.

Вплив нейроендокринного диференціювання клітин карциноми простати на характеристики об’ємрегульованого хлорного струму (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2370
Скачать документ

Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

_______________________________________________________________

ЛАЗАРЕНКО РОМАН МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 577.352:616-006.6

Вплив нейроендокринного диференціювання клітин карциноми простати на
характеристики об’ємрегульованого хлорного струму

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Шуба Ярослав Михайлович,

провідний науковий співробітник

відділу загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Романенко
Олександр Вікторович, завідувач кафедрою біології Національного
медичного університету ім. О.О. Богомольця, МОЗ України

чл.-кор. НАН і АМН України, доктор медичних наук, професор, Рєзніков
Олександр Григорович, завідувач відділу ендокринології репродукції та
адаптації Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.
Комісаренка АМН України

Провідна установа: Київський Національний університет
імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет, кафедра біофізики

Захист відбудеться 17.05. 2005 р. о 13 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця
4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця
4.

Автореферат розісланий 14.04. 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За статистичними даними карцинома простати є другою
після раку легень причиною смертності серед чоловіків від ракових
захворювань (Parcer et al. 1997). Незважаючи на масштабність цієї
проблеми і значні зусилля, спрямовані на її вирішення, біологічні основи
регуляції росту нормальної простати і механізми, відповідальні за її
злоякісне переродження, усе ще далеко не з’ясовані. У той же час існують
переконливі дані, що такі процеси як проліферація, диференціація й
апоптоз, котрі визначають як нормальний так і патологічний ріст клітин,
супроводжуються істотними змінами їхніх мембранних провідностей (Nilius
2001; Okada et al. 2001; Schlichter et al. 1996; Skryma et al. 1997).
Дослідження мембранних провідностей у клітинах простати є надзвичайно
важливим, оскільки така робота сприятиме глибшому розумінню причин та
шляхів злоякісного переродження клітин і може стати в пригоді при
розробці ефективних стратегій протиракової терапії.

Останнім часом при дослідженні фундаментальних механізмів канцерогенезу
простати широко використовуються in vitro моделі, якими є лінії клітин,
що походять з різних типів первинних злоякісно перероджених клітин
простати людини. Однією з таких моделей є клітини епітеліального
походження лінії LNCaР (Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Клітини
лінії LNCaP в умовах in vitro зберігають практично усі властивості
первинних епітеліальних клітин, включаючи андроген-залежність росту,
синтез кислих фосфатаз і секреторну активність (Horoszewicz J.S. et al.
1983).

Щодо провідностей плазматичної мембрани клітин лінії LNCaP, то донедавна
вважалося, що вони експресують лише потенціалкеровані калієві канали,
котрі задіяні в проліферації клітин (Skryma et al. 1997; Skryma et al.
1999).

Нещодавно в цих клітинах було також виявлено аніонну провідність,
активність якої регулюється зміною об’єму клітини і відбувається через
ОРАК – об’ємрегульовані аніонні канали (Shuba et al. 2000). Ці канали,
переносять об’ємактивований хлорний струм – ICl,swell і беруть участь у
регуляторному відновленні об’єму клітини (РВО). Однак регуляція ОРАК
ендо- і екзогенними факторами, особливо в простаті, поки що мало
вивчена. Оскільки функціонування ОРАК може бути пов’язане з низкою
білків, котрі посилено експресуються при злоякісному переродженні клітин
(Valverde et al. 1992; Wu et al. 1996), і передбачається участь
об’ємчутливого хлорного струму в процесах онкогенезу та трансформації
(Chou et al. 1995; Nilius et al. 1997), здається актуальним з’ясувати
функціональні властивості і роль ОРАК у ракових клітинах простати та
визначити фактори, що беруть участь у модуляції роботи цих каналів.
Особливий інтерес становить дослідження того, яким чином модифікується
робота ОРАК та ефективність РВО при нейроендокринному диференціюванні
клітин карциноми простати, оскільки збільшення популяції нейроендокринно
диференційованих (НЕД) клітин в тканині залози корелює з агресивністю
канцерогенезу і переходом до андроген-незалежної стадії раку, для якої
досі немає ефективної терапії. Дослідження АТФ-чутливості ICl,swell, а
відтак і РВО також є актуальним, бо зараз з’являється все більше робіт,
що описують нові методи протиракової терапії, котрі полягають у
вилученні з ракових клітин АТФ (Geschwind et al. 2002; Martin et al.
2000).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в тому, щоб визначити
фізіологічні і біофізичні властивості об’ємактивованої хлорної
провідності в клітинах карциноми простати лінії LNCaР і дослідити як ці
властивості модифікуються при нейроендокринному диференціюванні клітин.
Також ми ставили собі за мету визначити вплив внутрішньоклітинного АТФ
на функції ОРАК в контрольних та нейроендокринно-диференційованих
клітинах і зробити висновки про структурну організацію
об’ємрегульованого хлорного каналу та фактори, що беруть участь в
переході клітин раку простати від андроген-залежної до
андроген-незалежної стадії росту. Для цього були сформульовані такі
завдання:

відтворити експериментальні умови, що дозволяють адекватно реєструвати
об’ємактивований хлорний струм ICl,swell у клітинах LNCaР;

вивчити властивості ICl,swell у клітинах LNCaР (чутливість до змін
клітинного об’єму, характеристики активації і потенціалзалежної
інактивації); отримати дані про можливу участь відомих клонованих білків
у формуванні ОРАК;

визначити зміни об’ємчутливої аніонної провідності, ефективності РВО та
молекулярні механізми, що лежать в основі цих змін при нейроендокринному
диференціюванні клітин карциноми простати людини;

з’ясувати роль внутрішньоклітинного АТФ у функціонуванні ОРАК та
визначити особливості АТФ-чутливості ICl,swell в
нейроендокринно-диференційованих клітинах;

на підставі отриманих результатів зробити висновки про можливі шляхи
переходу клітин раку простати від андроген-залежного до
андроген-незалежного росту та протиапоптичної резистивності і визначити
можливі варіанти фармакологічного впливу на цей перехід.

Наукова новизна. Всі експериментальні дані, представлені в роботі,
отримані вперше. Вперше виявлено збільшення амплітуди і прискорення
реакції на гіпотонічність об’ємчутливого хлорного струму при
нейроендокринному диференціюванні клітин карциноми простати людини лінії
LNCaP. Вперше виявлені зміни кальцій-залежності ICl,swell, пов’язані зі
зменшенням інгібіторного впливу на ICl,swell з боку депо-керованих
кальцієвих каналів при нейроендокринному диференціюванні клітин
простати. Вперше виявлено кореляцію між величиною об’ємчутливого
хлорного струму та рівнем експресії ClC-3 білка хлорного каналу, що може
бути частиною або регулятором ендогенного ОРАК. Вперше показано
модуляторний вплив АТФ на характеристики об’ємчутливого хлорного струму
в клітинах LNCaP і визначено, що при нейроендокринному диференціюванні
клітин АТФ-чутливість струму знижується. Вперше показана пряма блокуюча
дія йонів магнію на об’ємрегульований хлорний канал в клітинах LNCaP.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані мають як
теоретичне значення, оскільки сприяють більш глибокому розумінню будови,
функціонування і фізіологічної ролі об’ємрегульованого хлорного каналу;
так і практичне, оскільки визначають потенційні мішені для
терапевтичного впливу на андроген-незалежну стадію раку простати.
Очевидно, дієвим може виявитись фармакологічний вплив, що полягає в
блокуванні об’ємрегульованого хлорного струму з метою підвищення
проапоптичного потенціалу злоякісних клітин простати.

Особистий внесок здобувача. Експерименти по вимірюванню РВО, визначенню
рівня експресії ClC-3 та Bcl-2 та вимірюванню рівня апоптичних процесів
в клітинах були проведені в співпраці з професором Р. Скримою –
співробітником лабораторії клітинної фізіології, керованої професором Н.
Преварською, Університету Наук і Технологій м. Ліль (Франція). Всі інші
електрофізіологічні експерименти й обробка експериментального матеріалу
були виконані автором особисто. Культивування клітинної лінії LNCaР
проводилося старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України к.б.н. Н. Х. Погорєлою. Обговорення
результатів досліджень, планування експериментів і формулювання
висновків проводилося разом з науковим керівником доктором біологічних
наук, професором Шубою Я. М.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися на конференції для молодих вчених Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця (Київ, 2003); Першому Українському конгресі з клітинної
біології (Львів, 2004), на літній школі IBRO (Ялта, 2004), Першій
міжнародній науковій конференції для студентів та аспірантів „Молодь і
поступ в біології” (Львів, 2005), семінарах в Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця (Київ, 2003 – 2004).

Публікації. Результати досліджень опубліковані в чотирьох наукових
статтях і шести тезах конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів
досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних
джерел з 249 найменувань. Робота викладена на 149 сторінках та містить
35 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Культура клітин. Клітини лінії LNCaP (American Type Culture Collection)
культивували в середовищі RPMI 1640 (Biowhittaker, Франція) з додаванням
5 ммоль/л L-глутаміну (Sigma, США), 10%-ї ембріональної бичачої
сироватки (Poly-Labo, Франція), 50000 од/л пеніциліну та 50 мг/л
стрептоміцину. Клітини вирощували у флаконах, об’ємом 50 мл при 37 оС в
інкубаторі зі зволоженою атмосферою 95% повітря та 5% СО2. Для
електрофізіологічних досліджень клітини висаджувались в чашки Петрі,
покриті поліорнітином (Sigma, США), і використовувались протягом 4-6
діб.

Для нейроендокринного диференціювання клітини інкубувалися з 1 ммоль/л
ДБ-цAMФ (N6,2′-O-dibutyryladenosine 3′:5′ – cyclic monophosphate Sodium
salt, Sigma, США) протягом трьох діб. Також використовувалась методика
диференціювання клітин в нейроендокринний фенотип шляхом тривалої
інкубації в безстероідному середовищі. Фотографії клітинних популяцій
були зроблені з використанням мікроскопа Leitz Diavert, США в фазовому
контрасті на плівці Micrat Isopan.

Електрофізіологічний експеримент і розчини.

Мембранні струми в LNCaP клітинах реєструвалися з використанням методики
“петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина”.

Інтегральні струми вимірювались у відповідь на стимуляцію клітини
імпульсами потенціалу, що складалися з плато при + 100 мВ, плато при –
100 мВ та лінійно-змінного відрізка між ними. Такий протокол дозволяв
одночасно відслідковувати потенціалзалежність, амплітуду та
характеристики випрямлення струму. Об’ємрегульований хлорний струм
розвивався внаслідок переведення клітин в ТЕА-вмісний гіпотонічний
зовнішній розчин та наступного набрякання клітин. Струм, що
спостерігався перед індукцією набрякання, вважався за базовий.

Осмотичність ізо- та гіпотонічних розчинів складала 310 та 190 мосмоль/л
відповідно. В експериментах використовувався зовнішньоклітинний
гіпотонічний розчин такого складу (ммоль/л): CaCl2 – 2, MgCl2 – 2,
Glucose – 10, HEPES – 10, TEACl – 80; в ізотонічному розчині – TEACl –
145.

Реєструючу піпетку заповнювали таким внутрішньоклітинним розчином
(ммоль/л): KOH – 100, KCl – 40, MgCl2 – 1 (або без MgCl2), HEPES – 10,
EGTA – 8, Mg-ATФ – 5 (або 5 Na-AТФ, або без АТФ), CaCl2 – 2,6; рН 7.2
(доводили L-глутаміновою кислотою). За такого складу розчину
концентрація вільного кальцію в клітині підтримувалась на рівні 1*10-7
моль/л. Опір реєструючої піпетки перебував в межах 3-5 МОм.

Для блокування ендогенної продукції АТФ в клітинах LNCaP у штучний
внутрішньоклітинний розчин додавалися (мкмоль/л): 40 олігоміцину, 5
йодоацетату, 20 ротенону. Крім того, перед використанням в
електрофізіологічному досліді клітини інкубувались протягом 25-35 хвилин
в середовищі зі 100 нмоль/л ротенону та 5 ммоль/л 2-деоксиглюкози.
Метаболічні інгібітори додавались із концентрованих розчинів, розведених
в DMSO. Кінцева концентрація DMSO у внутрішніх розчинах складала 0,15%.

Зміни зовнішнього розчину проводили за допомогою багатоствольної
мікропіпетки зі спільним витоком. Повна зміна зовнішнього розчину
відбувалася за час не більший за 1 с. Усі реактиви, які використовували
для приготування розчинів були від фірми “Sigma”. Експерименти проводили
з використанням підсилювача фірми “Dagan”, (США) у комплексі з
персональним комп’ютером.

Молекулярно-біологічні методи.

При дослідженні молекулярної природи ОРАК використовувались методики RT
PCR (з використанням гуанідіум тіоціанат-фенол-хлороформової процедури
для виділення мРНК (Chomczynski & Sacchi 1987); та праймерів для
ампліфікації RT-генерованої кДНК ClC-3:
5’-GGCAGCATTAACAGTTCTACAC-3’(нуклеотиди 675-696), номер доступу
NM_001829) і 5’-TTCCAGAGCCACAGGCATATGG-3’ (нуклеотиди 1207-1188),
синтезованих за послідовностями з GenBank); та Western blot з
використанням електроблотера (BioRad). Блотинг проводився за визначеною
процедурою. Вторинні антитіла до ClC-3 були кон’юговані з пероксидазою
хрону. Хемолюмінісценція визначалась за допомогою Super Signal West Pico
хемолюмінісцентного субстрату за інструкціями виробника. Інтенсивність
сигналу оцінювалась денситометрією, рівень експресії досліджуваного
білка порівнювався з рівнем ендогенного кальнексину для кожного
експерименту.

Рівень апоптозу визначався за кількістю апоптичних тілець, що
візуалізуються при забарвленні за Гьохстом, як детально описано в роботі
Skryma et al (Skryma R. et al. 2000).

Аналіз даних і статистика. Для реєстрації струмів використовувалось
програмне забезпечення pCLAMP-8 (Axon Instruments, США). А для обробки
та аналізу результатів – Origin-7 (Microcal, США). Результати
представлені у вигляді середніх значень ? стандартна похибка. Кожен
експеримент повторювався кілька разів. Для статистичного порівняння
середніх значень використовувався критерій Стьюдента, і різниця з Рv?ioe EHuy he`? hUk hUk hUk hUk hUk N P R T l n p ? ?? f°g?g.hEno8w:w

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2019