ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ОСИП ЮРІЙ ЛЕОНІДОВИЧ

УДК 577.1:547.943:611.018.15

Вплив алкалоїдів і тритерпенів чистотілу (chelidonium majus l.) на
проліферативну активність та метаболічні показники клітин in vitro

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка МОН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин,

професор кафедри біохімії Львівського національного університету імені
Івана Франка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Розгоні Іван Іванович

Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник лабораторії репродуктивної біотехнології;

доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович

Директор Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення
продуктивності тварин Львівської національної академії ветеринарної
медицини ім. С.З. Гжицького, професор кафедри органічної та неорганічної
хімії.

Провідна установа – Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ, м.
Київ.

Захист відбудеться 14 березня 2006 р. о 12 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН
за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий 13 лютого 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чистотіл (Chelidonium majus L.) широко застосовують у
народній (традиційній) і офіційній медицині для лікування багатьох
хвороб, зокрема для лікування пухлин. Це ефективний засіб при лікуванні
бородавок, кондилом, папілломатозу горла, поліпів товстої кишки,
захворюваннях печінки, жовчного міхура та інших. Екстракти з чистотілу
володіють антибактеріальною, противірусною та протигрибковою дією. Їх
рекомендують застосовувати при лікуванні ран, які важко загоюються,
опіків, запалень, екзем, дерматитів та псоріазу (Ерофеева Л.Н. и др.
1997, Путырский И.Н., Прохоров В.Н. 2000). Дані про протипухлинну
активність екстрактів чистотілу суперечливі. Проте у народній медицині
він широко застосовується для лікування пухлин різної локалізації,
особливо раку шкіри та шлунку (Потопальский А.И. 1992). В Австрії
виготовляють протипухлинний препарат “Україн”, що містить суміш
алкалоїдів чистотілу модифікованих алкілюючими речовинами (Panzer A. et
al. 2000, Jagiello-Wojtowicz E. et al. 1998). Враховуючи успішне
застосування чистотілу в народній медицині та спираючись на досвід
наукової медицини, зараз він вважається однією з найбільш перспективних
лікарських рослин.

Різносторонні біологічні ефекти чистотілу зумовлені дією більш ніж 36
алкалоїдів (Taborska E. et al. 1994, Потопальский А.И. 1992, Han L. et
al. 1991). Їх вміст у рослині різний, причому їх кількість і
співвідношення залежить від багатьох чинників, таких як ґрунт, сонячна
активність, температура, вологість, вік рослини, тощо. Алкалоїди
чистотілу проявляють різні за інтенсивністю, а деколи навіть протилежні
за скерованістю біологічні ефекти. Тому передбачити дію сумішей
алкалоїдів, отриманих за різних обставин, досить важко. У зв’язку з
недостатнім вивченням біологічної активності основних алкалоїдів,
препарати чистотілу поки-що мають обмежене застосування у сучасній
медицині. Тому першочерговим завданням нашої роботи було розробити
оптимальні методи отримання чотирьох основних алкалоїдів чистотілу,
таких як хелідонін, сангвінарин, хелеритрин та коптизин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у рамках держбюджетної теми Бх-116Б кафедри біохімії
Львівського національного університету ім. І.Франка “Ензиматичні системи
організму при дії іонізуючого випромінювання та інших патологічних
чинників” № держреєстрації 0103V001918 (2003-2004 pp.). За угодою про
наукову співпрацю біологічного факультету Львівського національного
університету ім. І.Франка та Інституту біології клітини НАН України
окремі дослідження проведені у межах теми відділу регуляції проліферації
клітин Інституту біології клітини НАН України “Дослідження молекулярних
механізмів резистентності пухлинних клітин до дії трансформуючого
фактора росту бета 1” № держреєстрації 0104V010049 (2003-2005 рр.).
Участь автора полягає в отриманні індивідуальних алкалоїдів чистотілу.
Дослідженні їх впливу на проліферацію пухлинних клітин і утилізацію ними
глюкози in vitro. Дослідженні впливу цих речовин на функціональну
активність нейтрофільних гранулоцитів крові людини. Дослідження
спорідненості цих речовин до ДНК.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було отримати очищені
препарати окремих алкалоїдів і тритерпенів чистотілу та дослідити їх
антипроліферативну активність in vitro, а також з’ясувати деякі
біохімічні механізми їх дії на клітини-мішені.

Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:

Розробити методики отримання основних алкалоїдів чистотілу з природної
сировини;

Дослідити цитотоксичну дію індивідуальних алкалоїдів щодо клітин L1210
лейкемії миші;

Дослідити вплив основних алкалоїдів чистотілу на функціональну
активність гранулоцитів крові людини;

Вивчити вплив індивідуальних алкалоїдів чистотілу на фізико-хімічні
властивості ДНК;

Дослідити вплив алкалоїдів чистотілу на утилізацію глюкози та
продукування молочної кислоти пухлинними клітинами;

Отримати фракцію тритерпенів із олії чистотілу, дослідити її склад і
біологічну активність у культурі пухлинних клітин.

Об’єкт дослідження. Проліферативна активність та метаболізм глюкози у
клітин ссавців під впливом алкалоїдів чистотілу.

Предмет дослідження. Вплив індивідуальних алкалоїдів та тритерпенів
чистотілу на функціонування та метаболічні показники клітин in vitro.

Методи дослідження. Використано тонкошарову хроматографію,
спектрофотометрію, хемілюмінесценцію, світлову та флуоресцентну
мікроскопію, мас-спектрометрію.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті роботи було
розроблено оригінальні методики виділення чотирьох основних алкалоїдів з
коріння чистотілу. Досліджено цитотоксичну активність основних
алкалоїдів чистотілу у культурі клітин лінії L1210. Вперше було
досліджено вплив хелідоніну, сангвінарину, хелеритрину, коптизину та
берберину на фагоцитарну активність та продукування активних форм кисню
гранулоцитами крові людини. Проведено комплексне дослідження впливу
індивідуальних алкалоїдів чистотілу на фізико-хімічні властивості ДНК.
Виявлено спорідненість сангвінарину, хелеритрину, коптизину та берберину
до ДНК. Досліджено вплив основних алкалоїдів чистотілу на утилізацію
глюкози та продукування молочної кислоти клітинами мишачої лімфоми NK/Ly
in vitro.

З олії насіння чистотілу було отримано препарат сапоніну. Досліджено
його цитотоксичну активність у культурі клітин лінії L1210 та вплив цієї
речовини на фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів крові
людини.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено методики виділення
хелідоніну, сангвінарину, хелеритрину та коптизину з коріння чистотілу,
які можуть бути використані для отримання цих речовин у препаративних
кількостях.

Дані щодо впливу досліджуваних речовин на пухлинні та імунокомпетентні
клітини та механізму їх дії важливі для подальшого їх дослідження і
пошуку практичного застосування.

Одержані результати, що стосуються отримання, очистки та ідентифікації
алкалоїдів чистотілу використовуються при викладанні спецкурсу
“Виділення та ідентифікація природніх фізіологічно-активних речовин”
(к.х.н., доц. Проц Д.І.) на кафедрі органічної та біологічної хімії
хімічного факультету Волинського державного університету імені Лесі
Українки.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за
темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину і
статистичну обробку отриманих результатів. Достовірність одержаних
результатів, щодо ідентифікації алкалоїдів, було підтверджено за
допомогою масспектрометричного аналізу, що був проведений доктором
Ульфом Гельманом у рамках співпраці відділу регуляції проліферації
клітини Інституту біології клітини НАН України з Людвігівським
Інститутом ракових досліджень (м. Упсала, Швеція). Аналіз і обговорення
отриманих даних проведені спільно з науковим керівником, а також
доктором біологічних наук М.Д. Луциком.

Апробація результатів дослідження. За матеріалами дисертації зроблено
доповіді на VI-й міжнародній конференції молодих онкологів України
“Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 4-5
грудня 2003 р.), конференції молодих науковців Інституту біології
клітини НАН України (Львів, 2003 р.), Першому (Установчому) Українському
з’їзді клітинних біологів (Львів, 25-28 квітня 2004 р.), міжнародній
конференції “Ionic Soft matter: Novel trends in theory and applications”
(Lviv, Ukraine, April 14-17, 2004), конференції “Сучасний стан і
проблеми експериментальної та клінічної біохімії” (Тернопіль, 11-12
листопада 2004 р.), щорічних звітних конференціях біологічного
факультету Львівського національного університету ім. І. Франка (2004 і
2005 рр.), Міжнародному науково-практичному форумі “Основи
молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля” на базі
Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (Київ,
31 травня-1 червня 2005 р.), на звітній конференції молодих вчених
Інституту біології клітини НАН України (Львів, 16 червня 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, з
них 3 статті у фахових виданнях і 5 тез у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ,
огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень,
аналіз та обговорення результатів досліджень, висновки, список
використаних джерел та додатки. Дисертацію викладено на 154 сторінках і
проілюстровано 64 рисунками та 9 таблицями, які займають 41 сторінку
друкованого тексту. Бібліографічний список складає 193 джерел, з них 140
латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури аналізуються дані про структуру та
властивості алкалоїдів та тритерпенів чистотілу. Детально висвітлено
дані щодо біологічної активності індивідуальних алкалоїдів чистотілу.
Особлива увага приділена біохімічним механізмам дії алкалоїдів на
клітини-мішені.

Матеріали та методи досліджень. Коріння чистотілу заготовляли навесні,
коли починає відростати наземна частина рослини, або восени (вересень –
жовтень), після відмирання наземної частини рослини. Сировину швидко
сушили при кімнатній температурі у темному місці (Потопальский А.И.,
1992). Насіння чистотілу збирали у період дозрівання (серпень).

Тонкошарову хроматографію проводили на пластинках “Silufol” (Чехія) із
закріпленим шаром сорбенту. Проби досліджуваних речовин на лінію старту,
яка знаходилася 1,5-2 см від нижнього краю пластинки, наносили
спеціальною піпеткою. Для розділення речовин застосовували метод
висхідної хроматографії. Як рухому фазу використовували три системи
розчинників: хлороформ – бензен – метиловий спирт – діетиламін
(4,5:0,5:5:0,5) і хлороформ – бензен – метиловий спирт – оцтова кислота
(4,5:0,5:5:0,5) для алкалоїдів; хлороформ – бензен – метиловий спирт
(4,5:0,5:5) та хлороформ – метиловий спирт (9:1) для тритерпенів. Після
проходження розчинника на висоту 15 см пластинку виймали з камери та
підсушували. Алкалоїди чистотілу виявляли на хроматограмі за
флюоресценцією в УФ-світлі. Для виявлення речовин, які невидимі в
УФ-світлі, хроматограму проявляли парами кристалічного йоду (Шталь Э.,
1965).

При досліджені цитотоксичної активності речовин використовували клітини
лінії L1210, які висівали у 24-лункові пластикові планшети в середовищі
RPMI (“Sigma”, США) у присутності 10% сироватки крові ембріонів великої
рогатої худоби (“Sigma”, США). Через 24 годин додавали досліджувану
речовину в різній концентрації. Підрахунок кількості клітин здійснювали
в гемоцитометричній камері. Концентрацію клітин у суспензії визначали за
формулою: с = 12500n, де с – кількість клітин в 1 мл суспензії, n –
середня кількість клітин в 5-ти великих квадратах камери. Відсоток
мертвих клітин визначали після їх фарбування 0,1 % (w/v) розчином
трипанового синього та підрахунку зафарбованих клітин у світловому
мікроскопі (Біолам, “ЛОМО” МЛ 3); живі клітини за цих умов не
фарбуються.

Визначення кількісних показників фагоцитарної активності нейтрофільних
гранулоцитів здійснювали за допомогою модифікованого методу оцінки
поглинальної здатності фагоцитів (Пастер Е.У. и др., 1989). Отримання
лейкоцитарного концентрату здійснювали у пластиковому шприці з
мінімальною кількістю операцій для уникнення травмування лейкоцитів. Для
прискорення осідання еритроцитів застосовували 5% розчин декстрану Т-500
(Loba Feinchemie, Австрія), який готували на фізрозчині (0,9 % NaCl),
розливали в ампули і стерилізували автоклавуванням (120°С, 2 атм.).
Аліквоту гепаринізованої крові (кінцеве розведення лікарського препарату
гепарину 1:100) змішували з 1/5 об’єму 5% розчину декстрану Т-500
(кінцева концентрація декстрану 1%) і залишали шприц під кутом 45° на
20-30 хв, для кращого відділення еритроцитів. Після цього верхній шар
плазми із лейкоцитами витискували із шприца у пластикову пробірку типу
Еппендорф через пластиковий капіляр, яким заміняли голку, і визначали
кількість і співвідношення лейкоцитів у плазмі. Для цього аліквоту 20
мкл плазми крові центрифугували 1-2 хв при 1500 об/хв, надосадову плазму
максимально видаляли, клітини суспендували у 37 мкл 0,05% розчину
метилового зеленого у 1% оцтовій кислоті (“Sigma”, США). Ядра
гранулоцитів і лімфоцитів рахували у гемоцитометричній камері (мікроскоп
“ЛОМО” МЛ 3, 40Ч10), у 25 великих квадратах камери.

Як об’єкт фагоцитозу використовували вбиті нагріванням дріжджі виду
Debarіomyces hansenii (ВКМ Y-102) (культура люб’язно надана пров.
науковим співробітником Інституту біології клітини НАН України д.б.н.
Д.В.Федорович).

50 мкл лейкоцитарної плазми поміщали в пластикову пробірку Еппендорф,
додавали досліджувану речовину в об’ємі 3-5 мкл і витримували при 37°С
протягом 2 годин. До лейкоцитів крові додавали суспензію дріжджів в
об’ємі 2-4 мкл і кінцевій концентрації дріжджових клітин 3-5 млн/мл,
після чого продовжували інкубацію при 37°С протягом 50 хв. Клітини
збирали центрифугуванням при 1500 об/хв протягом 2 хв, надосадову рідину
видаляли, клітини суспендували у мінімальному залишку середовища і
готували цитологічний мазок. Після фарбування клітин за методом
Романовського-Гімза в препараті підраховували 500 клітин нейтрофільних
гранулоцитів у трьох ділянках мазка. Для оцінки фагоцитарної активності,
визначали фагоцитарний індекс (відсоток фагоцитуючих нейтрофільних
гранулоцитів у популяції) та фагоцитарні числа: екстенсивне (середня
кількість поглинутих об’єктів усією популяцією нейтрофільних
гранулоцитів) та інтенсивне (середня кількість поглинутих об’єктів
фагоцитуючими нейтрофільними гранулоцитами) (Новиков Д.К. и др., 1979;
Хаитов Р.М. и др., 2001).

Люмінолзалежну хемілюмінесценцію гранулоцитів визначали за модифікованим
методом (Калмыков С.В. и др.,1989; Павленко Р.А и др., 1988) за
допомогою сцинтиляційного лічильника (NC-482, Угорщина) у
термостатованій кюветі при температурі 37°С, напрузі 915 В на
фотоелектронному помножувачі (покази шкали вимірювань х104).
Лейкоцитарну плазму крові людини отримували за методом описаним нижче.
До 50 мкл лейкоцитарної суспензії у пластиковій пробірці типу Еппендорф
додавали 1-5 мкл розчину досліджуваної речовини до заданої кінцевої
концентрації. Зразки інкубували протягом 2 годин при температурі 37°С.
Клітини відмивали забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), рН 7,2, який
містив 5 мМ МgCl2, 2 мМ CaCl2, 20 мМ глюкозу, центрифугуванням при
1500 об/хв протягом 2 хв. Видаляли 200 мкл надосадової рідини, а у
100 мкл залишку ресуспендовали клітини і додавали до них 5 мкл 0,1 %
люмінолу (Sigma, США). Для вимірювання хемілюмінесценції зразки
переносили у скляні пробірки на 1 мл із плоским дном. Суспензію клітин
інкубували протягом 10 хв при 37°С, після чого реєстрували фотоемісію у
сцинтиляційному лічильнику.

При дослідженні взаємодії алкалоїдів з ДНК використовували препарат ДНК
сперми лосося (Sigma, США). Спектри поглинання знімали при рН 8,05 в
області 220-500 нм. Для отримання відповідного середовища
використовували буферну суміш Tris-HCl з відповідним значенням рН.
Концентрація чистих речовин при отриманні спектрів поглинання була рівна
0,025 мг/мл. Для отримання цих спектрів у присутності ДНК
використовували розчини, що містили досліджувану речовину у концентрації
0,025 мг/мл та ДНК у концентрації 1 мг/мл. Перед використанням розчин
інкубували при 37°С протягом 12 год. Для порівняння сили спорідненості
речовин до ДНК готували ряд розчинів із концентрацією алкалоїду
0,1 мг/мл та різною концентрацією ДНК, від 0 до 0,4 мг/мл. Для отримання
розчинів з рН 7,4 використовували 20 мМ буферну суміш Na2HPO4– NaH2PO4
(рН 7,4). Розчини ДНК у присутності досліджуваних речовин інкубували при
37°С протягом 2 годин. Оптичну густину розчинів визначали при довжині
хвилі, яка відповідала найбільшій різниці у спектрах поглинання чистого
алкалоїду і алкалоїду у присутності ДНК. За графіком залежності оптичної
густини від концентрації ДНК визначали половинну концентрацію ДНК,
необхідну для досягнення максимального ефекту (Nandi R. et al., 1985).

Для дослідження динаміки термоденатурації ДНК використовували
спектрофотометр (СФ 46, ЛОМО, Санкт-Петербург, Російська Федерація) з
термостатованою кюветою. Визначення проводили при рН 7,5, для цього у
всіх пробах як розчинник використовували буферну суміш Tris-HCl. У всіх
пробах концентрація ДНК (препарат ДНК сперми лосося фірми Sigma, США)
була рівною 62,5 мкг/мл. Для визначення залежності температури
термоденатурації ДНК від концентрації тестованої речовини, останню
використовували у концентрації 0, 2, 5, 8, 10 та 15 мкг/мл у зразку.
Перед вимірюванням проби інкубували протягом 2 годин у термостаті при
37°С. Як розчин порівняння при вимірюванні використовували розчин
досліджуваної речовини у концентрації, рівній концентрації досліджуваної
речовини у зразку. Нагрівання кювет здійснювали зі швидкістю 1°С/хв.
Реєстрацію оптичної густини зразка проводили при довжині хвилі 260 нм
через кожних 2°С. (Schmeller T. et al., 1997).

Тест з метиловим зеленим (МЗ) (Sigma, США) здійснювали за методикою,
описаною в (Schmeller T. et al., 1997) з незначними модифікаціями. Усі
експерименти проводили при рН 7,5, для чого у всіх розчинах як розчинник
використовували буферну суміш Tris-HCl з рН 7,5. Для отримання комплексу
ДНК–МЗ до 105,72 мл буферної суміші додавали 12,44 мл розчину ДНК у
концентрації 0,5 мг/мл та 2,04 мл розчину МЗ концентрацією 1 мг/мл.
Отриману суміш інкубували у термостаті протягом 24 годин при температурі
37°С.

Для дослідження взаємодії комплексу ДНК–МЗ з алкалоїдом, готували ряд
розчинів з концентрацією алкалоїду від 0 до 200 мкг/мл та однаковою
концентрацією комплексу. Концентрація ДНК та МЗ у зразках складала
30 мкг/мл та 10 мкг/мл відповідно. Зразки інкубували у термостаті
протягом 24 годин при 37°С. Вимірювання оптичної густини здійснювали за
допомогою спектрофотометра (СФ 46, ЛОМО, Санкт-Петербург, Російська
Федерація) при довжині хвилі 630 нм. За отриманими результатами будували
графік залежності оптичної густини зразків при 630 нм від концентрації
досліджуваної речовини.

Для отримання кондиціонованого середовища клітини мишачої лімфоми NK/Ly
інкубували при 36°С у середовищі RPMI (“Sigma”, США) у присутності 10%
сироватки крові ембріонів великої рогатої худоби (“Sigma”, США) та
різних концентраціях досліджуваних речовин. Концентрація клітин у
середовищі становила 1 млн/мл. Зразки кондиціонованого середовища
відбирали через 3 та 6 годин після висівання клітин. Клітини у
відібраних зразках осаджували центрифугуванням протягом 3 хв при
3000 об/хв. Надосадову рідину збирали і визначали в ній концентрацію
глюкози та молочної кислоти.

При визначенні глюкози для приготування робочого розчину готували
фосфатний буфер з рН 7,4. До буферу додавали 100 мкл пероксидази хрону
(“Sigma”, США) концентрацією 1 мг/мл та 2 мл о-діазидину концентрацією
0,5 мг/мл. При приготуванні розчинів для фотометрування до 3 мл робочого
розчину додавали 30 мкл кондиціонованого середовища. Визначення
проводили при довжині хвилі 440 нм. Розрахунок концентрації глюкози у
зразках проводили за допомогою калібрувального графіка, для побудови
якого використовували стандартні розчини глюкози (“Sigma”, США)
(Асатиани В.С., 1969).

При визначенні молочної кислоти готували робочий розчин, для цього 3 г
гліцину (“Sigma”, США), 2 г гідразину (“Sigma”, США) та 0,1 г
етилендиамінтетраацетату Na (ЕDTA, “Serva”, Німеччина) розчиняли у 20 мл
дистильованої води. До отриманого розчину додавали 1 М розчин NaOH до рН
9,5 та доводили об’єм розчину до 100 мл. Після чого додавали НАД
(“Sigma”, США) у розрахунку 20 мг на 10 мл робочого розчину та
лактатдегідрогеназу (“Sigma”, США) у розрахунку 0,1 мл (5 мг/мл) на
10 мл робочого розчину. При приготуванні розчинів для фотометрування до
3 мл робочого розчину додавали 30 мкл кондиціонованого середовища.
Визначення проводили при довжині хвилі 360 нм. Розрахунок концентрації
молочної кислоти у зразках проводили за допомогою калібрувального
графіка, для побудови якого використовували стандартні розчини молочної
кислоти (“Sigma”, США) (Асатиани В.С., 1969). Усі досліди повторювали
тричі з трьома паралельними експериментами у кожному варіанті.
Розрахунки та побудову графіків виконували за допомогою програми
«Microsoft Excel 98».

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Очистка та ідентифікація алкалоїдів та тритерпенів з чистотілу. Для
виділення алкалоїдів використовували коріння, яке заготовляли восени
(вересень – жовтень) після відмирання наземної частини рослини, або
весною, коли вона тільки починає ріст.

Очистка алкалоїдів та тритерпенів з чистотілу. Суму алкалоїдів
екстрагували діетиловим етером з коріння чистотілу у вигляді основ. Для
переведення солей алкалоїдів в основи 500 г подрібненого до однорідного
порошку коріння рослини обробляли концентрованим розчином NH4OH (40 мл),
після чого проводили екстракцію діетиловим етером (500 мл). Після
відгонки діетилового етеру отримали зеленувато-коричневий залишок, який
розчиняли у 1 н хлоридній кислоті (300-400 мл) при нагріванні (60°С).
Нерозчинний залишок відділяли центрифугуванням. Надосадову рідину
доводили до рН 10 за допомогою натрій гідроксиду. Осад, що утворився,
відділяли на фільтрі Шотта, використовуючи вакуумний насос. Отриману
сумарну фракцію основ алкалоїдів переводили у солі за допомогою
концентрованої хлоридної кислоти. Сумарну фракцію хлоридів алкалоїдів
сушили під вакуумом над кристалічним натрій гідроксидом.

Основним алкалоїдом отриманої в результаті попередньої роботи суміші, є
хелідонін. Ця речовина, на відміну від інших компонентів суміші, є
малорозчинною в етиловому спирті. Для виділення хелідоніну 5 г сумарної
фракції алкалоїдів заливали 250 мл етилового спирту, суспендували і
залишали на 1-2 години для встановлення рівноваги. Хелідонін відділяли
на фільтрі Шотта, використовуючи вакуумний насос, і промивали на фільтрі
15 мл етилового спирту. Осад переносили у колбу на 100 мл зі зворотнім
холодильником, додавали 20 мл етилового спирту і нагрівали на водяній
бані при 70°С протягом 10-15 хв. Після охолодження вмісту колби, осад
відфільтровували і промивали на фільтрі 15 мл етилового спирту. Цю
операцію повторювали кілька разів до отримання майже білого осаду. Вихід
збагаченої хелідоніном фракції складає 1,5-2 г. Усі отримані спиртові
розчини об’єднували, спирт відганяли за допомогою вакуумного роторного
випарувача.

Після відділення хелідоніну алкалоїдну суміш розчиняли у воді. Отриманий
1 % розчин доводили до рН 7 0,02 н розчином NaOH. Осад, що утворився при
рН 7, відділяли за допомогою вакуумного насосу та промивали на фільтрі
0,02 н розчином NaOH (15 мл). Основним алкалоїдом отриманої фракції є
сангвінарин. Цю фракцію далі використовували для отримання чистого
сангвінарину.

Розчин, що залишився після відділення фракції збагаченої на сангвінарин,
доводили до рН 9 за допомогою 0,02 н розчину NaOH. Осад, що утворився,
відділяли за допомогою вакуумного насосу та промивали на фільтрі 0,02 н
розчином NaOH (15 мл). Основним алкалоїдом отриманої фракції є
хелеритрин. Дану фракцію використовували для отримання чистого
хелеритрину.

Розчин, що залишився, екстрагували хлороформом і фракцію хлороформу
декантували. Після відгонки розчинника отримали фракцію, збагачену
хелеритрином. Першу та другу фракції об’єднували.

Для отримання сангвінарину у чистому вигляді, фракцію збагачену
сангвінарином, розчиняли в етиловому спирті (кінцева концентрація
становила приблизно 2 %). Нерозчинний залишок відділяли фільтруванням.
До спиртового розчину додавали концентровану нітратну кислоту, до
припинення випадання осаду. Осад відділяли за допомогою вакуумного
насоса на фільтрі Шотта. Чистий сангвінарин нітрат отримували за
допомогою його перекристалізації з води (рис. 3.3). Для цього осад
розчиняли при нагріванні (70°С) у дистильованій воді до отримання 1 %
розчину. При охолоджені отриманого розчину (5°С) випадав осад, який
містив вищий відсоток сангвінарин нітрату ніж попередній. Отриманий осад
відділяли від розчину фільтруванням і повторно розчиняли у воді при
нагріванні для отримання 1 % розчину. Отриманий при охолоджені осад
відділяли фільтруванням. Операцію повторювали до отримання чистого
сангвінарин нітрату (одна пляма при ТШХ). Розчини, які отримали у
результаті перекристалізації, об’єднували та аналізували за допомогою
ТШХ. Зазвичай основним алкалоїдом такого розчину є хелеритрин і тому
його можна використати для отримання цього алкалоїду.

Отриманий сангвінарин нітрат переводили у сангвінарин хлорид. Для цього
речовину розчиняли у мінімальній кількості дистильованої води. рН
розчину доводили до 9 за допомогою 0,02 н NaOH. Осад основ, що
утворився, відділяли на фільтрі Шотта за допомогою вакуумного насоса. До
отриманої основи санвінарину додавали кілька крапель концентрованої
хлоридної кислоти. Отриманий сангвінарин хлорид сушили в ексикаторі над
кристалічним NaOH. Хелеритрин та хелідонін у чистому вигляді отримували
перекристалізацією хлоридів з води аналогічно очистці сангвінарину.

®

O

T °

Oe

¬

®

®

°

??&?

d?th

аляли центрифугуванням. До спиртового розчину додавали невеликими
порціями концентровану сульфатну кислоту. Осад коптизин сульфату збирали
центрифугуванням.

Для перекристалізації коптизину, отриманий жовто-оранжевий осад
розчиняли у 40-50 % водному розчині етанолу до кінцевої концентрації
0,5 %. До прозорого жовтого розчину додавали 20 % розчин натрій хлориду
до кінцевої концентрації 0,8-0,9 %. Утворювався осад, який розчиняли при
60°С. Дрібні голчасті кристали коптизину, які утворилися після
охолодження, відділяли фільтруванням.

Для отримання сапонінової фракції 100 г подрібненого насіння чистотілу
екстрагували діетиловим етером (150 мл). Після відгонки розчинника за
допомогою вакуумного роторного випарювача отримали 35 г олії, яку
розчиняли у 100 мл етилового спирту. Нерозчинний залишок видаляли
центрифугуванням (2000 об/хв, 10 хв). До спиртового розчину додавали 20
мл дистильованої води. Через 5-6 годин утворену емульсію центрифугували
(2000 об/хв, 10 хв) для відділення водно-етанольної фази. За допомогою
вакуумного роторного випарювача з водно-етанольної фази відганяли
етиловий спирт. Отриману емульсію центрифугували (2000 об/хв, 10 хв).
Після відділення водної фази отримали сапонінову фракцію (10 мл) олії
насіння чистотілу.

Сапонінову фракцію розчиняли в 50 мл етилового спирту. Після доведення
розчину до рН 9 за допомогою КОН (0,5 М), виділилась невелика кількість
олії, яку видалили за допомогою центрифугування (2000 об/хв, 10 хв).
Етиловий спирт відганяли, до отриманого водного розчину додавали 30 мл
хлороформу та струшували. Через 2-3 години суміш центрифугували
(2000 об/хв, 10 хв) для розділення водної та хлороформної фази.
Хлороформну фракцію видаляли, а до водної фракції додавали концентровану
ацетатну кислоту до кінцевої концентрації 3 %. Суміш центрифугували
(2000 об/хв, 10 хв) та видаляли водну фазу. Отриману олію сушили у
вакуумному ексикаторі над кристалічним NaOH.

Дослідження цитотоксичної активності речовин. Для визначення
цитотоксичного та цитостатичного ефектів хелідоніну, сангвінарину,
хелеритрину, коптизину, берберину та препарату сапоніну олії насіння
чистотілу на лейкемічні клітини лінії L1210 використовували метод
фарбування клітин трипановим синім, який широко застосовується для таких
цілей. Отримані результати свідчать про те, що досліджувані алкалоїди
володіють різною цитотоксичністю щодо клітин лінії L1210. Найвищу
цитотоксичність тут виявляли сангвінарин і хелеритрин, які в
концентрації 4-5 мкг/мл викликали 100% загибель клітин, у той час як
коптизин та берберин викликали повну загибель клітин лінії L1210 лише
при концентрації вищій за 20 мкг/мл. Хелідонін пригнічував поділ клітин,
але не викликав їх 100 % загибелі навіть у концентрації 50 мкг/мл. При
концентраціях до 5 мкг/мл спостерігалось зниження приросту клітин у
порівнянні з контролем. При концентраціях, вищих за 5 мкг/мл, приріст
клітин залишався сталим, що вказує на цитостатичну дію цього алкалоїду.

Отриманий препарат сапоніну олії чистотілу стимулював приріст клітин
лінії L1210 у концентраціях менших 40 мкг/мл. Найбільша стимуляція
приросту клітин спостерігалась при концентрації препарату 30 мкг/мл. У
концентраціях більших за 40 мкг/мл препарат виявляв цитотоксичну
активність.

Вплив досліджуваних речовин на функціональну активність нейтрофільних
гранулоцитів (НГ). У дисертаційній роботі вивчали вплив хелідоніну,
сангвінарину, хелеритрину, берберину і коптизину на функціональну
активність НГ крові клінічно здорових людей. Для цього використано
кількісну оцінку фагоцитарної активності НГ, зокрема здатність клітин
поглинати корпускулярні об’єкти (у даній роботі дріжджові клітини) та
люмінолзалежну хемілюмінесценцію гранулоцитів, що дозволяє визначити
рівень продукції активних форм кисню гранулоцитами під час їх активації
(Калмыков С.В. и др., 1989; Павленко Р.А. и др.; 1988; Albrecht D. et
al., 1993).

Із отриманих даних випливає, що досліджувані нами алкалоїди чистотілу,
за винятком хелідоніну, пригнічують функцію НГ, очевидно, виявляючи
цитотоксичну дію. Найбільш активними тут є сангвінарин та хелеритрин,
оскільки їх пригнічувальний ефект виявлявся вже при концентраціях 1 і
4 мкг/мл, при яких інтенсивність Хл знижувалась на 50-80 %. У той же час
суттєве зменшення фагоцитарного індексу (на 15-30 % стосовно до
контролю) спостерігалося при значно вищих концентраціях даних алкалоїдів
– 16 мкг/мл.

Коптизин та берберин виявилися менш токсичними щодо НГ (зниження
показників Хл та фагоцитарної активності спостерігалось при значно вищих
концентраціях даних препаратів – 25-30 мкг/мл).

Хелідонін відрізнявся від решти алкалоїдів тим, що стимулював
фагоцитарну активність НГ, однак, пригнічував їхню хемілюмінесценцію.
При концентрації хелідоніну 5 мкг/мл інтенсивність Хл становила 58 %
відносно контролю, тоді як значення фагоцитарного індексу при цій же
концентрації (5 мкг/мл) препарату становило 110 %, а при 20 мкг/мл –
132 % відносно контролю, який приймали за 100 %.

Отриманий нами з насіння чистотілу препарат сапоніну зменшував
фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів крові людини. При
концентрації препарату 70 мкг/мл фагоцитарна активність НГ знижувалась
на 20 %.

Дослідження впливу основних алкалоїдів чистотілу на утилізацію глюкози
та синтез молочної кислоти. При дослідженні впливу основних алкалоїдів
чистотілу на утилізацію глюкози та синтез молочної кислоти клітинами
мишачої лімфоми NK/Ly було виявлено підвищення рівня цих метаболічних
показників при тестуванні сангвінарину, хелеритрину, коптизину та
берберину. Сангвінарин та хелеритрин проявляли активність вже у
концентрації 1-2 мкг/мл, тоді як коптизин та берберин виявили подібну
активність у концентрації 10 мкг/мл. У випадку хелідоніну суттєвих змін
у порівнянні з контролем виявлено не було.

Дослідження впливу алкалоїдів чистотілу на фізико-хімічні властивості
ДНК. У результаті спектрофотометричного аналізу нами було виявлено, що у
присутності ДНК в області 320-500 нм (ДНК в цій області є оптично
неактивною) спектри поглинання сангвінарина, хелеритрина, коптизина та
берберина зміщені у довгохвильову область, а максимуми поглинання є
меншої величини. Такий стан характерний для інтеркаляторів ДНК і
пояснюється переходом молекул інтеркалятора з гідрофільного у гідрофобне
оточення, що веде до зміни оптичних властивостей цих речовин
(Фаддеева М.Д. и др., 1980). Така зміна у спектрах поглинання вказує на
утворення комплексів між досліджуваними речовинами та ДНК, які мають
відмінні оптичні властивості як від вільних алкалоїдів, так і від чистої
ДНК.

Аналогічні зміни у спектрах поглинання було виявлено у класичного
інтеркалятора актиноміцина D. У спектрі поглинання колхіцина, який за
даними літератури не є інтеркалятором ДНК, спектри поглинання чистої
речовини і речовини у присутності ДНК практично не відрізняються.

Для порівняння спорідненості тестованих алкалоїдів до ДНК визначали
концентраційну залежність оптичної густини розчину алкалоїду зі сталою
концентрацією від концентрації ДНК. Якщо зі збільшенням кількості ДНК у
пробі спостерігалося зменшення оптичної густини розчину, то це свідчить
про утворення комплексу ДНК-алкалоїд та зменшення концентрації вільного
алкалоїду. Після досягнення точки еквівалентності, коли весь алкалоїд
зв’язався з ДНК, оптична густина залишалася сталою. За отриманими даними
було виявлено, що для зв’язування сангвінарина та хелеритрина потрібно
менше ДНК, ніж для зв’язування коптизина чи берберина. Це вказує на вищу
спорідненість сангвінарина та хелеритрина до ДНК. Даний метод не
підходить для дослідження взаємодії хелідоніну з ДНК, оскільки максимуми
у спектрах поглинання цих речовин знаходяться в одній області.

Відомо, що інтеркалюючі чинники стабілізують спіральну конформацію ДНК і
підвищують температуру її плавлення (Schmeller T. et al., 1997). Нами
проведено порівняння інтеркаляторної активності п’яти індивідуальних
алкалоїдів чистотілу за ступенем підвищення температури плавлення ДНК.
Для порівняння використали класичний інтеркалятор актиноміцин D. Як
модель використали ДНК сперми лосося, температура плавлення якої при
рН 7,5 становила 63(С. Встановлено, що усі алкалоїди, за виключенням
хелідоніну, підвищували температуру плавлення ДНК (рис. 1). Найбільш
значний приріст температури плавлення ДНК у концентрації 10 мкг/мл
різниця (16-17(С) спостерігався у присутності сангвінарину та
хелеритрину. Хелідонін практично не впливав на температуру плавлення ДНК
(на 0,8(С вище за контроль). Для кількісної оцінки інтеркалюючої
здатності були визначені концентрації кожного алкалоїду, які викликали
половинний ефект підвищення температури плавлення ДНК, що також
відображає спорідненість речовини до ДНК. Найбільш ефективними
інтеркаляторами є сангвінарин і хелеритрин, які значно перевищують за
активністю актиноміцин D.

Нами також виявлено, що сангвінарин, хелеритрин, коптизин, берберин та
актиноміцин D витісняють метиловий зелений (МЗ) з його комплексу з ДНК
(рис. 2). У той же час хелідонін не взаємодіє з комплексом МЗ–ДНК. Це
вказує на те, що алкалоїди сангвінарин, хелеритрин, коптизин, берберин
та актиноміцин D утворюють більш стійкий комплекс з ДНК, ніж МЗ.

Отримані результати також вказують на те, що сангвінарин та хелеритрин є
сильнішими інтеркаляторами, ніж коптизин, берберин та актиноміцин D. Ці
алкалоїди мають подібну структуру, є сильними інтеркаляторами і
зв’язуються з ДНК з високою спорідненістю, що зумовлено компланарною
конформацією їх молекул та їх енергетично вигідним розміщенням між
парами азотистих основ у спіралі ДНК. Це приводить до стабілізації
спіралі (підвищення температури плавлення) ДНК і, як наслідок, до
гальмування процесу реплікації.

Хелідонін відрізняється від інших алкалоїдів більшою гідрогенізацією
циклів і відхиленням площини циклів від компланарності, що перешкоджає
входженню молекули хелідоніну між пари основ ДНК і, відповідно, до
втрати алкалоїдом ДНК-інтеркаляторної здатності. Із даних літератури
відомо, що хелідонін має властивість зв’язуватись із тубуліном і є
антимітотичним чинником (Colombo M.L. et al., 1996). Він є також менш
цитотоксичним чинником, ніж інші алкалоїди чистотілу.

Порівняння активності окремих алкалоїдів чистотілу показало, що вони
проявляють різну, часом протилежну за скерованістю дію, зокрема на
фагоцитоз. На відміну від решти алкалоїдів, які пригнічували фагоцитарну
активність гранулоцитів, хелідонін її стимулював. Така неоднозначність
дії може залежати від хімічної структури алкалоїдів. Із даних літератури
відомо, що алкалоїди групи сангвінарину і берберину взаємодіють із ДНК,
впливають на функціонування мітохондрій, у той час як хелідонін проявляє
антитубулінову активність і блокує процес мітозу внаслідок пошкодження
мітотичного веретена (Фаддеева М.Д. и др., 1997; Panzer A. et al.,
2001). Однак, передбачити конкретний прояв дії речовини на клітинні
функції на основі загального уявлення про її структуру неможливо. Для
цього необхідно проводити експериментальні дослідження, що й було
зроблено в нашій роботі.

Екстракти чистотілу містять одночасно всі досліджувані алкалоїди, а
також ряд інших речовин, і тому передбачити біологічну дію таких сумішей
важко. Співвідношення між окремими складниками, особливо тими, які мають
протилежну дію, може суттєво залежати від таких умов, як ґрунт,
інсоляція, температура, вологість і т.п. Тому при дослідженні
біологічної активності багатокомпонентних сумішей природних сполук
необхідно спочатку провести їх фракціонування і розділення на окремі
складники, після чого визначати біологічну активність окремих чистих
компонентів, застосовуючи при цьому кілька методичних підходів або
систем тестування біологічної активності.

ВИСНОВКИ

У дисертації, відповідно до поставленої мети та задач, було розроблено
методики отримання чотирьох основних алкалоїдів чистотілу: хелідоніну,
сангвінарину, хелеритрину та коптизину. Проведено порівняльне
дослідження впливу індивідуальних алкалоїдів чистотілу (сангвінарин,
хелідонін, хелеритрин, коптизин, берберин) на проліферацію пухлинних
клітин і утилізацію ними глюкози in vitro. Досліджено цитотоксичну дію
отриманих речовин щодо лейкемічних клітини лінії L1210, вплив на
утилізацію глюкози та утворення молочної кислоти клітинами NK/Ly
лейкемії миші, а також вплив на функціональну активність нейтрофільних
гранулоцитів крові людини. Виявлено кореляцію між цитотоксичною
активністю алкалоїдів і їх здатністю інтеркалювати в молекулу ДНК.
Отримано препарат тритерпенового сапоніну чистотілу, досліджено його
фізико-хімічні властивості і біологічну активність in vitro.

Розроблено методики фракціонування алкалоїдів чистотілу і очистки
основних алкалоїдів шляхом поступової екстракції в різних умовах без
застосування хроматографічних методів очистки. Отримано в чистому стані
5 основних алкалоїдів чистотілу: хелідонін, сангвінарин, хелеритрин,
коптизин та берберин; досліджено їх фізико-хімічні властивості і
біологічну активність в культурі клітин.

Найбільш виражену цитотоксичну дію в культурі лейкемічних клітин L1210
проявляють сангвінарин і хелеритрин, концентрація півмаксимального
ефекту пригнічення проліферації становить відповідно 2,5 мкг/мл та
1,0 мкг/мл. Коптизин та берберин є значно слабшими цитотоксичними
агентами, концентрація півмаксимального ефекту пригнічення проліферації
становить 10 мкг/мл для кожної з цих речовин. Хелідонін не викликає
загибелі клітин, однак блокує їх проліферацію (цитостатична дія). Під
впливом досліджуваних алкалоїдів клітини гинуть шляхом апоптозу, що
проявляється фрагментацією ДНК та утворенням апоптичних тілець.

У досліджених алкалоїдів чистотілу спорідненість до ДНК і ефективність
інтеркаляції зменшується у порядку: сангвінарин, хелеритрин, коптизин,
берберин. Відомий інтеркалятор актиноміцин D за активністю відповідає
берберину. Хелідонін не взаємодіє з ДНК і не впливає на стабільність її
конформації.

При дослідженні впливу основних алкалоїдів чистотілу на функціональну
активність нейтрофільних гранулоцитів людини встановлено, що найбільш
активними інгібіторами гранулоцитів є сангвінарин та хелеритрин, які
пригнічують хемілюмінесценцію і фагоцитоз в концентраціях 1-4 мкг/мл.
Особливий вплив на функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів
виявлено у хелідоніну, який пригнічує хемілюмінесценцію (на 30-40 %
менше відносно контролю), проте стимулює фагоцитарну активність
нейтрофільних гранулоцитів (на 15-40 % більше відносно контролю).

Сангвінарин, хелеритрин, коптизин та берберин підвищують швидкість
утилізації глюкози та продукування молочної кислоти клітинами мишачої
лімфоми NK/Ly. Вплив сангвінарину та хелеритрину виявляється у
концентрації 1-2 мкг/мл, коптизин та берберин виявляють подібну дію у
концентрації 10 мкг/мл. Хелідонін не викликав достовірних змін у
порівнянні з контролем.

Препарат сапоніну, отриманий із насіння чистотілу, проявляв цитотоксичну
активність у концентраціях вище 40 мг/мл. У нетоксичних концентраціях
він стимулює фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів людини.

Отримані результати свідчать, що індивідуальні алкалоїди чистотілу
проявляють різноспрямовані, часто протилежні біологічні ефекти, у
зв’язку з чим доцільним є розділення складних природних сумішей і
дослідження біологічної активності окремих компонентів.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.) на функціональну
активність гранулоцитів крові людини / М. Луцик-Кордовский, Т. Гулик,
Ю. Осип, Р. Стойка // Вісник Львів. університету. Серія біологічна. –
2004. – 35. – С. 47-53. (Дисертанту належить підготовка зразків для
дослідів, робота по отриманню біологічно-активних речовин, визначення
впливу досліджуваних речовин на фагоцитарну активність нейтрофільних
гранулоцитів крові, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі
результатів та написання статті).

2. Вплив складу розчинника та інтеркалюючих лігандів на конформаційну
стабільність молекули ДНК / Ю.Л. Осип, В.О. Камінський, М.Д. Луцик,
Р.С. Стойка // Медична хімія – 2004. – Т. 6, № 3 – С. 30-33.
(Дисертанту належить робота по отриманню біологічно-активних речовин та
проведення експериментів стосовно визначення впливу алкалоїдів чистотілу
на температуру термоденатурації ДНК, участь в аналізі результатів).

3. Використання стимульованих мітогеном лімфоцитів як клітин-мішеней при
тестуванні речовин на антипроліферативну активність / М.Д. Луцик, Лін
Ках Вай, Ю.Л. Осип, Р.С. Стойка // Експериментальна та клінічна
фізіологія та біохімія. – 2005. — № 1. – С. 19-24. (Дисертанту належить
робота по отриманню біологічно-активних речовин, участь у експериментах,
пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та
написання статті).

4. Осип Ю.Л., Гулик Т.М. Вплив алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus
L.) на функціональну активність гранулоцитів крові // VI-та конференція
молодих онкологів України – Київ. – 4-5 грудня, 2003. – С. 46.
(Дисертанту належить робота по отриманню біологічно-активних речовин та
визначення їх впливу на фагоцитарну активність нейтрофільних
гранулоцитів крові, статистичній обробці результатів, аналізі
експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

5. Lutsik M.D., Osyp Yu.L., Stoika R.S. Comparative study of
alkaloid/DNA interactions using individual alkaloids from greater
celandine (Chelidonium majus L.) // Ionic Soft Matter: Novel trends in
theory and applications – Lviv, Ukraine – April 14-17, 2004. – P. 14.
(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці
результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні
тез).

6. Osyp Yu.L., Lutsik M.D., Stoika R.S. Physico-chemical characteristics
of DNA-alkaloid interactions // Abstr. First (Inaugural) Ukrainian
Congress for Cell Biology. – Lviv. – April 25-28, 2004. – P. 362.
(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці
результатів, аналізі експериментальних даних).

7. Antiproliferative and immunomodulating effect of individual alkaloids
isolated from roots of Chelidonium majus L / M.D. Lutsik, Yu.L. Osyp,
M.L. Barska, M.A. Starykovych, R.S. Stoika // Abstr. First (Inaugural)
Ukrainian Congress for Cell Biology. – Lviv. – April 25-28, 2004. – P.
254. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній
обробці результатів, аналізі експериментальних даних).

8. Осип Ю.Л. Вплив основних алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.)
на фізико-хімічні властивості ДНК // Звітна конференція молодих вчених
інституту біології клітини – Львів. – 16 червня, 2005. – С. 19.
(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці
результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні
тез).

АНОТАЦІЯ

Осип Ю.Л. Вплив алкалоїдів і тритерпенів чистотілу (Chelidonium
majus L.) на проліферативну активність та метаболічні показники клітин
in vitro. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04-біохімія. – Інститут біології тварин УААН, Львів,
2005.

Дисертація присвячена дослідженню біологічної активності алкалоїдів та
тритерпенів чистотілу (Chelidonium majus L.). Отримано в чистому стані 5
основних алкалоїдів чистотілу хелідонін, сангвінарин, хелеритрин,
коптизин та берберин, досліджено їх фізико-хімічні властивості і
біологічну активність в культурі клітин. Найбільш виражену цитотоксичну
дію в культурі лейкемічних клітин L1210 проявляють сангвінарин і
хелеритрин (ІС50 2,5 мкг/мл та 1,0 мкг/мл). Коптизин та берберин є
значно слабшими цитотоксичними агентами (ІС50 10 мкг/мл). Хелідонін не
викликає загибелі клітин, однак блокує їх проліферацію (цитостатична
дія).

Встановлено, що найбільш активними інгібіторами функціональної
активності нейтрофільних гранулоцитів людини є сангвінарин та
хелеритрин, які пригнічують хемілюмінесценцію і фагоцитоз в
концентраціях 1-4 мкг/мл. Хелідонін, пригнічуючи хелюмінесценцію на
30-40 %, стимулює фагоцитарну активність гранулоцитів на 15-40 %.

Сангвінарин, хелеритрин, коптизин та берберин підвищують швидкість
утилізації глюкози та продукування молочної кислоти клітинами мишачої
лімфоми NK/Ly. Вплив сангвінарину та хелеритрину виявляється у
концентрації 1-2 мкг/мл, коптизин та берберин виявляють подібну дію у
концентрації 10 мкг/мл. Хелідонін не викликав достовірних змін у
порівнянні з контролем.

У досліджених алкалоїдів чистотілу спорідненість до ДНК і ефективність
інтеркаляції зменшувалась у порядку: сангвінарин, хелеритрин, коптизин,
берберин. Хелідонін не взаємодіє з ДНК і не впливає на стабільність її
конформації.

Препарат сапоніну, отриманий із насіння чистотілу, проявляв цитотоксичну
активність у концентраціях вище 40 мг/мл. У нетоксичних концентраціях
він стимулював фагоцитарну активність нейтрофільних гранулоцитів людини.

Ключові слова: хелідонін, сангвінарин, хелеритрин, коптизин, берберин,
проліферація, інтеркаляція, фагоцитоз, хемілюмінесценція, L1210, NK/Ly,
утилізація глюкози, продукування молочної кислоти.

АННОТАЦИЯ

Осип Ю.Л. Влияние алкалоидов и тритерпенов чистотела (Chelidonium
majus L.) на пролиферативную активность и метаболические показатели
клеток in vitro. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04-биохимия. – Институт биологии животных УААН,
Львов, 2005.

Диссертация посвящена изучению биологической активности алкалоидов и
тритерпенов чистотела (Chelidonium majus L.). В чистом состоянии
получено 5 основных алкалоидов чистотела хелидонин, сангвинарин,
хелеритрин, коптизин и берберин, исследовано их физико-химические
свойства и биологическую активность в культуре клеток.

В результате исследования влияния полученных веществ на пролиферативную
активность было установлено, что наиболее сильное цитотоксическое
действие в культуре клеток линии L1210 проявляют сангвинарин и
хелеритрин (ІС50 2,5 мкг/мл и 1,0 мкг/мл). Коптизин и берберин являются
более слабыми цитотоксическими агентами (ІС50 10 мкг/мл). Хелидонин не
вызывает смерти клеток, но блокирует их пролиферацию (цитостатическое
действие).

Установлено, что наиболее активными ингибиторами функциональной
активности нейтрофильных гранулоцитов человека является сангвинарин и
хелеритрин, которые подавляют хемилюминесценцию и фагоцитоз в
концентрациях 1-4 мкг/мл. Хелидонин, угнетает хелюминесценцию на
30-40 %, но стимулирует фагоцитарную активность гранулоцитов на 15-40 %.

Сангвинарин, хелеритрин, коптизин и берберин увеличивают скорость
утилизации глюкозы и продукции молочной кислоты клетками мышиной лимфомы
NK/Ly. Влияние сангвинарина и хелеритрина проявляется при концентрации
1-2 мкг/мл, коптизин и берберин проявили подобное действие в
концентрации 10 мкг/мл. Хелидонин не вызывал достоверных изменений в
сравнении с контролем.

Проведен сравнительный анализ интеркалирующих свойств пяти
индивидуальных алкалоидов чистотела. В качестве эталона сравнения
применяли известный интеркалятор актиномицин D. Установлено, что
исследованные алкалоиды чистотела за исключением хелидонина проявляют
свойства интеркаляторов. Они повышали температуру плавления ДНК,
наиболее значительное повышение наблюдалось в присутствии хелеритрина и
сангвинарина (на 16-17оС при концентрации алкалоида 10 мкг/мл).
Полумаксимальный эффект повышения температуры плавления ДНК достигался
при следующих концентрациях алкалоидов (мкг/мл): сангвинарин – 4,4;
хелеритрин – 4,6; коптизин – 5,4; бербрин – 5,7; актиномицин D – 5,7.
Результаты теста на вытеснение метилового зеленого из ДНК комплекса дали
аналогичный результат. Концентрации алкалоидов, обеспечивающие
полумаксимальный эффект в данном тесте, составляли: сангвинарин – 9,
хелеритрин – 15,5, коптизин – 34, берберин – 41,5, актиномицин D – 42
мкг/мл. Количественно результаты отличались от таковых, полученных по
температуре плавления, однако порядок размещения алкалоидов по
ослаблению интеркалирующих свойств был идентичным. По эффективности
интеркалирования актиномицин D соответствовал берберину. Установлено,
что между цитотоксичностью и антипролиферативной активностью алкалоидов
чистотела и их интеркалирующими свойствами существует тесная корреляция.

Препарат сапонина, полученный из семян чистотела, проявлял
цитотоксическую активность при концентрациях выше 40 мг/мл. В
нетоксических концентрациях он стимулировал фагоцитарную активность
нейтрофильных гранулоцитов человека.

Полученные результаты указывают на то, что индивидуальные алкалоиды
чистотела проявляют разные, часто противоположные биологические эффекты,
в связи с этим целесообразным есть разделение сложных природных смесей и
исследование биологической активности отдельных компонентов.

Ключові слова: хелидонин, сангвинарин, хелеритрин, коптизин, берберин,
пролиферация, интеркаляция, фагоцитоз, хемилюминесценция, L1210, NK/Ly,
утилизация глюкозы, продукция молочной кислоты.

SUMMARY

Osyp Yu.L. Influence of alkaloids and triterpens from celandine
(Chelidonium majus L.) on proliferation and metabolitic activity of
cells in vitro.

Thesis for Ph.D. science degree of speciality 03.00.04 – biochemistry.
Institute of Animal Biology of the Ukrainian Academy of Agrarian
Science, Lviv, 2006.

Dissertation is devoted to the study of biological activity of alkaloids
and triterpens from the celandine (Chelidonium majus L.). The effect of
five individual alkaloids (i.e. sanguinarine, chelerythrine,
chelidonine, coptisine, berberine) obtained from greater celandine roots
on cytotoxicity activity has been investigated. According to the
effectiveness of tested alkaloids they are arranged in the next order:
chelerythrine (ІС50 1 мg/ml), sanguinarine (ІС50 2,5 мg/ml), coptisine
(ІС50 10 мg/ml) and berberine (ІС50 10 мg/ml). Chelidonine has
cytostatic activity.

All alkaloids except chelidonine suppressed phagocytic activity and
chemiluminescence intensity in neutrophile granulocytes from human
peripheral blood. The most pronounced effect was exhibited by
sanguinarine and chelerythrine in concentrations lower than 1-2 (g/ml.
Chelidonine expressed bimodal effect: while stimulating phagocytosis, it
suppressed chemiluminescence in granulocytes.

Sanguinarine, chelerythrine, coptisine and berberine increase glucose
utilization and decrease lactate production of NK/Ly cells. Sanguinarine
and chelerythrine have effect in concentration 1-2 (g/ml, coptisine and
berberine have effect in concentration 10 (g/ml. Chelidonine does not
influence for glucose utilization and decrease lactate production of
NK/Ly cells.

Chelidonium alkaloids interact with DNA differentially: sanguinarine and
chelerythrine are strong intercalators, coptisine and berberine are
moderate ones, while chelidonine practically does not interact with DNA.

Keywords: sanguinarine, chelerythrine, chelidonine, coptisine,
berberine, proliferation, phagocytosis, chemiluminescence, L1210, NK/Ly,
glucose utilization, lactate production.

PAGE 1

PAGE 20

Рис. 1. Вплив алкалоїдів чистотілу та актиноміцину D на температуру
плавлення ДНК.

1 – хелідонін; 2 – берберин; 3 – коптизин;

4 – сангвінарин; 5 – хелеритрин;

6 – актиноміцин D.

Рис. 2. Конкурентне витіснення МЗ алкалоїдами з комплексу ДНК–МЗ

1 – хелідонін; 2 – сангвінарин; 3 – хелеритрин;

4 – берберин; 5 – коптизин;

6 – актиноміцин D.

Похожие записи