СОДЕРЖАНИЕ
ЛЕКЦИЯ 1. ОБОРУДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ БИОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ЛЕКЦИЯ 2. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК И ЭКСТРАКЦИЯ. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
ЛЕКЦИЯ 3. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПУТЕМ ОСАЖДЕНИЯ
ЛЕКЦИЯ 4. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ И СПЕЦИАЛЬНЫЕ ДОБАВКИ. УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ. ДИАЛИЗ. ДЕТЕРГЕНТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ЛЕКЦИЯ 5. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ХРОМАТОГРАФИИ, КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
ЛЕКЦИЯ 6. МАТЕРИАЛЫ МАТРИЦ СОРБЕНТОВ И ОБМЕННИКОВ. ТЕХНИКА КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
ЛЕКЦИЯ 7. АДСОРБЦИОННАЯ И РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИИ
ЛЕКЦИЯ 8. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
ЛЕКЦИЯ 9. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
ЛЕКЦИЯ 10. ИОНООБМЕННАЯ ЖХВД БЕЛКОВ. ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ
ЛЕКЦИЯ 11. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
ЛЕКЦИЯ 12. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ
ЛЕКЦИЯ 13. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ЛЕКЦИЯ 14. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ И ИЗОТАХОФОРЕЗ
ЛЕКЦИЯ 15. ОБНАРУЖЕНИЕ, КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МАКРОМОЛЕКУЛ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ЛЕКЦИЯ 16. ПРИНЦИП ИММУННОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. ИММУНОФИКСАЦИЯ
ЛЕКЦИЯ 17. ЭЛЕКТРОСИНЕРЕЗ. ЭЛЕКТРОИММУНОАНАЛИЗ
ЛЕКЦИЯ 18. МЕТОДЫ МЕЧЕНЫХ АТОМОВ
ЛЕКЦИЯ 19. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
ЛЕКЦИЯ 20. ФЛЮОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
ЛЕКЦИЯ 21. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
ЛЕКЦИЯ 22. РАДИОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. МАСС-СПЕКТРОСКОПИЯ
ЛЕКЦИЯ 23. БЛОТТИНГ-АНАЛИЗ
ЛЕКЦИЯ 1. ОБОРУДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ БИОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Источники опасности и меры безопасности в лаборатории при проведении биохимического анализа. Особенности применения общих лабораторных методов в биохимическом эксперименте. Микро – и нанометоды.
Лабораторная посуда: материалы для её изготовления, выбор оптимального материала в зависимости от поставленной задачи биохимического эксперимента, виды лабораторной посуды, биосовместимые способы мытья и сушки лабораторной посуды, особые способы подготовки лабораторной посуды для биохимического анализа.
Исходные реактивы для биохимической лаборатории. Сведения о реактивах: маркировка реактивов, использование литературных и электронных источников справочной информации. Особенности хранения реактивов для биохимического анализа. Способы проверки качества и чистоты реактивов, выбор способа проверки, адекватного поставленной аналитической задаче. Методы дополнительной подготовки и очистки реактивов для биохимического анализа. Перекристаллизация.
Методы отбора реактивов в биохимическом анализе. Взвешивание: виды весов для аналитической биохимии, принципы и источники погрешностей взвешивания. Дозирование жидкостей, использование пипеточных дозаторов, возможные источники погрешностей. Особенности приготовления растворов в аналитической биохимии: принципы приготовления, способы выражения, концентраций, растворимости, растворители для биохимического анализа, способы постепенного добавления реактивов, растворение плохо растворимых веществ (суспендирование, эмульгирование, детергенты, использование которых допустимо в биохимическом анализе). Буферные растворы для использования в биохимическом анализе.
Методы контроля температуры в биохимической лабораторной практике.
Необходимость проведения ряда биохимических анализов в специальных условиях. Техника работ с реагентами, чувствительными к влаге, кислороды воздуха и свету. Проведение реакций в апротонных растворителях, в безводных условиях и в инертной атмосфере. Техника проведения фотохимических реакций.
ЛЕКЦИЯ 2. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК И ЭКСТРАКЦИЯ. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Принцип метода, основные определения и формулы. Центрифугирование применяется для разделения неоднородных жидких сред.
Центрифугирование позволяет разделить смесь, состоящую из двух или более компонентов с разной удельной плотностью, если по крайней мере один из этих компонентов – жидкость.
Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.
Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (, в рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (г, в см): G = 2 • г. Поскольку один оборот ротора составляет 2л радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту (об. /мин) можно записать так: = 2 (об. /мин), а центробежное ускорение тогда будет равно: G =4r/3600 (об. /мин) 2.
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g {гравитационная постоянная, равная 980 см*с-1) и называется относительным центробежным, ускорением (ОЦУ), т.е. ОЦУ=4r/3600*980 (об. /мин) 2 или ОЦУ = 1,11*10-5*r (об. /мин) 2 (*)
На основании уравнения (*) Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г – среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке (т.е. расстояния от оси вращения до середины столбика жидкости).
Номограмма для расчета центробежного ускорения
Для определения G соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах; точка пересечения этой прямой со средней шкалой дает искомую величину центробежного ускорения. Следует иметь в виду, что правая колонка цифр шкалы G соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора; левая – левой.
Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением (закон Стокса, видоизмененный Сведбергом и Никольсом):
где t – время седиментации, с; – вязкость среды, Паскаль • секунда; гч – радиус частицы, см; рч – плотность частицы (удельный вес); p – плотность среды (жидкости) или удельный вес; гм – расстояние от оси вращения до мениска жидкости, см; гд – расстояние от оси вращения до дна пробирки, см.
Как следует из уравнения (**), при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно выделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды.
Описанными методами можно выделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы (или другие микротельца), микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети) и, наконец, рибосомы.
Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению (**), поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании конформации макромолекул.
Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований.
С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов.
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.
В практике препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем более подробно, хотя в основе обоих методов лежат общие принципы.
ЛЕКЦИЯ 3. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПУТЕМ ОСАЖДЕНИЯ
Осаждение нуклеиновых кислот.
Обычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он применялся и для фракционирования, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. Можно считать, что повезло, если при этом получается ещё и существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно рассчитывать на приблизительно 2-10 кратное обогащение).
Почему именно сульфат аммония?
При равной молярной концентрации поливалентные анионы долее эффективны для высаливания, чем моновалентные (отчасти из-за того, что имеет значение не концентрация соли, а ионная сила раствора), а поливалентные катионы даже препятствуют действию поливалентных анионов. Получается, что оптимально сочетание – это поливалентный анион с моновалентными катионами.
Эффективность высаливания убывает в серии Гофмейстера (Hofmeister):
Цитрат > Сульфат > Фосфат > Хлорид > Нитрат > Тиоционат
В этом же ряду убывает стабилизирующий эффект и возрастают хаотропные свойства соли. Таким образом, наиболее подходящие кандидаты: цитрат и сульфат. Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости (например, при нормальной температуре растворимость аммонийных солей цитрата и сульфата равны примерно 2.5М и 4.1М); низкой цены и стабилизирующего влияния, которое он оказывает на большинство белков при концентрациях выше 0.5М.
(NH4) 2SO4 преципитируют белки по двум механизмам
сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более эффеективно при pH
S [g/l] – растворимость белка; I – ионная сила; ß; Ks – константы.
Ks – слегка различается для различных белков и почти не зависит от pH и температуры. ß – сильно зависит от белка, pH и температуры; повышение температуры вызывает понижение ß => уменьшение растворимости белка.
Влияние pH. При низкой ионной силе ( 6; слабоосновные аниониты находятся в ионизованном состоянии при рН РЬ2+ > Sr2+ > Са2+ > Ni2+ > Cd2+ > Сu2+ > Со2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO2+ > Тl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Для орг. ионов на электростатич. взаимод. с фиксир. зарядами ионита накладывается еще и гидрофобное взаимод. орг. части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание орг. ионов и добиться оптим. селективности их разделения, к водному элюенту добавляют орг. компонент (1-25% метанола, изопропанола, ацетонитрила или диоксана). Элюент в И. х. кроме к-ты или основания и орг. добавок может содержать нейтральный электролит, напр. NaNO3, ионы к-рого конкурируют с разделяемыми ионами за взаимод. с сорбентом; при этом удерживание однозарядных ионов падает пропорционально концентрации соли в р-ре, двухзарядных ионов – пропорционально ее квадрату. Важна также природа нейтрального электролита: чем выше сродство его ионов к сорбенту, тем выше элюирующая сила р-ра. В И. х. анионов часто используют фосфатные р-ры, к-рые обладают большой элюирующей способностью при высоких значениях рН, где фосфат приобретает заряд – 3. Мн. неорг. катионы разделяют на сульфокатионитах, используя в качестве элюента комплексообразователи (орг. к-ты или гидроксикислоты). Разделение основано на том, что константы устойчивости образующихся комплексов, а значит и их сорбционные св-ва, даже таких близких по св-вам катионов, как лантаноиды и актиноиды, при определенных значениях рН различаются достаточно сильно; при этом заряд комплекса можно менять (вплоть до отрицательного). С помощью И. х. разделяют нек-рые нейтральные соед., если они способны превращ. в заряженные комплексы, как, напр., комплексы углеводов с борат-ионом. Удерживание разделяемых ионов в колонке пропорционально обменной емкости ионита. Для используемых в И. х. полимерных ионитов емкость 3-6 мг-экв/г, для ионитов на основе силикагеля с привитыми к его пов-сти функц. группами – на порядок ниже. При равном размере зерен (обычно 5-15 мкм) иониты на основе силикагеля обладают более высокой скоростью ионного обмена, что повышает эффективность хроматографич. колонок, однако их гидролитич. устойчивость при рН / 8 недостаточна. Для увеличения эффективности (числа теоретич. тарелок) колонки с полимерными ионитами обычно используют при повыш. т-рах (50-80 °С); при этом увеличиваются коэф. диффузии ионов в фазе ионита. В качестве сорбентов для И. х. могут использоваться нейтральные носители, пропитанные жидкими ионитами, т.е. несмешивающимися с водой орг. основаниями или к-тами, напр., триоктиламином, триоктилметиламмонием, алкиловыми зфирами алкилфосфорной к-ты. Разбавленные р-ры ионогенных ПАВ в сочетании с нейтральными гидрофобными носителями находят применение в ион-парной хроматографии (см. Жидкостная хроматография), к-рая отличается высокой эффективностью и большим числом варьируемых параметров для подбора оптим. селективности разделения. Детектирование в И. х. осуществляют с помощью любого детектора, применяемого в жидкостной хроматографии (см. Детекторы хроматографические). Наиб. универсален для ионных соединений кондуктометр, на применении к-рого основан вариант И. х. – ионная хроматография.И. х. применяется для разделения катионов металлов, напр., смесей лантаноидов и актиноидов, Zr и Hf Мо и W, Nb и Та; последние разделяют на анионитах в виде анионных хлоридных комплексов в р-рах соляной и плавиковой к-т. Щелочные металлы разделяют на катионитах в водных и водно-орг. средах, щел. – зем. и редкоземельные металлы на катионитах в присут. комплексонов. Большое значение имеет автоматич. анализ смесей прир. аминокислот на тонкодисперсном сульфокатионите в цитратном буфере при повыш. т-ре. Аминокислоты детектируют фотометрически после их р-ции с нингидрином или флюориметрически после дериватизации фталевым альдегидом. Высокоэффективная И. х. (колонки, упакованные сорбентом с размером зерен 5-10 мкм, давление для прокачивания элюента до 107 Па) смесей нуклеотидов, нуклеозидов, пурияовых и пиримидиновых оснований и их метаболитов в биол. жидкостях (плазма крови, моча, лимфа и др.) используется для диагностики заболеваний. Белки и нуклеиновые к-ты разделяют с помощью И. х. на гидрофильных высокопроницаемых ионитах на основе целлюлозы, декстранов, синтетич. полимеров, широкопористых силикагелей; гидрофильность матрицы ионита уменьшает неспецифич. взаимод. биополимера с сорбентом. В препаративных масштабах И. х. используют для выделения индивидуальных РЗЭ, алкалоидов, антибиотиков, ферментов, для переработки продуктов ядерных превращений.
ЛЕКЦИЯ 10. ИОНООБМЕННАЯ ЖХВД БЕЛКОВ. ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ
Хроматофокусирование – метод ионообменной хроматографии, использующий в качестве инструмента разделения градиент рН, формируемый в слое сорбента внутри колонки. Метод успешно применяют для разделения цвиттер-ионных биологических макромолекул [1-3]. Формирование внутреннего градиента рН в хроматофокусировании заключается в предварительном уравновешивании анионообменной хроматографической колонки стартовым раствором (СР) с высоким значением рН, содержащим слабое основание, и в последующем пропускании элюента с более низким рН, составленного из слабых органических кислот или амфолитов.
Предложен вариант хроматофокусирования переходных металлов, сочетающий принципы комплексообразовательной хроматографии с формированием нисходящего градиента рН внутри колонки, заполненной сорбентом с привитыми олигоэтиленаминами.
В основе этого варианта лежит образование аминных комплексов ионов металлов (например, Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+, Fe3+, Cr3+, Mn2+, UO22+, Pb2+) при начальном значении рН 7,0 – 7,5 и их последующая диссоциация при линейном снижении рН до 3. Возможности метода продемонстрированы на примере концентрирования и разделения 4 – 5 ионов металлов из изученного ряда в вариантах хроматографии низкого давления и ВЭЖХ [4, 5]. На данный момент ведутся работы на карбоксильных катионообменных сорбентах.
Это связано с тем, что комплексообразование ионов металлов с олигоэтиленаминами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой. В случае с карбоксильными сорбентами, вероятно, удастся расширить круг ионов металлов, разделяемых в условиях формирования нисходящего градиента рН, включив в него щелочноземельные металлы. Отметим, что нисходящие градиенты рН внутри катионообменных колонок в хроматофокусировании ранее не получали.
ЛЕКЦИЯ 11. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (от лат. affinis – родственный) (биоспецифич. хроматография, хроматография по сродству), метод очистки и разделения белков, основанный на их избират. взаимод. с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. В кач-ве лигандов используют соед., взаимод. к-рых с разделяемыми в-вами основано на биол. ф-ции последних. Так, при разделении ферментов (для чего преим. и применяется А. х) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, к-рая обусловливает высокую эффективность А. х., состоит в том, что разделение основано на различии не физ. – хим. признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфич. функциональных св-в, отличающих данный фермент от множества др. биополимеров.
Неподвижная фаза в А. х. представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель – соединяющее звено (“ножка”) – специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или “ножки”, содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом:
Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда хим. в-в и микроорганизмов.
Более стабильны макропористые неорг. носители (кремнезем, стекло) и орг. полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность специфич. взаимод. с ферментом заметно снижается вследствие пространств. затруднений. “Ножка”, как правило, устраняет стерич. препятствия, отдаляя лиганд от носителя. Как и носитель, она должна быть инертной и не влиять на процессы в ходе А. х., чего, однако, не всегда удается достигнуть. Напр., присоединение “ножки” по приведенной выше р-ции приводит к образованию катионной группировки изомочевины, и сорбент приобретает св-ва анионита. В кач-ве “ножки” используют обычно ди – и полиамины, аминокислоты, пептиды, олигосахариды.
Лигандами могут служить субстраты (напр., крахмал или гликоген при разделении амилаз), однако их превращ. в ходе А. х., катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет св-ва сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращ., т.е. ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые ими пептиды D-аминокислот. Эффективны прир. ингибиторы ферментов, напр. пепстатин – ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры таких “группоспецифич.” лигандов-антрахиноновые красители, аналоги никотинамидадениндину-клеотида.
Известны лиганды (напр., производные фенилборной к-ты), имитирующие при взаимод. с ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.
Разделение в А. х. обычно проводят на хроматографич. колонках; иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают буферным р-ром для удаления несвязавшихся в-в, после чего десорбируют исследуемый компонент.д.есорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного р-ра или добавлением в него орг. р-рителя, что ослабляет взаимод. лиганд – фермент. Более избирательна десорбция р-ром лиганда.
Помимо ферментов, методом А. х. можно выделять также токсины, рецепторы, ингибиторы, транспортные белки и др. биологически активные в-ва. Высокой избирательностью отличается т. наз. иммуносорбция, при к-рой в кач-ве лиганда используют антитела, обладающие специфичностью к выделяемым белкам; особенно эффективны моноклональные антитела.
Для разделения белков применяется также ряд др. аналогичных методов.Т. наз. ковалентная хроматография основана на избират. образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым в-вом и носителем, напр. между белком с SH-группами и ртуть-орг. производными агарозы.
Применяется также лигандообменная хроматография, при к-рой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе.
Получила распространение гидрофобная хроматография, при к-рой сорбент (напр., фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на пов-сти белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимод., как, напр., при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз. Избират. выделение гликопротеинов обеспечивают иммобилизованные на носителях лектины – белки, специфически взаимодействующие с концевыми моносахаридными звеньями углеводных цепей.
Иммобилизованные субъединицы ряда белков с четвертичной структурой м. б. использованы для извлечения этих белков из сложных смесей вследствие специфич. межсубъединичных контактов. А. х. сформировалась как метод в кон.60-х гг.20 в.
ЛЕКЦИЯ 12. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ
ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА.
Привычное название “гель-фильтрация” для хроматографического метода фракционирования молекул по их размерам можно сохранить и в случае хроматографии при высоком давлении, где среди используемых жестких пористых матриц главную роль играет силикагель. Иногда используют и такие названия, как “молекулярно-ситовая” (“molecular sieve”) или “эксклюзивная” (“exclusion… “) хроматография.
Неподвижная фаза при гель-фильтрации представлена жидкостью, находящейся внутри пористых, хорошо смачиваемых гранул, заполняющих хроматографическую колонку. Если на такую колонку подается растворенная в элюенте смесь молекул различных размеров, то крупные молекулы, неспособные проникнуть внутрь гранул, будут двигаться вдоль колонки вместе с подвижной фазой;
для них коэффициент распределения К == 0. В то же время наиболее мелкие молекулы, размеры которых заведомо меньше диаметра пор в гранулах, будут равномерно распределяться между подвижной и неподвижной фазами. Для них будет осуществляться хроматографический процесс с присущим ему замедлением миграции хроматографической зоны; значение К при этом близко к единице. Для молекул промежуточной величины благодаря статистическому распределению размеров пор окажется доступной только часть объема неподвижной фазы. Для них 0
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
