.

Взаємозв’язок інтенсивності проліферації і ліпідно-каротиноїдного обміну в клітинах Dunaliella Teod. та вплив ліпідно-каротиноїдних екстрактів на функ

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2630
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КОМАРИСТА ВІКТОРІЯ ПАВЛІВНА

УДК 577.123+577.125+612.35

ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК ІНТЕНСИВНОСТІ ПРОЛІФЕРАЦІЇ І
ЛІПІДНО-КАРОТИНОЇДНОГО ОБМІНУ В КЛІТИНАХ DUNALIELLA TEOD.
ТА ВПЛИВ ЛІПІДНО-КАРОТИНОЇДНИХ ЕКСТРАКТІВ НА
ФУНКЦІОНАЛЬНУ АКТИВНІСТЬ ГЕПАТОЦИТІВ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Харків – 1999

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в науково-дослідному інституті біології Харківського державного
університету Міністерства освіти України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Божков
Анатолій Іванович, завідувач відділом молекулярної біології та біо¬технології науково-
дослідного інституту біології Харківського дер¬жавного університету Міністерства
освіти України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Бондаренко Тетяна Петрівна, завідувач відділом біохімії і фармако¬логії
нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробіт¬ник
Іонов Ігор Анатолійович, завідувач відділом фізіології, біохімії та
харчування птахів Інституту птахівництва УААН, м. Борки

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України (лабораторія молекулярної
ге¬нетики), м. Київ.

Захист відбудеться ” 20 ” жовтня 1999 р. о 15-15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради
К 64.051.17 при Харківському державному університеті Міністерства освіти України за адресою:
310077, м. Харків, м. Свободи, 4, ауд. III-15.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського
державного університету Міністерства освіти України за адресою:
310077, м. Харків, м. Свободи, 4.

Автореферат розісланий ” 17 ” вересня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник Падалко В.І.

1
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Каротиноїди виявляються в клітинах бактерій, водоростей, грибів, вищих рослин, а також тварин (Liaaen-Jensen, 1977). Універсальний характер розповсюд¬ження цих сполук дозволяє припустити, що в клітинах таких різних організмів каротиноїди виконують схожі функції. Здатність поглинати світло певної довжини хвилі зумовлює функ¬цію цих сполук як пігментів, що надають колір тканинам організмів. Достатньо добре вив¬ченою є функція каротиноїдів як фоторецепторних молекул у фотосинтезуючих організмів та функція апокаротиноїдів в органах зору тварин (Бриттон, 1986). Каротиноїди є ліпо¬фільними і здатні зв’язувати молекулярний кисень і пероксидні радікали. Існують численні літературні дані про антиоксидантну дію каротиноїдів (Lavy et al., 1993), менш відомо про вплив каротиноїдів на стан біологічних мембран (Britton, 1995). Залишається недослідженим питання про взаємозв’язок обміну каротиноїдів з іншими метаболічними процесами в клі¬тині і процесом клітинного циклу, хоча відомо, що при окислювальній деградації молекул каротиноїдів утворюються речовини, що впливають на проліферацію, експресію геному та диференціацію клітин різних організмів: триспорові кислоти – у грибів, абсцизова кислота – у рослин, вітамін A та його аналоги – у тварин (Olson, 1993). З цієї точки зору дослідження взаємозв’язку інтенсивності проліферації клітин з обміном каротиноїдів і ліпідів має загальнобіологічне значення.
Деякі види водоростей і грибів мають здатність до надсинтезу і накопичення каро¬тиноїдів за певних умов культивування і можуть бути використаними як модельні об’єкти при дослідженні метаболізму і функцій каротиноїдів.
Водорості роду Dunaliella Teod. – організми, що легко культивуються і можуть бути використаними як джерело каротиноїдів та інших біологічно активних речовин на потребу медицини, харчової і косметичної промисловості. Незважаючи на численні дослідження, що були присвячені розробці технології промислового культивування Dunaliella, не вдається отримати стабільного виходу біомаси і -каротину. Це може бути пов’язано з функціо¬нальною гетерогенністю клітин в культурі та недостатньою дослідженістю структури попу¬ляції клітин Dunaliella в процесі росту культури та за різних умов культивування (Bozhkov, Menzyanova, 1995; Божков, Мензянова, 1997). Залишається не дослідженим взаємозв’язок інтенсивності проліферації і обміну каротиноїдів і ліпідів у клітинах водоростей роду Dunaliella. Знання взаємозв’язку між цими метаболічними системами дозволить розробити систему інтенсивного культивування водоростей з високим виходом каротиноїдів. Дослід¬ження останніх 5-ти років показали перспективність використання каротиноїдів, отриманих з Dunaliella, як лікарських препаратів. Однак, проведено лише поодинокі роботи, в яких досліджено фармакокінетику каротиноїдів та їхні антиоксидантні властивості, а
2
досліджень їхнього впливу на проліферацію і диференціацію клітин тварин дуже мало.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились у відділі молекулярної біології і біотехнології НДІ біології Харківського держуніверситету в межах теми “Дослідження механізмів дії ендогенних регуляторів білкової та ліпідної природи на проліферацію клітин тваринних і рослинних організмів та роль цих регуляторів в онто¬генетичній адаптації до екзогенних факторів довкілля” N ДР 0198U005803, яку включено до координаційного плану N16 “Механізми розвитку і старіння біологічних систем” за фаховим напрямком “Біологія” Міністерства освіти України.
Мета і задачі дослідження. Визначити взаємозв’язок метаболізму каротиноїдів з ліпід¬ним обміном і проліферативною активністю клітин, а також розробити режими культи¬вування каротиноносних мікроводоростей, що забезпечують здійснення надсинтезу кароти¬ноїдів. Для досягнення мети вирішували наступні задачі:
1. Визначити інтенсивність синтезу нуклеїнових кислот у двох видів мікроводоростей – Dunaliella salina Teod. і Dunaliella viridis Teod., що розрізняються за швидкістю проліферації, у періодичній культурі – моделі клітинної популяції з проліферативною активністю, що змі¬нюється з пливом часу;
2. Визначити склад, вміст у клітині і інтенсивність синтезу каротиноїдів і ліпідів у періо-дичній культурі мікроводорості D. salina, що має здатність до надсинтезу -каротину, і D. viridis, що не накопичує -каротин;
3. Визначити взаємозв’язок між концентрацією клітин в культурі, віком клітинної по-пуляції, освітленням і температурою культивування і накопиченням каротиноїдів і ліпідів у клітинах D. salina і D. viridis;
4. Визначити вплив ліпідно-каротиноїдних екстрактів мікроводоростей роду Dunaliella на деякі показники функціональної активності печінки (інтенсивність синтезу РНК і вміст ліпідів) при гепатиті і фіброзі печінки.
Наукова новизна одержаних результатів. На підставі одержаних результатів сформу-льовано робочу гіпотезу про існування базового та індукованого рівня каротиногенезу в клі¬тинах водоростей. Базовий рівень у більшій мірі знаходиться під генетичним контролем, але змінюючи умови культивування, можна індукувати каротиногенез, що знаходиться під епіге¬нетичним контролем. Комплексний вплив таких чинників, як початкова концентрація клі¬тин, температура і освітлення, пригнічує проліферацію клітин і індукує ліпо- і каротиногенез, при цьому вміст ліпідів і каротиноїдів збільшується в 2-4 рази в обох видів водоростей.
В процесі культивування клітин Dunaliella змінюється рівень синхронності проход-ження
3
клітинного циклу, і на 16-20-ту добу росту спостерігається найвища міра синхронізації клітинних циклів.
Показано, що швидкість поглинання неорганічного вуглецю, що був введений в куль-туральне середовище у формі NaH14CO3, клітинами D. salina і D. viridis зменшується з 4-ої до 24-ої доби росту культури. Це обумовлено зміненням складу і фізико-хімічних властивостей культурального середовища.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено біореактор закритого типу для масового культивування мікроводоростей роду Dunaliella (свідоцтво прав автора ПА N641).
Розроблено схему індукції надсинтезу каротиноїдів в клітинах Dunaliella, що дозволяє збільшити вихід -каротину в 2-4 рази в залежності від виду водорості. Одержані результати дозволяють запропонувати D. viridis поряд з D. salina як перспективного продуцента кароти-ноїдів і нейтральних ліпідів.
Одержано зразки ліпідно-каротиноїдних екстрактів Dunaliella, які рекомендовано для розробки гепатотропних лікарських препаратів.
Особистий внесок здобувача. Написання огляду літератури, експерименти з досліджен¬ня вмісту і швидкості синтезу нуклеїнових кислот, каротиноїдів і ліпідів в процесі росту куль¬тури, впливу концентрації клітин і віку культури на інтенсивність проліферації клітин, комплексного впливу концентрації клітин, освітлення і температури на вміст каротиноїдів і ліпідів в клітинах D. salina і D. viridis було проведено самостійно. Дослідження впливу зразків ліпідно-каротиноїдних екстрактів з D. viridis на функціональний стан клітин печінки щурів було проведено разом з науковим керівником. Аналіз та інтерпретацію одержаних результа¬тів було проведено самостійно.
Вибір об’єкта дослідження та умов культивування мікроводоростей було здійснено при співкерівництві доктора біологічних наук, професора Т.В. Догадиной.
Апробація результатів дисертації. Результати і основні положення роботи доповідалися на Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996) і наукових конференціях молодих учених біологічного факуль¬тету і науково-дослідного інституту біології Харківського державного університету в 1995 і 1996 роках.
Публикації. За результатами дисертаційної роботи було опубліковано 9 праць, з них – 4 статті і 1 свідоцтво прав автора.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу і розділів: огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень і їхнє обговорення, заключення і висновки, а також переліку цитованої літератури з 204 найменувань. Роботу викладено на 150 сторінках друкованого тексту, вона містить 2 таблиці і 25 рисунків.

4
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Альгологічно чисті культури Dunaliella salina ssp. salina f. magna IBASU-A N11 і D. viridis var. viridis f. euchlora IBASU-A N29 (Index of cultures…, 1991) вели на рідкому середо¬вищі Артарі в модифікації Масюк (1973) в скляних конічних колбах на 500 мл (шар суспензії не більш 1,5 см завтовшки). Пересів культур здійснювали кожні 3 тижнi (стаціонарна фаза росту), розводячи їх свіжим культуральним середовищем до концентрації клітин близько 1,5 млн./мл. Для проведення досліджень культури пересіювали в конічні колби, ємністю 100 мл по 25 мл суспензії в колбу (шар 1 см завтовшки). Кількість клітин в одиниці об’єму середо¬вища лічили під мікроскопом в камері Горяєва або визначали за поглинанням суспензії при 550 нм на спектрофотометрі СФ-46 і розраховували за калібровочною кривою.
Перед внесенням мічених попередників концентрацію клітин вирівнювали до 12,5 млн. клітин в 1 мл. Наявність мертвих клітин контролювали за забарвленням трипановим синім. В 19 мл такої культури вносили 1,5 МБк NaH14CO3 або 1 МБк [3Н]тимідина. Культури інку¬бували за освітлення 6,5 клк від 4-х ламп ЛБ-40 і температури 26-28 C протягом 1 години. Потім культури охолоджували і відмивали клітини від радіоактивного попередника охолод¬женим культуральним середовищем.
Клітини відділяли від культуральної рідини центрифугуванням за 3000 g протягом 10 хв. Пігменти і ліпіди екстрагували за Фолчем (Кейтс, 1975). Екстракти розділяли методом ТШХ на пластинах Silufol (Czechoslovakia) в системах гексан:етиловий ефір (4:1, за об’ємом) і гексан:бензол:ацетон (1:1:1, за об’ємом). Фракції -каротину і лютеїну ідентифікували за допомогою свідків. Пігменти елюювали сумішшю хлороформ:метанол (2:1, за об’ємом) і визначали кількісно за довжини хвилі, що відповідає максимуму поглинання пігменту в на¬даній суміші розчинників: -каротин – за 440 нм, лютеїн – за 460 нм, ксантофіли віола¬ксантинового циклу – за 420 нм. Вміст пігментів розраховували в пкг на клітину водоростей. Хроматограми проявляли в парах йоду, фракції нейтральних ліпідів ідентифікували за допомогою свідків і елюювали сумішшю хлороформ:метанол (1:1, за об’ємом). Ліпіди визна¬чали кількісно як описано в роботі (Грибанов, Сергеев, 1975). Розрахунок проводили в пкг на клітину водоростей.
Осад після екстракції пігментів і ліпідів двічі промивали 5% HClO4 і проводили гідро¬ліз нуклеїнових кислот (Губарь и др., 1986). Нуклеїнові кислоти визначали за поглинанням гідролізатів при 270 і 290 нм (Спирин, 1958) і розраховували їхній вміст в пкг на клітину водоростей. Осад після гідролізу нуклеїнових кислот розчиняли в 2 мл 1N NaOH і визначали білки за методом Лоурі (Lowry et al., 1957).
Для визначення поглинання мічених попередників клітинами їх руйнували в розчині такого
5
складу: 0,5% тритон Х-100, 0,02М Tris-HCl рН 7,0, 0,0044М ЕДТА протягом 30 хв за кімнатної температури. Проби підкислювали HClO4 до 5%, залишали на 12 годин за 0 С, а потім центрифугували за 3000g. Надосадову рідину, що містила низькомолекулярні компоненти клітин, промивали хлороформом, а осад, що містив високомолекулярні компо¬ненти, – сумішшю хлороформ:метанол (1:2, за об’ємом). У фракції низькомолекулярних ком¬понентів клітин визначали кількість матеріалу, поглинаючого за 270 і 290 нм.
Аліквоти елюатів пігментів і ліпідів, гідролізатів нуклеїнових кислот і низькомоле¬кулярних попередників вносили в сцинтиляційні флакони з діоксановим сцинтилятором (5 г РРО, 250 мг РОРОР, 100 г нафталіну на 1000 мл діоксану) і лічили на сцинтиляційному -спектрометрі Вeckman LS-7800 (USA). Гідролізати ДНК перед внесенням у флакони нейтра¬лізували 60% КОН. Розраховували питому радіоактивність (тис. імп. в хв на мг речовини). Експерименти з дослідження впливу біомаси і пігмент-ліпідного екстракту D. viridis проводили на тримісячних самцях щурів лінії Wistar. Для моделювання гепатиту одну групу тварин піддавали локальній гіпертермії печінки як описано (Божков, Скляр, 1993). Іншій групі тварин для моделювання фіброзу печінки внутрішньочеревно вводили сірчанокислу мідь, яку готували на фізіологічному розчині безпосередньо перед введенням, в дозі 1 мг на 100 г маси тварини 3 рази з інтервалом 48 годин. Тварини кожної експериментальної групи одержували внутрішньошлунково гліцерин, біомасу або екстракт D. viridis, ресуспендовані в гліцерині з розрахунку 0,2 мг -каротину на 100 г маси тварини. Тварини з експеримен¬тальним гепатитом одержували препарати відразу після операції і далі протягом 2 діб (3 введення). Тварини з фіброзом печінки починали одержувати препарати наступної доби після останнього введення сірчанокислої міді і одержували їх протягом 5 діб (5 введень).
Через добу після останнього введення щурам вводили внутрішньочеревно по 2 МБк [14C]оротової кислоти на 100 г маси тварини і через 20 хв забивали їх декапітацією. Під час забивання збирали кров і відділяли сироватку. Печінку перфузували холодним 0,9% NaCl і гомогенізували в реактиві А (0,25М сахароза, 5мМ МgCl2, 50мМ КСl, 25мМ Tris-НСl, рH 7,5). Субклітинні фракції одержували диференціальним центрифугуванням гомогенату. Постмікросомальну фракцію використовували як фракцію цитозолю. В осадах ядер і алі¬квотах субклітинних фракцій визначали питому радіоактивність РНК, в аліквотах цитозолю і мікросом клітин печінки і сироватки крові визначали вміст ліпідів і білка, використовуючи ті ж самі методи, що і для клітин водоростей. Вміст ліпідів розраховували в мкг на 1 мг білка.
Одержані результати оброблювали статистично, використовуючи не¬параметричні методи аналізу (Гублер, 1978).

6
ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Інтенсивність синтезу і вміст нуклеїнових кислот у водоростей роду Dunaliella Teod. в процесі періодичного культивування. Суперечливі відомості, що є в літературі, про зв’язок проліферації клітин Dunaliella з ліпідно-каротиноїдним обміном було одержано на підставі даних щодо динаміки росту без урахування гетерогенності клітинних культур за функціо¬нальним станом клітин. Перше ніж використовувати періодичну культуру Dunaliella для рі¬шення задач, що поставлено в роботі, необхідно оцінити функціональну гетерогенність клі¬тин у ній. Чутливим та інформативним показником функціональної гетерогенності і пролі¬феративної активності клітин може бути швидкість синтезу нуклеїнових кислот, оскільки їхній синтез є віднесеним до стадій клітинного циклу, відображає спрямованість загального метаболізму клітин і має виражену часову характеристику.
Інтенсивність мічення ДНК радіоактивним попередником NaH14CO3 в процесі культи-вування D. salina і D. viridis була найбільшою в 4-х добової культури, різко зменшувалася на 8-12-ту добу росту культур, з незначним збільшенням цього показника на 16-20-ту добу, і знов зменшувалася в клітинах 24-х добових культур. Визначення питомої радіоактивності РНК в культурах різного віку показало, що швидкість її синтезу зменшувалася з 4-ої до 8-12-ої доби росту в 2 рази. Однак, надалі цей показник майже лінійно зменшувався до 24-ої доби культивування (рис. 1). Результати оцінки швидкості синтезу ДНК в процесі культи¬вування водоростей і, зокрема, різке її зменшення на 8-12-ту добу росту, виявилися несподі¬ваними, оскільки вони не збігалися з достатньо великою швидкістю росту культури в цей пе¬ріод. Це протиріччя було пов’язано з тим, що гідрокарбонат натрію з різною швидкістю включався в клітини культур різного віку (рис. 1).

Рис. 1. Питома радіоактивність ДНК (1), РНК (2) і внутрішньо¬клітинного пула попередників ну¬клеїнових кислот (3) в клітинах D. salina (а) і D. viridis (б) через 60 хв після внесення NaH14CO3 до культур без попереднього змінення культу¬рального середовища

Згідно даних літератури розчинений CO2 є переважною формою неорганічного вугле¬цю, яку поглинають клітини Dunaliella (Масюк, 1965). Рівновага між H14CO3– і продуктом його

7
гідролізу 14CO2, яка встановлюється в культуральній рідині після внесення NaH14CO3, залежить від
pH культуральної рідини. Можна чекати, що експериментальне змінення куль¬турального середовища вплине на внутрішньоклітинний вміст H14CO3. Видалення культу¬рального середовища і перенесення клітин 4, 8, 12, 16, 20, 24-ти добових культур на свіже середовище приводило до практично однакового включення іонів гідрокарбонату в клітини. В разі однакового рівня пула мічених попередників синтез ДНК здійснювався з найбільшою швидкістю в клітинах 16-ти добових культур D. salina і D. viridis. Надалі, із збільшенням стро¬ків культивування, інтенсивність синтезу ДНК в клітинах D. salina і D. viridis декілька змен¬шувалася, однак залишалася значно вищою ніж в 4-8-ми добових культур (рис. 2). Швидкість синтезу РНК в процесі культивування за незмінного рівня пула мічених попередників спів¬падала за характером з такою ДНК (рис. 2). При цьому швидкість синтезу РНК була як і в першому разі значно (в 10 разів) менше порівняно з швидкістю синтезу ДНК.

Рис. 2. Питома радіоактив¬ність ДНК (1), РНК (2) і внутріш¬ньоклітинного пула попередників нуклеїнових кислот (3) в клітинах D. salina (а) і D. viridis (б) через 60 хв після внесення NaH14CO3 до куль¬тур різного віку, що були переве¬деними на свіже середовище Артарі

Одержані результати свідчать про те, що в процесі періодичного культивування кліти¬ни розрізнялися за їхньою функціональною активністю і 16-ти – 20-ти добова культура D. salina і D. viridis є найбільш однорідною за проліферативною і функціональною активністю клітин. Таким чином, в процесі періодичного культивування існують етапи відносної син¬хронізації функціонального стану клітин, тобто одночасного синтезу ДНК і РНК в основній масі клітин. Необхідно відмітити, що з віком культури водоростей роду Dunaliella різко падає швидкість включення Н14СО3 в клітини і в значній мірі це обумовлено впливом культураль¬ного середовища на ці процеси.
Ліпідно-каротиноїдний обмін в клітинах мікроводоростей роду Dunaliella Teod. в процесі періодичного культивування. В наступній серії експериментів досліджували динаміку
8
вмісту каротиноїдних пігментів в клітинах D. salina і D. viridis в процесі періодичного культиву-вання. В наших експериментах каротиноїди, екстраговані з клітин D. salina і D. viridis, розподілялися на 6 фракцій методом тонкошарової хроматографії в системі гексан:бен¬зол:ацетон (1:1:1). Кількісний аналіз одержаних фракцій показав, що на лютеїн припадає більш половини від усіх каротиноїдів (69 і 57 % у D. salina і D. viridis, відповідно), а на сумарну фракцію ксантофілів віолаксантинового циклу – біля 20 % (21 і 19 % відповідно у D. salina і D. viridis). Вміст -каротину у D. salina змінювався більш ніж в 3 рази з 4-ої до 24-ої доби росту. Вміст -каротину в процесі росту культури D. viridis залишався незмінним і був в 2 рази менше порівняно з D. salina з 4-ої до 16-ої доби росту (рис. 3).

Рис. 3. Вміст -каротину (1), лютеїну (2) і ксантофілів віола¬ксантинового циклу (3) в процесі періодичного культивування клітин D. salina (а) і D. viridis (б)

Порівняння кривих динаміки синтезу ДНК (рис. 2) і вмісту -каротину (рис. 3) в процесі росту періодичної культури показало, що у D. salina на початкових стадіях культи¬вування (4-та-8-ма доба росту) спостерігається пряма кореляція між швидкістю синтезу ДНК і вмістом каротиноїдів. Надалі (12-та-16-та доба) характер залежності між швидкістю синтезу ДНК і метаболізмом каротиноїдів змінювався на протилежний – зменшення інтенсивності проліфераціі супроводжується накопиченням -каротину, а збільшення інтенсивності пролі¬фераціі – зменшенням вмісту-каротину. У D. viridis на тлі змінення інтенсивності проліфе¬раціі в процесі культивування вміст -каротину залишається постійним.
Можна припустити, що нелінійна динаміка вмісту -каротину в клітинах D. salina пов’язана з використанням пула попередників каротиноїдів, зокрема ацетилKoA, на синтез інших продуктів, наприклад нейтральних ліпідів, або з метаболічними перетвореннями само¬го -каротину, наприклад, в інші каротиноїди. Вміст лютеїну і сумарної фракції ксантофілів змінювався нелінійно в процесі росту культур обох видів водоростей. Співвідношення фрак¬цій каротиноїдів також варіювало
9
(рис. 3). Було виявлено, що в клітинах D. salina і D. viridis до 55% від суми нейтральних ліпідів (триацилгліцериди, стероїди і неетерифіковані жирні кислоти) припадає на неетерифіковані жирні кислоти. В клітинах D. salina містилося в 1,3-1,5 рази більш нейтральних ліпідів порівняно з D. viridis. В процесі культивування клітин водо¬ростей вміст досліджуваних фракцій ліпідів залишався незмінним (рис. 4). Таким чином, вміст каротиноїдів в процесі росту культури водоростей не корелював із вмістом нейтраль¬них ліпідів в їхніх клітинах. Можна вважати, що виявлений нелінійний характер змінення вмісту каротиноїдів в процесі культивування є пов’язаним зі зміненням інтенсивності їхнього синтезу і не залежить від синтезу ліпідів.

Рис. 4. Вміст неетерифікованих жирних кислот (1), триацилгліцеридів (2) і стероїдів (3) в клітинах D. salina (a) і D. viridis (б) в процесі періодич¬ного культивування

В наступній серії експериментів визначали швидкість синтезу фракцій каротиноїдів, про яку судили за включенням радіоактивного вуглецю до складу каротиноїдів при годинній експозиції з NaH14CO3. З найбільшою швидкістю радіоактивна мітка включалася до-каротину. Так, його синтез в 4-х добовій культурі D. salina здійснювався в 6,3 рази швидче порівняно з лютеїном і в 3,8 рази швидче порівняно з рештою фракцій каротиноїдів. Для D. viridis ця різниця була декілька меншою – в 5,0 і 2,0 рази відповідно. Лінійне зменшення питомої радіоактивності в процесі культивування пов’язано зі зменшенням пула мічених попередників (H14CO3) в клітині в процесі культивування. Динаміка питомої радіоактив¬ності різних фракцій каротиноїдів була різною на однаковому тлі зменшення внутрішньо¬клітинного пула мічених попередників каротиноїдів в процесі росту культури. Так, питома радіоактивність -каротину майже лінійно зменшувалася з 4-х до 24-ої доби росту. Питома радіоактивність лютеїну і сумарної фракції ксантофілів зменшувалася до 12-14-ої доби і нада¬лі не змінювалася або ж збільшувалася, що свідчить про змінення швидкості синтезу цих фракцій каротиноїдів в процесі культивування (рис. 5).
Таким чином, -каротин є найактивнішим обмінюваним каротиноїдним пігментом в клітині Dunaliella. Для кожної з досліджуваних фракцій каротиноїдів був виявлений індиві-дуальний характер змінення їхнього вмісту і швидкості синтезу в процесі культивування, і він
10
розрізнявся у D. salina і D. viridis. Каротиноїдний обмін є варіабельним показником, що змінюється в процесі культивування водоростей і його зв’язок з інтенсивністю проліферації клітин в культурі не є однозначним. Це вказує на те, що він залежить від різноманітних чин¬ників, що змінювалися в процесі росту культури, тобто контролюється не тільки генетично, але і епігенетично.

Рис. 5. Питома радіоактивність -каротину (1), лютеїну (2) і ксанто¬філів віолаксантинового циклу (3) в процесі періодичного культи¬вування клітин D. salina (a) і D. viridis (б)

Вплив концентрації клітин і віку культури на динаміку росту і ліпідно-каротиноїдний обмін в клітинах Dunaliella Teod. В процесі росту культури в періодичному режимі безперерв¬но змінюються такі параметри як концентрація клітин, функціональний стан клітинної по¬пуляції, склад культуральної рідини. Змінення комплексу цих параметрів в свою чергу буде впливати на метаболізм клітини, і зокрема, на ліпо- і каротиногенез.
Швидкість поділу клітин Dunaliella залежала від початкової концентрації клітин в культурі. Найбільший приріст числа клітин спостерігався за початкової концентрації 2,5 млн. клітин в 1 мл культурального середовища. Подальше збільшення початкової концент¬рації клітин призводило до пригнічення росту культури. Далі визначали вплив концентрації клітин в культурі на вміст -каротину. Для цього клітини з 4-х, 8-ми, 12-ти, 16-ти, 20-ти і 24-х добових культур пересіювали на свіже культуральне середовище таким чином, щоб почат¬кова концентрація становила близько 5, 15 і 20 млн./мл і через 4 доби росту за освітлення 6,5 клк і температури 27-30 C визначали вміст -каротину в клітинах. За таких високих концентрацій клітин в середовищі вміст -каротину збільшувався майже в 2 рази як в кліти¬нах D. salina, так і D. viridis порівняно з концентрацією клітин 1,3 млн./мл (рис. 6). Важливим є те, що за таких концентрацій клітин в культурі не спостерігалося приросту кількості клітин і міжвидових різниць, а також різниць, пов’язанних з віком культури, які були характерними для стандартних умов культивування (рис. 3). Це свідчить про
11
високу метаболічну варіабельність каротиногенезу в клітинах водоростей і особливо – D. viridis. Одночасне збільшення освітлення до 8 клк і температури до 38-40 C за високих концентрацій клітин в культурі не призводило до загибелі культури і супроводжувалося підвищенням вмісту -каротину в клітинах D. salina і D. viridis, при цьому зберігався зв’язок цього показника з концентрацією клітин при пересіві (рис. 6).

Рис. 6. Вміст -каротину на 4-ту добу росту клітин D. salina і D. viridis за освітлення 6,5 клк і тем¬ператури 25-27 С (), і освітлення 8,0 клк і температури 38-40 С () за початкової концентрації клітин 4-6 млн./мл (1), 10-14 млн./мл (2) і 18-20 млн./мл (3)

Таким чином, збільшуючи концентрацію клітин, освітлення до 8 клк і температуру культивування до 38-40 C вдалося значно збільшити вміст -каротину в клітинах D. salina і D. viridis, при цьому міжвидова різниця ліквідувалася.
Ще більш варіабельним виявився вміст нейтральних ліпідів в клітинах водоростей за означених умов культивування. Змінення концентрації клітин не впливало на вміст нейт¬ральних ліпідів в клітинах D. salina і D. viridis. Однак, збільшення освітлення і температури культивування супроводжувалося значним збільшенням вмісту стероїдів – в 2,0-3,0 рази, неетерифікованих жирних кислот – в 2-4 рази, триацилгліцеридів і ефірів стероїдів – також в 2-3 рази. Необхідно відмітити, що за збільшення освітлення і температури культивування найбільший вміст ліпідів в клітинах виявлявся у випадку великих концентрацій клітин (рис. 7). Таким чином, комплексне збільшення концентрації клітин, освітлення і температури під час культивування супроводжувалося найбільшим підвищенням вмісту нейтральних ліпідів.

Рис. 7. Вміст не¬етерифікованих жир¬них кислот (I), триацилгліце¬ридів (II), стероїдів (III) і ефірів стероїдів (IV) на 4-ту добу росту D. salina (а) і D. viridis (б) за освітлення 6,5 клк і температури 25-27 С (), і освітлення 8,0 клк і температури 38-40 С () за початкової концентра¬ції клітин 4-6 млн./мл (1), 10-14 млн./мл (2) і 18-20 млн./мл (3)

12
Необхідно відмітити, що D. salina і D. viridis за стандартних умов культивування розріз¬няються між собою за вмістом каротиноїдів і ліпідів в 1,5-2 рази. Комплексний вплив таких чинників як початкова концентрація клітин, температура і освітлення індукують ліпо- і каро¬тиногенез, при цьому вміст ліпідів і каротиноїдів збільшується в 2-4 рази в обох видів водо¬ростей.
На підставі одержаних даних можна сформулювати робочу гіпотезу про існування базового і індукованого рівня каротиногенезу в клітинах водоростей. Базовий рівень спо¬стерігається в оптимальних умовах культивування. Для базового рівня характерною є пряма кореляція інтенсивності проліферації з вмістом каротиноїдів у клітині і відсутність зв’язку з накопиченням нейтральних ліпідів. Для індукованого рівня характерною є зворотна кореля¬ція з інтенсивністю проліфераціі і пряма – з накопиченням нейтральних ліпідів. Необхідно відмітити, що обидва досліджуваних види Dunaliella за визначених умов культивування можуть бути перспективними продуцентами каротиноїдів і ліпідів.
Вплив біомаси і хлорофіл-каротиноїдного екстракту Dunaliella viridis Teod. на синтез РНК в клітинах печінки щурів з експериментальним гепатитом. Жиророзчинний комплекс (хлорофіл-каротиноїдна паста) з хвої сосни, ялини і піхти давно використовується в терапії ран і запалювальних хвороб (Фролов и др., 1969). Хлорофіл-каротиноїдна паста з синьо¬зелених водоростей прискорювала загоєння експериментальних термічних опіків у кролів (Сакевич, 1985). Біомаса Dunaliella є нетоксичною для тварин навіть при тривалому вжи¬ванні per os (Mokady et al., 1989), і може виявитися ефективною в терапії захворювань внутрішних органів. В наступній серії експериментів досліджували вплив біомаси і хлорофіл-каротиноїдного екстракту D. viridis на швидкість синтезу і транспорту РНК в клітинах печін¬ки щурів на двох моделях ураження печінки – експериментального гепатиту і фіброзу печінки.
На 4-ту добу після локальної гіпертермії печінки щурів швидкість синтезу РНК в ядрах була в 1,8 рази вищою порівняно з інтактними тваринами (рис. 8). Активація синтезу РНК в клітинах печінки щурів після локальної гіпертермії є наслідком регенеративних процесів в

Рис. 8. Питома радіоактив¬ність РНК ядер (I), цитозолю (II) і мікросом (III) клітин печінки інтакт¬них щурів (а), щурів з експеримен¬тальним гепатитом (б), щурів з експе-риментальним гепатитом, що одержу¬вали зразки біомаси (в) або екстракту (г) Dunaliella viridis протягом 3-х діб після локальної гіпертермії печінки

печінці. Введення біомаси D. viridis тваринам після локальної гіпертермії привело до того, що на
13
4-ту добу після операції питома радіоактивність РНК ядер була всього в 1,3 рази вищою, ніж питома радіоактивність РНК ядер клітин печінки інтактних тварин (рис. 8), тобто вве¬дення біомаси привело до наближення даного показника до норми. Введення екстракту не¬значно зменшувало питому радіоактивність РНК ядер клітин печінки щурів з експери¬ментальним гепатитом (рис. 8).
Питома радіоактивність РНК цитозолю клітин печінки щурів зросла порівняно з інтактними щурами як і РНК ядер в 1,8 рази, що свідчить про те, що швидкість транспорту новосинтезованої РНК до цитоплазми зросла пропорційно швидкості синтезу РНК після локальної гіпертермії. Питома радіоактивність РНК фракції мікросом збільшилася в меншій мірі – в 1,4 рази. Можливо, ця фракція РНК, що представлена в основному рРНК і входить до складу рiбосом, зв’язаних з мембранами ЕПР, обмінюється повільніше, ніж РНК цитозолю (рис. 8). Введення зразків біомаси приводило до нормалізації також і цих показників. Питома радіоактивність РНК цитозолю і мікросом була в цьому варіанті лише в 1,3 рази вищою, ніж в інтактних тварин (рис. 8). Зразок екстракту іншим чином впливав на досліджувані показники порівняно зі зразком біомаси D. viridis. Питома радіоактивність РНК цитозолю і мікросом була вищою в 1,9 рази, ніж в інтактних тварин (рис. 8), тоді як питома радіоактивність РНК ядер – вищою в 1,6 рази. Це свідчить про значне збільшення швидкості транспорту новосинтезованої РНК до цитоплазми і швидкості синтезу і/або транспорту рРНК, зв’язаної з мікросомами, а також про змінення часового характеру процесів синтезу і транспорту РНК в клітинах печінки. Різний характер дії зразків біомаси і екстракту D. viridis на питому радіоактивність РНК печінки щурів обумовлений різницею їхнього складу. Цільна біомаса водоростей крім комплексу ліпофільних речовин містить водорозчинні компоненти клітин, що також можуть мати біологічну активність, і білки, які, створюючи комплекси з ліпофільними компонентами, можуть впливати на їхню стабільність і біодоступність.
На 6-ту добу після останнього введення сірчанокислої міді питома радіоактивність РНК субклітинних фракцій клітин печінки щурів, що одержували як гліцерин, так і обидва зразки, не відрізнялася від відповідних показників інтактних тварин. Ліпідний склад цитозолю клітин печінки і сироватки крові у всіх групах тварин не розрізнявся. На 6-ту добу після триразового введення сірчанокислої міді спостерігалося 20%-е зменшення вмісту триацилгліцеридів в мікросомах клітин печінки. Жоден з досліджуваних зразків не приводив до відновлення цього показника.
Таким чином, зразки як біомаси, так і екстракту D. viridis впливали на питому радіо-активність РНК субклітинних фракцій клітин печінки щурів на 4-ту добу після локальної гіпертермії печінки. Триразове введення біомаси D. viridis приводило до зменшення питомої радіоактивності РНК всіх досліджуваних субклітинних фракцій порівняно з тваринами, що одержували гліцерин протягом 3-х діб після операції. Екстракт незначно зменшував питому
14
радіоактивність РНК ядер, але при цьому приводив до збільшення питомої радіоактивності РНК цитозолю і мікросом.
ВИСНОВКИ

1. В процесі культивування клітин Dunaliella змінюється інтенсивність синтезу нуклеї-нових кислот, а на 16-ту-20-ту добу спостерігається відносна синхронізація процесів проліфе¬рації клітин в культурі.
2. В процесі культивування клітин Dunaliella зменшується швидкість поглинання міче¬ного H14CO3, що пов’язано зі зміненням фізико-хімічних властивостей культуральної рідини.
3. В оптимальних умовах культивування (25 C, круглодобове освітлення, 6 клк) в клітинах D. salina містилося в 2 рази більше каротиноїдів і в 1,5 рази більше нейтральних ліпідів порівняно з D. viridis. В клітинах D. salina і D. viridis близько 55% від усіх нейтральних ліпідів припадає на неетерифіковані жирні кислоти. Виявлено існування базового рівня вмісту каротиноїдів.
4. За швидкістю синтезу каротиноїди D. salina і D. viridis розташовуються в такій послідовності: -каротин>ксантофіли віолаксантинового циклу>лютеїн. На базовому рівні вміст -каротину в клітинах D. viridis залишається незмінним в процесі культивування, а в клітинах D. salina – змінюється ритмічно.
5. На початкових стадіях культивування D. salina (4-та-8-ма доба росту) спостерігається пряма кореляція між швидкістю синтезу ДНК і вмістом каротиноїдів. Надалі (12-та-16-та доба) характер залежності між швидкістю синтезу ДНК і метаболізмом каротиноїдів змінюється на протилежний.
6. Швидкість поділу клітин Dunaliella залежить від початкової концентрації клітин в культурі. Найбільший приріст кількості клітин спостерігається за початкової концентрації 2,5 млн. клітин в 1 мл культурального середовища.
7. Інгибування росту культури Dunaliella збільшенням концентрації клітин до 10 млн./мл і збільшення освітлення до 8 клк і температури культивування до 38-40 C супро¬воджувалося збільшенням вмісту -каротину в клітинах D. salina і D. viridis в 2-3 рази, стероїдів – в 2-3 рази, неетерифікованих жирних кислот – в 2-4 рази, триацилгліцеридів і ефі¬рів стероїдів – в 2-3 рази. Таким чином, був виявлений індукований рівень синтезу -каротину в клітинах Dunaliella, за якого видова різниця між D. salina і D. viridis за вмістом каротиноїдів і нейтральних ліпідів повністю ліквідувалася.
8. Зразки біомаси і ліпідно-каротиноїдного екстракту D. viridis впливають на процеси синтезу і транспорту РНК в клітинах печінки щурів з експериментальним гепатитом і мо¬жуть бути рекомендованими для розробки гепатотропних лікарських препаратів.
15
СПИСОК ПРАЦЬ. ЩО ВІДОБРАЖАЮТЬ
ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хомяков Г.В., Догадина Т.В., Комаристая В.П. Действие сублетальных доз ионов меди на культуру Dunaliella viridis Teod. (Chlorophyta) // Альгология. – 1994. – Т. 4, N4. – С. 30-35.
2. Комаристая В.П., Божков А.И., Догадина Т.В. Интенсивность синтеза нуклеиновых кислот у водорослей рода Dunaliella Teod. в процессе периодического культивирования // Альгология. – 1997. – Т. 7, N4. – С. 350-357.
3. Комаристая В.П. Влияние исходной концентрации клеток и возраста культуры на динамику роста и накопление -каротина в клетках Dunaliella viridis Teod. // Биологический вестник. – 1997. – Т. 1, N1. – С. 100-106.
4. Комаристая В.П. Влияние биомассы и хлорофилл-каротиноидного экстракта Dunaliella viridis Teod. на синтез РНК в клетках печени крыс с экспериментальным гепатитом и фиброзом печени // Биологический вестник. – 1998. – Т.2, N1. – С. 57-60.
5. Божков А.И., Мензянова Н.Г., Комаристая В.П. Массовое культивирование микро-водорослей и получение биомассы определенного состава. // Свідоцтво про державну реєст¬рацію прав автора на твір ПА N641. Зареєстровано в Державному агентстві України з ав¬торських і суміжних прав 30 липня 1997 року. – 9 с.
6. Комаристая В.П. Влияние разных доз ионов меди на экскрецию белков клетками водорослей Dunaliella viridis Teod. // Актуальні питання ботаніки і екології. Конференція молодих учених і спеціалістів, (19-21 жовтня 1993, Ялта). Тези доповідей. – Київ, 1993. – с. 61.
7. Комаристая В.П. Влияние темнового периода на выход биомассы и -каротина у двух видов Dunaliella Teod. // Материалы научной конференции молодых ученых биологи¬ческого факультета и научно-исследовательского института биологии. – Харьков, 1996. – с. 30.
8. Комаристая В.П. Зависимость динамики роста культур одноклеточных водорослей от популяционного возраста исходной культуры // Материалы научной конференции молодых ученых биологического факультета и научно-исследовательского института биологии. – Харьков, 1996. – с. 27-28.
9. Комаристая В.П. Зависимость скорости роста культуры одноклеточных организмов после пересева от возраста исходной культуры // Біологічні механізми старіння. Міжнародний сімпозіум (15-17 травня 1996 року), тези доповідей. – Харків, 1996. – с. 75.

16
АНОТАЦІЯ

Комариста В.П. Взаємозв’язок інтенсивності проліферації і ліпідно-каротиноїдного обміну в клітинах Dunaliella Teod. та вплив ліпідно-каротиноїдних екстрактів на функціо¬нальну активність гепатоцитів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціаль¬ністю 03.00.04 – біохімія. – Харківський державний університет Міністерства освіти України, Харків, 1999.
Дисертацію присвячено дослідженню взаємозв’язку метаболізму каротиноїдів, ліпідів і проліферації клітин Dunaliella, а також впливу ліпідно-каротиноїдних екстрактів цих мікро-водоростей на функціональну активність печінки при гепатиті і фіброзі. Сформульовано гі¬потезу базового та індукованого рівня каротиногенезу в клітинах водоростей. Для базового рівня характерною є пряма кореляція інтенсивності проліфераціі з вмістом каротиноїдів у клітині, для індукованого – зворотна кореляція з інтенсивністю проліфераціі і пряма – з нако¬пиченням нейтральних ліпідів. Зразки біомаси і екстракту D. viridis впливають на синтез і транспорт РНК в клітинах печінки щурів з гепатитом і рекомендуються для розробки ге¬патотропних препаратів.
Ключові слова: Dunaliella, проліферація, каротиноїди, нейтральні ліпіди, гепатит, фіброз печінки.

АННОТАЦИЯ

Комаристая В.П. Взаимосвязь интенсивности пролиферации и липидно-кароти¬ноидного обмена в клетках Dunaliella Teod. и влияние липидно-каротиноидных экстрактов на функциональную активность гепатоцитов. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специ-альности 03.00.04 – биохимия. – Харьковский государственный университет Министерства образования Украины, Харьков, 1999.
Диссертация посвящена исследованию взаимосвязи метаболизма каротиноидов, липи¬дов и пролиферации клеток Dunaliella, а также влияния липидно-каротиноидных экстрактов этих микроводорослей на функциональную активность печени при гепатите и фиброзе. Сформулирована гипотеза базового и индуцированного уровня каротиногенеза в клетках водорослей. Для базового уровня характерна прямая корреляция интенсивности пролифе¬рации с содержанием каротиноидов в клетке, для индуцированного – обратная корреляция с интенсивностью пролиферации и прямая – с накоплением нейтральных липидов. Образцы биомассы и экстракта D. viridis влияют на
17
синтез и транспорт РНК в клетках печени крыс с гепатитом и рекомендованы для разработки гепатотропных препаратов.
Ключевые слова: Dunaliella, пролиферация, каротиноиды, нейтральные липиды, гепатит, фиброз печени.

ABSTRACT

Komaristaya V.P. Interconnections between proliferation intensity and lipid-carotenoid me-tabolism in Dunaliella Teod. and effect of the lipid-carotenoid extracts on hepatocytes functional activity. – Manuscript.
Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.04 – biochemistry. – Kharkiv State University of Ministry of education of Ukraine.
The dissertation is devoted to investigation of interconnections between carotenoid and lipid metabolism and proliferation activity in the unicellular algae of genus Dunaliella cells as well as to de-finition of their lipid-carotenoid extracts effect on several liver functional activity indexes under he¬patitis and liver fibrosis.
While cultivating Dunaliella the intensity of nucleic acids synthesis in the cells was changing and on the 16-th-20-th days the relative synchronization of cell proliferation processes occurred in the culture. This fact was discovered using radioactive labeling of nucleic acids with NaH14CO3 and confirmed by DNA labeling with [14C]thymidine. The H14CO3 absorption rate decreased in the cultivation process and that was connected to the physico-chemical properties of culture medi¬um changing during the culture growth. After changing culture medium for the fresh one the incor¬poration of H14CO3 in the cells of cultures of different ages became equal.
The -carotene content in D. salina cells was changing rhythmically in the process of culture growth under the optimal conditions. On the initial stages of D. salina culture growth the straight correlation between -carotene content and DNA synthesis was observed but on the further stages of the growth the correlation became reverse. The -carotene content in D. viridis cells remained constant during the cultivation. The neutral lipids content in the cells of the both species remained unchanged during the cultures growth and this fact made it possible to conclude that it was indepen¬dent on carotenoid metabolism and the rhythmical pattern of -carotene content in D. salina cells depended on carotenoids interconvertions themselves.
The investigation of different carotenoid fractions synthesis in the both species showed the individual patterns of synthesis rate for -carotene, lutein and the violaxanthin cycle xanthophylls that were
18
depended on the culture growth stage. -carotene was the most rapidly synthesized caro¬tenoid in Dunaliella cells, violaxanthin cycle xanthophylls came the next, and lutein was the most slowly synthesized. It was somewhat surprising as the lutein content was the greatest – 60% of the total carotenoid content in the cell. Using H14CO3 as the precursor it could not be a success to evaluate the input of the different fractions synthesis in the -carotene content fluctuations during the culture growth because of different H14CO3 absorbtion rates in the cultures of different ages. Nevertheless, carotenoid metabolism was under control of different conditions which were changing during the cultures growth such as the concentration of cells was.
The inhibition of Dunaliella culture growth by cells concentration increase, high light inten¬sity and superoptimal temperature led to the -carotene, triacylglycerides, sterols and their esters content 2-3 time increase and the non-esterified fatty acids content 2-4 time increase in the cells of the both species.
It was proposed the hypothesis of basic and induced carotenogenesis levels in the algae cells. On the basic level the straight correlation between proliferation intensity and -carotene content was characteristic but the correlation with neutral lipids accumulation was absent. On the induced level of carotenogenesis the reverse correlation with proliferation intensity and the straight con¬nection with neutral lipids accumulation were characteristic. On the basic level under the optimal cultivation conditions D. salina cells contained 2 times more carotenoids and 1,5 times more neutral lipids than D. viridis cells did. Our data showed that the both species investigated under the inductive conditions may be prospective carotenoids and lipids producers.
The samples of D. viridis biomass and lipid-carotenoid extract influenced RNA synthesis and transport processes in liver cells of the rats suffering from the experimental hepatitis induced by the local hyperthermy of liver. Three time administration of D. viridis biomass led to RNA labeling with [14C]orotic acid decrease in nuclei, cytosol and microsomes fractions of rat liver cells comparing to the animals that had obtained placebo. The extract decreased RNA putative radioactivity in nuclei slightly but increased the one in cytosol and microsomes. The samples did not influence RNA synthesis in rat liver cells under the experimental fibrosis induced by copper sulfate administration and the neutral lipids content in liver cells under both hepatitis and fibrosis. The samp¬les were recommended for hepatotropic drugs elaboration.
Key words: Dunaliella, proliferation, carotenoids, neutral lipids, hepatitis, liver fibrosis.

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2019