ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

КЛЕВЕТА ГАЛИНА ЯРОСЛАВІВНА

УДК: [517.151.6+612.419+612.33]:504.054+577.161.3

Вплив іонізуючої радіації низької інтенсивності та вітаміну Е на систему
антиоксидантного захисту тканин із високою проліферативною активністю

03.00.04-біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів-2005 Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка

МОН України.

Науковий керівник — кандидат біологічних наук, доцент

Чайка Ярослав Петрович,

Львівський національний університет імені Івана Франка,

завідувач кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин;

доктор біологічних наук, професор

Фіра Людмила Степанівна,

Тернопільська державна медична академія

ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою.

Провідна установа — Київський національний університет ім. Т. Шевченка

(кафедра біохімії), МОН України, м. Київ

Захист відбудеться «12» квітня 2005 р. о 10 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35 368.01 в Інституті біології тварин УААН

за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий «11» березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема наслідків дії на людину і тварин іонізуючого
випромінювання малих доз і потужностей сьогодні набула особливої
гостроти та актуальності внаслідок зростання їхнього шкідливого впливу
на організм. Це зумовлено не лише забрудненням довкілля радіонуклідами,
до якого призводять радіоактивні викиди та аварії на АЕС, а також
ураженням за умови виробництва та при застосуванні методів лікування з
використанням радіоактивних ізотопів.

На малі дози іонізуючого випромінювання організм реагує розвитком
оксидативного стресу, що супроводжується генерацією активних форм кисню
(АФК) та активацією процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ)
(Барабой В.А, 1994; Зенков Н.К. и др., 2001). Залежно від концентрації,
АФК виявляють регуляторний або цитотоксичний ефект (Дубинина Е.Е., 2001;
Турпаев К.Т., 2002; Ochsner U.A., 2000). Пошкоджувальна дія АФК на
клітини простежується за умов їхньої посиленої генерації та виснаження
системи антиоксидантного захисту (АОЗ). З огляду на це, особливо
актуальним є використання природних радіозахисних та протистресових
антиоксидантів.

Відомо, що вітамінам групи Е, передусім ?-токоферолу, притаманні
антиоксидантні властивості, що зумовлено наявністю в молекулі
хроманового кільця – головної “пастки” вільних радикалів. Токофероли
реагують з О2- (Goton N. et al., 1992), О21 (Kaiser S. et al., 1990),
ROO· (Zhou Y. C., 1991), OH· (Miura T. et al., 1993), інгібуючи
індуковані ними процеси ПОЛ. Дія вітаміну Е у клітинах може бути
комплексною і зумовленою як антиоксидантними властивостями, так і
взаємодією з токоферолзв’язувальними білками (ТЗБ) (Капралов А.А. и др.
1993; Донченко Г.В., 2002). Незважаючи на велику кількість даних про
широкий спектр біологічної та терапевтичної дії вітаміну Е в організмі
людини і тварин, літературні дані щодо його радіопротекторних
властивостей за різних доз випромінювання є досить суперечливими
(Донченко Г.В., 1993; Барабой В.А. та ін., 1994; Azzi A. et al., 2002).

У разі дії на організм іонізуючого випромінювання низької інтенсивності
(ІВНІ) ураження зазнають, передусім, мембранні структури клітин з
високим рівнем проліферації – ентероцити тонкого кишківника (Степанова
С.І. та ін., 1999; Кучеренко М.Є. та ін., 2003), а також клітинні
елементи кісткового мозку (Гродзинський Д.М., 2000). З цих позицій,
дослідження корекції радіоіндукованих ефектів у клітинах радіочутливих
тканин шляхом введення вітаміну Е має науково-практичне і теоретичне
значення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках науково-дослідної теми Бх-13б “Дослідження
мембранотропної дії малих доз хронічного рентгенівського опромінення
низької потужності” кафедри біохімії Львівського національного
університету імені Івана Франка за 2000 — 2002 р.р. (№ держреєстрації
0100U001438). Здобувач виконала препаративне виділення клітин кісткового
мозку (КМ) та ентероцитів (ЕН) тонкого кишківника; дослідила
інтенсивність процесів ПОЛ та активність ензимів АОЗ.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати особливості
динаміки процесів ПОЛ за умов ІВНІ та роль ензимів АОЗ у попередженні
радіоіндукованих порушень в ентероцитах тонкого кишківника і клітинах
кісткового мозку щурів, а також експериментально встановити ефективність
корекції цих змін шляхом введення препаратів вітаміну Е з різною
довжиною бічного ланцюга.

Для досягнення мети потрібно було вирішити такі завдання:

дослідити хронічний вплив ІВНІ у дозах 10 — 30 сГр на динаміку процесів
ПОЛ і стан ензимів АОЗ у клітинах тонкого кишківника та кісткового мозку
щурів;

порівняти характер змін досліджуваних показників у нормі та за умов
рентгенівського опромінення у щодобовій дозі 1 сГр в ентероцитах та
клітинах гранулоцитарно-моноцитарного і еритроїдного рядів КМ;

визначити активність ензимів АОЗ за умов радіаційного впливу та в
пострадіаційний період у клітинах з високим рівнем проліферації;

з’ясувати ефективність застосування препаратів вітаміну Е з різною
довжиною бічного ланцюга – фармакопейного ?-токоферолацетату (?-ТФА) та
його коротколанцюгового похідного (?-ТФАС6) для корекції порушень
прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу у клітинах радіочутливих
тканин за дії ІВНІ;

виконати порівняльний аналіз коригувальної дії досліджуваних препаратів
в ентероцитах тонкого кишківника та клітинах кісткового мозку за умов
пролонгованого впливу рентгенівського випромінювання.

Об’єкт дослідження – оксидативний стрес за хронічної дії малих доз
радіації низької потужності та коригувальний ефект вітаміну Е.

Предмет дослідження – процеси ПОЛ та активність ензимів АОЗ в
ентероцитах тонкого кишківника та клітинах кісткового мозку щурів.

Методи досліджень. Гравіметричний метод розділення клітин КМ та метод
препаративного виділення ЕН тонкого кишківника. Кількісну оцінку
біохімічних показників оксидативного стресу (вміст дієнових кон’югатів
та ТБК-позитивних продуктів) та активність ензимів АОЗ
(супероксиддисмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази (ГПО) та
глутатіонредуктази (ГР)), а також концентрацію білка визначали із
застосуванням методів спектрофотометрії та колориметрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджено хронічний вплив
ІВНІ у щодобовій дозі 1 сГр (потужність дози 0,042 мГр?с-1) на
прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз ЕН та клітин
гранулоцитарно-моноцитарного ряду (ГМР) і еритроїдного ряду (ЕР)
кісткового мозку. Встановлено інтенсифікацію процесів пероксидоутворення
у тканинах з високим ступенем радіочутливості, що супроводжується
активацією ензиматичної складової АОЗ. Максимальний рівень активності
досліджуваних ензимів виявлено в період після припинення дії
опромінення, що свідчить про пролонгованість віддалених ефектів малих
доз радіації. Зафіксовано коливні зміни активності ензимів АОЗ за умов
рентгенівського випромінювання у дозах 10 — 30 сГр та у пострадіаційний
період.

Уперше комплексно досліджено сукупну дію іонізуючої радіації за сумарної
поглинутої дози 10, 20, 30 сГр та препаратів вітаміну Е з різною
довжиною бічного ланцюга – фармакопейного ?-ТФА та ?-ТФАС6 на систему
окиснювального гомеостазу у тканинах з високим рівнем проліферації
клітин. Введення вітаміну Е впродовж пролонгованої дії малих доз
радіації, знижувало накопичення продуктів ПОЛ та нормалізувало
прооксидантно-антиоксидантну рівновагу в досліджуваних клітинах.
Порівняльний аналіз дії коротколанцюгового ?-ТФАС6 та фармакопейного
?-ТФА за умов ІВНІ свідчить про вираженіший антиоксидантний вплив ?-ТФА.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень
розширюють та поглиблюють існуючі уявлення про вплив малих доз
іонізуючого випромінювання на стан анти- та прооксидантної систем тканин
з високою проліферативною активністю клітин. Дослідження коригувальної
дії вітаміну Е на систему окиснювального гомеостазу можуть слугувати
науковим обгрунтуванням для розробки методів корекції метаболічних
порушень за умов низькоінтенсивного опромінення. Отримані дані щодо
впливу фармакопейного ?-ТФА та його коротколанцюгового похідного –
?-ТФАС6 на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз за умов опромінення
дають змогу рекомендувати використання фармакопейного препарату вітаміну
Е як ефективнішого, для коригування наслідків оксидативного стресу,
індукованого пролонгованою дією ІВНІ. Теоретичні узагальнення роботи
впроваджені у наукову і навчальну роботу Львівського національного
університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Дисертант виконала весь обсяг
експериментальних досліджень, статистичне опрацювання результатів, пошук
та аналіз наукової літератури з теми кандидатської дисертації.
Планування досліджень, аналіз та інтерпретацію результатів роботи
проведено за участю наукового керівника канд. біол. наук, доц. Я.П.
Чайки та канд. біол. наук, доц. Л.С. Старикович. Тварин опромінено за
участю ст. наук. співроб. Л.О. Дацюка. В експериментах використано
препарати вітаміну Е, які люб’язно надані д-ром біол. наук, член-кор.
НАН України Г.В. Донченком (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН
України).

Апробація результатів дисертації. Головні положення дисертаційної роботи
представлені на IV з’їзді з радіаційних досліджень “Радиобиология,
радиоэкология, радиационная безопасность” (Москва, 2001), VI Міжнародній
конференції “Биоантиоксидант” (Москва, 2002), ІІІ Українському
біофізичному з’їзді (Львів, 2002), VIІІ Українському біохімічному з’їзді
(Чернівці, 2002), Міжнародній науковій конференції “Molecular mechanisms
of cell activation biological signals and their target ensymes”
(Wroclaw, 2002), ІІІ Міжнародному симпозіумі “Механизмы действия
сверхмалых доз” (Москва, 2002), 7-й Пущинській школі-конференції молодих
вчених “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2003), ІІІ з’їзді з
радіаційних досліджень “Радіобіологія, радіоекологія” (Київ, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових
наукових виданнях та 8 тез доповідей у збірниках матеріалів з’їздів і
конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів
досліджень аналізу і узагальнення отриманих результатів, висновків та
списку джерел (240 позицій найменувань). Робота викладена на
134  сторінках, проілюстрована 18 рисунками та 7 таблицями, які займають
9 сторінок друкованого тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури проаналізовано сучасні уявлення щодо основних
підходів до оцінки біологічного ефекту малих доз радіації, детально
висвітлено участь АФК у реалізації ефектів іонізуючого випромінювання, а
також роль ензимів АОЗ у попередженні радіоіндукованих порушень.
Особлива увага приділена аналізу нових аспектів дії вітаміну Е та
перспективам його практичного використання.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження виконані на статевозрілих
безпородних щурах масою 150 — 180 г, яких утримували в стандартних
умовах віварію. У процесі досліджень використано 144 тварини, яких
розподіляли на групи: перша ? інтактні щури (контроль); друга – тварини
опромінені впродовж 30 діб у дозі 1 сГр на апараті РУМ-17 (напруга 140
кВ, сила струму 4 мА, фільтри 0,5 мм (Cu) та 1 мм (Al), шкірно-фокусна
відстань 178 см, потужність дози – 0,042 мГр?с-1); третя – тварини,
використані для досліджень на 40-, 50-, 60-ту доби експерименту, після
припинення 30 — добового опромінення. Тваринам четвертої групи вводили
per os, розчинений на оливковій олії фармакопейний ?-ТФА у дозі 47 мг/кг
маси тварини один раз за три дні впродовж 30 — добової дії іонізуючої
радіації. Щури п’ятої групи отримували ?-ТФА у зазначеній вище дозі один
раз за три дні впродовж 30 діб без опромінення. Тваринам шостої групи
перорально вводили похідне ?-ТФА із вкороченим до С6 бічним ланцюгом –
?-ТФАС6 – в еквімолярній йому дозі 33 мг/кг маси тварини раз за три дні,
впродовж 30 — добової дії іонізуючої радіації. Дози та схеми
застосування досліджуваних препаратів визначали на підставі літературних
даних (Барабой В.А та ін., 1994; Кузьменко И.В. и др., 2002; Петрова
Г.В. и др., 2002).

Інтактні ентероцити слизової оболонки тонкого кишківника (відділ
дванадцятипалої кишки) виділяли за методикою Сухомлинова Б.Ф. та ін.,
1983. Клітини КМ виділяли зі стегнових та гомілкових кісток шляхом
аспірації; фракціонували центрифугуванням суспензії клітин КМ у
тришаровому градієнті густини суміші фікол (Ficol-400, “Pharmacia”,
Швеція) — верографін (Verografin “Spofa”, Чехія) (?1=1,03 г·см-3;
?2=1,09 г·см-3; ?3=1,1 г·см-3) (Сибірна Н.О., 1991). У роботі
використовували лізати ентероцитів та фракціонованих клітин КМ, для
одержання яких цілісні клітини руйнували шляхом заморожування у рідкому
азоті.

Інтенсивність процесів ПОЛ у лізатах досліджуваних клітин оцінювали за
такими показниками: вміст дієнових кон’югатів – за інтенсивністю
поглинання світла кон’югованими структурами гідропероксидів ліпідів у
ділянці 232 нм (Гаврилов В.Б. и др., 1983); вміст ТБК-позитивних
продуктів – за інтенсивністю забарвлення кінцевих продуктів ПОЛ із
2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (Тимирбулатов Р.А. и др., 1981). СОД
активність (супероксид: супероксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1) визначали
методом, що грунтується на відновленні нітротетразолію синього
супероксидними радикалами (Чевари С. и др., 1991), каталазну активність
(пероксид гідрогену: пероксид гідрогену оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) –
за швидкістю розкладу пероксиду водню (Королюк М.А. и др., 1988), ГР
активність (НАД(Ф)Н: окиснений глутатіон оксидоредуктаза, КФ 1.6.4.2.) –
за зниженням вмісту НАДФН при 340 нм у реакції з окисненим глутатіоном
(Прохорова М.И., 1982). ГПО активність (глутатіон: пероксид водню
оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.9) визначали методом, який грунтується на
розвитку кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп із реактивом
Елмана (Моин В.И., 1986). Концентрацію білка визначали
спектрофотометрично за Lowri O.H. et al., 1951. Статистичне опрацювання
результатів виконували загальноприйнятими методами варіаційної
статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Розрахунки та побудову графіків
виконували на комп’ютері з використанням прикладної програми “Microsoft
Excel 98”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Вплив низькоінтенсивного рентгенівського випромінювання на інтенсивність
накопичення продуктів ПОЛ у клітинах радіочутливих тканин. Аналіз
отриманих результатів засвідчив, що у контрольних тварин вміст дієнових
кон’югатів та ТБК-позитивних продуктів в ЕН вищий, ніж у клітинах КМ
(табл. 1). Більша інтенсивність процесів ПОЛ у клітинах тонкого
кишківника зумовлена підвищеним вмістом у них ліпідних компонентів та
значною їхньою різноманітністю (Степанова Л.И. и др., 1999).

Таблиця 1

Вміст дієнових кон’югатів в ентероцитах та клітинах кісткового мозку

за умов низькоінтенсивного опромінення (нмоль·мг-1 білка, M±m).

Тип клітин Контроль

Опромінення, сГр

10

20

30

ЕН 194,1?18,3

(n = 9) 53,2?11,1*

(n = 5) 309,8?14,3*

(n = 5) 269,6?16,0*

(n = 5)

ГМР 154,9?16,0

(n = 7) 245,6?24,0*

(n = 6) 155,0?13,1

(n = 6) 284,1?7,2*

(n = 6)

ЕР 72,7?4,2

(n = 6) 55,3?6,3

(n = 5) 104,1?9,4*

(n = 5) 153,9?10,8*

(n = 5)

Примітка. Тут і далі: * — різниця вірогідна порівняно з контролем
(Р<0,05). За умов ІВНІ у щодобовій дозі 1 сГр встановлено активацію вільнорадикальних процесів за доз 10 - 30 сГр у досліджуваних клітинах. Найінтенсивніше накопичення продуктів пероксидації ліпідів в ЕН зафіксовано за дози 20 сГр: вміст ліпідних гідропероксидів підвищувався на 60% (табл. 1), а ТБК-позитивних продуктів – на 71% порівняно з контролем. У клітинах ГМР та ЕР кісткового мозку максимальний рівень первинних продуктів ПОЛ встановлено на термінальному етапі експерименту (30 сГр), що вище від контролю, відповідно, на 83 та 112%. Вміст кінцевих продуктів ПОЛ максимально перевищував контроль в ЕР за дози 20 сГр (на 465%), а у ГМР – за дози 30 сГр (на 348%). Отримані результати свідчать про більшу чутливість до дії іонізуючого випромінювання клітин КМ. На підставі значень двох отриманих показників ПОЛ – дієнових кон’югатів та ТБК-позитивних продуктів за умов хронічного опромінення ми можемо стверджувати про активацію вільнорадикальних процесів, що свідчить про розвиток оксидативного стресу у клітинах радіочутливих тканин. Стан ензиматичної складової антиоксидантної системи за умов ІВНІ та у пострадіаційний період. Для нормального функціонування і життєдіяльності організму вільнорадикальні реакції повинні підтримуватись на певному рівні завдяки злагодженій дії системи АОЗ. У табл. 2 наведені значення активності основних ензимів АОЗ у тонкому кишківнику та кістковому мозку контрольних тварин. Отримані результати свідчать про те, що внесок ензиматичних антиоксидантів у захист клітини від АФК та продуктів вільнорадикального окиснення є неоднаковим у різних типах клітин, що, передусім, зумовлено різною інтенсивністю метаболічних процесів у них. Таблиця 2 Активність ензимів антиоксидантного захисту в ентероцитах та клітинах кісткового мозку контрольних щурів (M ±m, n = 6). Активність ензимів ЕН ГМР ЕР СОД, МО·хв-1 ?мг-1білка 364,0±22,0 520,0±80,0 120,0±70,0 Каталазна, нмоль Н2О2 ·хв-1 ?мг-1білка 207,0±32,1 20,9±0,8 18,7±1,3 ГПО, нмоль GSH·хв-1 ?мг-1 білка 1,1±0,3 3,7±0,1 2,5±0,2 ГР, нмоль NADPH·хв-1?мг-1білка 68,7±7,4 177,0±19,0 143,0±16,0 За умов пролонгованого впливу опромінення клітини зазнають тривалого оксидативного стресу і, відповідно, реагують зміною ефективності роботи системи АОЗ (Барабой В.А. и др., 1997; Геруш І.В. та ін., 1999; Erden M. et al., 1984). Ефекти, які простежуються в живих організмах після припинення дії іонізуючої радіації, достатньо не з’ясовані, що стало передумовою для дослідження ензиматичної складової антиоксидантної системи у пострадіаційний період. Тривале опромінення щурів у щодобовій дозі 1 сГр зумовлювало зниження СОД активності в ЕН впродовж експерименту (рис. 1, А). У клітинах ЕР та ГМР зафіксовано активацію СОД за дози опромінення 20 сГр на 83 та 418%; вірогідне зниження її активності щодо контролю виявлено лише за дози 30 сГр в ЕР. Наведені закономірності свідчать про вагоміший внесок СОД у знешкодження О2?? за умов радіаційного стресу в клітинах кісткового мозку, аніж в ЕН, що ймовірно, пов’язано з активацією біосинтезу ізоформ СОД, що мають вищу радіорезистентність. Синергістом СОД у клітині є каталаза, яка запобігає накопиченню пероксиду водню. У вибраному діапазоні доз виявлено підвищення її активності у КМ (10 та 30 сГр). В ЕН активація каталази зафіксована лише за дози 10 сГр (на 148%), надалі фазу початкової стимуляції змінило пригнічення активності (20 - 30 сГр), що, ймовірно, є наслідком інгібуючої дії О2?? на фоні низької СОД активності (рис. 1, Б). Рис. 1. Зміни СОД (А) та каталазної (Б) активності за умов іонізуючого випромінювання (10-30-та доби) та у пострадіаційний період (40-60-та доби). Підвищення ГПО активності виявлено на 10- та 30-ту доби у всіх досліджуваних клітинах. Максимальні значення ензиму виявлено на початковому етапі опромінення (10 сГр), що перевищує контроль на 555 (ЕН), 110 (ЕР) та 81% (ГМР) (рис. 2, А). Дані з вивчення ГР корелюють зі змінами ГПО активності, що свідчить про узгодженість дії глутатіонзалежних ензимів (рис. 2, Б). Рис. 2. Зміни ГПО (А) та ГР (Б) активності за умов іонізуючого випромінювання (10 - 30-та доби) та у пострадіаційний період (40 - 60-та доби). Отже, змінам активності ензимів АОЗ у клітинах з високою радіочутливістю за впливу малих доз іонізуючої радіації притаманний нелінійний коливний характер. Дія екстремальних факторів, таких як опромінення, зумовлює підсилення меж коливання завдяки реалізації різних механізмів, у тому числі й біосинтезу ізоформ ензимів (Гусев В.А. и др., 1980). Після припинення впливу радіації, коли сумарна доза опромінення становила 30 сГр, зафіксовано високу активність ензимів АОЗ, що, ймовірно, пов’язане з регенеративними процесами у тонкому кишківнику та підсиленням викиду у кров молодих клітин і, відповідно, утворенням у клітинах-попередниках ізоформ, які мають більшу питому активність. Вітамін Е в корекції метаболічних порушень за хронічного впливу іонізуючого випромінювання низької інтенсивності. Дослідження показників, які характеризують стан мембранних структур підтвердили коригувальний вплив вітаміну Е за умов пролонгованого впливу іонізуючого випромінювання у щодобовій дозі 1 сГр (табл. 3). Таблиця 3 Вміст дієнових кон’югатів в ентероцитах та клітинах кісткового мозку за умов іонізуючого випромінювання та вітаміну Е (нмоль·мг-1 білка, M ± m). Тривалість досліду, доби Тип клітин ЕН ГМР ЕР контроль 194,1±18,3 (n = 9) 154,9?16,0 (n = 7) 72,6?2,1 (n = 6) Опромінення (n = 6) 10-та 53,2?11,1 245,6?24,0* 55,3?2,0 20-та 309,8?14,3* 155,0?13,1 104,1?9,4* 30-та 269,6?16,0* 284,1?25,9* 153,9?10,8* Введення ?-ТФА опроміненим тваринам (n = 5) 10-та 115,9?12,7*** 87,0?6,2*** 138,6?6,8*** 20-та 158,1?9,4*** 113,6?10,9* 171,2?15,0*** 30-та 82,5?3,0*** 204,3?18,7*** 82,5?3,1** Введення ?-ТФАС6 опроміненим тваринам 10-та 154,0?12,5** (n = 8) 91,4?4,2*** (n = 7) 99,7?4,6*** (n = 6) 20-та 169,2?11,4*** (n = 6) 205,9?18,7*** (n = 6) 186,0?28,9** (n = 6) 30-та 92,3?7,1*** (n = 6) 77,1?7,5*** (n = 7) 98,1?10,0** (n = 6) Примітка. Тут і далі: 1. * - різниця вірогідна порівняно з контролем (Р<0,05); 2. ** - різниця вірогідна порівняно з опроміненням (Р<0,05). o - d ” >

h

¬

O

@

B

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

@

$

@

$

@

@

@

OJPJQJ

???`??

?$???

t??

¬»¬$¬UUUUH’kdA

@

@

$

@

@

@

$

@

@

@

@

@

ів на 20 — 30-ту доби, відповідно, на 69 та 46% (Р<0,05), що свідчить про кореляцію накопичення ранніх та кінцевих продуктів ПОЛ. У КМ зниження вмісту дієнових кон’югатів зафіксовано лише у клітинах ЕР (30-та доба). Концентрація кінцевих продуктів ПОЛ знижувалася у ГМР на 30-ту добу (на 56%), а в ЕР – на 20 - 30-ту доби (на 76 та 71%), порівняно з цим же показником за умов опромінення. Використання ?-ТФАС6 зумовлювало зниження концентрації ранніх продуктів ПОЛ в ЕН на 20 - 30-ту доби, відповідно на 61 та 66% порівняно з опроміненням. Вірогідне зниження вмісту кінцевих продуктів зафіксовано лише на 20-ту добу (на 55%). У клітинах ГМР кісткового мозку рівень ліпідних гідропероксидів знижувався, за умов введення ?-ТФАС6 на 10-ту та 30-ту доби, а в ЕР – на 30-ту добу експерименту порівняно з цим же показником при опроміненні без введення вітаміну (табл. 3). Зниження концентрації ТБК-позитивних продуктів у КМ виявлене на термінальних етапах експерименту: в ЕР – на 30-ту добу (на 73%), а в ГМР – на 20 - 30-ту доби (відповідно, на 66 та 63%) порівняно з опроміненням. Антиоксидантна дія фармакопейного ?-ТФА та ?-ТФАС6 ефективніше реалізується на ранніх етапах процесу ПОЛ – на стадії утворення дієнових кон’югатів. Характер дії вітаміну Е у тонкому кишківнику та КМ є неоднаковим, що, ймовірно, пов’язане зі швидкістю його транспортування та особливостями розподілення у різних тканинах. Встановлено підвищення СОД активності в ЕН на 10- та 20-ту доби (відповідно на 163 та 71%) щодо опромінення, причому, на 20-ту добу зафіксовано наближення її до контролю. У клітинах ГМР та ЕР її активність знижувалася на 20-ту добу, як щодо контролю, так і щодо опромінення. Застосування ?-ТФАС6, зумовлювало активацію СОД в ЕН (10 - 20-та доби), відповідно, на 246 та 296% і в клітинах ГМР на 154% (10-та доба) щодо опромінення (рис. 3). Рис. 3. СОД активність в ентероцитах та клітинах кісткового мозку за умов іонізуючого випромінювання та вітаміну Е. За дії іонізуючого випромінювання та препаратів вітаміну Е (?-ТФА і ?-ТФАС6) зафіксовано підвищення каталазної активності в ЕН на 10-ту добу, відповідно, на 265 та 41%, порівняно з контролем. У клітинах ГМР активність ензиму зростала на 30-ту добу експерименту: на 81% (за дії ?-ТФА) та на 78% (за дії ?-ТФАС6). У клітинах ЕР фармакопейний ?-ТФА зумовлював нормалізацію каталазної активності на 20-ту добу, застосування ?-ТФАС6 зумовлювало її зниження порівняно з опроміненням впродовж експерименту. Введення ?-ТФА, незважаючи на дію іонізуючої радіації, практично нормалізувало ГПО активність в ЕН на 20 - 30-ту доби, а його коротколанцюгового похідного – на 30-ту добу. У клітинах КМ наближення активності досліджуваного ензиму до контрольних значень виявлено за умов застосування ?-ТФА (10-та доба), а також на 10-ту та 30-ту доби у разі введення ?-ТФАС6 (рис. 4). Рис. 4. ГПО активність в ентероцитах та клітинах кісткового мозку за умов іонізуючого випромінювання та вітаміну Е. Отже, ?-ТФАС6, подібно до ?-ТФА, виявляє антиоксидантні властивості за умов опромінення у щодобовій дозі 1 сГр, попереджуючи накопичення продуктів ПОЛ, проте останній має вираженішу активність. Коригувальний вплив ?-ТФА на процеси ПОЛ виявлявся починаючи з ранніх етапів експерименту, що, ймовірно, зумовлене ефективною інтеграцією його в біліпідний шар мембрани завдяки наявності довгого бічного ланцюга. Вкорочення останнього знижує можливість взаємодії з біліпідним шаром мембран, тому вплив ?-ТФАС6 менш ефективний та виявляється на пізніших етапах експерименту. Один з можливих шляхів впливу вітаміну Е на активність ензимів АОЗ – це зниження рівня АФК шляхом їхнього знешкодження мембранозв’язаною формою ?-токоферолу. Не виключено, що зміни ензиматичної активності за його участю зумовлені зв’язуванням з ядерними ТЗБ та впливом на транскрипційні процеси. Порівняльний аналіз коригувальної здатності ?-ТФА та його коротколанцюгового похідного на систему прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу у клітинах високорадіочутливих тканин щурів за дії ІВНІ свідчить про вищу ефективність ?-ТФА. З огляду на це, проведені дослідження дають можливість рекомендувати використання фармакопейного ?-ТФА для подальшого глибокого фармакологічного дослідження з метою застосування його для корекції метаболічних порушень індукованих хронічним впливом малих доз іонізуючої радіації. ВИСНОВКИ У дисертації наведено узагальнення та нове вирішення актуальної проблеми розвитку оксидативного стресу за умов низькоінтенсивного опромінення у щодобовій дозі 1 сГр (потужність дози 0,042 мГр·с-1) у клітинах з високою проліферативною активністю та можливості корекції порушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги шляхом введення вітаміну Е. У результаті вирішення наукової проблеми зроблено такі наукові та прикладні висновки. За умов іонізуючого випромінювання у дозах 10 - 30 сГр встановлено активацію ПОЛ у клітинах з високою проліферативною активністю щурів. Максимальне підвищення вмісту дієнових кон’югатів та ТБК-позитивних продуктів зафіксовано в ЕН за дози 20 сГр, що перевищує контроль, відповідно, на 60 та 71%, у клітинах ГМР кісткового мозку – за дози 30 сГр, відповідно, на 83 та 348%, а в ЕР – рівень дієнових кон’югатів зростає на 112% (30 сГр), ТБК-позитивних продуктів – на 465% за дози 20 сГр. Отримані результати свідчать про вищу радіочутливість клітин КМ. З’ясовано, що відповідь організму на дію ІВНІ полягає в залученні власних ендогенних антиоксидантів. Це супроводжується підвищенням СОД активності в КМ за дози 20 сГр, а каталазної, ГПО та ГР – за дози 10 та 30 сГр. В ентероцитах тонкого кишківника активація досліджуваних ензимів (за винятком СОД) зафіксована на 10-ту добу (10 сГр). У клітинах тканин з високою радіочутливістю виявлено значний рівень активності ензимів АОЗ у пострадіаційний період. Максимальну активацію ензимів в ЕН зареєстровано на 50 - 60-ту доби, а в клітинах ГМР та ЕР кісткового мозку – на 60-ту добу експерименту (за винятком СОД). Це свідчить про пролонгованість віддалених ефектів малих доз радіації. Застосування ?-ТФА на фоні щодобового опромінення сприяє нормалізації СОД (20 - 30-та доби) та ГПО (10 - 30-та доби) активності, а використання ?-ТФАС6 – ГПО активності в ентероцитах (30-та доба), а також ГР (10- та 30-та доби) та каталазної (30-та доба) – у клітинах ЕР кісткового мозку. Введення опромінюваним щурам ?-ТФА та його коротколанцюгового похідного зумовлює вірогідне зниження вмісту продуктів ПОЛ в ЕН та клітинах КМ (20 - 30-та доби) порівняно з опроміненням. Це свідчить про те, що досліджувані препарати гальмують розвиток оксидативного стресу та запобігають виникненню радіоіндукованих порушень у клітинах з високою проліферативною активністю. Порівняльний аналіз коригувальної здатності препаратів вітаміну Е (?-ТФАС6 та ?-ТФА) за умов пролонгованого впливу іонізуючої радіації на систему прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу свідчить про вираженіший адаптогенний вплив фармакопейного ?-ТФА. СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Клевета Г.Я. Вплив препаратів вітаміну Е на перебіг процесів пероксидного окиснення ліпідів за умов дії низькоінтенсивного рентгенівського опромінення // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2003. - Вип. 32. - С. 31-36. Дослідження активності ферментів антиоксидантної системи еритроцитів та кісткового мозку щурів за умов низькоінтенсивного рентгенівського опромінення / Я.І. Верніковська, Л.С. Старикович, Т.В. Виговська, А.Г. Бесерріль, Г.Я. Клевета // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2002. - Вип. 28. - С. 34-40. (Дисертант визначила активність СОД та каталази у клітинах кісткового мозку, підготувала статтю до друку). Дослідження окремих ферментів антиоксидантної системи ентероцитів тонкого кишківника щурів за умов низькоінтенсивного рентгенівського опромінення / Г.Я. Клевета, Я.П. Чайка, Л.С. Старикович, Т.В. Виговська // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2002. - Вип. 29. - С. 39-45. (Дисертант визначила активність СОД, каталази, ГПО та ГР, підготувала статтю до друку). Вплив 30-ти добового низькоінтенсивного рентгенівського випромінювання та ефект післядії на активність ферментів антиоксидантної системи еритрону / Л.С. Старикович, Т.В. Виговська, Г.М. Паук, Г.Я. Клевета // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2003. - Вип. 32. - С. 56-63. (Дисертант визначила активність СОД, ГПО та ГР у клітинах кісткового мозку, виконала статистичне опрацювання результатів). Активність ферментів антиоксидантного захисту та стан процесів пероксидного окиснення ліпідів в ентероцитах тонкого кишківника та клітинах крові різного ступеня зрілості за умов іонізуючого опромінення та введення вітаміну Е / Г.Я. Клевета, Л.С. Старикович, Я.П. Чайка, Т.В. Виговська, Г.М. Паук, Л.О. Дацюк, О.В. Трикуленко, М.М. Великий, Г.В. Донченко, І.В. Кузьменко // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т. 75, № 5. - С. 87-95. (Дисертант визначила вміст продуктів ПОЛ та активність основних ензимів АОЗ в ентероцитах, підготувала статтю до друку). Антиоксидантная система эритрона белых крыс в условиях низкоинтенсивного ионизирующего излучения / Г.Я. Клевета, Я.И. Верниковская, Л.С. Старикович, Т.В. Выговская // Тезис. докл. IV съезда по радиац. исслед. “Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность”. - Москва. - 2001. - С. 148. (Дисертант визначила активність СОД та ГР у клітинах кісткового мозку, підготувала тези до друку). Вплив малих доз іонізуючого випромінювання на активність ферментів антиоксидантної системи ентероцитів тонкого кишківника щурів / Г.Я. Клевета, Я.П. Чайка, Л.С. Старикович, Т.В. Виговська // Тези доп. III-го Біофіз. з’їзду. - Львів. - 2002. - С. 294. (Дисертант визначила активність СОД, каталази, ГПО та ГР, виконала статистичне опрацювання результатів, підготувала тези до друку). Influence of vitamine E on superoxide dismutase activity following low dose rate X-irradiation / L. Starikovich, G. Kleveta, T. Vigovska, G. Pauk, O. Trikulenko, L. Datsiuk, Ya. Chayka, N. Klimyshyn, N. Veliky, G. Donchenko, E. Kuzmenko // 4th Parnas conf. “Molecular mechanisms of cell activation biological signals and their target ensymes”. - Wroclaw. - 2002. - Р. 87. (Дисертант визначила активність СОД, брала участь в обговоренні результатів, написанні та перекладі тез доповіді). Исследование антиоксидантной системы эритрона и клеток энтероцитов тонкого кишечника крыс в условиях низкоинтенсивного излучения / Л.С. Старикович, Г.Я. Клевета, Т.В. Выговская, А.В. Трикуленко, Л.А. Дацюк, Я.П. Чайка, И.В. Чорна, Т.Б. Олексюк // Тезис. докл. VI-й Междунар. конф. “Биоантиоксидант”. - Москва. - 2002. - С. 554-555. (Дисертант визначила активність ензимів АОЗ в ентероцитах, виконала статистичне опрацювання результатів, підготувала тези до друку). Исследование эффекта последействия малых доз ионизирующих излучений на активность ферментов антиоксидантной защиты белых крыс / Л.С. Старикович, Т.В. Выговская, Г.Я. Клевета, Г.М. Паук, И.В. Чорная, Я.П. Чайка // Тезис. докл. III-го Междунар. симпоз. “Механизмы действия сверхмалых доз”. - Москва.- 2002. - С. 139. (Дисертант визначила активність СОД у клітинах кісткового мозку, виконала статистичне опрацювання результатів, підготувала тези до друку). Клевета Г.Я., Чайка Я.П., Старикович Л.С. Активність ферментів антиоксидантного захисту ентероцитів тонкого кишківника щурів за умов хронічного впливу рентгенівського опромінення низької інтенсивності // Матер. VIII Укр. біохім. з’їзду. - Чернівці. - 2002. - С. 223. (Дисертант визначила активність СОД, каталази та ГПО, підготувала тези до друку). Антиоксидантний ефект препарату вітаміну Е (С-16) у разі дії радіації низької інтенсивності у малих дозах / Г.Я. Клевета, Я.П. Чайка, Л.С. Старикович, М.М. Великий, Г.В. Донченко, І.В. Кузьменко // Тези доп. ІІІ з’їзду з радіац. досліджень (радіобіологія, радіоекологія). - Київ. - 2003. - С. 37. (Дисертант визначила вміст продуктів ПОЛ та активність основних ензимів АОЗ в ентероцитах, виконала статистичне опрацювання результатів, підготувала тези до друку). Влияние сочетанного действия короткоцепочного производного витамина Е и малых доз радиации на интенсивность процессов пероксидного окисления липидов в клетках быстропролиферирующих тканей / Г.Я. Клевета, Я.П. Чайка, Л.С. Старикович, Г.М. Паук // Тезис. докл. 7-й школы-конф. “Биология – наука XXI века”. - Пущино. - 2003. - С. 62. (Дисертант визначила вміст продуктів ПОЛ в ентероцитах та клітинах кісткового мозку, підготувала тези до друку). АНОТАЦІЯ Клевета Г.Я. Вплив іонізуючої радіації низької інтенсивності та вітаміну Е на систему антиоксидантного захисту тканин із високою проліферативною активністю. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04-біохімія.- Інститут біології тварин УААН, Львів, 2005. Дисертація присвячена вивченню хронічного впливу іонізуючого випромінювання низької інтенсивності (у сумарно поглинутих дозах 10, 20 та 30 сГр, потужність дози – 0,042 мГр?с-1) та коригувальної дії препаратів вітаміну Е з різною довжиною бічного ланцюга на динаміку процесів пероксидного окиснення ліпідів та стан ензиматичної складової антиоксидантного захисту в ентероцитах тонкого кишківника та клітинах кісткового мозку щурів. Встановлено, що щодобове опромінення у дозі 1 сГр активує процеси пероксидоутворення в досліджуваних клітинах. Відповідь організму на дію іонізуючого випромінювання в малих дозах полягає у залученні власних ендогенних антиоксидантів. Зафіксовано коливні зміни активності ензимів антиоксидантного захисту в дозах 10 - 30 сГр. Введення щурам вітаміну Е на фоні хронічного впливу іонізуючої радіації сприяло зниженню інтенсивності накопичення продуктів пероксидного окиснення ліпідів у клітинах тканин з високим ступенем радіочутливості. Порівняльний аналіз дії фармакопейного ?-токоферолацетату та його похідного з укороченим до 6 атомів вуглецю бічним ланцюгом за умов низькоінтенсивного опромінення, свідчить про вираженіший антиоксидантний ефект довголанцюгового препарату вітаміну Е. Коригувальна дія вітаміну Е найбільше виражена в ентероцитах тонкого кишківника, котрі насамперед поглинають ?-токоферол. Для оцінки порушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги пропонується дослідження ключових ензимів антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази), а також вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів (дієнові кон’югати та ТБК-позитивні продукти). Зміни у цих показниках дадуть змогу встановити характер порушень та здійснити оптимальний підбір антиоксидантних препаратів для їхньої профілактики та корекції. Отримані нами результати свідчать про високу ефективність застосування фармакопейного ?-токоферолацетату у якості засобу корекції прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у клітинах з високою радіочутливістю щурів за дії низьких доз радіації. Це дає змогу рекомендувати подальше глибоке фармакологічне дослідження даного препарату з метою використання для корекції метаболічних порушень індукованих хронічним впливом малих доз іонізуючої радіації. Ключові слова: іонізуюче випромінювання, вітамін Е, антиоксидантна система, тонкий кишківник, кістковий мозок. АННОТАЦИЯ Клевета Г.Я. Влияние ионизирующей радиации низкой интенсивности и витамина Е на систему антиоксидантной защиты быстропролиферирующих тканей. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04-биохимия. – Институт биологии животных УААН, Львов, 2005. Диссертация посвящена изучению хронического влияния низкоинтенсивного ионизирующего излучения (в суммарно поглощенных дозах 10, 20 и 30 сГр, мощность дозы - 0,042 мГр?с-1) на состояние прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза в клетках с высокой пролиферативной активностью крыс (энтероциты тонкой кишки, клетки костного мозга), а также исследованию эффектов последействия ионизирующего излучения. Исследовано коррегирующий эффект препаратов витамина Е, которые отличаются длиной боковой цепи (длинноцепочного фармакопейного ?-токоферолацетата и его производного с укороченной до 6 атомов углерода боковой цепью) при оксидативном стрессе, вызванном хроническим облучением в малых дозах. В результате проведенных исследований установлено, что ежедневное рентгеновское облучение крыс в дозе 1 сГр повышает содержание продуктов перекисного окисления липидов в энтероцитах тонкой кишки и клетках гранулоцитарно-моноцитарного и эритроидного рядов костного мозга. Ответ организма на действие ионизирующего излучения в малых дозах заключается в активации энзимов антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Установлено колебательный характер изменений активности исследуемых энзимов в активно пролиферирующих клетках при хроническом облучении в дозах 10 - 30 сГр. Максимальный уровень активности наблюдается в пострадиационный период, что свидетельствует о пролонгированном действии малых доз радиации. Высокое содержание диеновых конъюгатов и ТБК-позитивных продуктов в энтероцитах тонкой кишки, а также в клетках гранулоцитарно-моноцитарного и эритроидного рядов костного мозга на фоне активации энзимов антиоксидантной защиты свидетельствует о развитии оксидативного стресса в условиях пролонгированного действия ионизирующей радиации. Исследование показателей, которые характеризируют состояние мембранных структур, подтверждают адаптогенные свойства витамина Е в условиях хронического воздействия ионизирующей радиации в дозах 10 - 30 сГр. Применение фармакопейного ?-токоферолацетата и его производного способствовало снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов и нормализации прооксидантно-антиоксидантного равновесия в исследуемых клетках, в сравнении с облученными животными, которые не получали витамина Е. Характер влияния витамина Е на процессы пероксидации липидов и состояние антиоксидантных энзимов отличается в клетках костного мозга и в энтероцитах тонкой кишки. Вероятно, это связано со скоростью транспорта ?-токоферола, а также особенностями его распределения в разных тканях организма. Эффективность ?-токоферола как адаптогена наиболее выражена в энтероцитах, которые первоначально поглощают витамин Е. Изменение показателей перекисного окисления липидов в энтероцитах и клетках костного мозга крыс при введении преператов витамина Е, позволяют сделать вывод о более выраженной их способности угнетать образование ранних продуктов перекисного окисления липидов – диеновых конъюгатов. Полученные нами данные позволяет утверждать о более эффективном использовании в качестве антиоксиданта при хроническом облучении длинноцепочного препарата витамина Е. Следует полагать, что при укорочении боковой цепи витамина Е снижается возможность его интеграции в билипидный слой мембраны, особенно при действии малых доз ионизирующего облучения. Поэтому его способность тормозить свободнорадикальные процессы менее выражена в сравнении с длинноцепочным. Для оценки нарушений прооксидантно-антиоксидантного равновесия в условиях хронического действия малых доз радиации предлагается исследование ключевых энзимов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы), а также содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, ТБК-позитивные продукты). Изменения этих показателей дадут возможность установить характер нарушений и оптимально подобрать антиоксидантные препараты с целью профилактики и коррекции установленных нарушений. Проведенные исследования дают возможность рекомендовать использование фармакопейного ?-токоферолацетата, для дальнейшего детального фармакологического изучения с целью применения его для коррекции метаболических нарушений в условиях хронического влияния малых доз радиации. Ключевые слова: ионизирующие излучения, витамин Е, антиоксидантная система, тонкая кишка, костный мозг. SUMMARY Kleveta H.Ya. Effect of low-intensity ionizing radiation and vitamin E on the antioxidant defence system of tissues with high proliferative activity. – Manuscript. Thesis for Ph.D. science degree of speciality 03.00.04 – biochemistry. Institute of Animal Biology of the Ukranian Academy of Agrarian Sciances, Lviv, 2005. The thesis deals with the effect of chronic exposure to low-intensity ionizing radiation (cumulative absorbed radiation doses of 10, 20, 30 sGy, dose rate of 0,042 mGy·s-1) and injections of vitamin E with different side chain length on the dynamics of peroxide lipid oxidation processes, as well as on the state of enzymatic component of antioxidant defence in small intestine enterocytes and bone marrow cells of rats. It was shown, that 24-hour radiation treatment of rats with dose of 1 sGy had been activating peroxide lipid oxidation processes in the cells. Being exposed to minor doses of ionizing radiation rat’s organism reacts by employing its own endogenous antioxidants. Oscillating character of changes in the activity of antioxidant defence enzymes in the dose interval of 10 - 30 sGy has been observed. Injection of vitamin E on the background of chronic effect of ionizing radiation has promoted the reduction intensive accumulation of products of peroxide lipid oxidation and normalization prooxidant-antioxydant homeostasis in the tissue cells with high level of radiosensetivity. Antioxidant effect of ?-tocopherol is most strongly pronounced in case of small intestine enterocytes, which are the first in absorbing of vitamin E and therefore play a leading role in mediating the biological effect of the vitamin. Comparative analysis of action of the pharmacopoeic ?-tocopherol and its short-chain analogue under the action of low-intensity radiation indicates that the long chain preparation of vitamin E has more pronounced antioxidant effect. Key words: vitamin E, antioxidant system, small intestine, bone marrow. PAGE \* Arabic 20

Похожие записи