Вплив нейроендокринного диференціювання клітин карциноми простати на характеристики об’ємрегульованого хлорного струму (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2348
Скачать документ

Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

_______________________________________________________________

ЛАЗАРЕНКО РОМАН МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 577.352:616-006.6

Вплив нейроендокринного диференціювання клітин карциноми простати на
характеристики об’ємрегульованого хлорного струму

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Шуба Ярослав Михайлович,

провідний науковий співробітник

відділу загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Романенко
Олександр Вікторович, завідувач кафедрою біології Національного
медичного університету ім. О.О. Богомольця, МОЗ України

чл.-кор. НАН і АМН України, доктор медичних наук, професор, Рєзніков
Олександр Григорович, завідувач відділу ендокринології репродукції та
адаптації Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.
Комісаренка АМН України

Провідна установа: Київський Національний університет
імені Тараса Шевченка,

біологічний факультет, кафедра біофізики

Захист відбудеться 17.05. 2005 р. о 13 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця
4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця
4.

Автореферат розісланий 14.04. 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За статистичними даними карцинома простати є другою
після раку легень причиною смертності серед чоловіків від ракових
захворювань (Parcer et al. 1997). Незважаючи на масштабність цієї
проблеми і значні зусилля, спрямовані на її вирішення, біологічні основи
регуляції росту нормальної простати і механізми, відповідальні за її
злоякісне переродження, усе ще далеко не з’ясовані. У той же час існують
переконливі дані, що такі процеси як проліферація, диференціація й
апоптоз, котрі визначають як нормальний так і патологічний ріст клітин,
супроводжуються істотними змінами їхніх мембранних провідностей (Nilius
2001; Okada et al. 2001; Schlichter et al. 1996; Skryma et al. 1997).
Дослідження мембранних провідностей у клітинах простати є надзвичайно
важливим, оскільки така робота сприятиме глибшому розумінню причин та
шляхів злоякісного переродження клітин і може стати в пригоді при
розробці ефективних стратегій протиракової терапії.

Останнім часом при дослідженні фундаментальних механізмів канцерогенезу
простати широко використовуються in vitro моделі, якими є лінії клітин,
що походять з різних типів первинних злоякісно перероджених клітин
простати людини. Однією з таких моделей є клітини епітеліального
походження лінії LNCaР (Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Клітини
лінії LNCaP в умовах in vitro зберігають практично усі властивості
первинних епітеліальних клітин, включаючи андроген-залежність росту,
синтез кислих фосфатаз і секреторну активність (Horoszewicz J.S. et al.
1983).

Щодо провідностей плазматичної мембрани клітин лінії LNCaP, то донедавна
вважалося, що вони експресують лише потенціалкеровані калієві канали,
котрі задіяні в проліферації клітин (Skryma et al. 1997; Skryma et al.
1999).

Нещодавно в цих клітинах було також виявлено аніонну провідність,
активність якої регулюється зміною об’єму клітини і відбувається через
ОРАК – об’ємрегульовані аніонні канали (Shuba et al. 2000). Ці канали,
переносять об’ємактивований хлорний струм – ICl,swell і беруть участь у
регуляторному відновленні об’єму клітини (РВО). Однак регуляція ОРАК
ендо- і екзогенними факторами, особливо в простаті, поки що мало
вивчена. Оскільки функціонування ОРАК може бути пов’язане з низкою
білків, котрі посилено експресуються при злоякісному переродженні клітин
(Valverde et al. 1992; Wu et al. 1996), і передбачається участь
об’ємчутливого хлорного струму в процесах онкогенезу та трансформації
(Chou et al. 1995; Nilius et al. 1997), здається актуальним з’ясувати
функціональні властивості і роль ОРАК у ракових клітинах простати та
визначити фактори, що беруть участь у модуляції роботи цих каналів.
Особливий інтерес становить дослідження того, яким чином модифікується
робота ОРАК та ефективність РВО при нейроендокринному диференціюванні
клітин карциноми простати, оскільки збільшення популяції нейроендокринно
диференційованих (НЕД) клітин в тканині залози корелює з агресивністю
канцерогенезу і переходом до андроген-незалежної стадії раку, для якої
досі немає ефективної терапії. Дослідження АТФ-чутливості ICl,swell, а
відтак і РВО також є актуальним, бо зараз з’являється все більше робіт,
що описують нові методи протиракової терапії, котрі полягають у
вилученні з ракових клітин АТФ (Geschwind et al. 2002; Martin et al.
2000).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в тому, щоб визначити
фізіологічні і біофізичні властивості об’ємактивованої хлорної
провідності в клітинах карциноми простати лінії LNCaР і дослідити як ці
властивості модифікуються при нейроендокринному диференціюванні клітин.
Також ми ставили собі за мету визначити вплив внутрішньоклітинного АТФ
на функції ОРАК в контрольних та нейроендокринно-диференційованих
клітинах і зробити висновки про структурну організацію
об’ємрегульованого хлорного каналу та фактори, що беруть участь в
переході клітин раку простати від андроген-залежної до
андроген-незалежної стадії росту. Для цього були сформульовані такі
завдання:

відтворити експериментальні умови, що дозволяють адекватно реєструвати
об’ємактивований хлорний струм ICl,swell у клітинах LNCaР;

вивчити властивості ICl,swell у клітинах LNCaР (чутливість до змін
клітинного об’єму, характеристики активації і потенціалзалежної
інактивації); отримати дані про можливу участь відомих клонованих білків
у формуванні ОРАК;

визначити зміни об’ємчутливої аніонної провідності, ефективності РВО та
молекулярні механізми, що лежать в основі цих змін при нейроендокринному
диференціюванні клітин карциноми простати людини;

з’ясувати роль внутрішньоклітинного АТФ у функціонуванні ОРАК та
визначити особливості АТФ-чутливості ICl,swell в
нейроендокринно-диференційованих клітинах;

на підставі отриманих результатів зробити висновки про можливі шляхи
переходу клітин раку простати від андроген-залежного до
андроген-незалежного росту та протиапоптичної резистивності і визначити
можливі варіанти фармакологічного впливу на цей перехід.

Наукова новизна. Всі експериментальні дані, представлені в роботі,
отримані вперше. Вперше виявлено збільшення амплітуди і прискорення
реакції на гіпотонічність об’ємчутливого хлорного струму при
нейроендокринному диференціюванні клітин карциноми простати людини лінії
LNCaP. Вперше виявлені зміни кальцій-залежності ICl,swell, пов’язані зі
зменшенням інгібіторного впливу на ICl,swell з боку депо-керованих
кальцієвих каналів при нейроендокринному диференціюванні клітин
простати. Вперше виявлено кореляцію між величиною об’ємчутливого
хлорного струму та рівнем експресії ClC-3 білка хлорного каналу, що може
бути частиною або регулятором ендогенного ОРАК. Вперше показано
модуляторний вплив АТФ на характеристики об’ємчутливого хлорного струму
в клітинах LNCaP і визначено, що при нейроендокринному диференціюванні
клітин АТФ-чутливість струму знижується. Вперше показана пряма блокуюча
дія йонів магнію на об’ємрегульований хлорний канал в клітинах LNCaP.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані мають як
теоретичне значення, оскільки сприяють більш глибокому розумінню будови,
функціонування і фізіологічної ролі об’ємрегульованого хлорного каналу;
так і практичне, оскільки визначають потенційні мішені для
терапевтичного впливу на андроген-незалежну стадію раку простати.
Очевидно, дієвим може виявитись фармакологічний вплив, що полягає в
блокуванні об’ємрегульованого хлорного струму з метою підвищення
проапоптичного потенціалу злоякісних клітин простати.

Особистий внесок здобувача. Експерименти по вимірюванню РВО, визначенню
рівня експресії ClC-3 та Bcl-2 та вимірюванню рівня апоптичних процесів
в клітинах були проведені в співпраці з професором Р. Скримою –
співробітником лабораторії клітинної фізіології, керованої професором Н.
Преварською, Університету Наук і Технологій м. Ліль (Франція). Всі інші
електрофізіологічні експерименти й обробка експериментального матеріалу
були виконані автором особисто. Культивування клітинної лінії LNCaР
проводилося старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України к.б.н. Н. Х. Погорєлою. Обговорення
результатів досліджень, планування експериментів і формулювання
висновків проводилося разом з науковим керівником доктором біологічних
наук, професором Шубою Я. М.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися на конференції для молодих вчених Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця (Київ, 2003); Першому Українському конгресі з клітинної
біології (Львів, 2004), на літній школі IBRO (Ялта, 2004), Першій
міжнародній науковій конференції для студентів та аспірантів „Молодь і
поступ в біології” (Львів, 2005), семінарах в Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця (Київ, 2003 – 2004).

Публікації. Результати досліджень опубліковані в чотирьох наукових
статтях і шести тезах конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів
досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних
джерел з 249 найменувань. Робота викладена на 149 сторінках та містить
35 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Культура клітин. Клітини лінії LNCaP (American Type Culture Collection)
культивували в середовищі RPMI 1640 (Biowhittaker, Франція) з додаванням
5 ммоль/л L-глутаміну (Sigma, США), 10%-ї ембріональної бичачої
сироватки (Poly-Labo, Франція), 50000 од/л пеніциліну та 50 мг/л
стрептоміцину. Клітини вирощували у флаконах, об’ємом 50 мл при 37 оС в
інкубаторі зі зволоженою атмосферою 95% повітря та 5% СО2. Для
електрофізіологічних досліджень клітини висаджувались в чашки Петрі,
покриті поліорнітином (Sigma, США), і використовувались протягом 4-6
діб.

Для нейроендокринного диференціювання клітини інкубувалися з 1 ммоль/л
ДБ-цAMФ (N6,2′-O-dibutyryladenosine 3′:5′ – cyclic monophosphate Sodium
salt, Sigma, США) протягом трьох діб. Також використовувалась методика
диференціювання клітин в нейроендокринний фенотип шляхом тривалої
інкубації в безстероідному середовищі. Фотографії клітинних популяцій
були зроблені з використанням мікроскопа Leitz Diavert, США в фазовому
контрасті на плівці Micrat Isopan.

Електрофізіологічний експеримент і розчини.

Мембранні струми в LNCaP клітинах реєструвалися з використанням методики
“петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина”.

Інтегральні струми вимірювались у відповідь на стимуляцію клітини
імпульсами потенціалу, що складалися з плато при + 100 мВ, плато при –
100 мВ та лінійно-змінного відрізка між ними. Такий протокол дозволяв
одночасно відслідковувати потенціалзалежність, амплітуду та
характеристики випрямлення струму. Об’ємрегульований хлорний струм
розвивався внаслідок переведення клітин в ТЕА-вмісний гіпотонічний
зовнішній розчин та наступного набрякання клітин. Струм, що
спостерігався перед індукцією набрякання, вважався за базовий.

Осмотичність ізо- та гіпотонічних розчинів складала 310 та 190 мосмоль/л
відповідно. В експериментах використовувався зовнішньоклітинний
гіпотонічний розчин такого складу (ммоль/л): CaCl2 – 2, MgCl2 – 2,
Glucose – 10, HEPES – 10, TEACl – 80; в ізотонічному розчині – TEACl –
145.

Реєструючу піпетку заповнювали таким внутрішньоклітинним розчином
(ммоль/л): KOH – 100, KCl – 40, MgCl2 – 1 (або без MgCl2), HEPES – 10,
EGTA – 8, Mg-ATФ – 5 (або 5 Na-AТФ, або без АТФ), CaCl2 – 2,6; рН 7.2
(доводили L-глутаміновою кислотою). За такого складу розчину
концентрація вільного кальцію в клітині підтримувалась на рівні 1*10-7
моль/л. Опір реєструючої піпетки перебував в межах 3-5 МОм.

Для блокування ендогенної продукції АТФ в клітинах LNCaP у штучний
внутрішньоклітинний розчин додавалися (мкмоль/л): 40 олігоміцину, 5
йодоацетату, 20 ротенону. Крім того, перед використанням в
електрофізіологічному досліді клітини інкубувались протягом 25-35 хвилин
в середовищі зі 100 нмоль/л ротенону та 5 ммоль/л 2-деоксиглюкози.
Метаболічні інгібітори додавались із концентрованих розчинів, розведених
в DMSO. Кінцева концентрація DMSO у внутрішніх розчинах складала 0,15%.

Зміни зовнішнього розчину проводили за допомогою багатоствольної
мікропіпетки зі спільним витоком. Повна зміна зовнішнього розчину
відбувалася за час не більший за 1 с. Усі реактиви, які використовували
для приготування розчинів були від фірми “Sigma”. Експерименти проводили
з використанням підсилювача фірми “Dagan”, (США) у комплексі з
персональним комп’ютером.

Молекулярно-біологічні методи.

При дослідженні молекулярної природи ОРАК використовувались методики RT
PCR (з використанням гуанідіум тіоціанат-фенол-хлороформової процедури
для виділення мРНК (Chomczynski & Sacchi 1987); та праймерів для
ампліфікації RT-генерованої кДНК ClC-3:
5’-GGCAGCATTAACAGTTCTACAC-3’(нуклеотиди 675-696), номер доступу
NM_001829) і 5’-TTCCAGAGCCACAGGCATATGG-3’ (нуклеотиди 1207-1188),
синтезованих за послідовностями з GenBank); та Western blot з
використанням електроблотера (BioRad). Блотинг проводився за визначеною
процедурою. Вторинні антитіла до ClC-3 були кон’юговані з пероксидазою
хрону. Хемолюмінісценція визначалась за допомогою Super Signal West Pico
хемолюмінісцентного субстрату за інструкціями виробника. Інтенсивність
сигналу оцінювалась денситометрією, рівень експресії досліджуваного
білка порівнювався з рівнем ендогенного кальнексину для кожного
експерименту.

Рівень апоптозу визначався за кількістю апоптичних тілець, що
візуалізуються при забарвленні за Гьохстом, як детально описано в роботі
Skryma et al (Skryma R. et al. 2000).

Аналіз даних і статистика. Для реєстрації струмів використовувалось
програмне забезпечення pCLAMP-8 (Axon Instruments, США). А для обробки
та аналізу результатів – Origin-7 (Microcal, США). Результати
представлені у вигляді середніх значень ? стандартна похибка. Кожен
експеримент повторювався кілька разів. Для статистичного порівняння
середніх значень використовувався критерій Стьюдента, і різниця з Р<0.05 вважалася за достовірну.РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬЗміни РВО і ОРАК при нейроендокринному диференціюванні клітин раку простати. За критерії нейроендокринного диференціювання клітин LNCaP ми вважали морфологічні зміни – нейритоподібне видовження відростків та збільшення експресії клітинами нейроспецифічних енолаз. В попередніх роботах було показано, що в LNCaP клітинах у відповідь на зниження осмотичності зовнішнього розчину розвивається Cl- струм, ICl,swell, величина якого корелює з рівнем набрякання клітин (Shuba et al. 2000). Також було доведено, що цей струм бере участь в процесі РВО (Lemonnier et al. 2002).Експозиція до гіпотонічного розчину спричинювала активацію такого самого струму і в нейроендокринно-диференційованих клітинах LNCaP. Однак спостерігалися дві помітні відмінності: ICl,swell в НЕД клітинах характеризувався прискоренням розвитку та збільшенням амплітуди, порівняно з контролем.Рис.1. Морфологічні зміни клітин карциноми простати лінії LNCaP при нейроендокринному диференціюванні (НЕД) через 2 доби та 5 діб після пасажу. Калібровка 100 мкм.Струм, що розвивався в гіпотонічних умовах мав ознаки зовнішнього випрямлення та потенціал реверсії -19 мВ (контроль) і - 22 мВ (нейроендокринні клітини), що досить близько до розрахункового рівноважного потенціалу для іонів хлору (-17,5 мВ); а амплітуда струму при нейроендокринному диференціюванні майже в 2 рази перевищувала контрольний рівень. При + 100 мВ густина ICl,swell в НЕД клітинах складала 88?7 пкА/пкФ, (n = 10), проти 42?2 пкА/пкФ, (n = 11) в контролі.Рис.2. Потенціал-залежність ICl,swell в контрольних та НЕД клітинах LNCaP.А: оригінальні записи струмів у відповідь на протокол стимуляції, зображений над контролем. Б: усереднені вольт-амперні характеристики струмів, що розвиваються за гіпотонічних умов в контрольних (n=10) та нейроендокринно-диференційованих клітинах (n=11). В: пронормовані вольт-амперні характеристики, котрі демонструють майже однакове помірне зовнішнє випрямлення.Усереднені вольт-амперні характеристики активованих набряканням струмів в контрольних і нейроендокринно диференційованих клітинах (див. рис. 2.В) не зважаючи на різницю в амплітуді демонстрували однакове помірне вихідне випрямлення, що є додатковим доказом на користь того, що зареєстрований струм – ICl,swell.На додаток до збільшення густини ICl,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах характеризувався більш швидкою активацією у відповідь на гіпоосмотичність.Рис.3. Кінетичні характеристики ICl,swell в клітинах LNCaP. А: часова залежність розвитку струму в контрольних та НЕД клітинах LNCaP. Б: затримка та розвиток струму. В НЕД - клітинах прискорюється реакція ICl,swell на гіпотонічність.Це проілюстровано у вигляді нормалізованих кривих часозалежності активації ICl,swell на рис. 3А. Швидкість реакції струму на гіпоосмотичність також визначалась шляхом обчислення латентного періоду та, власне, періоду розвитку струму (рис. 3Б). Затримка та розвиток струму в контролі складали 24?2,4 с та 110?7,5 с; в той час як в НЕД клітинах - 15?1,7с та 90?5,6 с відповідно.Ми також досліджували потенціал-залежну інактивацію ICl,swell в контрольних та нейроендокринно-диференційованих клітинах LNCaP, що також є однією з характерних рис цього струму. Досліджувані струми справді виявляли здатність до інактивації при потенціалах вищих за + 40 мв, однак, експоненційна апроксимація інактиваційної фази струму при +120 мВ в середньому не виявляла достовірної різниці часових констант інактивації між контрольними (?ін = 197?31 мс) і нейроендокринно диференційованими (?ін = 234?38 мс) клітинами.Підвищення амплітуди і прискорення реакції на набрякання клітини в нейроендокринно диференційованих клітинах, теоретично, мало б вести до більш ефективної відповіді на індуковане гіпотонічністю збільшення об’єму клітини. Рис. 4 показує, що наші очікування справджуються і максимальний об’єм нейроендокринно диференційованих клітин збільшується лише на 30%, в той час як в контрольних клітинах – на 50%, таким чином, можна припустити, що при нейроендокринному диференціюванні клітин раку простати відбувається більш ефективна регуляція об’єму внаслідок потенціації ICl,swell.Молекулярна основа посилення ICl,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах. На жаль, молекулярна природа ОРАК, що переносять ICl,swell не відома. З багатьох кандидатів на цю роль лише ClC-3 все ще розглядається як варіант, тому, намагаючись знайти пояснення посиленню ICl,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах, ми вирішили перевірити гіпотезу про участь ClC-3.Рис.4. Зміни РВО при нейроендокринному диференціюванні клітин LNCaP. НЕД-клітини демонструють відносно менше збільшення об’єму у відповідь на гіпотонічність, порівняно з контрольними LNCaP клітинами.Висота стовпчиків відповідає середньому проценту зміни клітинного об’єму, виміряному за допомогою проточного цитометра на принаймні 5000 клітин.Як показано на рис. 5, ClC-3 транскрипт (А) і білок (Б) помітно експресуються в контольних LNCaP клітинах і експресія значно зростає при нейроендокринній диференціації.Паралельне визначення рівня експресії антиапоптичного білка BСL-2 показало, що він не змінюється при диференціації (Б), що узгоджується з наявністю Bcl-2 незалежних механізмів протиапоптичної стійкості нейроендокринно диференційованих клітин. Такий характер експресії ClC-3 дозволяє нам зробити висновки, що ClC-3 може грати певну роль в ICl,swell в клітинах LNCaP та посилення ICl,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах може, принаймні частково, бути наслідком підвищення рівня експресії ClC-3.Ca2+-залежна регуляція ICl,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах карциноми простати лінії LNCaP. Наступним фактором, що може впливати на величину ICl,swell є зміна Са2+-залежної регуляції ОРАК. Справді, попередні дослідження показали, що:ОРАК, котрі переносять ICl,swell в LNCaP клітинах, ефективно інгібуються кальцієм, котрий входить в клітину через депо-керовані кальцієві канали (SOCs). Цей факт дозволяє говорити про просторову колокалізацію двох типів каналів в плазматичній мембрані (Lemonnier et al. 2002)Нейроендокринне диференціювання LNCaP клітин супроводжується зменшенням ISOC, найвірогідніше внаслідок зниження кількості активних SOC-каналів (Vanoverberghe et al. 2004).Ці дані вказують на те, що нейроендокринна диференціація може також змінювати характер кальційзалежної регуляції ICl,swell. Щоб підтвердити таке припущення, ми експонували клітини до інгібітора SERCA-помпи ендоплазматичного ретикулума – тапсигаргіну (TG), котрий сприяє спустошенню внутрішньоклітинних кальцієвих депо. Рис.6 показує, що вплив 0,1 мкмоль/л TG в присутності 5 ммоль/л зовнішнього кальцію веде до майже 50% зниження ICl,swell в контрольних LNCaP клітинах і це узгоджується з раніше постульованими механізмами Са2+-залежної регуляції. На противагу, аналогічні експерименти з НЕД клітинами не виявили значного ефекту TG (спостерігалось зниження струму на 2,7?2,1 %).Рис.5. Зміни експресії ClC-3 при нейроендокринному диференціюванні клітин LNCaP.А: RT-PCR аналіз експресії ClC-3 транскрипту в контрольних LNCaP клітинах та при нейроендокринному диференціюванні. Б: Western Blot з ClC-3 та Bcl-2 специфічними антитілами. В: усереднені часові залежності розвитку ICl,swell у відповідь на гіпоосмотичність. ICl,swell в контрольних клітинах зменшується в присутності специфічних антитіл до ClC-3 (n=6), порівняно з контролем (в присутності інактивованих ClC-3 специфічних антитіл , n= 8).Відсутність ефекту TG на ICl,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах узгоджується з попередніми даними про те, що нейроендокринна диференціація веде до зниження депо-керованого входу кальцію в клітину. Такі зміни кальцієвої регуляції ОРАК на додаток до збільшення експресії ClC-3, очевидно, роблять свій внесок в посилення ICl,swell при нейроендокринному диференціюванні LNCaP клітин.Додатковим доказом правильності такого припущення є те, що в НЕД клітинах спостерігається менший інгібіторний вплив йонів кальцію при зміні підтримуваного потенціалу від -50 до -80 мВ (рис. 6Б,В) та присутності 2ммоль/л Са2+ в зовнішньоклітинному розчині (коли зростає базальний вхід Са2+ через депо-керовані канали) порівняно з контрольними LNCaP.Рис.6. Нейроендокринна диференціація зменшує інгібування ICl,swell тапсигаргін-індукованим входом Са2+ через депо-керовані канали. А: усереднені нормовані часові залежності індукованого набряканням ICl,swell при експозиції до 0,1 мкмоль/л тапсигаргіну в присутності 5 ммоль/л зовнішньоклітинного Са2+; амплітуда вимірювалась при +100 мВ і нормувалася до максимального значення фази активації та безпосередньо перед аплікацією тапсигаргіну. Б: оригінальні записи струмів за умов, коли змінюється депо-керований базальний вхід кальцію: при зміні підтримуваного потенціалу від –50 до –80 мВ та концентрації зовнішньоклітинного Са2+ від 2 до 0 ммоль/л; В: усереднені значення амплітуди ICl,swell, порівняно з амплітудою при 2Са2+, -50 мВ, взятою за 100% для контрольних (n=6), та НЕД-LNCaP (n=6), P<0.05, різниця статистично достовірна.Майже дворазове зростання ICl,swell і, разом з тим, зменшення функціональна експресія депо-керованих кальцієвих каналів спостерігається також в андроген-незалежних LNCaP/Bcl-2 клітинах, котрі набувають здатності до гормон-незалежності внаслідок надекспресії в них протиапоптичного білка Bcl-2 (Vanoverberghe et al. 2004). Можна припустити, що власне для переходу клітин карциноми простати від андроген-залежного до андроген-незалежного росту мають певне значення перебудови кальцієвої сигналізації в клітинах (зменшення кальцієвого входу через депо-керовані канали) та посилення внаслідок зазначених змін об'ємрегульованого хлорного струму.Наші дані вказують на те, що блокатори ICl,swell не перешкоджають, а навпаки, сприяють підвищенню рівня апоптозу (рис. 7). Відтак, можна припустити, що цей струм є важливим елементом, котрий сприяє кращому виживанню клітин, і що протиапоптична стійкість LNCaP клітин пропорційна до величини ICl,swell. Той факт, що блокатори ICl,swell впливають на апоптоз в нормотонічних умовах вказує на те, що існує якась фонова активність струму, котра, ймовірно, за певних умов може призводити до зморщення клітин і їхньої апоптичної загибелі. Оскільки такого не відбувається, очевидно, процеси РВО та АЗО (апоптичного зменшення об’єму) реалізуються через різні механізми.Рис. 7 Вплив блокаторів ICl,swell на апоптоз. Гістограми демонструють процент апоптичних клітин при культивуванні протягом 48 годин в стандартних умовах; в присутності окремо індуктора апоптозу TNF? (10 нг/мл), або разом з блокаторами ICl,swell – NPPB (100 мкмоль/л) чи DIDS (50 мкмоль/л); усереднені дані±стандартна похибка, n=4 для кожної з умов.Рис.8. Потенціалзалежність об’ємчутливого хлорного струму(ICl,swell) в клітинах лінії LNCaP під впливом АТФ та Mg2+. A : показові оригінальні записи струмів в клітинах, діалізованих штучним внутрішньоклітинним розчином без вмісту АТФ чи Mg2+ з блокаторами синтезу АТФ (в контролі); в присутності 5 ммоль/л Na-ATP чи Mg-ATP (при дослідженні впливу АТФ); та в присутності 1 ммоль/л Mg2+ (для визначення ефекту Mg2+). У випадку АТФ-ефекту струми більшої амплітуди розвивалися за присутності 5 ммоль/л Na-AТФ в піпетці; Б: усереднені вольт-амперні характеристики ICl,swell, побудовані за лінійно-змінною ділянкою протоколу стимуляції: квадратики – в контролі (n= 10), кружечки - під впливом внутрішньоклітинного магнію (n= 7) та трикутнички – під дією АТФ (n= 26); В: усереднені значення максимальної густини об’ємчутливого хлорного струму : в контролі (54,6 ? 4,6 пА/пФ при +100 мВ та –14,4 ? 2,6 при –100 мВ); під впливом Mg2+ ( 38,8 ? 5,8 пА/пФ, та –10,9 ? 2); під впливом АТФ ( 70,3 ? 4,1 та –15 ? 1,4 пА/пФ).Вплив внутрішньоклітинного АТФ на характеристики ICl,swell в клітинах LNCaP. Амплітуда ICl,swell в контрольних клітинах LNCaP істотно зростала в присутності АТФ в цитозолі, і зменшувалась під дією йонів Mg2+. Так, коли за відсутності АТФ в піпетці клітини демонстрували струм густиною 54,6?4,6 пА/пФ (n=10) при потенціалі +100 мВ, то в присутності АТФ (Na-ATP) ця величина зростала до 70,3?4,1 пА/пФ (n=26, р= 0,037) (зростання на 29,7%). Додавання йонів магнію, зменшувало амплітуду струму до 38,8?5,8 пА/пФ (n=7, p=0.048)(на 30,6%). Усереднені значення густини струмів представлені на рис. 8.Як в контролі, так і в під дією АТФ чи Mg2+ ICl,swell, реєстрований у відповідь на ступінчасту стимуляцію від підтримуваного потенціалу –60 мВ до потенціалів вищих за +40 мВ виявляв залежну від часу інактивацію, рівень якої зростав з підвищенням деполяризації (рис. 9А). При +120 мВ зменшення струму внаслідок інактивації можна було описати як суму спадаючої експоненти та її постійного компонента. Стала часу інактивації струму (?in) в контролі при +120 мВ складала 150,4?17,1 мс (n=10), при дії АТФ - 157,6?10,9 мс (n=26), та 155,5?22,6 мс при впливові йонів магнію (n=7). Усереднені нормовані значення струмів при +120 мВ під дією АТФ та Mg2+ представлені на рис. 9Б.po. v ? i oeEHuyhe`? hUkhUkhUkhUkhUkNPRTlnp???f°g?g.hEn o8w:w

Похожие документы
Обсуждение
    Заказать реферат
    UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2018