризуют с
помощью одного из двух ферментов и затем обрабатывают ферментом Bal 31.
Далее в результате разрезания вторым ферментом получают набор фрагментов
уменьшающейся длины. Лигирование этих фрагментов с частью А и
последующее клонирование дает набор молекул с делециями, начинающимися в
сайте RE1.

Использование неспецифических эндонуклеаз. В сверхспиральные кольцевые
молекулы могут быть внесены единичные разрывы с помощью неспецифических
эндонуклеаз, например ДНКазы I. При этом образуется целый набор линейных
молекул с разрывами в разных сайтах. После внесения разрыва и расширения
делетированной области осуществляют лигирование с помощью методов,
описанных ранее для устранения эндонуклеазных разрывов. При таком
подходе используют некоторые интересные свойства ДНКазы I: в присутствии
Мп2+ этот фермент расщепляет сразу обе цепи дуплексной ДНК, а в
присутствии Mg2+ гидролизует за один раз только одну цепь, в результате
чего в ДНК появляются одноцепочечные пробелы. Кроме того, фермент
расщепляет сверхспиральную ДНК быстрее, чем линейную дуплексную,
вследствие локальной неупорядоченности ДНК в сверхспиральном состоянии.
Поэтому после непродолжительной обработки сверхспиральной ДНК ДНКазой I
в присутствии Mg2+ образуются в основном полноразмерные линейные
дуплексные молекулы. Обработка их с помощью Bal 31 или экзонуклеазы, а
затем 81-нуклеазы расширяет образовавшийся ранее пробел. После
лигирования отдельные продукты можно получить с помощью молекулярного
клонирования.

в. Инсерционные мутанты

Принципы конструирования инсерционных мутантов сходны с описанными выше
для делеционных мутантов. Клонированный сегмент ДНК расщепляют по одному
из сайтов с помощью рестриктирующей эндонуклеазы или неспецифической
эндонуклеазы. При необходимости заполняют пробелы на концах
образовавшейся линейной молекулы или отщепляют одноцепочечные “хвосты” с
помощью нуклеазы и осуществляют лигирование в присутствии сегмента,
который хотят встроить в молекулу. В качестве вставки может
использоваться синтетический фрагмент, содержащий множество сайтов для
рестрикционных эндонуклеаз, – так называемый полилинкер. Если первое
расщепление было неспецифичным, то появление новых сайтов рестрикции в
наборе клонированных мутантов поможет построить физическую карту
мутаций.

г. Точечные мутации

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном
участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК,
содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания
таких сайт-специфических пробелов состоит в обработке сверхспиральной
ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии
бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований
и вносит нарушения в структуру дуплекса. При этих условиях многие
рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в
соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в
обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в
сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все
рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же
число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью
экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный
пробел в месте разреза. Альтернативный способ получения дуплексной
молекулы с пробелом состоит в использовании векторной системы на основе
фага М13. Для этого создают одноцепочечный М13-рекомбинант, содержащий
нужный сегмент, а также другой, двухцепочечный, рекомбинант, содержащий
такой же сегмент, но с делецией. Этот двухцепочечный рекомбинант
денатурируют и реассоциируют с одноцепочечным, в результате чего
образуется гетеродуплекс с пробелом.

Если ДНК, содержащую одноцепочечный пробел, обработать бисульфитом
натрия, то в одноцепочечном участке произойдет дезаминирование остатков
цитозина с образованием урацила, т.е. дезаминируются только определенные
остатки цитозина. Если пробел невелик, а число дезаминированных остатков
цитозина ограничено благодаря малому времени реакции и низкой
концентрации бисульфита, то возникает очень небольшое число
специфических мутаций. Далее пробел заполняют с помощью ДНК-полимеразы и
осуществляют лигирование. Вместо исходных С”С-пар в молекуле ДНК теперь
содержатся пары и”А, которые после репликации превращаются в Т”А-пары.

Мутагенное копирование. Специфические мутации другого типа можно
получить, если при заполнении пробела вместо нормального
дезоксирибонуклеозидтрифосфата использовать его мутагенный аналог.
ДНК-полимераза I способна использовать в качестве субстратов различные
аналоги обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Некоторые из них
являются мутагенами. Например,] М6-гидро-ксидезоксицитидин-5′-трифосфат
может включаться в синтезируемую цепь в положение, соответствующее А или
G в матричной цепи в зависимости от того, находится ли он в иминной или
аминной форме соответственно. Если пробел в дуплексной ДНК заполняется с
помощью HO-dCTP вместо dTTP, то напротив А будет находиться HO-dC. После
трансфекции и репликации наряду с нормальными формами будут
обнаруживаться мутантные геномы с транзициями Т • А – ” С • G. Проведя
отбор, эти мутанты можно клонировать. Аналогично замещение dCTP на
HO-dCTP приводит к транзициям С • G – > Т • А.

Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических
олигодезоксинуклеотидов. Олигодезоксинуклеотиды можно синтезировать в
больших количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные
методы получения сайт-специфических точечных мутаций в клонированных
сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование
гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим
олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность, и
комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей
соответствующий сегмент дикого типа. Для этого ген, в котором мы хотим
получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают
одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой
кольцевой молекулой отжигают синтетический олигодезоксирибонуклеотид
длиной от 8 до 20 нуклеотидов, содержащий мутантную последовательность.
Этот олигодезоксирибонуклеотид выполняет роль праймера, а оставшийся
одноцепочечным участок-роль матрицы при синтезе ДНК in vitro с помощью
ДНК-полимеразы I. После копирования всей кольцевой молекулы начало и
конец новой цепи соединяют лигазой. Образовавшаяся дуплексная молекула
содержит неспаренные основания в мутантной последовательности.
Интересно, что фаговое потомство, вышедшее из одной инфицированной
клетки, сегрегирует как смешанная популяция фагов дикого типа и
мутантных рекомбинантов, которые можно разделить при последующем
клонировании.

При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок
клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным
олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В
приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор
типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы
хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты,
встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют,
приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный
олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных
цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания.
Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который
они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от
гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного
рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют
смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих
альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов
сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью
последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если
необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что
синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется
простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного
мононуклеотида, а их смеси.

Изучение функций клонированных сегментов ДНК

Нередко клонирование определенных сегментов геномной ДНК, или кДНК,
осуществляют с целью выяснения функций их внутриклеточных двойников.

Исходя из результатов структурного анализа клонированных
последовательностей, указывающих на присутствие в них открытых рамок
считывания, можно предположить, что они содержат гены. Часто удается
выявить специфические промоторные последовательности и другие
регуляторные элементы. Однако, чтобы подтвердить эти данные, необходимо
провести прямые функциональные исследования. При этом нужно ответить на
следующие вопросы:

1. Транскрибируется ли данная последовательность только в одном или
нескольких типах клеток?

2. Являются ли транскриптами молекулы мРНК?

3. Влияют ли на транскрипцию изменения, происходящие в клетке?

4. Содержит ли клонированный сегмент промоторы, терминаторы или другие
регуляторные сигналы, и если да, то как они работают?

5. Какова связь между структурой клонированного сегмента и структурой
внутриклеточных транскриптов?

6. Могут ли транскрипты транслироваться в полипептид? Для ответа на все
эти вопросы используют различные экспериментальные подходы в зависимости
от того, какая именно система анализируется.

а. Характеристика внутриклеточных транскриптов, соответствующих
клонированным сегментам ДНК

Говоря о любом клонированном сегменте генома, нам прежде всего
необходимо ответить на вопросы, связанные с его транскрипцией in vivo.
Очень важными являются также данные о структурном сходстве между
клонированной кДНК и внутриклеточными родственными транскриптами. В
основе соответствующих исследований лежат три метода: РНК-блоттинг,
анализ с использованием специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз и
копирование РНК, выделенной из клеток, с помощью обратной транскриптазы.
Все методы включают предварительное выделение и очистку РНК из целых
клеток или специфических внутриклеточных органелл, таких, как ядро или
цитоплазма. Результативность всех методов зависит от способности РНК
образовывать гетеродуплексы с комплементарной клонированной ДНК.

РНК-блоттинг. Блоттинг РНК аналогичен блоттингу ДНК. Он состоит в
следующем. Выделенную РНК разделяют по размерам с помощью электрофореза
в агарозном геле. Обычно электрофорез проводят в условиях,
способствующих денатурации РНК, чтобы свести к минимуму влияние
вторичной структуры молекулы на ее электрофоретическую подвижность.
Щелочные условия для этой цели не подходят ввиду лабильности
фосфодиэфирных связей в молекуле РНК в этих условиях. Поэтому используют
такие агенты, как глиоксаль, формальдегид или мочевину. Затем РНК
переносят на иммобилизованную подложку, стараясь сохранить распределение
молекул РНК. Далее используют меченую ДНК в качестве зонда для выявления
на фильтре соответствующих молекул РНК. Фильтр инкубируют с ДНК в
условиях, благоприятствующих гибридизации. Промыв фильтр для удаления
избыточной ДНК, с помощью радиоавтографии устанавливают положение зонда,
а следовательно, и положение гомологичной РНК в том геле, в котором
проводился электрофорез. Таким способом выявляют продукты транскрипции
клонированного сегмента ДНК. Если на параллельной дорожке этого же геля
одновременно провести разделение смеси РНК или молекул одноцепочечной
ДНК известного размера, то можно оценить размер транскриптов. Кроме
того, РНК-блоттинг позволяет оценить количество РНК, синтезированной в
клетках, из которых она получена. Метод оценки аналогичен используемому
при определении числа копий ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах. Плотность
полосы на рентгеновской пленке пропорциональна количеству присутствующей
гомологичной РНК. Как и ранее, желательно, чтобы меченый зонд был
одноцепочечным, поскольку он не должен реассоциировать с комплементарной
цепью ДНК вместо РНК.

С помощью всех этих довольно простых методов можно получить обширную
информацию о функциональных свойствах клонированного сегмента ДНК. Сюда
относятся не только данные о способности к транскрибированию, но и
оценка числа траскриптов и ее зависимость от типа клеток или
внеклеточной среды. Анализируя РНК из очищенных клеточных компонентов,
можно установить, где локализуются разные транскрипты – в ядре,
цитоплазме или полисомах. Часто очень важным является вопрос о
полиаденилировании гомологичной РНК, поскольку полиаденилирование
является характерным признаком большинства эукариотических мРНК.
Разделить полиаденилированную и неполиаденилированную] РНК не составляет
труда, поскольку полиаденили-рованная РНК спаривается при
соответствующих условиях с poly или poly. Сами полимеры обычно фиксируют
на инертной твердой подложке, что упрощает отделение несвязанной
poly-PHK. Фракцию poly-PHK элюируют при денатурирующих условиях. Затем
РНК из каждой фракции подвергают электрофорезу, блоттингу и

тестированию на способность гибридизоваться с клонированной ДНК. Если
РНК, идентифицированная с помощью клонированной ДНК, выделена из
цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего она представляет собой
мРНК. Идентификация становится более надежной, если, кроме того, РНК
связана с полисомами.

Еще одной характеристикой мРНК, гибридизовавшихся с клонированным
сегментом ДНК, является их размер. Иногда РНК имеет больший размер, чем
клонированный сегмент; это означает, что в клоне представлена лишь часть
гена. В других случаях РНК оказывается короче клонированного сегмента,
что свидетельствует о наличии в клонированной последовательности
дополнительных последовательностей, не представленных в транскрипте. Это
могут быть геномные последовательности, фланкирующие транскрибируемую
область, или не-кодирующие последовательности, прерывающие кодирующую
область и подвергающиеся сплайсингу во время созревания мРНК. Все эти
взаимоотношения между клонированным сегментом ДНК и гомологичной
клеточной РНК можно установить более точно, используя специфичные к
одноцепочечным ДНК нуклеазы или осуществляя обратную транскрипцию.

Исследование родства между клонированным сегментом ДНК и внутриклеточной
РНК с помощью ДНК-РНК-гибридизации и специфичных к одноцепочечным ДНК
нуклеаз. Эксперимент включает три этапа. На первом клонированный
фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом и денатурируют. Можно также
использовать одноцепочечную ДНК. На втором этапе ДНК гибридизуют с
выделенной клеточной РНК в растворе в условиях, благоприятных для
образования ДНК-РНК-гибридов. Любые последовательности ДНК,
присутствующие в клонированном фрагменте, но не представленные в РНК,
остаются одноцепочечными. Их удаляют с помощью нуклеазы, специфичной к
одноцепочечной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денатурируют и
подвергают гель-электрофорезу. Размер образующейся радиоактивной ДНК
определяют с помощью радиавтографии, сравнивая положение исследуемой ДНК
с положением молекул ДНК известного размера.

Этот основной эксперимент можно проводить во многих разных вариантах,
каждый из которых позволяет выявить свои особенности структуры РНК в
зависимости от того, какая именно нуклеаза используется, является ли РНК
суммарной или очищенной цитоплазматической ро1у-мРНК. Один из таких
вариантов, где в ДНК имеется один протяженный участок, комплементарный
РНК, и не спарены только концы молекулы. Метод позволяет также выявить
любую область, где отсутствует комплементарность между РНК и ДНК. Во
многих экспериментах такого рода используется специфичная к
одноцепочечной ДНК эндонуклеаза S1, поэтому метод называют
картированием.

81-картирование часто используют для установления соответствия между
началом молекулы РНК и специфическим сайтом в клонированном сегменте
ДНК. Во многих случаях этот сайт представляет собой сайт инициации
транскрипции. Точность эксперимента значительно повышается, если
используется небольшой ДНК-зонд, что позволяет измерить длину
защищенного сегмента ДНК с точностью до одного нуклеотида. Для получения
такого зонда обычно субклонируют строго определенные участки длинного
фрагмента ДНК. Размер защищенного фрагмента ДНК определяют с помощью
электрофореза в таких же гелях, что и при определении нуклеотидной
последовательности.

Удлинение праймера: исследование родства между внутриклеточной РНК и
клонированным фрагментом ДНК с помощью обратной транскриптазы. Для
проведения этого эксперимента необходим относительно короткий ДНК-зонд,
который гибридизуется с участком РНК, желательно находящимся на
расстоянии не более 100 пар оснований от предполагаемого 5′-конца РНК.
ДНК-зонд отжигают с РНК, и он играет роль праймера при обратной
транскрипции, а матрицей служит РНК. Поскольку обратная транскриптаза
прекращает копирование, когда достигает 5′-конца РНК, размер продукта
позволяет установить, где начинается РНК. Обычно праймер бывает
радиоактивно меченным, что позволяет легко определить положение продукта
в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен только к конкретной РНК,
исследуемый препарат может представлять собой смесь разных РНК.

б. Функциональное тестирование клонированной ДНК

Клонированные сегменты ДНК можно транскрибировать и транслировать в
эукариотических системах либо in vitro с использованием клеточных
экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo после введения
клонированного сегмента в клетку.

Системы in vitro. Для приготовления бесклеточных экстрактов, содержащих
РНК-полимеразы I, II и III, обычно используют разнообразные
эукариотические клетки. В анализируемом сегменте должны присутствовать
последовательности, ответственные за регуляцию транскрипции; необходимы
также вспомогательные белки, стимулирующие транскрипцию. При
фракционировании таких экстрактов получают очищенные или частично
очищенные полимеразы и факторы, с помощью которых можно детально изучить
механизмы транскрипции. Для осуществления трансляции мРНК с образованием
соответствующих полипептидов используют другие типы клеточных
экстрактов.

Системы in vivo. Для изучения функций клонированного сегмента ДНК лучше
всего использовать целые клетки, поскольку это позволяет следить как за
процессом транскрипции, так и за процессом трансляции. Наиболее
изученной биологической тест-системой являются ооциты лягушки. Ооциты –
это крупные клетки объемом до 1 мкл, которые можно многократно получать
от одной лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро, при этом обычно
достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплексе с гистонами ооцита
упаковывается с образованием хроматина, далее осуществляются ее
транскрипция и трансляция, и в течение нескольких часов можно
идентифицировать продукты экспрессии генов – мРНК и полипептиды. Для
проведения эксперимента часто оказывается достаточно того количества РНК
и полипептидов, которое синтезируется одним ооцитом. Во многих
отношениях экспрессия инъецированных клонированных генов в ооцитах
протекает нормально. Исходные ядерные транскрипты генов РНК-полимераз II
и III подвергаются процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят в
цитоплазму.

Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в эукариотические клетки в
культуре. Молекулы можно инъецировать непосредственно в отдельные
клетки, однако проще вводить клонированные молекулы в большую популяцию
клеток одновременно. При этом используется методика трансфекции в связи
с клонированием в эукариотических клетках. По крайней мере часть
молекул, введенных таким способом, достигает ядер.

Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами
эукариотической ДНК

В предыдущих разделах мы уже не раз останавливались на синтезе in vitro
и in vivo полипептидов, кодируемых вставками в рекомбинантных векторах.
Скрининг по фенотипу зависит от экспрессии интересующего нас гена в
клетках хозяина. Отбор нужных клонов такими методами, как HART и
гибридизационная селекция, осуществляется с помощью трансляции in vitro,
а функциональный анализ клонированного сегмента после введения его в
исходную клетку основывается на изучении как транскрипции, так и
трансляции. Цель многих экспериментов по клонированию состоит в синтезе
нужного полипептида, а иногда – в получении его в количествах,
достаточных для проведения фенотипического анализа. В ряде случаев цель
клонирования состоит в получении антител. В этом разделе мы опишем
некоторые системы хозяин-вектор, специально созданные для продукции
нужного белка.

Синтез белков, предназначенных для проведения тех или иных исследований
или для применения в медицине и промышленности, – это одна из самых
первых задач, которые ставились при разработке технологии рекомбинантных
ДНК. В настоящее время ряд поступающих в продажу ферментов, используемых
для конструирования рекомбинантных молекул ДНК, в свою очередь
синтезируются под контролем генов, клонированных в плазмидных векторах
E. coli. Использующиеся при этом препараты имеют высокую степень
очистки, относительно недороги и включают ДНК-полимеразу I, ДНК-лигазу
E. coli, обратную транскриптазу. Другие белки и их мутантные формы,
полученные после сайт-специфического мутагенеза соответствующих
клонированных генов, используют для установления связи между структурой
белка и его функцией. К ним относятся алкогольдегидрогеназа,
в-лактамаза, цитохром с – и тирозил-тРНК-синтетазы. С помощью методов
клонирования были синтезированы важные в клиническом отношении белки,
которые трудно было получить иным способом. Сюда относятся интерфероны,
инсулин и гормон роста человека. Были синтезированы белки, кодируемые
некоторыми вирусами животных и простейшими. Они использовались в
качестве антигенов в некоторых вакцинах.

а. Выбор системы экспрессии

Для экспрессии уже клонированного гена выбор хозяина имеет такое же
важное значение, как и при самом клонировании. Наиболее подходящими
хозяевами для получения белка часто оказываются клетки E. coli,
поскольку с ними просто манипулировать и их легко выращивать в больших
объемах. После открытия интронов, прерывающих кодирующие участки многих
эукариотических генов, для использования в экспрессирующих векторах чаще
стали применять клонированные кДНК, а не сами гены. Однако при синтезе
активных форм определенных эукариотических белков в клетках E. coli
возникает ряд проблем. Так, первичные продукты трансляции некоторых
эукариотических генов должны подвергнуться специфическим
посттрансляционным модификациям, прежде чем образуются функциональные
молекулы. Обычно эти модификации состоят в протеолизе, фосфорилировании,
ацетилировании и гликозилировании. Ферменты, катализирующие эти реакции
в клетках Е. coli, обычно отсутствуют. Отчасти для решения этой проблемы
были разработаны эффективные эукариотические системы экспрессии. В
животных системах хозяин-вектор в качестве кодирующих
последовательностей не обязательно использовать кДНК, поскольку эти
клетки способны удалять интроны.

Векторы, предназначенные для эффективной транскрипции и трансляции
клонированного сегмента, содержат элементы, повышающие эффективность
репликации вектора и экспрессии соответствующих генов. Репликация как
таковая для экспрессии генов не требуется, но, обеспечивая образование
большого числа матриц для транскрипции, она повышает содержание мРНК и
полипептидов в клетке. Таким образом, экспрессирующие векторы обычно
содержат точку начала репликации и кодируют некоторые другие функции,
необходимые для эффективной внутриклеточной репликации и не
обеспечивающиеся хозяйскими клетками. Транскрипция зависит от наличия в
векторе промотора, который соответствует присутствующей в клетках
РНК-полимеразе, т.е. промотора E. coli для экспрессии в клетках бактерий
и промотора, используемого РНК-полимеразой II, для экспрессии в
эукариотических клетках. Этот промотор должен быть расположен в векторе
таким образом, чтобы клонированный ген мог встроиться в правильной
ориентации и за промотором по ходу транскрипции. Эукариотические
экспрессирующие векторы должны также иметь сайт для расщепления и
полиаденилирования транскрипта-предшественника функциональной мРНК. Для
точной трансляции в начале кодирующей области должен находиться кодон
ATG, а в конце – один из стоп-кодонов. Последний обычно содержится в
клонированном сегменте, но стартовый кодон часто отсутствует во вставке
кДНК, поэтому его функции должен выполнять вектор. Для трансляции в Е.
coli на 5′-конце на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от инициирующего
кодона должен находиться сайт связывания с рибосомой, последовательность
Шайна-Дальгарно.

В экспрессирующие векторы часто бывают включены дополнительные элементы.
Обычно они предназначаются для увеличения выхода полипептидов или для
упрощения процедуры очистки нужного белка от других клеточных белков.
Одним из основных факторов, ответственных за уменьшение выхода, является
нестабильность многих белков в чужеродной клеточной среде.

Чтобы добиться экспрессии гена, обычно каждый раз приходится решать
уникальную экспериментальную задачу. Поэтому многие экс-прессирующие
векторы, хотя и обладают некоторыми общими свойствами, имеют свои
особенности. Ниже мы рассмотрим системы, в которых используются
оригинальные экспрессирующие векторы, предназначенные для конкретных
целей.

б. Экспрессирующие векторы, используемые в E. coli

Векторы, сконструированные для осуществления эффективного белкового
синтеза в E. coli, обычно происходят от pBR322 или другой высококопийной
плазмиды; это необходимо для получения максимального числа матриц для
транскрипции.

Промоторы. Большинство векторов, предназначенных для изучения экспрессии
генов, содержат один из сильных промоторов, описанных в разд.3.11:
Лас-промотор с соответствующим оператором, trp-промотор и оператор, а
также Рь-промотор бактериофага X. Обычно используют мутантный промотор,
называемый UV5, поскольку это позволяет осуществлять транскрипцию с
большей скоростью, чем в случае промотора дикого типа, а кроме того,
активность сохраняется даже в отсутствие положительного эффектора
САР-сАМР. Другой часто используемый промотор, lac, представляет собой
синтетическую конструкцию: его – 35-последовательность представляет
собой – 35-последовательность trp-промотора, а блок Прибнова –
соответствующую последовательность промотора UV5. Таким образом,
1ас-промотор идентичен оптимальному промотору E. coli, структура
которого была определена исходя из данных, полученных при сравнении
последовательностей многих природных промоторов. Как и ожидалось, он
оказался весьма эффективным.

Помимо такого достоинства, как эффективность, эти четыре промотора
обладают еще одним ценным свойством: они позволяют осуществлять
временной контроль инициации транскрипции, поскольку связаны с
регуляторными элементами. Это очень важно, так как накопление больших
количеств чужеродного для E. coli белка может подавлять рост клеток и
тем самым ограничивать конечный выход белка. Впрочем, если клетки
удается вырастить до высокой плотности, а затем индуцировать к
оптимальной экспрессии клонированного гена, то часто можно достигнуть
оптимального выхода белка. Если белок, который предполагается
синтезировать, нестабилен в клетках Е. coli, то молекулы,
синтезированные в начале цикла роста, вероятно, деградируют ко времени
достижения культурой высокой плотности. Поэтому имеет смысл отсрочить
экспрессию до того момента, когда плотность культуры повысится
достаточно сильно. Если используются векторы, в которых экспрессия
клонированного гена зависит от этих промоторов, то количество нужного
белка обычно составляет от 1 до 10% уровня суммарного белка в клеточном
экстракте.

Экспрессирующий вектор с lac-промотором. Плазмидные векторы, содержащие
промотор lac UV5, часто содержат также последовательность
Шайна-Дальгарно ас-оперона и кодирующие последовательности для
в-галактозидазы. Поскольку экспрессия, инициируемая на участке с
ас-оператором-промотором, находится под контролем ас-оперона,
транскрипцию можно инициировать с помощью индуктора
изопропил-в-В-тиогалактозида. В приведенном примере вместо восьмого
кодона в-галактозидазного гена встроен полилинкер, что нарушает
кодирующую рамку. Клетки E. coli, несущие такой вектор, не способны
синтезировать активную в-галактозидазу. Две части рамки считывания можно
совместить, если в один из рестриктазных сайтов полилинкера встроить
фрагмент с определенной рамкой считывания. В этом случае трансляция мРНК
может инициироваться в начале кодирующего участка в-галактозидазного
гена, проходить через вставку и остальную часть кодирующего участка
этого гена и заканчиваться на обычном стоп-кодоне. В результате клетки,
содержащие плазмиду с такой вставкой, будут продуцировать активную
в-галактозидазу, поскольку первые восемь аминокислот молекулы
несущественны для активности фермента и чужеродные аминокислоты не будут
влиять на нее. Гибридный полипептид можно очистить, при этом показателем
степени очистки будет служить удельная активность в-галактозидазы. В
некоторых случаях гибридный белок можно расщепить и удалить протяженную
карбоксильную в-галактозидазную часть. Однако и сами гибридные белки
находят применение: с их помощью получают антитела к чужеродному белку.

Экспрессирующий вектор с trp-промотором. В векторе, перед полилинкером
находятся trp-промотор, оператор, последовательность Шайна-Дальгарно,
аттенуатор, а также примерно 300 кодонов гена trp E. Транскрипцию можно
контролировать, поместив содержащие плазмиду клетки Е. coli, выращенные
до высокой плотности, в среду без триптофана и добавив затем
3-в-индолилакриловую кислоту. Последняя конкурирует с оставшимся
триптофаном за связывание с trp-репрессором, однако образует неактивный
комплекс, в результате чего происходит дерепрессия промотора. Как и в
случае с вектором, содержащим Лас-промотор, при встраивании чужеродного
гена в рамку считывания по одному из сайтов рестрикции в полилинкере
синтезируется гибридный белок. Трансляция останавливается, дойдя до
случайного стоп-кодона вектора.

В случае вставка кодирует обратную транскриптазу ретровируса. После
трансфекции и дерепрессии в клетках E. coli синтезируется ферментативно
активный гибридный белок. Для повышения стабильности обратной
транскриптазы большую часть избыточных последовательностей гена trpE
делетируют с помощью некоторых манипуляций и переклонирования. Несколько
аминокислот trpE, остающихся на N-конце образовавшегося полипептида,
слабо влияют на активность обратной транскриптазы.

Экспрессирующий вектор, использующий PL-npo-мотор бактериофага X. Вектор
позволяет синтезировать эукариотические белки, не сливающиеся с
чужеродным полипептидом. Транскрипция с этого промотора подавляется
X-репрессором, который образуется профагом, присутствующим в
клетке-хозяине. Применение клеток, лизогенизированных фагом, который
кодирует чувствительный к нагреванию репрессор, позволяет индуцировать
экспрессию гена путем переноса клеток, выращенных при 30°С, в среду с
температурой 42°С. Кроме промотора вектор содержит часть
последовательности Шайна-Дальгарно гена cII фага X. Между промотором и
этой последовательностью находится группа регуляторных элементов фаговой
ДНК, которые функционируют в цис-положении, ослабляя транскрипционную
полярность. Эти последовательности с антиполярным эффектом функционируют
при наличии продукта гена N фага X, поставляемого лизогенизированными
хозяйскими клетками, которые обычно используются с вектором этого типа.
В таком векторе сегмент, содержащий связывающийся с рибосомой участок
Ш-Д-последовательности, включает также кодон ATG cII-гена фага X. Более
того, ATG перекрывает BamHI-сайт, унаследованный от плазмиды pBR322.
Эукариотические кодирующие участки встраивают в BamHI-сайт разными
способами, зависящими от кодирующей последовательности. Очень важным
моментом является встраивание кодирующей последовательности таким
образом, чтобы она находилась в рамке с ATG. Таким образом, вектор
поставляет все регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и
трансляции, за исключением стоп-кодона, который обычно находится в
пределах клонированных эукариотических кДНК.

в. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей

Наиболее эффективные в отношении экспрессии генов дрожжевые векторы
сконструированы на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей. Эта плазмида
обеспечивает образование в дрожжевых клетках большого числа копий
рекомбинантной ДНК до тех пор, пока сегмент REP3 находится в
цис-положении, а функциональные гены REP1 и REP2 – либо в цис-, либо в
транс-положении. Применяются несколько разных регулируемых дрожжевых
промоторов; в примере это промотор гена CYC1, кодирующего изо-1-цитохром
с. Этот промотор и связанные с ним регуляторные сигналы составляют
область размером в несколько сотен пар оснований, что типично для
подобных сложных эукариотических областей, в которых транскрипция
регулируется с помощью РНК-полимеразы II. Сегменты ДНК, трансляцию
которых мы хотим осуществить, встраивают в рамку считывания в сайте. В
этом случае они непосредственно прилегают к инициирующему кодону ATG
гена CYC1. Сайт полиаденилирования в векторе отсутствует, но обычно кДНК
содержат такой сайт, который расположен за стоп-кодоном трансляции.

г. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках животных

Для экспрессии клонированных генов в клетках животных были
сконструированы два типа векторов; в основе одного из них лежит геном
SV40, а другого – геном папилломавируса крупного рогатого скота.
Основные свойства этих двух систем вирусных векторов описаны в разд.
5.7. Векторы на основе папилломавирусов особенно полезны для синтеза
больших количеств белка, а векторы на основе SV40 используются во многих
экспериментах.

Типичные векторы содержат либо весь геном BPV, либо его часть,
необходимую для стабильной трансформации хозяйских клеток, например
мышиных клеток в культуре. Такие векторы часто включают эукариотический
ген вместе с промотором, сигналом полиаденилирования и другими
регуляторными областями. Между сайтом инициации транскрипции и стартовым
кодоном трансляции находится удобный рестриктазный сайт. Когда в этот
сайт встраивается определенная кодирующая последовательность, она
транскрибируется с образованием соответствующей мРНК. Синтез этой мРНК
начинается от стартового кодона транскрипции и заканчивается на сигнале
полиаденилирования, находящемся во вставке или в векторной
последовательности. Кодирующая последовательность должна содержать свой
собственный стартовый и стоп-кодоны. Одним из преимуществ
экспрессирующих векторов, созданных на основе BPV, является то, что
трансформированные ими клетки сохраняются в культуре в течение многих
месяцев. В результате непрерывного деления клеток постоянно
синтезируется нужный белок. В одном из экспериментов в BPV-вектор была
встроена предварительно клонированная кодирующая часть гена
поверхностного антигена вируса гепатита В. Трансформированные клетки
секретировали около 10 мг антигена на 1 л культуры за 24 ч.

Ферментативная амплификация сегментов ДНК и РНК

На заре развития методов молекулярного клонирования применение
альтернативных способов амплификации специфических сегментов ДНК или
РНК, присутствующих в больших популяциях молекул, казалось
маловероятным. Однако в настоящее время такой метод разработан и широко
используется. Он получил название полимеразной цепной реакции. С его
помощью можно получать микрограммы ДНК-копии сегментов ДНК или РНК, даже
когда они присутствуют в препарате в виде единственной молекулы.

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием
ДНК-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров, комплементарных двум
3′-концам участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент.
Таким образом, разработка ПЦР-метода стала возможной лишь после того,
как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза
олигонуклеотидов. Для осуществления реакции необходимо знать
нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим
амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие
олигонуклеотидные праймеры.

Полимеразная цепная реакция. Для того чтобы амплифицировать какой-то
сегмент ДНК, синтезируют два олигонуклеотидных праймера, каждый из
которых комплементарен одному из двух 3′-концов участков, ограничивающих
амплифицируемый дуплексный сегмент. В ходе ПЦР-реакции необходимо
копировать последовательность каждой из цепей, находящуюся между
участками, с которыми спариваются олигонуклеотидные праймеры. После
спаривания праймеров с денатурированной ДНК, содержащей амплифицируемый
сегмент, осуществляют встречное удлинение праймеров с помощью
ДНК-полимеразы в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов.
Образующиеся дуплексные ДНК денатурируют, вновь спаривают с праймерами и
проводят ДНК-полимеразную реакцию. Этот цикл может быть повторен
примерно 60 раз с удвоением в каждом цикле количества дуплексного
сегмента ДНК. За п циклов образуется 2″ копий дуплексного сегмента,
ограниченного праймерами.

Используя термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильных
бактерий Thermus aquaticus, можно осуществлять множество ПЦР-циклов при
однократном введении фермента. Сначала смешивают ДНК, избыточное
количество праймерных молекул, дезоксинуклеозидтрифосфаты и полимеразу.
Цикл запускают, нагрев смесь до температуры, обеспечивающей денатурацию
ДНК; затем охлаждают раствор до температуры, необходимой для отжига
праймеров. Далее устанавливают температуру, при которой может
происходить синтез ДНК. Весь процесс, который длится несколько часов,
можно автоматизировать, используя нагреватели, работа которых
регулируется с помощью компьютера.

Использование ДНК-полимеразы Т. aquaticus не только позволяет
автоматизировать процесс, но дает и другое преимущество. Этот фермент
наиболее активен в температурном интервале 70-75°С. При таких условиях
спаривание олигонуклеотидных праймеров и ДНК происходит более
специфично, чем при 37°С – оптимальный температуре для ДНК-полимеразы Е.
coli. В результате ассоциация праймеров происходит более точно, что
сводит к минимуму амплификацию нежелательных сегментов ДНК, особенно в
присутствии всей геномной ДНК. Точность отжига повышается также при
подборе оптимального температурного режима, ионной силы, длины праймера
и его нуклеотидного состава. Специфичность может быть достаточно
высокой, чтобы осуществлялась амплификация двух разных сегментов в одном
и том же препарате ДНК в присутствии двух пар праймеров.

РНК можно амплифицировать с образованием дуплексной ДНК аналогичным
образом с той лишь разницей, что в начале первого цикла необходимо
синтезировать кДНК-копию РНК. Если РНК представлена молекулами мРНК, то
роль одного из праймеров в ПЦР, а также в реакциях с участием обратной
транскриптазы могут выполнять короткие рогу-цепочки.

Разные варианты полимеразных цепных реакций. Как мы уже говорили, для
проведения ПЦР необходимо знать нуклеотидные последовательности,
фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это подразумевает, что ПЦР-метод
может применяться только при наличии предварительно клонированных и
секвенированных сегментов ДНК. Однако с помощью относительно простых
модификаций можно значительно расширить возможности метода ПЦР. В одном
из вариантов можно выделить определенный ген, если известна
аминокислотная последовательность лишь короткого участка
соответствующего очищенного белка. Например, синтезировав праймеры
длиной 20 пар нуклеотидов на основании данных о последовательности двух
концов пептидного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно
амплифицировать геномный фрагмент длиной 60 п. н. Вследствие
вырожденности генетического кода при этом используют смесь праймеров с
альтернативными основаниями в нужных положениях. После проведения ПЦР
амплифицированный сегмент из 60 п. н. очищают с помощью
гель-электрофореза или клонирования и используют в качестве зонда для
идентификации интересующей нас последовательности при анализе библиотек
геномной ДНК или кДНК.

Еще один пример универсальности метода ПЦР дает использование его для
амплификации полной кДНК-копии мРНК исходя из данных последовательности
одного небольшого участка либо соответствующего пептида, либо мРНК.
Метод состоит в следующем. Суммарную мРНК копируют с образованием
одноцепочечной кДНК, используя короткий рогу^Т) – праймер. Затем с
помощью терминальной трансферазы к 3′-концу кДНК присоединяют “хвост”;
разд.4.8); используя короткий рогу^С) – праймер, синтезируют вторую цепь
ДНК. До этого момента никакой специфичности в отношении определенной
мРНК не проявляется. На следующем этапе используют олигонуклеотидный
праймер с такой же последовательностью, как и у короткого участка вблизи
3′-конца нужной нам мРНК. С помощью этого праймера и poly проводят ПЦР;
специфичность оказывается достаточно высокой для получения практически
чистого продукта, представляющего полноразмерную мРНК.

В другом варианте в 5′-концы праймеров включают последовательности,
соответствующие какому-либо рестриктазному сайту. При отжиге с исходной
матрицей они остаются неспаренными, но амплифицируемый фрагмент
приобретает концевые рестриктазные сайты. Они могут оказаться полезными
при последующем клонировании или включении в вектор для изучения
экспрессии.

Применение ПЦР. Возможности метода ПЦР во всей полноте еще не раскрыты,
но с его помощью уже удалось получить новые данные о структуре разных
РНК, генов и геномов, а также о процессах, протекающих на геномном
уровне. Одно из его очень важных применений состоит в определении
характера мутаций. После того как ген клонирован, с помощью двух
праймеров амплифицируют соответствующий геномный сегмент, полученный от
разных особей данного вида. Секвенирование этого сегмента позволяет
установить природу мутации, произошедшей в данном гене, или выявить
полиморфизм, будь то замена одной пары оснований или делеция, инсерция
или перестройка. Благодаря простоте метода с его помощью можно
диагностировать генетические заболевания и проводить
популяционно-генетические исследования. Используя праймеры, которые
специфически ассоциируются с определенными мутантными формами гена,
можно также классифицировать мутации.

С помощью зондов, комплементарных геномам таких инфекционных агентов,
как вирусы и бактерии, могут быть идентифицированы геномы этих агентов
на фоне значительного избытка ДНК клетки-хозяина. В частности, вполне
реальной представляется диагностика СПИДа с помощью этого метода. Еще
одно его применение состоит в анализе структуры продуктов реакций
рекомбинации.

Одним из интересных и потенциально наиболее эффективных применений ПЦР
является амплификация сегментов ДНК внутри отдельных клеток. Такие опыты
проводились как на диплоидных клетках, так и на сперматозоидах человека.
Использование сперматозоидов имеет особое значение для генетического
анализа видов, включая человека, которые не могут подвергаться
экспериментальному скрещиванию. Этот метод позволяет оценить частоту
мейотической рекомбинации непосредственно в больших популяциях
сперматозоидов, если использовать пару праймеров, специфичных в
отношении полиморфных или мутантных форм сцепленных генов.

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020