Реферат на тему:

Полімеразна ланцюгова реакція (копіювання ДНК)

Вступ

Уперше склад інгредієнтів, що входять у реакційну суміш для постановки
полімеразної ланцюгової реакції, і основні принципи використання
праймерів (коротких штучно синтезованих молекул ДНК) для одержання копій
ДНК були описані Kleppe із співавт. у 1971 році. Однак тоді ще не була
продемонстрована основна риса ПЛР — експонентне збільшення кількості
копій фрагмента вихідної ДНК як результат реакції.[10] Це було здійснено
в 1985 р. на фірмі Cetus. Наступне використання в ПЛР термостабільної
ДНК-полімерази  істотно розширило можливості її застосування, як у
наукових цілях, так і в клініці.[1]  У 1985 році Saiki із співавт.
опублікували статті, у якій була описана ампліфікація геномної
послідовності b-глобіна. З цього моменту кількість публікацій, у яких
автори повідомляли про застосування ПЛР у своїх роботах, стало
збільшуватися в геометричній прогресії. Метод став настільки популярний,
що сьогодні уже важко представити роботу в області молекулярної біології
без його використання. Особливо бурхливий розвиток метод полімеразної
ланцюгової реакції одержав завдяки міжнародній програмі «Геном людини».
Були створені сучасні лазерні технології секвенування (розшифровки
нуклеотидних послідовностей ДНК). Якщо в недавнім минулому для
розшифровки послідовності ДНК розміром у 250 пару нуклеотидів (п.н.) був
потрібна тиждень, то сучасні лазерні секвенатори дозволяють визначати до
5000 п.н. у день. Це у свою чергу сприяє значному росту інформаційних
баз даних, що містять послідовності ДНК. В даний час запропоновані
всілякі модифікації ПЛР, показана можливість створення тест-систем для
виявлення мікроорганізмів, виявлення крапкових мутацій, описані десятки
різних застосувань методу.[10] Ми коротенько розглянемо теоретичні
основи ПЛР і застосування цього методу для молекулярно-генетичного
дослідження зразків тканин. Основна увага буде приділено практичним
аспектам, важливим для аналізу звичайних тканинних зразків.

Полімеразна ланцюгова реакція

ПЛР — це здійснювана in vitro специфічна ампліфікація нуклеїнових
кислот, ініційована синтетичними оліго-нуклеотидними праймерами; основні
її етапи представлені на мал. 2. ПЛР-цикл складається з теплової
денатурації ДНК, її отжога з праймером і подовження ланцюга (елонгації);
зміна цих етапів відбувається в результаті простої зміни температури.
Праймери при цьому орієнтуються на матриці так, що число раундів
реплікації росте експоненціально, відповідно збільшується і число копій
специфічної нуклеотидної послідовності.

Застосування молекулярних методів для цілей клінічної діагностики
обмежується їхньою невисокою чутливістю і тривалістю аналізу. Так, для
виявлення нуклеїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ із
застосуванням радіоактивно  міченого зонда необхідно, щоб мішень була
присутня в препараті в декількох тисячах копій. Нерідке число аномальних
послідовностей у клінічному препараті діагностично-значимо, але менше
цієї величини і гібридизація може дати помилко негативний результат. На
відміну від цього ПЛР дозволяє виявити унікальну нуклеотидну
послідовність. Для цього в реакційну суміш додають у великому надлишку
специфічні для даної послідовності олігонуклеотидні праймери
(«амплімери»), що утворюють з нею комплекс, і проводять реплікацію ДНК
in vitro. Оскільки амплімери гібридизуються з обома ланцюгами ДНК, то і
нативна послідовність, і синтезовані ПЛР-продукти можуть служити
матрицями в наступних раундах реплікації, у результаті чого число копій
унікальної послідовності експоненціально збільшується (мал. 2). Завдяки
цьому послідовності, що є присутнім у клінічному препараті в мінімальній
кількості (одна чи кілька копій) і не піддаються виявленню ніякими
іншими методами, легко виявляються за допомогою ПЛР. ПЛР дозволяє знайти
всього одну аномальну послідовність на 100000-1000000 нормальних кліток.

Принцип полімеразної ланцюгової реакції зображений на рис №1. Принцип
комплементарності й антипаралельності ланцюгів ДНК представлений на рис
№3.

 

Рис №1.

 

Експонентне збільшення числа копій молекули-мішені не тільки забезпечує
високу чутливість методу, але і полегшує їхнє виявлення. Кожен раунд ПЛР
займає від 2 до 5 хв, і звичайно для досягнення необхідної чутливості
досить 25-50 раундів, тобто 2-4 год. Таким чином, весь аналіз можна
провести протягом одного дня. Крім того, оскільки зміст ПЛР-продуктів
досить великий, можна використовувати неізотопні методи детекції. У
табл.1 приведені дані, що дозволяють порівняти метод ПЛР з іншими
молекулярно-генетичними методами дослідження. Видно, що він володіє
двома важливими перевагами: високою чутливістю і нетривалістю аналізу.

Рис. 2. Полімеразна ланцюгова реакція. Праймери підбирають таким чином,
щоб забезпечити специфічну ампліфікацію фрагмента ДНК визначеного
розміру.

 

Таблиця 1. Порівняння різних методів гібридизації

  ПЛР Блот-гібридизація по Саузерну Гібридизація in situ

Чутливість 1/100000 1/100 10 мішеней

Специфічність Висока Висока Висока

Тривалість аналізу 1 доба 1 доба 1 доба

 

Рис. № 3. Принцип комплементарності й антипаралельності ланцюгів ДНК.

 

Ампліфікація РНК

Можливість використання РНК як мішень для ПЛР істотно розширює спектр
застосування цього методу. Наприклад, геноми багатьох вірусів (гепатит
З, вірус інфлюенци, пікорнавіруси і т.д.) представлені саме РНК. При
цьому в їхніх життєвих циклах відсутня проміжна фаза перетворення в ДНК.
Для детекції РНК необхідно в першу чергу перевести її у форму ДНК. Для
цього використовують обернену транскриптазу, що виділяють із двох різних
вірусів: avian myeloblastosis virus і Moloney murine leukemia virus.
Використання цих ферментів зв’язано з деякими труднощами. Насамперед,
вони термолабільні і тому можуть бути використані при температурі не
вище 42° С., Тому що при такій температурі молекули РНК легко утворять
вторинні структури, то ефективність реакції помітно знижується і за
різними оцінками приблизно дорівнює 5%. Починаються спроби обійти цей
недолік використовуючи в якості оберненої транскриптази термостабільну
полімеразу, отриману з термофільного мікроорганізму Thermus
Thermophilus, що виявляє транскриптазну активність у присутності Mn2+.
Це єдиний відомий фермент, здатний виявляти як полімеразну, так і
транскриптазну активність.

Для проведення реакції оберненої транскрипції в реакційній суміші також
як і в ПЛР повинні бути присутнім праймери як запал і суміш 4-х дНТФ, як
будівельний матеріал.

Після проведення реакції оберненої транскрипції, отримані молекули кДНК
можуть служити мішенню для проведення ПЛР.

Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК

Для аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК використовують різні методи. Ми
розглянемо три найбільш простих: гель-електрофорез,
дот-блот-гібридизацію і блот-гібридизацію по Саузерну. З їхньою
допомогою можна аналізувати більшість ПЛР-продуктів, але абсолютно точні
результати можна одержати тільки секвенуванням.

Підготовка ПЛР-продуктів

Насамперед необхідно видалити мінеральну олію, що покривала реакційну
суміш. Для цього в пробірку для ПЛР додають краплю хлороформу, пробірку
струшують і центрифугують при 12 000 g протягом 1 хв, щоб відокремити
водяну фазу, що містить ПЛР-продукти. Ампліфіковану; ДНК можна зберігати
з хлороформом при 4 °С протягом декількох тижнів. Для наступного аналізу
звичайно беруть від 1/10 до 1/5 обсягу реакційної суміші.

При використанні ДНК виділення з кліток крові підготовчі роботи не
проводяться.

Гель-електрофорез

Електрофорез в агарозном гелі дозволяє легко, без застосування
радіоізотопів, знайти ампліфіковану ДНК і визначити її розмір.
Зупинимося на деяких її особливостях стосовно аналізу ПЛР-ампліфікованої
ДНК. 10-20 мкл ампліфікованої ДНК розділяють у 2% агарозном гелі з
додаванням спеціального барвника ДНК, наприклад, бромистого етидія разом
зі стандартними фрагментами розміром 50-1000 п.н.  При заливанні за
допомогою гребінок у гелі формують спеціальні лунки, у які надалі
вносять продукти ампліфікації. При використанні ДНК виділеної з клітин
крові використовують 5 мкл ампліфікованої ДНК змішують з 3 мкл барвники
на парафилме і наносять у лунку.

Пластину гелю поміщають в апарат для горизонтального гель-електрофорезу
і підключають джерело постійної напруги. Негативно заряджена ДНК починає
рухатися в гелі від мінуса до плюса. При цьому більш короткі молекули
ДНК рухаються швидше, ніж довгі. На швидкість руху ДНК у гелі впливає
концентрація агарози, напруженість електричного поля, температура, склад
електрофорезного буфера і, у меншому ступені, ГЦ-склад ДНК. Усі молекули
одного розміру рухаються з однаковою швидкістю. Барвник вбудовується
(інтеркалірує) площинними групами в молекули ДНК. Після закінчення
електрофорезу, що продовжується від 10 хв. до 1 години, гель поміщають
на фільтр трансіллюмінатора, що випромінює світло в ультрафіолетовому
діапазоні (254 — 310 нм). Енергія ультрафіолету, що поглинається ДНК в
області 260 нм, передається на барвник, змушуючи його флуоресценувати в
оранжево-червоній області видимого спектра (590 нм).

Яскравість смуг продуктів ампліфікації може бути різною. Тому часто в
ПЛР-лабораторіях прийнято оцінювати результат по трьох- чотирьох чи
п’ятьох- бальній системі. Однак, як уже відзначалося раніше, це не можна
зв’язувати з початковою кількістю Днк-мішені в зразку. Часте зменшення
яскравості світіння смуг зв’язано зі зниженням ефективності ампліфікації
під впливом інгібіторів або інших факторів.

Електрофорез проводять при високій напрузі (10-15 В/див), оскільки
утворювані при ПЛР невеликі фрагменти складно детектувати після
електрофорезу протягом ночі при невеликій напрузі внаслідок їхньої
інтенсивної дифузії. Розділення можна підвищити, використовуючи
поліакриламідні або агарозні гелі NuSieve (FMC Bio-Products, Rockland,
USA) з високою концентрацією агарози (3-4%). Утім, якщо аналіз потрібно
провести швидко і при невеликих витратах, цілком прийнятні 2% агарозні
гелі.

Звичайно при ампліфікації ДНК, виділеної з фіксованих тканин, вихід
ПЛР-продуктів нижчий і вони менш специфічні, чим у випадку ампліфікації
високоочищеної ДНК.

 

Інструкція 1 по приготуванню агарозного гелю (50мол).

Агарозний гель складається з 1,8% агарози і 98,2% Трис-буфера.

Зважуємо агарозу (0,9г).

Переносимо агарозу в термостійку колбу.

Додаємо  50мол трис-буфера в колбу.

Установлюємо плашку, установлюємо гребінку на плашку.

Плавимо агорозу шляхом нагрівання в мікрохвильовій печі до одержання
однорідного розчину.

Додаємо барвник етидіум бромід у колбу і перемішуємо.

Заливаємо агарозний гель  на плашку.

Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Цей метод дозволяє ідентифікувати смуги в гелі, що спостерігаються після
електрофорезу ампліфікованої ДНК. Для гібридизації використовуються як
ізотопно, так і неізотопно мічені зонди. Докладно метод гібридизації
ПЛР-продуктів описаний у протоколі 1.

 

Протокол 1. Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Матеріали

• Буфер для денатурації: 1,5 М NaOH, 0,5 М NaCl

• Буфер для нейтралізації: 1,5 М трис-Нс1, 0,5 М NaCl, p 6,5

• 20 х SSPE: 3,6 М NaCl, 0,2 М фосфат натрію, 0,02 М ЄДТА, рН 7,4

• 10% (в/о) ДСН

Методика

1.Для денатурації фрагментів ДНК гель вимочують у буфері для денатурації
при обережному погойдуванні протягом 30 хв. при кімнатній температурі,
потім витримують у буфері для нейтралізації протягом 30 хв.

2. За цей час вимочують найлоновий фільтр для переносу ДНК у 6 х SSPE
протягом 5хв. (або довше). Ми використовуємо фільтри Genetrans 45
(Fiasco, Wolburn, Massachusetts, USA).

3. Збирають систему для переносу ДНК, і проводять перенос при кімнатній
температурі протягом ночі. Як буфер для переносу використовують 20 х
SSPE.

4. По закінченні переносу знімають фільтрувальний папір і відзначають
положення лунок на фільтрі. Фільтр знімають і для видалення прилиплої
агарози промивають у 20 х SSPE протягом 1 хв.

5. Пришивають ДНК до фільтра, помістивши останній (стороною з ДНК
нагору) на 5 хв під УФ-лампу (254 нм). Можна скористатися і спеціальним
приладом для пришивання ДНК (Stratagene, La Jolla, California, USA).

6. Поміщають фільтр у поліетиленовий пакет і запаюють його. Проводять
предгібридизацію при 42 0С протягом 10 хв. і гібридизацію з відповідним
міченим зондом при тій же температурі протягом 30-60 хв. Як зонд
звичайно використовують 5-мічені за допомогою полінукле-отидкінази
олігонуклеотиди.

7. Промивають фільтр у двох-трьох змінах 2 х SSPE, 0,1 % ДСН, по 5 хв. у
кожній зміні. Іноді на цьому етапі проводять відмивання й у більш
жорстких умовах, але необхідність цієї процедури визначають
експериментальним шляхом.

8. Гібридизований зонд виявляють за допомогою радіоавтографії або
неізотопними методами детекції.

Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Дот-блот-гібридизація дає просту відповідь по типу так-ні й особливо
корисна в тих випадках, коли проводиться аналіз великого числа зразків.
Один із прикладів застосування цього методу описаний у протоколі 2.

 

Протокол 2. Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Матеріали

• Розчин для денатурації: 0,4 М NaOH, 1 мм ЭДТА

• 20 х SSPE (див. протокол 15.7)

• Найлоновий фільтр

• Прилад для одержання дот-блотів

Методика

1. Вимочують найлоновий фільтр у дистильованій воді не менш 5 хв.

2.10-20 мкл ПЛР-ампліфікованої ДНК додають до 300 мкл. розчину для
денатурації (денатурація при цьому відбувається практично миттєво).

3. Кожен зразок вносять в окремий осередок приладу для одержання
дот-блотів; стежать за тим, щоб для усмоктування зразка з осередку було
потрібно близько 1 хв.

4. Промивають кожен осередок 20 х SSPE три рази по 5 хв.

5. Виймають фільтр із приладу й обполіскують його в 20 х SSPE.

6. Виконують операції, описані в протоколі 15.7, починаючи з п. 5.

Інтерпретація результатів

Результат ПЛР можна кваліфікувати як позитивний чи негативний у
залежності від того, виявлена в зразку інтересуюча нас мішень чи ні.
Однак порушення нормального ходу ампліфікації, недостатня чутливість
методу і непередбачений поліморфізм послідовності-мішені в області
зв’язування праймерів чи гібридизаційного зонда може дати помилково
негативний результат. У випадку забруднення зразків і випадкової
гомології між зондом, праймерами і послідовністю, подібною з мішенню,
виходять помилково негативні результати. Проблеми, що виникають у
зв’язку з перехресними реакціями за участю зонда або праймерів і
можливим поліморфізмом.

Вибір контролів

Дуже важливим для правильної інтерпретації результатів є вибір
контролів. Позитивні і негативні конт-ролі повинні бути добре
охарактеризовані. Часто використовують ДНК із клітинних ліній, що
завідомо містять чи не містять послідовність-мішень. У кожнім аналізі
потрібні як мінімум три контролі:

• позитивний контроль;

• негативний контроль;

• бланк-контроль.

Бланк-контроль — це реакційна суміш, у якій присутні усі компоненти, за
винятком ДНК; він є індикатором забруднень. Один тип позитивного
контролю повинний містити максимальне число послідовностей-мішеней,
інший — невелике їхнє число. Це дозволяє визначити чутливість і
ефективність ПЛР.

У деяких випадках ампліфікація взагалі не відбувається, і якщо є
підстави думати, що отриманий результат помилково негативний, дуже важко
визначити, по якій саме причині. Щоб вирішити цю проблему, кожен зразок
необхідно тестувати, провівши ампліфікацію якої-небудь геномної
послідовності, наприклад гена рецептора ліпопротеїнів низької щільності
або р-глобінового гена. При цьому розмір геномної послідовності-мішені
повинний бути небагато більший, ніж досліджуваний; це дозволить
переконатися, що ДНК зразка не занадто сильно деградована. При ПЛР
будь-якого зразка тканин людини геномна ДНК повинна ампліфікуватися.
Відсутність ампліфікації може означати інгібування ферменту, сильну
деградацію ДНК чи те, що її занадто мало. У цьому випадку треба
повторити ампліфікацію зразка, збільшивши і зменшивши кількість
ДНК-матриці або збільшивши концентрацію ДНК-полімерази Tag. Ампліфікація
може  бути відсутня незважаючи на всі прикладені зусилля. Це може бути
зв’язане із сильним некрозом досліджуваної тканини або фіксацією
препарату не в 10% формаліні, а в інших фіксаторах. У цьому випадку
єдиним виходом є повторна біопсія.

Геномні праймери можна використовувати в одному раунді ПЛР разом із
праймерами, специфічними у відношенні послідовності-мішені: ампліфікація
двох послідовностей йде при цьому одночасно (див. Протокол 4). Такий
множинний ПЛР-тест може бути менш чуттєвим, чим той, у якому
використовується один набір праймерів, але він виключає появу помилково
негативного результату.

Чутливість

Визначити чутливість ПЛР-методу стосовно аналізу фіксованих і залитих у
парафін препаратів досить складно. Це зв’язано з відсутністю добре
охарактеризованих катаних тканин з відомим змістом послідовності-мішені,
а чутливість методу при аналізі очищеної ДНК і ДНК, отриманої з
фіксованих формаліном тканин, за таких самих умовах помітно
розрізняється.

Однак у даний час існує можливість створювати штучні фіксовані тканини з
відомим змістом послідовності-мішені на основі добре охарактеризованих
клітинних ліній. Для цього змішують клітки, що містять потрібну
послідовність і не містять її, суміш фіксують у формаліні і заливають у
парафін. Отриманий блок нарізають і обробляють так само, як біоптати
тканин, проводять ПЛР і визначають чутливість методу. І хоча цей метод
не дозволяє визначити чутливість ПЛР-методу з такою високою точністю, як
цього хотілося б (див. нижче), він вказує напрямок до правильної
інтерпретації результатів.

Рис. 4. Чутливість ПЛР-аналіза, проведеного на фіксованих формаліном і
залитих у парафін тканин.

Суміш кліток Raji (приблизно 50 копій ДНК EBV на клітку) і Molt 3 (не
містять EBV) збирали центрифугування, фіксували в 10% забуференному
формаліні протягом 1 год. і заливали в парафінові блоки. Робили зрізи
товщиною 10 мкм, що містять приблизно по 1000 кліток, обробляли їх, і
проводили ПЛР-аналіз з використанням геномних і EBV-специфічних
праймерів. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою
дот-блот-гібридизації з геномним і EBV-специфічним зондами. Як і треба
було очікувати, гібридизація з геномним зондом відбувалася у всіх
клітинних сумішах, а з EBV-спецефічним спостерігалася тільки в суміші, у
якій частка кліток лінії Raji складала 0,01, але не 0,001 або 0,0001.
Таким чином, при тих умовах, у яких проводилася ПЛР, вдається виявити
приблизно 10 EBV-інфікованих клітин на 1000 нормальних (число клітин, з
яким проводився ПЛР-аналіз). Підвищити чутливість можна, змінивши умови
проведення ПЛР або використовуючи для аналіза більшу кількість клітин.

Кількісний ПЛР-аналіз

Логічно думати, що кількість утворюваних при ПЛР ДНК корелюється з
числом послідовностей-мішеней в аналізованому зразку. Однак так буває не
завжди. Часто такі виключення спостерігаються при роботі з препаратами
тканин, залитими в парафін: у цьому випадку число факторів, що впливають
на ефективність ампліфікації, особливо велике. Це може бути природа
тканини, спосіб фіксації і її тривалість, час, що пройшов від моменту
одержання тканини до її фіксації, «вік» парафінових блоків, розмір
зрізу, кількість виділеної і використаної для ПЛР ДНК.

Часто клінічні зразки отримують в умовах, далеких від оптимальних, що
теж утрудняє проведення кількісного аналізу, особливе визначення
абсолютної кількості послідовності-мішені. Для таких препаратів
розроблений простий відносний метод, заснований на ПЛР-аналізі декількох
розведень препарату ДНК. Для цього готують послідовні десятикратні
розведенням ДНК у воді і проводять ампліфікацію в умовах, що дозволяють
одержати максимальну чутливість; число циклів ПЛР при цьому може
досягати 50. Такий аналіз дозволяє оцінити мінімальне число
послідовностей-мішеней у препараті, оскільки при досить сильному
розведенні ампліфікація повинна припинитися. Якщо паралельно проводити
ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, то можна визначити
співвідношення між числом клітин і числом послідовностей-мішенів. При
відомому числі клітин у препараті (наприклад, у препараті СМЖ)
інтерпретацію результатів проводять так, як це описано в табл. 2.

 

Таблиця 2. Визначення чутливості методом розведення

Число ампліфікованих кліток Послідовність-мішень Геномна послідовність
Інтерпретація

100000 + + 1 мішень/100000 кліток

10000 + + 1 мішень/ 10000 кліток

1000 + + 1 мішень/ 1000 кліток

100 + + 1 мішень/ 100 кліток

10 + + 1 мішень/10 кліток

1 + + Мішень практично

у кожній клітці

0 — — Система працює нормально

 

  Точна кількість кліток в останніх розведеннях визначити неможливо
внаслідок  помилок у піпетуванні і пуассонівському розподілу числа
клітин. Геномні послідовності повинні ампліфікуватися і детектуватися на
рівні приблизно 1 клітини. У цьому випадку, якщо послідовність-мішень
міститься в 1% клітин, останнє розведення, що дає позитивний сигнал,
повинне відповідати 100 клітинам.

В даний час ПЛР-тести можна ставити тільки в спеціально оснащених
клінічних лабораторіях. Зразки тканин, одержувані при звичайних
хірургічних операціях, фіксують формаліном і заливають у парафін. Такі
препарати можна досліджувати методом ПЛР, що при необхідності дозволяє
провести молекулярно-генетичний аналіз без заморожування і збереження
препаратів.

Похожие записи