львівський національний університет імені івана франка

вац юліана олександрівна

удк 612.014.42:612.31:591.431.2

Властивості Са2+-помпи мембран ацинарних секреторних клітин підщелепної
слинної залози щурів

03.00.13 — фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів — 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного
університету імені Івана Франка Міністерства освіти і науки Украйни.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

Тугай Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник

Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України.

кандидат біологічних наук,

Давидовська Тамара Леонідівна,

доцент кафедри біофізики

Київського національного університету імені

Тараса Шевченка.

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.
Богомольця, м. Київ.

Захист відбудеться “17” червня 2004 року о 1500 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 Львівського національного
університету імені Івана Франка (79005, м. Львів, вул.. Грушевського, 4,
біологічний факультет, ауд. № 333).

Поштова адреса: 79005, м. Львів, вул.. Грушевського, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського
національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м.
Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “14” травня 2004 року.

Виконуючий обов’язки вченого секретаря

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Манько В.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Дослідження ролі Са2+-АТФаз у Са2+-залежній
регуляції функціонування секреторних клітин є особливо актуальним з
огляду на те, що у екзокринних клітинах за рахунок процесів
внутрішньоклітинної Ca2+-сигналізації забезпечується спряження між
стимулом і секрецією. Секреторні клітини характеризуються унікальною
полярною будовою і завдяки цьому специфічним просторово-часовим
перебігом внутрішньоклітинних процесів, зокрема Са2+-сигналізації та
екзоцитозу (Gerasimenko et al., 1996, Petersen et al., 1999). Викликане
вивільненням Са2+ з ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) підвищення його
концентрації у цитозолі приводить до активації Са2+-помпи плазматичної
мембрани (ПМ) (Tepikin et al., 1992). При спустошенні Са2+-депо після
стимуляції клітин Са2+ входить через депо-керовані канали базальної
мембрани і закачується Са2+-помпою в ЕПР. Таким чином, Са2+-помпи ПМ та
ЕПР відіграють важливу роль у підтриманні внутрішньоклітинного
Са2+-гомеостазу секреторних клітин, що було доведено з використанням
специфічних блокаторів цих систем на панкреацитах (Petersen & Cancela,
2000), клітинах слинних залоз ссавців (Liu et al., 1998) та личинок
хірономід (Федірко, Клевець, 2000), гепатоцитах (Zhuang et al., 2002). З
фізіологічної точки зору Са2+-помпи – це системи енергозалежного
транспорту Са2+, проте слід наголосити, що їх робота забезпечується
ферментами – Са2+-АТФазами, що здійснюють спряження гідролізу АТФ та
транспорту Са2+ через мембрану. Як і кожен фермент, вона
характеризується кінетичними та каталітичними властивостями, з’ясування
яких є необхідним для розуміння як закономірностей функціонування
Са2+-помп за фізіологічних умов, так і механізму порушення їх функцій
при патологіях. Враховуючи це, актуальною проблемою сучасної фізіології
клітини є комплексне вивчення функціонування Са2+-помп та їх ролі у
регуляції функціональних відповідей клітин (з використанням
фізіологічних методів на цілісних клітинах та їх функціональних
угрупуваннях — ацинусах) і ферментативної активності Са2+-АТФаз (з
використанням біохімічних методів на мембранних везикулах) на одному
об’єкті, що дасть змогу сформувати цілісне уявлення про роль Са2+-помп у
Са2+-залежній регуляції функцій ацинарних клітин. У зв’язку з цим не
підлягає сумніву актуальність та доцільність ідентифікації, вивчення
властивостей та особливостей модифікації функціонування цих систем
секреторних клітин та їх ролі у регуляції функціональних відповідей
клітин слинних залоз, чому і присвячена дана робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана в рамках науково-дослідних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і
енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під
впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 O 001452, БЛ-114Б
“Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних
клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872, а також за сприяння
Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні
властивостей Са2+-помп мембран секреторних клітин слинної залози на
основі аналізу змін внутрішньоклітинної концентрації іонізованого Са2+
([Са2+]і), сумарного вмісту кальцію у ацинарних клітинах, кінетичних та
каталітичних характеристик Са2+-АТФаз мембранних везикул. Для досягнення
цієї мети необхідно було вирішити наступні завдання:

З’ясувати роль Са2+-помп у Са2+-залежній регуляції функціонування клітин
підщелепної слинної залози щурів та визначити питомі активності
Са2+-АТФаз у фракції мембранних везикул.

Провести аналіз кінетичних та каталітичних властивостей Cа2+-АТФаз ПМ та
ЕПР клітин слинної залози щурів, як основні типологічні показники, що
визначають функціональну роль Са2+-помп.

Дослідити роль іоногенних груп залишків амінокислот у функціонуванні
Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинної залози щурів.

З’ясувати внутрішньоклітинні Са2+-залежні механізми порушення
функціонування секреторних клітин слинних залоз за умов ксеростомії.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі виявлених змін
сумарного вмісту та [Са2+]і під впливом специфічних блокаторів Са2+-помп
вперше доведено роль Са2+-помп в здійсненні Са2+-залежної регуляції
функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів.
Визначено кінетичні та каталітичні характеристики Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР
ацинарних клітин, механізми модуляції їх функціонування та роль окремих
іоногенних груп у регуляції їх роботи Показано неконкуретний механізм
інгібування сульфгідрильними реагентами Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР, що
супроводжується зниженням спорідненості їх центрів до АТФ. На основі
значень рК та інгібіторного аналізу постулюється важлива роль
імідазольної групи гістидину, SH-групи цистеїну, СОО-_груп глутамінової
та аспарагінової кислот у функціонуванні Са2+-АТФаз. Вперше показано, що
за умов ксеростомії відбувається пригнічення функціонування Са2+-АТФаз,
що і є однією із причин розвитку порушень слиновиділення та травлення у
ротовій порожнині у пацієнтів, що страждають на ксеростомію.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть
бути теоретичною основою для подальших досліджень Са2+-гомеостазу в
секреторних клітинах, причин розвитку патологій травних залоз та
розробки методів їхньої фармакологічної корекції. Вони використовуються
при читанні загального курсу з фізіології людини і тварин, біофізики та
спецкурсу із фізіології травлення у Львівському національному
університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи
автором разом з доцентом кафедри фізіології людини і тварин Львівського
національного університету імені Івана Франка к.б.н. Федірко Н.В. та
науковим керівником розроблено методики одержання фракції мембранних
везикул клітин слинної залози, визначення питомих активностей Са2+-АТФаз
ПМ та ЕПР секреторних клітин та проведено планування досліджень. Автором
самостійно здійснено проведення переважної більшості експериментів,
поданих у даній роботі, їх статистичну обробку, аналіз, узагальнення,
висновки. Деякі експерименти було проведено спільно з іншими
дослідниками з приблизно однаковим внеском: дослідження
внутрішньоклітинної Са2+-сигналізації в ацинарних клітинах слинних залоз
за умов модифікації роботи Са2+-помп – з к.б.н. Федірко Н.В. та старшим
науковим співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН
України к.б.н. Войтенко Н.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до
дисертації та основні положення були представлені на: наукових семінарах
кафедри фізіології людини і тварин (2000-2003 рр.), міжнародній
школі-семінарі “Мембрани і сигнали” (Київ, 2000 р.), З’їзді Британського
фізіологічного товариства (Ліверпуль, 2001 р.), 23му Міжнародному
Конгресі фізіологічних наук (Крайсчерч, 2001 р.), 4тій Конференції
Чеського Нейрофізіологічного товариства (Прага, 2001 р.), Міжнародному
симпозіумі “Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та тваринних
системах” (Київ, 2001 р.), 16му З`їзді Українського фізіологічного
товариства (Вінниця, 2002 р.), III з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002 р.), Міжнародній конференції пам’яті проф.
Шостаковської І.В. (Львів, 2002 р.), 47му з’їзді Американського
Біофізичного товариства (Сан-Антоніо, 2003 р.), 3му Конгресі FEPS (Ніца,
2003 р.), щорічних звітних конференціях біологічного факультету
Львівського національного університету імені Івана Франка (2000-2002
рр.) та міжкафедральному семінарі біологічного факультету у жовтні 2003
р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 6 статей у фахових
наукових журналах та 9 тез доповідей у матеріалах міжнародних та
українських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 187
сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: „Вступ”,
„Огляд літератури”, „Методи досліджень”, „Результати досліджень”,
„Обговорення результатів досліджень”, „Висновки” та „Список використаних
джерел”, який містить 349 посилань. Робота ілюстрована — 49 рисунками та
4 таблицями.

основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Вимірювання сумарного вмісту кальцію. Дослідження ролі Са2+-помп у
підтриманні Са2+-гомеостазу та функціонуванні секреторних клітин
проводили на ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.
Клітини ізолювали з використанням колагенази (тип І, активність — 270
од/мг). Зовнішньоклітинний розчин, який використовували для інкубації
клітин містив (в ммоль/л): NaCl — 140,0; KCl — 4,7; CaCl2 — 1,3; MgCl2 —
1,0; HEPES — 10; глюкоза — 10,0 (рН =7.4). Сумарний вміст кальцію у
клітинах визначали після відмивання зовнішньоклітинного розчину та
гомогенізації з використанням арсеназо ІІІ і виражали у нмолях в
перерахунку на 1 мкг білка. Секрецію загального білка виражали у
процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті, який
визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951).

Вимірювання [Ca2+]і в ацинарних клітинах. [Ca2+]і в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози щурів реєстрували з використанням
флуоресцентного барвника фура-2/АМ. Флуоресцентний сигнал реєстрували на
довжинах хвиль 360 та 390 нм. Реєструючи відносну зміну інтенсивності
флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати
[Ca2+]і у клітинах за формулою, яка була запропонована Грінкевичем і
співавт. у 1985 р. (Grynkiewicz et al., 1985):

[Ca2+]i = Kd ( b ( (R — Rmin)/(Rmax — R).

Значення констант, що входять у рівняння, одержані внаслідок
калібрування: Rmin=0,9, Rmax=19, b=26. Параметр Kd, взятий з роботи
Грінкевича і співавт. (Grynkiewicz et al., 1985), становив 224 нмоль/л.

Одержання фракції мембранних везикул. Гетерогенну фракцію мембранних
везикул підщелепної слинної залози щурів одержували методом
диференційного центрифугування (Kribben et al., 1983; Thiyagarajah et
al., 1986). Залозу гомогенізували у буферному розчині, який містив в
ммоль/л: сахароза — 250,0; ЕДТА — 1,0; трис-Сl — 10,0 (рН = 7.1, t =
4?С); оуабаїн — 1,0; NaN3 — 1,0. Супернатант, збагачений фрагментами ПМ
та ЕПР, одержаний після серії центрифугувань (10 хв при 1600 g та 10 хв
при 10000 g), зберігали при t = -200С. Топологію мембранних фрагментів
визначали після їх обробки розчином дигітоніну (0,1 %).
Електронно-мікроскопічно показано, що фракція мембранних фрагментів
підщелепної слинної залози представлена замкнутими в площині везикулами
діаметром 0,5 ± 0,04 мкм (n=89).

Визначення активності Са2+-АТФаз. Аліквоти мембранних везикул переносили
у розчин, близький за складом до внутрішньоклітинного (РБВ), який містив
в ммоль/л: NaCl — 50,0; KCl — 100,0; трис-Сl — 20,0 (рН = 7.4, t =
37?С); MgCl2 — 3,0; CaCl2 — 0,01. АТФ-гідролазну реакцію ініціювали
додаванням 3 ммоль/л АТФ. Проби інкубували 1,5 хв (t = 37?С) і реакцію
зупиняли додаванням 200 мкл 20 % ТХО після чого вміст пробірок
відцентрифуговували (10 хв при 1600 g). В одержаному безбілковому
супернатанті фотоелектроколориметрично визначали вміст Рі за
модифікованим методом Фіске-Суббароу (Hurley et al., 1984). Питому
активність АТФазних систем виражали у мкмоль Рі/год·мг білка. При цьому
враховували вміст ендогенного фосфору та Рі, вивільненого в процесі
неферментативного гідролізу АТФ. Вміст білка мембранного препарату
визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951). Активність Са2+-АТФаз
розраховували як різницю між активністю АТФазних систем в Са2+-вмістному
та безкальцієвому середовищах. Сумарну Са2+-АТФазну активність розділяли
на складові: тапсигаргін-нечутливу Са2+-АТФазу ПМ та тапсигаргін-чутливу
Са2+-АТФазу ЕПР.

Метод отримання експериментального діабету. Діабет викликали
внутрішньоочеревинною ін’єкцією стрептозотоцину, розчиненого в 0,9 %
розчині NaCl, з розрахунку 80 мг на 1 кг маси тіла тварини.
Стрептозотоцин-ін’єктовані та контрольні тварини того ж віку утримували
на однаковій дієті протягом всього періоду розвитку захворювання. Тварин
використовували в експерименті через 3-5 тижнів після ін’єкції
стрептозотоцину. Концентрація глюкози в плазмі крові здорових тварин
знаходилася в межах 5 — 9 ммоль/л, у хворих на
стрептозотоцин-індукований діабет — 14 — 28 ммоль/л.

Оригінальні записи [Са2+]і, опрацьовували за допомогою програми Tida
версії 5.0 (Batelle, Germany). Концентрацію вільного Са2+ в інкубаційних
середовищах розраховували за допомогою програми “Win MAXC v2.10, Chris
Patton” (Stanford University, USA). Для порівняння і визначення
достовірності відмінностей між одержаними даними, використовували t-тест
Стьюдента (Деркач, 1977). Опрацювання результатів проводили за допомогою
персонального комп’ютера ІВМ РС АТ. Уявні константи, що характеризують
спорідненість Са2+-АТФаз до реагентів (КАТФ, КСа, КMg) та ефекторів (Кі
для інгібіторів) розраховували, виходячи із ліанеризованих рівнянь
Хілла. Значення коефіцієнтів кореляції (r) лінеаризованих графіків
становили 0,95-0,99.

Результати досліджень

Функціональне підтвердження ролі Са2+-помп в здійсненні Са2+-залежної
регуляції функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози
щурів

Нами показано, що внаслідок додавання в середовище інкубації ацинарних
клітин еозину Y (10 мкмоль/л) сумарний вміст кальцію достовірно зростав
на 41 ± 7 % (р<0,05, n=6). Додавання ж до середовища тапсигаргіну та рутенієвого червоного не викликало достовірних змін показника (рис. 1). Отже, очевидно, що у підтриманні низької [Cа2+]і у досліджуваних клітинах відіграє узгоджена робота Са2+-помп ПМ та ЕПР. Підтвердженням цього є зареєстровані нами [Cа2+]і-транзиєнти, які виникали при аплікації (15 с) блокаторів Са2+-помп ПМ та ЕПР (рис.2): еозину Y (5 мкмоль/л) - з амплітудою 74 ± 8 нмоль/л (р<0,05, n=6), циклопіазонієвої кислоти (5 мкмоль/л) - 45 ± 6 нмоль/л (р<0,05, n=6), тапсигаргіну – 43 ± 7 нмоль/л (р<0,05, n=6). Внаслідок інкубації ацинарних клітин у присутності 10 мкмоль/л ніфедипіну сумарний вміст у них кальцію достовірно зменшувався на 28 ± 4 % (p<0,05, n=10). Сумісна дія ніфедипіну та еозину Y не викликала достовірних змін показника. Це свідчить, на нашу думку, про взаємодію між надходженням Са2+ в стані спокою Са2+-каналами та викачуванням його з цитозолю Са2+-помпами. 2. Кінетичні та каталітичні властивості Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів Активність сумарної Са2+-АТФази мембран ацинарних клітин становила 7,4 ± 0,1 мкмоль Рі/год на 1 мг білка, тапсигаргін-нечутливої її складової – 4,6 ± 0,1 мкмоль Pi/год на 1 мг білка та тапсигаргін-чутливої – 1,1 ± 0,1 мкмоль Pi/год на 1 мг білка (n=89). Отже, мембранні везикули секреторних клітин підщелепної слинної залози здійснюють Са2+-залежний гідроліз АТФ, який каталізується Са2+-АТФазами ПМ та ЕПР. При дослідженні топології мембранних фрагментів показано їх переважну inside-out орієнтацію, оскільки після їх обробки дигітоніном не спостерігалося змін активності Mg2+-, та Na+,K+-АТФаз, які, як відомо, тестують цитоплазматичний бік ПМ (Невилл, 1979; Daniel, 1985). Шляхом лінеаризації кривої залежності активності сумарної Са2+-АТФази мембрани ацинарних клітин від часу інкубації розраховано величини початкової швидкості (V0), максимальної кількості продукту реакції (Рmax) та характеристичного часу реакції Ca2+-залежного гідролізу АТФ (?) (рис. 3). Виявилось, що реакція Ca2+-залежного гідролізу АТФ, що каталізується Са2+-АТФазами мембран секреторних клітин відповідає за кінетикою реакції першого порядку. Нами виявлено двофазний характер залежності активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинних залоз від концентрації АТФ. Шляхом лінеаризації одержаних експериментальних кривих в координатах Хілла ми показали наявність високо- та низькоафінних центрів зв’язування АТФ, які відрізняються за своїми каталітичними властивостями (табл. 1). Показано однакову спорідненість обох Са2+-АТФаз до субстрату ферментативної реакції (на основі подібності їх констант Міхаеліса (КАТФ) в обох центрах). Встановлено, що високоафінний центр Са2+-АТФази ПМ зв’язує АТФ з негативною кооперативністю, а Са2+-АТФази ЕПР – з позитивною. Виявилось, що коефіцієнти Хілла (nн) низькоафінних центрів обох Са2+-АТФаз є значно вищі за одиницю. Залежність активності Са2+-АТФз мембран клітин слинних залоз від [Са2+]і також є двофазною (табл. 2). Са2+-АТФаза ПМ є більш чутливою до Са2+ у високоафінному центрі зв’язування, ніж у Са2+-АТФаза ЕПР. Високі значення nн високоафінних центрів свідчать про позитивну кооперативність зв’язування Са2+ цими ділянками Са2+-АТФаз. Залежність активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР від концентрації іонізованого Mg2+ ([Mg2+]i) мала виражений дзвоноподібний характер. Розраховані нами КMg і nн для Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР становили 3,9 10-5 моль/л і 0,8 ± 0,1 та 3,8 10-5 моль/л і 0,6 ± 0,04 (n=6) відповідно. Спорідненість Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин до двовалентних катіонів та нуклеозидтрифосфатів Встановлено, що здатність Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин гідролізувати АТФ в присутності Mg2+ та Ме2+ (10-3 моль/л) відповідає таким послідовностям: Са2+=Ba2+>Sr2+ та Са2+=Ba2+=Sr2+ відповідно.
Здатність Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин гідролізувати АТФ в
присутності Са2+ та Ме2+ (10-3 моль/л) зменшується в таких рядах:
Mg2+>Mn2+>Co2+>Cu2+ та Mg2+=Mn2+>Cu2+>Co2+ відповідно. Са2+-АТФази
мембран клітин підщелепної слинної залози щурів характеризуються високою
спорідненістю до АТФ. Ефективність гідролізу різних нуклеозидтрифосфатів
Са2+-АТФазами ПМ та ЕПР клітин слинних залоз зменшується відносно АТФ в
послідовностях: АТФ (100 %) > ГТФ (46 %) > УТФ (32 %) > ЦТФ (29 %) та
АТФ (100 %) > ГТФ (50 %) > ЦТФ (40 %) > УТФ (33 %) відповідно.

4. Модуляція роботи Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз

Вплив блокаторів, температури та зміни рН середовища на Са2+-АТФази ПМ
та ЕПР ацинарних клітин слинних залоз. З’ясувалось, що еозин Y пригнічує
Са2+-АТФази ПМ та ЕПР з константою інгібування (Кі) 2,9 ± 0,2 · 10-5 та
4,7 ± 0,1 · 10-5 моль/л (n=6), а La3+ – з Кі 1,9 ± 0,01 · 10-3 та 4,5 ±
0,1 · 10-4 моль/л відповідно. Показано, що для Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР
оптимуми рН складають 7.3 та 7.0 відповідно. Зниження рН від 7.4 до 6.0
приводило до пригнічення роботи Са2+-АТФаз з рКа — 6.7 та 6.0 для
Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР відповідно. Залужнення середовища від 7.4 до 8.0
також призводило до зниження активностей Са2+-АТФаз (рКb для Са2+-АТФаз
ПМ та ЕПР – 8.44 та 7.22 відповідно). Температурні оптимуми для
Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР ацинарних клітин становлять 42?С та 37?С, а енергія
активації складає 33 та 39 кДж/моль відповідно.

Роль SH-груп в функціонуванні Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин
підщелепної слинної залози щурів. Для з’ясування ролі SH-груп в
функціонуванні Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР ми додавали до середовища інкубації
парахлормеркурійбензоат (ПХМБ) в різних концентраціях (1-1000 мкмоль/л).
ПХМБ пригнічував досліджувані АТФази з Кі 0,6 ± 0,1 · 10-3 та 1,4 ± 0,1
· 10-3 моль/л для Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР відповідно. Хелатор SH-груп
дитіотреітол (ДТТ) збільшував активність Са2+-АТФази ПМ на 10 ± 2 % (при
0,01 ммоль/л ДТТ, р<0,05, n=4), а мембрани ЕПР на 60 ± 12 % (при 0,1 ммоль/л ДТТ, р<0,05, n=4). ДТТ зворотно реактивув пригнічену ПХМБ активність Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР (максимальне підвищення їх активності складало 180 ± 34 % та 280 ± 39 % (р<0,05, n=7) порівняно до ефектів ПХМБ), проте не повністю їх відновлював (рис. 4). Нами встановлено неконкуретний спосіб взаємодії ПХМБ з SH-групами Са2+-АТФаз, оскільки вираженість його пригнічуючого впливу не залежала від тривалості преінкубації з ним мембранних везикул. Для з’ясування механізму впливу ПХМБ на функціонування Са2+-АТФаз мембран ацинарних клітин ми провели аналіз залежності їх активності від [АТФ] та [Са2+]і в присутності ПХМБ. Нами встановлено, що при [АТФ], нижчих за 0,5 ммоль/л, ПХМБ (150 мкмоль/л) повністю пригнічував Са2+-AТФази. При додаванні до середовища, яке містило ПХМБ, АТФ у концентраціях 1 – 3 ммоль/л активність обох Са2+-АТФаз поступово збільшувалась, хоча була значно нижчою, ніж у контролі. З’ясувалось, що ПХМБ викликає підвищення KАТФ в середньому на 30 ± 3 % та 42 ± 5 % (р<0,05, n=7) для Са2+-AТФаз ПМ та ЕПР відповідно, що свідчить про зниження спорідненості АТФ-зв’язуючого центру Са2+-АТФаз до АТФ. ’ ¶ ? ue ( F l n   c a ’ ue , D F c a ????? ??????? ????? ????? ??? ??? ????? ????? ??? ????? ????? ??????????? ??????? ??????????? = n=6) порівняно до контролю. ці дані свідчать про важливу роль кальмодуліну у регуляції роботи Са2+-АТФази ПМ ацинарних клітин. Зміни функціонування Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР за умов ксеростомії Ксеростомія (сухість в роті) є наслідком зниженої функціональної активності клітин слинних залоз (Chisholm & Mason, 1975). Однак сьогодні субклітинні механізми зниження функціональної активності клітин слинних залоз залишаються не вивченими. Нами вперше показано, що при стрептозотоцин-індукованому діабеті (як експериментальній моделі ксеростомії) порушується робота Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР. Зменшення їх активності складало 88 ± 3 % та 53 ± 6 % (р<0,05, n=9) порівняно із здоровими тваринами. Показано також, що за умов цукрового діабету знижується величина всіх кінетичних параметрів роботи Са2+-АТФаз: Рmax – на 52 ± 6 % і V0 - на 50 ± 7 % (p<0,05, n=7). Отже, за умов експериментально-індукованого діабету ефективність роботи Са2+-АТФаз виражено знижується. Нами показано, що за умов діабету зазнають змін і каталітичні параметри, що характеризують роботу Са2+-АТФаз (табл. 3, 4). Зокрема за цих умов відбувається зменшення Vmax високоафінного центру зв’язування АТФ Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР в середньому на 22 ± 2 % та 48 ± 7 % (p<0,05, n=6), а низькоафінного центру - на 45 ± 7 % та 83 ± 8 % (p<0,05, n=7) відповідно, порівняно до показників, одержаних на здорових тваринах. Причому нами виявлено підвищення KАТФ високоафінного центру зв’язування АТФ Са2+-АТФази ПМ (в середньому на 74 ± 6 % (p<0,05, n=7)). Однак нами не було виявлено змін KАТФ низькоафінного центру зв’язування та nн обох центрів Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин слинних залоз. Показано також, що за умов експериментального діабету відбувається достовірне зменшення величин Vmax, KСа низькоафінного центру зв’язування Са2+ в молекулах Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР в середньому на 50 ± 5 %, 84 ± 7 % та 27 ± 4 %, 74 ± 7 % (p<0,05, n=6) відповідно (табл. 4). З’ясувалось, що за умов експериментального діабету відбувається зростання кооперативності низькоафінного центру зв’язування Са2+ Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР в середньому на 63 ± 6 % та 58 ± 5 % (p<0,05, n=6) відповідно. Таким чином, нами вперше показано, що за умов цукрового діабету відбуваються зміни внутрішньоклітинного Са2+-гомеостазу, викликані зменшенням ефективності роботи Са2+-АТФаз, що є ймовірною причиною порушення секреторної функції слинних залоз. Обговорення результатів В експериментах на суспензії ацинусів підщелепної слинної залози щурів нами доведено важливу роль узгодженого функціонування Са2+-помп ПМ та ЕПР для регулювання Са2+-сигналізації. Наші дані сповна узгоджуються із результатами Петерсена і співавт. (Petersen et al., 1999) та Сміта і співавт. (Smith et al., 1994), які з використанням селективних флуоресцентних зондів довели важливий вклад Са2+-помп у регуляцію цих процесів у панкреацитах. Нами також виявлено, що підтримання внутрішньоклітинного Ca2+-гомеостазу забезпечується не лише Са2+-помпами, а є збалансоване з входом Са2+ із зовнішньоклітинного середовища. Таким чином, ще до стимуляції відбувається підготовка клітин слинних залоз до повноцінної секреторної відповіді при дії секретагогів, яка була б неможливою при “[Са2+]і-перевантаженні” чи недостатньо заповненому ЕПР, що забезпечується роботою Са2+-помп. Аналізуючи властивості Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР клітин підщелепної слинної залози щурів можна зробити висновок, що вони за своїми кінетичними та каталітичними параметрами (КАТФ, КСа, nH, КMg) подібні до систем АТФ-залежного накопичення Са2+ везикулами ПМ досліджуваних клітин (Hurley & Ryan, 1988), привушної слинної залози (Low et al., 1987), Са2+-АТФаз ПМ гепатоцитів (Pavoine et al., 1987) та мембран клітин прищитоподібної залози (Dawson-Hughes et al., 1983). Виявилось, що досліджувані нами Са2+-АТФази характеризуються високою спорідненістю до Mg2+, як необхідного компоненту хелатного комплексу Mg·АТФ, та АТФ, оскільки інші нуклеотидтрифосфати (ГТФ, ЦТФ, УТФ) зменшують їх активність. Інгібіторний аналіз показав, що Са2+-АТФази мембран клітин слинної залози ефективно пригнічуються еозином Y та La3+. Причому Са2+-АТФаза ПМ є більш чутливою до еозину Y, ніж Са2+-АТФаза ЕПР. Проте вони є менш чутливі до еозину Y, ніж Са2+-АТФаза ПМ гладком’язових клітин (Черниш, Слінченко, 1999). Кі по La3+ для Са2+-АТФази ЕПР були близькими до розрахованих для АТФ-залежного транспорту Са2+ в панкреацитах (Kribben et al., 1983). Оскільки La3+ утворює стійкі комплекси з СОО--групами, які, як відомо, містяться в Са2+-зв’язуючому (Adebayo et al., 1995) та, ймовірно, в АТФ-зв’язуючому центрах молекули ферменту, то пригнічення роботи Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин La3+ викликане блокування саме цих груп. З’ясувалось, що оптимуми рН для Са2+-АТФаз мембран досліджуваних клітин знаходяться в фізіологічних межах, характерних для цитоплазми клітин та близькі до наведених для АТФ-залежного накопичення 45Са2+ везикулами ПМ інших типів секреторних клітин (Kasson & Levin, 1981; Low et al., 1987; Evers et al., 1988). На основі рКа ми припускаємо, що носіями іоногенних груп в складі АТФ-зв’язуючого центру є залишки амінокислоти гістидину у молекулах обох Са2+-АТФаз. Згідно даних літератури ця амінокислота керує структурною перебудовою конформаційного переходу Е1?Е2 (Винокуров и др., 1998). На основі величини рКb ми припускаємо важливу роль амінокислотних залишків цистеїну у молекулах досліджуваних АТФаз. Підтвердженням цього також є виявлене нами пригнічення Са2+-АТФаз при дії ПХМБ. Причому, ймовірно, що у молекулах Са2+-АТФаз наявні як поверхневі, так і приховані SH-групи, оскільки ДТТ, як з’ясувалось, тільки частково відновлював пригнічені ПХМБ активності Са2+-АТФаз. Причому ПХМБ зв’язується з SH-групами у неконкурентний спосіб, оскільки нами не виявлено залежності його пригнічуючого ефекту від тривалості преінкубації з ним мембранних везикул секреторних клітин. На основі того, що ПХМБ приводить до підвищення КАТФ для Са2+-АТФаз і не впливає на КСа ми вважаємо, що ймовірним механізмом його дії є зниження спорідненості молекул ферменту до АТФ, внаслідок інгібування SH-груп АТФ-зв’язуючого центру. Така поширена патологія як ксеростомія (сухість в роті) є наслідком зниження здатності клітин слинних залоз продукувати та секретувати слину (Navazesh & Ship, 1983). Як модель ксеростомії ми використовували стрептозотоцин-індукований діабет. Виявилось, що у тварин із цукровим діабетом робота обох Са2+-АТФаз пригнічена. Подібні результати було отримано і на гепатоцитах (Струтинська і співавт., 2002), синаптосомах (Janicki et al., 1995), кардіоміоцитах (Rupp et al., 1994), клітинах крові (Balasubramanyan et al., 2001; Spieker et al., 1994). Ми припускаємо, що за умов цукрового діабету зменшується ефективність роботи Са2+-АТФаз секреторних клітин слинних залоз за рахунок змін кальцієвої та субстратної регуляції активності ферменту. На нашу думку, ймовірною причиною цього є зниження спорідненості Са2+-АТФази ПМ до АТФ (на основі підвищення КАТФ) і, крім того, зниження кількості обертів молекул обох Са2+-АТФаз (на основі зниження Vmax). Компенсація пригніченої за умов діабету функції Са2+-АТФаз здійснюється за рахунок зростання спорідненості до Са2+ та кооперативності його зв’язування. Проаналізувавши власні результати та дані літератури, ми пропонуємо гіпотетичну схему ролі функціонально важливих груп у роботі Са2+-АТФаз (рис. 6). За основу ми взяли модель будови Са2+-АТФази, запропоновану Лі та Істом (Lee & East, 2001). висновки: Оскільки дані щодо властивостей Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз є малочисельні, у дисертації із використанням комплексу методів проведено всебічне дослідження Са2+-помп клітин слинних залоз щурів, що включає ідентифікацію активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР, вивчення їх властивостей, механізмів модифікації та ролі у внутрішньоклітинній Са2+-сигналізації. Узгоджене функціонування Са2+-помп мембран ацинарних клітин слинних залоз відіграє важливу роль у підтриманні внутрішньоклітинного Са2+-гомеостазу та Са2+-залежної базальної секреції. Основні кінетичні параметри роботи Са2+-АТФаз клітин підщелепної слинної залози становлять: початкова швидкість V0 - 0,1 ± 0,01 мкмоль Рі/хв на 1 мг білка, максимальна кількість продукту реакції Рmax - 0,8 ± 0,1 мкмоль Рі/мг білка, характеристичний час ферментативної реакції ? - 6,8 ± 0,4 хв. Ідентифіковано високо- та низькоафінні центри зв’язування АТФ та Са2+ з Са2+-АТФазами мембран досліджуваних клітин. Показано участь високоафінного АТФ-зв’язуючого центру у ферментативній реакції, а в транспорті Са2+ - низькочутливої компоненти Са2+-залежного гідролізу АТФ. Здатність двовалентних катіонів заміняти Са2+ у функціонуванні Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР знаходиться у послідовності: Са2+=Ba2+>Sr2+ та
Са2+=Ba2+=Sr2+. Нами вперше показано пригнічення активності Са2+-АТФаз
ПМ та ЕПР клітин слинної залози при заміні Mg2+ (Mg2+>Mn2+>Co2+>Cu2+ та
Mg2+=Mn2+>Cu2+>Co2+). Здатність інших нуклеотидів заміняти АТФ у роботі
Са2+-АТФаз ПМ та ЕПР зменшується у послідовності: АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ та
АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ відповідно.

Са2+-АТФази мембрани секреторних клітин пригнічуються еозином Y, La3+ та
ПХМБ. На основі значень рК та інгібіторного аналізу постулюється важлива
роль імідазольної групи гістидину, SH-групи цистеїну, СОО-_груп
глутамінової та аспарагінової кислот у функціонуванні Са2+-АТФаз.

Сульфгідрильний реагент ПХМБ знижує спорідненість Са2+-АТФаз до АТФ,
проте не впливає на спорідненість до Са2+. Виявлено в складі їх молекул
як поверхневих, так і прихованих SH-груп. Показано неконкурентний спосіб
взаємодії ПХМБ з каталітичним центром Са2+-АТФаз.

Показано, що при експериментальному діабеті (як моделі розвитку
ксеростомії) порушується робота Са2+-АТФаз мембрани ацинарних клітин
слинних залоз, в основі чого, очевидно, є зменшення кількості обертів
молекули і зміни кальцієвої та субстратної регуляції активності
ферменту.

список опублікованих робіт за темою дисертації:

Fedirko N., Klevets M., Vats Ju. Isolated acini as an object for the
investigation of the Ca2+-transporting system of the secretory cell
membranes. // Neurophysiology. — 2000. — Vol. 32. — P. 183-184.
(Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання
експериментальних даних.)

Федірко Н.В., Клевець М.Ю., Кругліков І.А., Вац Ю.О. Зміни концентрації
катіонів кальцію у секреторних клітинах ізольованих ацинусов підщелепної
слинної залози щурів під впливом ацетилхоліну та норадреналіну // Вісн.
Харк. ун-ту, Біофізичний вісник. — 2001. — № 525. — С. 54-57. (Здобувач
провів дослідження змін сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах
під впливом медіаторів, взяв участь в аналізі експериментальних даних,
написанні та оформленні статті.)

Федірко Н.В., Вац Ю.О., Клевець М.Ю. Ідентифікація Са2+-активованої,
Mg2+-залежної АТФ-ази мікросомальної фракції мембран секреторних клітин
ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів. // Вісник
Львівського університету. Серія біологічна. — 2002. — Вип. 28. — С.
303-310. (Здобувач провів дослідження, статистичне опрацювання
результатів, аналіз експериментальних даних, взяв участь у написанні та
оформленні статті.)

Вац Ю.А., Федирко Н.В., Клевець М.Ю., Войтенко Н.В. Роль SH-групп в
функционировании кальцийтранспортных АТФаз, регулирующих кальциевый
гомеостаз и экзоцитоз.// Нейрофизиология // Neurophysiology. — 2002. –
Т. 34, № 1. — С. 7-17. (Здобувач провів дослідження та статистичне
опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі
експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

Fedirko N., Vats Ju., Klevets M., Kruglikov I., Voitenko N. Neuronal
control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology. —
2002. — Vol. 34, Nо. 2/3. — P.144-147. (Здобувач провів дослідження,
взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та
перекладі статті.)

Федирко Н.В., Вац Ю.О., Кругликов И.А., Войтенко Н. В. Изменения
функционирования Са2+-АТФаз экзокринных клеток крыс при
экспериментальном диабете. // Нейрофизиология / Neurophysiology. — 2003.
— Т. 35, № 5. — 12 с. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в
аналізі експериментальних даних та написанні статті.)

Fedirko N., Klevets M., Vats Yu. Caffeine-induced Changes of
Steady-state Ca2+ Content in the Secretory Cells of Rat Submandibular
Salivary Gland. // XXXIV International Congress of Physiological
Sciences, July, 25 – August, 1, 2001, Christchurch, New Zealand.
Programme and Abstracts. — http: //
iups.esc.auckland.ac.nz/cgi-in/get_registrant.cgi?registrants.id =1996.
(Здобувач провів дослідження та аналіз експериментальних даних.)

Fedirko N., Vats Ju., Klevets M. Noradrenaline-activated Са2+ influx
into the secretory cells of submandibular salivary gland //
International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal
Systems (ISPAS)”, 9-14 September, 2001, Kyiv, Ukraine, 2001. Programme
and Abstracts of International Symposium. — P. 59. (Здобувач провів
дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні,
оформленні, перекладі тез доповіді та представляв стендову доповідь на
конференції.)

Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Vats Ju.A., Klevets M.Yu. Possible
mechanism of steady-state Ca2+ increase in the acinar secretory cells of
rat submandibular salivary glands // Fourth Conference of the Czech
Neuroscience Society, October 23-25, 2001, Prague. — Abstract. — 2001. —
P. 68. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання
результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних,
написанні, оформленні та перекладі тез доповіді.)

Vats Ju., Klevets M., Fedirko N. Involvement of SH-groups in the
regulation of PMCA and SERCA functional activity // Proceedings of the
Physiological Society Meeting, Liverpool, July 8-12, 2002. — J Physiol
(Lond). — 2001. — Vol. 543. — P. 66. (Здобувач провів дослідження та
статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі
експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді,
представляв стендову доповідь на конференції.)

Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Дослідження Ca2+-, Mg2+-ATФазних
активностей плазматичної та ендоплазматичної мембран секреторних клітин
підщелепної слинної залози щурів// 16-й з`їзд українського
фізіологічного товариства. 28-30 травня, 2002 р., Вінниця. — Фізіол.
журн. — 2002. — Т. 48, № 2. — С.130-131. (Здобувач провів дослідження,
взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та
представляв стендову доповідь на конференції.)

Федірко Н.В., Вац Ю.О., Пасович О.Б., Копач О.В., Клевець М.Ю.
Дослідження механізмів підтримання Са2+-гомеостазу в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози щурів.// III з’їзд Українського біофізичного
товариства. 8-11 жовтня 2002 р., Львів. Тези доповідей. — С. 68.
(Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів
досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез
доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Залежність функціональної
активності Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз від
концентрації АТФ.// Матеріали міжнародної конференції. присвяченої
пам’яті професора Шостаковської І.В. 11-12 жовтня 2002 р., Львів, С. 14.
(Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів
досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез
доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

Fedirko N.V., Vats Ju., Klevets M.Yu. Role of Endoplasmic Ca2+-stores in
Cholinergic Ca2+ Signaling in Rat Salivary Acinar Cells // 47th Annual
Meeting of the Biophysical Society, 2-7 March 2003, San-Antonio, Texas,
USA. — Biophysical J. — 2003. — Vol. 84, № 2. — P. 228. (Здобувач провів
дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв
участь в аналізі експериментальних даних, написанні, перекладі тез
доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

Fedirko N., Vats J., Voitenko N. Effect of streptozotocin-induced
diabetes on salivary secretory cells Ca2+-ATPase // 3rd FEPS Congress,
28 June-2 July, 2003, Nice, France. — Abstract book. — P. 16. (Здобувач
провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень,
взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та
перекладі тез доповіді.)

анотаціЇ:

Вац Ю.О. Властивості Са2+-помпи мембран ацинарних секреторних клітин
підщелепної слинної залози щурів. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.13 — фізіологія людини і тварин. – Львівський
національний університет імені Івана Франка, Львів, 2004.

Дисертація присвячена комплексному вивченню властивостей Са2+-АТФаз
плазматичної та ретикулярної мембран клітин підщелепної слинної залози
щурів.

На ізольованих ацинусах показано, що Са2+-гомеостаз у клітині
підтримується за рахунок узгодженої роботи Са2+-помп та каналів
плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз.

В інтегральній фракції inside-out орієнтованих везикул слинної залози
ідентифіковано тапсигаргін-нечутливу Са2+-АТФазу плазматичної та
тапсигаргін-чутливу Са2+-АТФазу ретикулярної мембран. Ідентифіковано
високо- та низькоафінні центри зв’язування АТФ та Са2+ з Са2+-АТФазами.
Здатність катіонів заміняти Са2+ та Mg2+, та інших нуклеотидів заміняти
АТФ у роботі Са2+-АТФаз плазматичної та ретикулярної мембран знаходиться
у послідовності: Са2+=Ba2+>Sr2+ та Са2+=Ba2+=Sr2+; Mg2+>Mn2+>Co2+>Cu2+
та Mg2+=Mn2+>Cu2+>Co2+; АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ та АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ відповідно.
Інгібітори пригнічують Са2+-АТФази: еозин Y > ПХМБ > La3+. Виявлено,
важливу роль імідазольної групи гістидину та SH-групи цистеїну
АТФ-зв’язуючого центру у роботі Са2+-АТФаз.

Ключові слова: Са2+-АТФаза, [Са2+]і-сигналізація, мембранні везикули,
секреторні клітини, слинні залози.

Вац Ю.О. Свойства Са2+-насоса мембран ацинарных секреторных клеток
подчелюстной слюнной железы крыс. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Львовский
национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2004.

Диссертация посвящена комплексному изучению свойств Са2+-АТФаз
плазматической и ретикулярной мембран клеток подчелюстной слюнной железы
крыс.

На изолированных ацинусах показано, что Са2+-гомеостаз в клетке
поддерживается за счёт согласованной работы Са2+-насосов и каналов
плазматической мембраны секреторных клеток слюнных желез.

В интегральной фракции inside-out ориентированных везикул слюнной железы
идентифицировано тапсигаргин-нечувствительную Са2+-АТФазу плазматической
и тапсигаргин-чувствительную Са2+-АТФазу ретикулярной мембраны.
Идентифицировано высоко- и низкоаффинные центры связывания АТФ и Са2+ с
Са2+-АТФазами. Способность катионов заменять Са2+ и Mg2+, и других
нуклеотидов заменять АТФ в работе Са2+-АТФаз плазматической и
ретикулярной мембран находится в последовательности: Са2+=Ba2+>Sr2+ и
Са2+=Ba2+=Sr2+; Mg2+>Mn2+>Co2+>Cu2+ и Mg2+=Mn2+>Cu2+>Co2+;
АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ и АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ соответственно. Ингибиторы угнетают
Са2+-АТФазы: эозин Y > ПХМБ > La3+. Установлено важную роль имидазольной
группы гистидина и SH-группы цистеина АТФ-связывающего центра в работе
Са2+-АТФаз.

Ключевые слова: Са2+-АТФаза, [Са2+]і-сигнализация, мембранные везикулы,
секреторные клетки, слюнные железы.

Vats Ju.A. Properties of Ca2+ pumps of acinar secretory cells from rats
submandibular salivary gland. – Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on specialty 03.00.13 – Human and Animals
Physiology. – Ivan Franko National University of Lviv. Lviv, 2004.

Dissertation is devoted to the study of the properties of plasma and
endoplasmic reticulum membranes Ca2+-activated Mg2+-dependent ATPases of
rat submandibular salivary gland cells.

In the experiments using isolated acini secretory cells was shown that
intracellular Ca2+ homeostasis and spontaneous secretion are maintained
by coordinated functioning of both Ca2+ pumps and plasma membrane
channels.

We showed that integral fraction of inside-out oriented membrane
vesicles is enriched with thapsigargin-insensitive plasma membrane
Ca2+-ATPase and thapsigargin-sensitive endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase
molecules. Ca2+-activated Mg2+-dependent ATP hydrolysis reaction is
characterized by the following kinetic parameters: V0 – 0.1 ± 0.01
mcmoles Рі/min per 1 mg protein, Рmax – 0.8 ± 0.09 mcmoles Рі/mg
protein, ? – 6.8 ± 0.4 min. High- and low-affinity ATP- and Ca2+-binding
sites in the molecules of plasma and endoplasmic reticulum membranes
Ca2+-ATPases were revealed. It was established that high-affinity
ATP-binding site of both Ca2+-ATPases directly participates in enzymatic
reaction. Whereas with respect to Ca2+, low-sensitive component of
Ca2+-ATPase is responsible for Ca2+ -transporting function of molecules
of both enzymes.

The ability of other bivalent metal cations and nucleotides to suppress
the activity of plasma and endoplasmic reticulum membrane Ca2+-ATPases
decreased in the following sequences: Са2+=Ba2+>Sr2+ and Са2+=Ba2+=Sr2+;
Mg2+>Mn2+>Co2+>Cu2+ and Mg2+=Mn2+>Cu2+>Co2+; ATP> GTP>UTP>CTP and
ATP>GTP>CTP>UTP correspondingly. Plasma and endoplasmic reticulum
membrane Ca2+-ATPases are inhibited by eosin Y (Кі=2.9±0.2 · 10-5 and
4.7±1.0 · 10-5 mole/l), La3+ (Кі =1.9±0.1· 10-3 and 4.5±0.1 · 10-3
mole/l) and p-chloromercuribenzoate (Кі =0.6±0.1 · 10-3 and 1.4±0.1 ·
10-3 mole/l). Using dithiotreitol it was shown that the molecules of
both Ca2+-ATPases of salivary cells are enriched with mobile and masked
SH-groups. The activation energy of plasma and endoplasmic reticulum
membranes Ca2+-ATPases are 33 and 39 kJ/mol correspondingly. The
temperature and pH optimum for plasma and endoplasmic reticulum
membranes Ca2+-ATPases are 42 and 37?C, 7.3 and 7.0 correspondingly. It
was found that in the regulation of both Ca2+-ATPases important role
belong to imidazole group of histidine and SH-group of cysteine
consisting of ATP-binding sites. We suppose that decrease of enzyme
molecule rotation as well as regulation of Ca2+-ATPases by Ca2+ and ATP
could underlie the development of xerostomia.

Key words: Са2+-ATPase, [Са2+]і-signaling, membrane vesicles, secretory
cells, salivary glands.

активність, мкмольРі/год на 1 мг білка

активність, мкмольРі/год на 1 мг білка

мкмоль Рі/мг білка

мкмоль Рі/мг білка

Похожие записи