НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ

ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ВІННИЧУК ЮЛІЯ ДМИТРІВНА

УДК 616-006.81.04:612.112.94:611.428

Взаємодія аутологічних лімфоцитів з клітинами меланоми: реалізація
протипухлинного ефекту

14.01.07 — онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник – доктор медичних наук, професор

Бережна Нінель Михайлівна,

Інститут експериментальної
патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького
НАН України,

провідний науковий співробітник
відділу

біології пухлинної клітини

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук

Сидоренко Світлана Павлівна,

Інститут експериментальної
патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького
НАН України, завідувач

лабораторії сигнальних каскадів
клітин;

кандидат біологічних наук

Бендюг Галина Дмитрівна,

Інститут онкології АМН України,
провідний науковий

співробітник лабораторії клінічної
імунології

Провідна установа – Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця

МОЗ України, кафедра онкології, м.
Київ.

Захист відбудеться “14” квітня 2004 року о 16 год. 00 хв. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за
адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 45

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького
НАН України

Автореферат розісланий “ 12 “ березня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук
Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення взаємодії пухлинних і імунокомпетентних
клітин є однією з головних проблем сучасної онкології, оскільки
взаємодія цих клітин це складний, взаємозалежний процес, результатом
якого може бути як розвиток ефективної імунологічної відповіді, так і
прогресія злоякісного процесу. Важливе значення у реалізації
протипухлинної дії лімфоцитів при їх взаємодії з пухлинними клітинами
відіграють біологічні особливості цих клітин [Бережная Н.М., 2001].

Біологічні особливості та функціональна активність пухлинних клітин
різного гістогенезу і лімфоцитів в значній мірі визначаються тим, які
поверхневі рецептори або внутрішньоклітинні антигени вони експресують.
Згідно даних літератури останніх років ідентифікована велика кількість
таких антигенів, важливе місце серед яких займають рецептори
інтерлейкінів: ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8 та ін. [Бережная Н.М.,
1999], молекули адгезії (CD54, CD58, інтегрини, кадхерини) [Ровенский
Ю.А., 1998], маркери проліферуючих клітин (CD71, ядерні антигени
проліферуючих клітин, що визначаються МКАТ ІПО-38, МКАТ Кі-67)
[Trombridge I.S. et al., 1982; Chitambar C.R. et al., 1983; Глузман Д.Ф.
и соавт., 1993; Сидоренко С.П. и соавт., 1994], рецептори різноманітних
ростових факторів [Tabone M. et al., 2000; Breier G. et al., 2002;
Yoshiji H. et al., 2002]. Експресія цих структур пов’язана з такими
процесами як проліферація, активація, адгезія, взаємодія з іншими
клітинами. В залежності від біологічних особливостей пухлинних клітин
вони по-різному впливають на систему імунітету та мають різні можливості
ухилення від імунологічного нагляду [Foss F., 2001].

Вивчення експресії рецепторів на пухлинних та лімфоїдних клітинах
дозволяє виявити деякі особливості фенотипу пухлинних клітин та
лімфоцитів, а також з’ясувати роль цих особливостей для реалізації
протипухлинної дії лімфоцитів.

На сьогоднішній день отримані дані про експресію клітинами меланоми
різних рецепторних структур [Lupetti R. et al., 1996; Ciotti P. et al.,
1995; Berking C. et al., 2001], але при цьому не визначена їх роль при
взаємодії пухлинних клітин та лімфоцитів, а також не вивчена їх
експресія в динаміці пухлинного процесу.

При вивченні взаємодії пухлинних і імунокомпетентних клітин актуальним є
пошук речовин, які підвищують протипухлинну дію лімфоцитів. Меланома в
більшості випадків є або первинно резистентна до хіміотерапії, або
швидко набуває резистентності [Helmbach H. et al., 2001; Kiniwa Y. et
al., 2001]. Різні види імунотерапії, які застосовуються для цих хворих
також не досить ефективні. Тому, пошук нових імунотерапевтичних засобів
для лікування хворих на меланому залишається актуальним. Поряд з
вакцинацією хворих розповсюдженим є застосування іммуномодуляторів
широкого спектру дії (інтерлейкін-2, гормони тимусу, левамизол,
інтерферон) [Mocellin S. et al., 2001]. Проте, сучасні імунологічні
дослідження свідчать, що ефект імуномодуляторів залежить від
селективності їх дії. Крім того, дані по використанню різних
імуномодуляторів при лікуванні онкологічних хворих мають односторонню
інформацію про зміни в системі імунітету під впливом певного
імуномодулятора, а інформація про вплив імуномодуляторів на ріст
пухлинних клітин практично відсутня [Бережная Н.М. и соавт., 1996].

Пошук імуномодуляторів з селективною дією був здійснений Р.В. Петровим і
співавт., які з мієлопіда (імуномодулятора кісткового мозку) виділили та
охаректеризували декілька пептидів, що впливали на окремі клітини
системи імунітету [Петров Р.В. и соавт., 1997]. В останні роки в
літературі з’явились дані про те, що мієлопептид-2 (МП-2), який є одним
з пептидів мієлопіду, здатний in vitro відновлювати функціональну
активність Т-лімфоцитів та in vivo гальмувати ріст різних
трансплантованих пухлин: лімфолейкозу Р-388, аденокарциноми молочної
залози Са-755, карциноми легень Lewis, саркоми S-180, меланоми В16
[Михайлова А.А., 1999].

Таким чином, зазначене вище обумовлює проведення досліджень спрямованих
на вивчення ролі експресії СD25, CD54 та ядерного антигена проліферуючих
клітин лімфоцитами та клітинами меланоми для взаємодії цих клітин, а
також корекції протипухлинної дії лімфоцитів імуномодулятором —
мієлопептидом-2.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у лабораторії імунології та алергології відділу біології
пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького згідно з планами науково-дослідної
роботи за темами: 2.28.8.7. “Вивчення значення експресії деяких
поверхневих структур пухлинних клітин для їх взаємодії з лімфоцитами на
різних етапах пухлинного процесу”, 5.4/71 “Вивчення закономірностей
взаємодії пухлинних та імунокомпетентних клітин в залежності від
біологічних властивостей пухлинних клітин та їх дії на функціональну
активність лімфоцитів”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення особливостей
взаємодії клітин меланоми і аутологічних лімфоцитів на різних стадіях
пухлинного процесу та оцінка ролі експресії антигенів пухлинними
клітинами і лімфоцитами для цієї взаємодії, а також впливу
імуномодулятора кісткового мозку МП-2 на протипухлинну дію лімфоцитів.

Задачі даної роботи:

1) визначити експресію CD25, CD54 oa ядерного антигена проліферуючих
клітин лімфоцитами регіонарних і віддалених лімфатичних вузлів мишей та
пухлинними клітинами в динаміці росту меланоми В16;

2) вивчити протипухлинну дію лімфоцитів при їх взаємодії з пухлинними
клітинами в динаміці росту меланоми В16 мишей і з’ясувати роль експресії
вказаних антигенів досліджуваними клітинами у реалізації протипухлинної
дії лімфоцитів;

3) дослідити експресію ядерного антигена проліферуючих клітин, CD54 oa
CD25 пухлинними клітинами та таких маркерів лімфоцитів, як CD3, CD4,
CD8, CD25, CD56, CD11b аутологічними лімфоцитами периферичної крові
(ЛПК) хворих на меланому з різними стадіями захворювання;

4) вивчити протипухлинну дію лімфоцитів периферичної крові при їх
взаємодії з пухлинними клітинами хворих на меланому з урахуванням
експресії цими клітинами вказаних рецепторів;

5) дослідити імуномодулюючу дію МП-2 на ріст клітин меланоми та їх
взаємодію з аутологічними лімфоцитами.

Об’єкт дослідження: пухлинні клітини та лімфоцити регіонарних і
віддалених лімфатичних вузлів мишей лінії С57BL/6 з меланомою В16;
пухлинні клітини та лімфоцити периферичної крові хворих на меланому.

Предмет дослідження: маркери проліферуючих клітин, активованих клітин,
молекули адгезії, протипухлинна дія лімфоцитів у динаміці росту
меланоми, вплив мієлопептиду-2 на взаємодію клітин меланоми і
лімфоцитів.

Методи дослідження: методи виділення пухлинних клітин і лімфоцитів,
імунологічні методи (непрямий імунофлуоресцентний метод), культуральні
методи (культивування пухлинних клітин та лімфоцитів у дифузійних
камерах з подальшою оцінкою їх росту), статистичні методи з
використанням t-критерію Стьюдента.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчені закономірності
експресії CD25, ядерного антигена проліферуючих клітин та CD54
пухлинними клітинами та лімфоцитами лімфатичних вузлів мишей з меланомою
В16, встановлені зміни цієї експресії в динаміці росту пухлини, а також
з’ясована її роль для реалізації протипухлинної дії лімфоцитів.

Показано, що при рості меланоми В16 лімфоцити регіонарних лімфатичних
вузлів, у порівнянні з віддаленими, мають більш виражену протипухлинну
дію протягом всього пухлинного процесу. Протипухлинна дія лімфоцитів як
регіонарних, так і віддалених лімфатичних вузлів асоціюється з
підвищеною кількістю лімфоцитів, експресуючих ядерний антиген
проліферуючих клітин; протипухлинна дія лімфоцитів віддалених
лімфатичних вузлів – з підвищеною кількістю CD54+ лімфоцитів.

Вивчена експресія CD25, ядерного антигена проліферуючих клітин та CD54
пухлинними клітинами, загальних маркерів лімфоцитів аутологічними
лімфоцитами периферичної крові на різних стадіях злоякісного процесу
хворих на меланому і показано, що збільшення кількості пухлинних клітин,
які експресують CD54, асоціюється з прогресією захворювання. ЛПК хворих
на меланому мають низький відсоток CD25+ лімфоцитів. Протипухлинна
активність ЛПК хворих супроводжується збільшенням числа CD11b+
лімфоцитів.

Вперше в системі in vitro встановлено, що МП-2 пригнічує ріст клітин
меланоми людини і мишей та посилює протипухлинну активність лімфоцитів.

Практичне значення одержаних результатів. Збільшення кількості клітин
меланоми людини, які експресують CD54, може бути використано в якості
додаткового прогностичного маркера перебігу пухлинного процесу, а
визначення CD11b+ лімфоцитів як критерій протипухлинної активності ЛПК
хворих.

Здатність МП-2 пригнічувати ріст пухлинних клітин меланоми людини та
посилювати протипухлинну дію аутологічних лімфоцитів відкриває
перспективи його використання в імунотерапії цієї пухлини.

Виражена протипухлинна дія лімфоцитів регіонарних лімфатичних вузлів, у
порівнянні з лімфоцитами віддалених лімфатичних вузлів, обгрунтовує
доцільність їх використання в адоптивній імунотерапії хворих на
меланому.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто зібрана і проаналізована
література за темою дисертації; проведені експерименти по визначенню
експресії антигенів пухлинними клітинами та лімфоцитами, дослідженню
взаємодії пухлинних клітин і лімфоцитів, а також вивченню впливу МП-2 на
ріст пухлинних клітин та їх взаємодію з лімфоцитами на моделі меланоми
В16 мишей і меланомі людини. Самостійно проведений статистичний аналіз
та теоретичне узагальнення результатів роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали даної роботи були
представлені та обговорені на ІІ з’їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000
р.); III, V eiioa?aioe?yo iieiaeeo a/aieo Інституту експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України
(Київ, 2000, 2002 рр.) та VI Республіканській науково-практичній
конференції молодих онкологів України ”Сучасні проблеми
експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2003 р.).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 10 наукових праць,
із них – 5 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1
робота – у матеріалах та 4 – у тезах конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 124
сторінках друкованого тексту, складається із вступу, аналітичного огляду
літератури, власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів,
висновків. Текст ілюстровано 9 таблицями та 26 рисунками. Список
використаної літератури містить 144 джерела, з них 33 вітчизняних та 111
зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені
на 350 мишах-самцях лінії C57BL/6 масою 18-20a (розведення віварію
Інститута експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є.Кавецького НАН України), керуючись міжнародно-прийнятими правилами
проведення робіт з експериментальними тваринами.

Для відтворення моделі меланоми В16 пухлинні клітини вводили мишам
підшкірно (по 7х105 пухлинних клітин на тварину). На 14-у добу видаляли
пухлину, виділяли пухлинні клітини і вводили іншим мишам. Для подальших
досліджень клітини меланоми отримували на 7-у, 10-у, 14-у і 21-у добу
після перещеплення пухлини.

Пухлинні клітини та лімфоцити периферичної крові одержані від 25 хворих
на меланому шкіри з різними стадіями захворювання (15 хворих з І і ІІ
стадіями, 10 хворих з ІІІ і IV стадіями), що знаходилися на
стаціонарному лікуванні у науково-дослідному відділенні пухлин
опорно-рухового апарату Інституту онкології АМН України. Лімфоцити
периферичної крові 10 здорових донорів отримані у Київській міській
лікарні №8. Пухлинні клітини, експлантати та лімфоцити мишей і хворих
виділяли згідно стандартних методів. Життєздатність одержаних клітин
оцінювали в камері Горяєва після фарбування розчином трипанового
синього.

Вивчення експресії антигенів пухлинних і лімфоїдних клітин тварин і
людини проводили з використанням непрямого флуоресцентного методу
[Глузман Д.Ф. и соавт., 1993]. На пухлинних клітинах і лімфоцитах мишей
вивчали експресію CD25 (МКАТ ІСО-105 НПЦ “МедБиоСпектр”, Росія); CD54
(МКАТ ІСО-184 НПЦ “МедБиоСпектр”, Росія); а також ядерного антигена
проліферуючих клітин (МКАТ ІПО-38 ІЕПОР НАН, Україна).

На пухлинних клітинах людини вивчали експресію CD25 (МКАТ ІСО-105 НПЦ
“МедБиоСпектр”, Росія); CD54 (МКАТ ІСО-184 НПЦ “МедБиоСпектр”, Росія);
експресію ядерного антигена проліферуючих клітин визначали,
використовуючи МКАТ ІПО-38 (ІЕПОР НАН, Україна). Деякі фенотипові
характеристики Т-лімфоцитів вивчались за допомогою МКАТ ІСО-90 (CD3),
ІСО-186 (CD4), ІСО-31 (CD8), ІСО-105 (CD25), ІСО-186 (CD56), ІСО-GMI
(CD11b). Всі МКАТ вироблені НПЦ “МедБиоСпектр” (Росія).

Для обліку результатів використовували імерсійну флуоресцентну систему
мікроскопу ЛЮМАМ-1 (об. 90, ок. 5), враховуючи кількість клітин в
препараті, які зв’язали МКАТ на кожні 200 клітин; результати визначали у
відсотках.

Протипухлинну дію лімфоцитів людини і мишей оцінювали по пригніченню
росту пухлинних клітин при їх сумісному культивуванні з лімфоцитами в
дифузійних камерах. Експлантати пухлин або пухлинні клітини (1х106) і
лімфоцити (4х106) вносили в дифузійні камери, що складаються з 2
тефлонових кілець, на які за допомогою клею БФ-6 наклеювали міліпорові
фільтри з діаметром пор 0,23 мк (“Синпор-8”, Чехія ) [Уманский Ю.А. и
соавт., 1983]. Дифузійні камери з пухлинними клітинами і лімфоцитами
культивували на протязі 5 діб у культуральному середовищі RPMI-1640
(“Sigma”, США) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки
(“Сангва”, Україна) при температурі 370С та насиченні повітря 5% СО2 в
24-луночних планшетах (“Nunclon”, Данія). Препарати фіксували в
спирт-формолі (1 год), фарбували гематоксиліном Караччі (20 хв),
проводили через спирти з наростаючою концентрацією, просвітлювали в
ксилолі на протязі 1 хв. Аналіз препаратів проводили на мікроскопі МБІ-6
(об. 20 та 40, ок. 10).

Для визначення особливостей росту експлантатів пухлин, ізольованих
пухлинних клітин і протипухлинної дії лімфоцитів при їх сумісному
культивуванні була розроблена 9-бальна система морфологічної оцінки, яка
давала можливість охарактеризувати ріст пухлинних клітин в дифузійних
камерах і подати дані в графічному режимі [Aa?aaeiay I.I. e niaao.,
1996]. Система оцінки була такою: 1 бал – ріст відсутній; 2 – міграція
поодиноких пухлинних клітин; 3 –початкові етапи створення моношару; 4 —
поява моношару низької густини; 5 — створення моношару середньої
густини; 6 — конгломерати клітин; 7 — сфероїдоутворення (1-2 сфероїди у
полі зору); 8 — сфероїдоутворення (3-5 сфероїдів у полі зору); 9 —
інтенсивне сфероїдоутворення (10-12 сфероїдів у полі зору). Кожен бал
цієї системи характеризує певну особливість росту пухлинних клітин і має
достовірні відмінності від іншого балу.

Статистичну обробку отриманих результатів дослідження проводили згідно
загально прийнятих методів [Урбах В.Ю., 1985] з використанням програми
Microsoft Exnel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Експресія ядерного антигена проліферуючих клітин, CD25 і CD54 пухлинними
клітинами і лімфоцитами в динаміці росту меланоми В16 та роль експресії
цих антигенів у реалізації протипухлинної дії лімфоцитів. При
дослідженні експресії ядерного антигена проліферуючих клітин, CD25 і
CD54 пухлинними клітинами мишей в динаміці росту меланоми В16
встановлено, що висока відносна кількість CD25-позитивних пухлинних
клітин була зареєстрована на 7-у (60,0(2,8%) та 21-у (65,0(4,1%) добу
після перещеплення пухлини. Відмічено також поступове збільшення
кількості клітин меланоми, які експресували yaea?iий aioeaai
i?iл?oa?oth/eo клітин, з 25,0(4,2% (7-а доба після перещеплення) до
45,0(2,9% (21-а доба росту пухлини). Число СD54+ клітин на ранніх етапах
росту пухлини становило 12,0(4,2% (7-а доба) і 20,0(2,1% (10-а доба). На
14-у добу кількість клітин, експресуючих СD54, дорівнювала 16,0(3,1%, а
на 21-у добу такі клітини не виявлялись (рис. 1).

Рис. 1. Експресія пухлинними клітинами CD25, CD54 та ядерного антигена
проліферуючих клітин в динаміці росту меланоми В16 (% позитивних
клітин).

При вивченні експресії зазначених вище антигенів лімфоцитами регіонарних
і віддалених лімфатичних вузлів мишей в динаміці росту меланоми В16 було
встановлено, що для неактивованих лімфоцитів лімфатичних вузлів
інтактних мишей характерне знижене число лімфоцитів, що експресували
ядерний антиген проліферуючих клітин (40,1(2,4%), CD25 (21,3(2,7%) ?
CD54 (15,2(4,3%). Лімфоцити лімфатичних вузлів інтактних мишей служили
контролем у даних дослідженнях (?en. 2, ?en.3).

Рис. 2. Експресія CD25 лімфоцитами регіонарних і віддалених лімфатичних
вузлів мишей в динаміці росту меланоми В16 (% позитивних клітин).

Рис. 3. Експресія CD54 лімфоцитами регіонарних і віддалених лімфатичних
вузлів мишей в динаміці росту меланоми В16 (% позитивних клітин).

,

0

H j ® 2

P

~

uiaeaeaeaeOeEE3/43/4EEEEEEEEEEE

dh`„?a$

$

$

dha$

$

,

.

0

^

F H ® 2

ae

?

)?+oooooooooooooooooooooiaaaa

лімфоцитів у регіонарних лімфатичних вузлах: 20,5(2,7% (7-а доба) і
10,3(2,4% (10-а доба). Число CD25+ лімфоцитів у регіонарних лімфатичних
вузлах також поступово знижувалось по мірі росту пухлини.

Дослідження протипухлинної дії лімфоцитів лімфатичних вузлів мишей по
відношенню до клітин меланоми В16 (при сумісному культивуванні цих
клітин в дифузійних камерах) показало наступне. Лімфоцити регіонарних і
віддалених лімфатичних вузлів на ранніх етапах росту пухлини (7-10-а
доба після перещеплення) в рівній мірі пригнічували ріст пухлинних
клітин. Це проявлялось у формуванні пухлинними клітинами моношару
середньої густини. В контролі ізольовані пухлинні клітини утворювали в
цей строк конгломерати.

На 14-у добу після перещеплення відмічались відмінності в протипухлинній
активності лімфоцитів регіонарних і віддалених лімфатичних вузлів.
Лімфоцити регіонарних лімфатичних вузлів пригнічували ріст пухлинних
клітин так само, як і на 7-у та 10-у добу, лімфоцити віддалених
лімфатичних вузлів не впливали на ріст пухлини.

На 21-у добу протипухлинна дія лімфоцитів регіонарних лімфатичних вузлів
зберігалась. В контролі ізольовані клітини меланоми В16 утворювали
сфероїди, а при дії лімфоцитів спостерігалось утворення конгломератів
клітин, в той час як лімфоцити віддалених лімфатичних вузлів, як і на
14-у добу росту пухлини, не проявляли протипухлинної дії (рис. 4).

Таким чином, протипухлинна дія лімфоцитів лімфатичних вузлів мишей по
мірі росту меланоми В16 загалом зменшувалась. Але лімфоцити регіонарних
лімфатичних вузлів проявляли більш виражену протипухлинну дію. Такі
особливості цих лімфоцитів можна пояснити їх локалізацією відносно
пухлини, внаслідок чого вони знаходяться під впливом антигенів цієї
пухлини, що забезпечує їх преактивацію і більш виражену дію по
відношенню до пухлинних клітин [Lores В., 1998]. Крім того, в
експериментах in vitro показано, що лімфоцити дренованих регіонарних
лімфатичних вузлів пацієнтів з меланомою відрізняються більш інтенсивною
проліферацією, у порівнянні з ЛПК, високою специфічною цитотоксичністю
по відношенню до аутологічних пухлинних клітин і рекомендуються авторами
цих досліджень для використання в імунотерапії [Skornik Y. et all.,
1990].

Рис. 4. Особливості росту пухлинних клітин при їх сумісному
культивуванні з лімфоцитами регіонарних і віддалених лімфатичних вузлів
мишей в динаміці росту пухлини.

Протипухлинна активність лімфоцитів як регіонарних, так і віддалених
лімфатичних вузлів на 7-10-у добу росту пухлини асоціювалась з
підвищеною кількістю лімфоцитів, які експресували ядерний антиген
проліферуючих клітин. В цей період число пухлинних клітин, які
експресували даний антиген, не досягало високого рівня. На термінальних
стадіях пухлинного процесу число пухлинних клітин, що експресували
ядерний антиген проліферуючих клітин, було найбільшим при низькій
протипухлинній активності лімфоцитів. Велика кількість CD54+ лімфоцитів
у віддалених лімфатичних вузлах асоціювалась з їх протипухлинною
активністю на ранніх етапах пухлинного процесу.

Протипухлинна дія лімфоцитів проти клітин меланоми людини та їх
фенотипові особливості. Вивчення експресії ядерного антигена
проліферуючих клітин, CD25, CD54 клітинами меланоми хворих показало
наступне. Число CD25+ клітин і клітин, що експресували ядерний антиген
проліферуючих клітин, не мало чіткої залежності від стадії пухлинного
процесу. На відміну від цього, збільшена кількість CD54+ клітин була
відмічена у хворих з ІІІ і IV (n=10) стадіями захворювання: 20,0(2,3% у
хворих з І і ІІ стадіями захворювання і 40,0(5,7% у хворих з ІІІ, IV
стадіями захворювання.

При дослідженні експресії CD3, CD8, CD4, CD25, CD56, CD11b (ліганд CD54)
лімфоцитами периферичної крові хворих виявлено наступне. Знижений
відсоток CD3+, CD4+, CD11b+ лімфоцитів спостерігався у хворих з III ? IV
стадіями захворювання у порівнянні з ЛПК здорових донорів. Невелике
число лімфоцитів, що експресували CD25, було відмічене у всіх обстежених
хворих. Це може свідчити про низьку функціональну активність цих
лімфоцитів. Отримані дані можна пояснити секрецією клітинами меланоми
супресуючих факторів, які пригнічують активність ефекторних активованих
і неактивованих ІЛ-2 лімфоцитів крові людини [Siwek B.L. et al., 1991;
Boyano M.D. et al., 1997].

Вивчення протипухлинної активності аутологічних лімфоцитів при їх
взаємодії з пухлинними клітинами хворих на меланому дозволило
розподілити хворих на дві групи за характером впливу лімфоцитів на ріст
пухлинних експлантатів. До І-ї групи (n=17), більшість якої склали хворі
з І і ІІ стадіями, були віднесені хворі, ЛПК яких проявляли
протипухлинну дію. При сумісному культивуванні пухлинних експлантатів та
лімфоїдних клітин спостерігалось пригнічення росту клітин меланоми, що
проявлялось у створенні клітинами моношару низької густини. В
контрольних препаратах (культивування пухлинних експлантатів)
спостерігалась міграція з експлантату пухлинних клітин, створення ними
моношару середньої густини у 6 випадках з 17 (35,3%), формування
конгломератів клітин відмічалось у 11 випадках з 17 (64,7%). ІІ-у групу
(n=8) склали хворі переважно з ІІІ і IV стадіями захворювання, ЛПК яких
не проявляли протипухлинної дії. При сумісному культивуванні пухлинних
експлантатів цих хворих з аутологічними ЛПК не спостерігалось
пригнічення росту пухлини (ріст пухлинних клітин в дослідних препаратах
не відрізнявся від контрольних). ЛПК донорів по відношенню до клітин
меланоми характеризувались вираженою протипухлинною активністю, у
порівнянні з ЛПК хворих.

Встановлено, що протипухлинна дія ЛПК хворих І-ї групи асоціювалась зі
збільшеною кількістю лімфоцитів, які експресували CD11b. Відомо, що
важливе місце у взаємодії пухлинних клітин і лімфоцитів займають
молекули адгезії, а саме CD54 та його ліганди — CD11a, CD11b [Altomonte
N. et al., 1993]. Отримані нами дані узгоджуються з даними цих авторів,
які показали, що блокада відповідними моноклональними антитілами молекул
адгезії на клітинах меланоми приводить до зниження їх лізису клітинами
імунної системи.

Вплив мієлопептиду-2 на ріст клітин меланоми в дифузійних камерах та їх
взаємодію з лімфоцитами. Дослідження впливу різних концентрацій МП-2
(0,1 мкг/мл; 1 мкг/мл; 50 мкг/мл) на ріст клітин меланоми людини і мишей
та протипухлинну дію лімфоцитів при їх взаємодії з пухлинними клітинами
дозволило встановити наступне. МП-2 має здатність однаково пригнічувати
в умовах in vitro ріст клітин меланоми людини і мишей в концентрації 50
мкг/мл. Концентрації 0,1 мкг/мл і 1 мкг/мл (при додаванні в культуральне
середовище) не впливали на ріст експлантатів меланоми людини і пухлинних
клітин мишей (рис. 5).

Рис. 5. Вплив МП-2 на ріст у дифузійних камерах клітин меланоми людини
та мишей.

Протипухлинна дія ЛПК хворих на меланому і лімфоцитів регіонарних і
віддалених лімфатичних вузлів мишей по відношенню до відповідних клітин
меланоми під впливом МП-2 посилювалась, в порівнянні з дією вказаних
лімфоцитів при їх сумісному культивуванні з пухлинними клітинами без
додавання МП-2. Пригнічуюча дія ЛПК хворих відносно аутологічних клітин
меланоми посилювалась під впливом всіх досліджуваних концентрацій МП-2
(рис. 6).

Рис. 6. Вплив МП-2 на ріст клітин меланоми хворих при їх сумісному
культивуванні з аутологічними ЛПК у дифузійних камерах. Примітка:
контроль — сумісне культивування пухлинних експлантатів і ЛПК без
додавання МП-2.

Протипухлинна активність лімфоцитів лімфатичних вузлів мишей залежала
від концентрації МП-2 та локалізації лімфатичних вузлів. Так,
протипухлинна дія лімфоцитів регіонарних лімфатичних вузлів посилювалась
при дії МП-2 у всіх досліджуваних концентраціях, а лімфоцитів віддалених
лімфатичних вузлів — в концентраціях 1 мкг/мл і 50 мкг/мл.

Вивчення впливу МП-2 на протипухлинну активність лімфоцитів лімфатичних
вузлів інтактних мишей та ЛПК здорових осіб відносно відповідних
пухлинних клітин показало, що під дією МП-2 посилення протипухлинної
дії даних лімфоцитів не спостерігалось .

Посилення протипухлинної дії ЛПК хворих під впливом МП-2 навіть у
невеликих концентраціях обгрунтовує доцільність його використання в
імунотерапії хворих на меланому.

ВИСНОВКИ

Робота присвячена проблемі взаємодії аутологічних лімфоцитів різної
локалізації (ЛПК, регіонарні та віддалені лімфатичні вузли) з клітинами
меланоми людини та мишей, вивченню ролі експресії ядерного антигена
проліферуючих клітин, CD25, CD54 у реалізації протипухлинної дії
лімфоцитів та можливої корекції вказаної взаємодії мієлопептидом-2.

1. Найбільш характерним для клітин меланоми В16 є зниження кількості
CD54-позитивних клітин і підвищення кількості клітин, які експресують
ядерний антиген проліферуючих клітин, у динаміці росту пухлини.

2. Встановлено, що в динаміці росту меланоми В16 знижується кількість
лімфоцитів, які експресують CD54 і ядерний антиген проліферуючих клітин,
в регіонарних та віддалених лімфатичних вузлах.

3. Показано, що при рості меланоми В16 знижується протипухлинна дія
лімфоцитів регіонарних і особливо віддалених лімфатичних вузлів при їх
взаємодії з пухлинними клітинами.

4. Протипухлинна дія лімфоцитів регіонарних і віддалених лімфатичних
вузлів мишей з меланомою В16 асоціюється із збільшенням кількості
лімфоцитів та зниженням кількості пухлинних клітин, які експресують
ядерний антиген проліферуючих клітин; протипухлинна дія лімфоцитів
віддалених лімфатичних вузлів асоціюється з високою кількістю
CD54-позитивних ee?oei. 5. Відсоток CD54-позитивних пухлинних клітин у
хворих на меланому збільшується на ІІІ і IV стадіях пухлинного процесу і
асоціюється із стадією захворювання, що може мати прогностичне значення.

6. Протипухлинна дія лімфоцитів хворих на меланому
асоціюється з високим відсотком CD11b-позитивних лімфоцитів периферичної
крові.

7. Мієлопептид-2 пригнічує ріст клітин меланоми людини і
мишей з меланомою В16 та посилює протипухлинну дію аутологічних
лімфоцитів лімфатичних вузлів мишей з пухлиною і ЛПК хворих при
сумісному культивування лімфоцитів і пухлинних клітин у дифузійних
камерах.

Список опублікованих праць за темою дисертації:

Винничук Ю.Д., Спивак С.И., Бережная Н.М. Экспрессия некоторых структур
адгезии, пролиферации и активации на опухолевых клетках и лимфоцитах
мышей линии C57BL/6 с меланомой В16 // Экспериментальная онкология. —
1999. – Т. 21, №3-4. — С. 227-231 (Самостійно проводила виділення
пухлинних клітин і лімфоцитів, проводила імунофлуоресцентний аналіз;
обробку отриманих результатів, приймала участь у написанні статті).

Бережная Н.М., Винничук Ю.Д., Спивак С.И., Толстопятов Б.А., Коноваленко
В.Ф., Ковальчук Е.В. Влияние миелопептида-2 на рост опухолевых клеток и
их взаимодействие с лимфоцитами in vitro // Экспериментальная онкология.
— 2001. — Т. 23, №3. — С. 149-152 (Самостійно проводила виділення
пухлинних клітин, лімфоцитів, досліджувала вплив МП-2 на ріст клітин
меланоми В16 мишей, клітин меланоми хворих і їх взаємодію з лімфоцитами
лімфатичних вузлів мишей, ЛПК, обробку отриманих результатів, приймала
участь у написанні статті).

Співак С.І., Вінничук Ю.Д., Ковальчук О.В. Протипухлинна дія лімфоцитів
(різної локалізації) мишей з перевивною МХ-рабдоміосаркомою та меланомою
В16 // Вісник Київського національного університету ім. Т.Шевченка,
Біологія. — 2000.- Вип. 32. — С. 24-26 (Самостійно отримувала клітини
меланоми В16 та лімфоцити лімфатичних вузлів мишей лінії C57BL/6,
досліджувала протипухлинну дію лімфоцитів мишей з меланомою В16;
приймала участь у оформленні наукових результатів та написанні статті).

Співак С.І., Вінничук Ю.Д., Ковальчук О.В., Коноваленко В.Ф. Взаємодія
пухлинних клітин та лімфоцитів хворих: значення адгезивних молекул //
Вісник Київського національного університету ім. Т.Шевченка, Біологія. —
2001. — Вип. 34. — С. 15-17 (Самостійно виділяла пухлинні клітини і
лімфоцити периферичної крові хворих на меланому, досліджувала експресію
молекул адгезії та протипухлинну дію лімфоцитів; приймала участь у
оформленні наукових результатів та написанні статті).

Бережная Н.М., Винничук Ю.Д. Взаимодействие лимфоцитов и опухолевых
клеток под влиянием предварительной обработки миелопептидом-2 //
Аллергология и иммунология. — 2003. — Т. 4, №1. — С. 12-15 (Самостійно
проводила експериментальні дослідження: отримання клітин меланоми В16 і
лімфоцитів лімфатичних вузлів мишей, обробку їх МП-2, вивчення взаємодії
пухлинних клітин і лімфоцитів; приймала участь у оформленні наукових
результатів і написанні статті).

Спивак С.И., Винничук Ю.Д. Значение экспрессии различных структур
опухолевых и лимфоидных клеток для их взаимодействия в динамике роста
опухоли // Тез. ІV Української науково-практичної конференції з
актуальних питань алергології та клінічної імунології. Імунологія та
алергологія. — Київ, 1999. — №3. — С. 45.

Бережная Н.М., Винничук Ю.Д., Спивак С.И., Ковальчук Е.В., Коноваленко
В.Ф. Взаимодействие лимфоцитов и опухолевых клеток: значение особенности
опухоли. // Тез. ІІ съезда онкологов стран СНГ. — Киев, 2000 //
Экспериментальная онкология.- 2000. — Т.22. — С. 217.

Бережна Н.М., Співак С.І., Вінничук Ю.Д., Ковальчук О.В. Клінічна
інтерпретація антигенів CD25, CD71, CD5\на пухлинних клітинах та CD11b
на лімфоцитах хворих саркомами та меланомою // Матеріали Х з’їзду
онкологів України. – Київ, 2001. – С. 33-34.

Винничук Ю.Д. Значение экспрессии CD25, CD54 лимфоцитами и опухолевыми
клетками для взаимодействия этих клеток в динамике роста меланомы В16.
// Тез. V конференції молодих онкологів України. — Київ, 2002. — С. 3.

Винничук Ю.Д. Влияние иммуномодулятора костномозгового происхождения
миелопептида-2 на рост клеток меланомы и их взаимодействие с лимфоцитами
// Тез. VI конференції молодих онкологів України. — Київ, 2003. – С. 12.

АНОТАЦІЯ

Вінничук Ю.Д. Взаємодія аутологічних лімфоцитів з клітинами меланоми:
реалізація протипухлинного ефекту. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 14.01.07 – онкологія. — Інститут експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України,
Київ, 2004.

Дисертація присвячена вивченню взаємодії лімфоцитів і пухлинних клітин в
динаміці росту меланоми В16 мишей та хворих на меланому шкіри, вивченню
ролі експресії ядерного антигена проліферуючих клітин, CD25 і CD54
лімфоцитами і пухлинними клітинами у реалізації протипухлинної дії
лімфоцитів, а також можливої корекції вказаної взаємодії
мієлопептидом-2.

Виражена протипухлинна дія лімфоцитів регіонарних і віддалених
лімфатичних вузлів мишей з меланомою В16 асоціюється зі збільшеною
кількістю лімфоцитів, які експресують ядерний антиген проліферуючих
клітин і низькою кількістю пухлинних клітин, які експресують цей
антиген; протипухлинна дія лімфоцитів віддалених лімфатичних вузлів
асоціюється з підвищеною кількістю CD54+ лімфоцитів.

Протипухлинна дія ЛПК хворих на меланому асоціюється з великою кількістю
CD11b+ лімфоцитів. Число CD54+ пухлинних клітин хворих достовірно вище у
випадках розповсюдженого пухлинного процесу.

ЛПК хворих на меланому і лімфоцити лімфатичних вузлів мишей з меланомою
В16 посилюють свою протипухлинну дію під впливом мієлопептиду-2.
Мієлопептид-2 також безпосередньо пригнічує ріст клітин меланоми В16 і
клітин меланоми хворих в системі in vitro.

Ключові слова: меланома, лімфоцити, взаємодія, CD25, CD54, ядерний
антиген проліферуючих клітин, мієлопептид-2.

АННОТАЦИЯ

Винничук Ю.Д. Взаимодействие аутологических лимфоцитов с клетками
меланомы: реализация противоопухолевого эффекта. – Рукопись.

Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 14.01.07 – онкология. — Институт экспериментальной
патологии, онкологии и радиобиологии ми. Р.Е. Кавецкого НАН Украины,
Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению взаимодействия лимфоцитов и опухолевых
клеток в динамике роста экспериментальных опухолей у мышей, больных
меланомой кожи, определению роли экспрессии ядерного антигена
пролиферирующих клеток, CD25 и CD54 лимфоцитами и опухолевыми клетками в
реализации противоопухолевого действия лимфоцитов, а также возможной
коррекции указанного взаимодействия миелопептидом-2.

Экспериментальные исследования показали, что опухолевые клетки и
лимфоциты регионарных и отдаленных лимфатических узлов мышей линии
С57BL/6 с меланомой В16 экспрессируют ядерный антиген пролиферирующих
клеток, CD25 и CD54. Количество же экспрессирующих данные антигены
клеток изменяется в динамике роста опухоли. При исследовании
противоопухолевой активности лимфоцитов лимфатических узлов мышей
показано, что выраженное противоопухолевое действие лимфоцитов как
регионарных, так и отдаленных лимфатических узлов сочетается с
повышенным количеством лимфоцитов, экспрессирующих ядерный антиген
пролиферирующих клеток, и небольшим количеством опухолевых клеток,
экспрессирующих этот антиген. Противоопухолевое действие лимфоцитов
отдаленных лимфатических узлов ассоциировано с увеличением числа CD54+
лимфоцитов. Сравнительный анализ противоопухолевого действия лимфоцитов
лимфатических узлов показал, что лимфоциты регионарных лимфатических
узлов обладают более выраженным противоопухолевым действием.

При исследовании клинического материала отмечено, что противоопухолевое
действие лимфоцитов периферической крови больных меланомой кожи
ассоциировано с повышенным количеством CD11b+ лимфоцитов. При
распространенном опухолевом процессе отмечен высокий процент опухолевых
клеток, которые экспрессируют CD54.

Изучение влияния миелопептида-2, входящего в состав миелопида
(иммуномодулятора костномозгового происхождения), на рост клеток
меланомы человека и мышей и их взаимодействие с аутологическими
лимфоцитами показало, что миелопептид-2 усиливает противоопухолевое
действие лимфоцитов периферической крови больных и лимфоцитов
регионарных и отдаленных лимфатических узлов мышей с опухолью.
Миелопептид–2 также оказывает непосредственное угнетающее действие на
рост клеток меланомы человека и мышей в условиях in vitro.

Ключевые слова: меланома, лимфоциты, взаимодействие, CD25, CD54, ядерный
антиген пролиферирующих клеток, миелопептид-2.

SUMMARY

Vinnichuk Yu.D. Interaction between autologic lymphocytes and tumor
cells: realization of antitumor effect. – Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences on
speciality 14.01.07 – oncology. – R.E. Kavetsky Institute of
Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, NAS of Ukraine, Kyev,
2004.

The dissertation is aimed to study the interaction between lymphocytes
and tumor cells in the dynamics of malignant process (in mice with
melanoma B16 and patients with malignant melanoma); to receive the
evidence of importance of the nuclear antigen of proliferating cells,
CD25 and CD54 expression by lymphocytes and tumor cells; and possible
correction of the interaction between these cells by myelopeptyd-2.

The significant antitumor action of regional and distant lymph node
lymphocytes in mice bearing melanoma B16 is associated with high level
of expressing nuclear antigen of proliferating cell expression of
lymphocytes and low of expressing thise antigen of tumor cells.
Antitumor action of distant lymph node lymphocytes was correlated with
high level of CD54+ lymphocytes.

It has been shown that antitumor effect of peripheral blood lymphocytes
from the patients with malignant melanoma was associated with high level
of CD11b+ lymphocytes. It was also observed that progression of tumor
process is supplemented with the high level of CD54+ tumor cells.

Our data suggested that myelopeptyd-2 enhanced antitumor effect both of
peripheral blood lymphocytes from the patients with malignant melanoma
and lymph nodes lymphocytes of mice bearing melanoma B16. Inhibitory
effects of MP-2 on melanoma B16 and human tumor cell growth were
demonstrated.

Key words: melanoma, lymphocytes, CD25, CD54, interaction, nuclear
antigen of proliferating cell, myelopeptyd-2.

Похожие записи