.

Вивчення участі продуктів метаболізму арахідонової кислоти у функціонуванні гепатоцитів щурів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера: Автореф. д

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2890
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ЛУШНІКОВА ІРИНА ВАСИЛІВНА
УДК 612.35:612.014.3:615.015.44

ВИВЧЕННЯ УЧАСТІ ПРОДУКТІВ МЕТАБОЛІЗМУ АРАХІДОНОВОЇ КИСЛОТИ У ФУНКЦІОНУВАННІ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ В КУЛЬТУРІ ТА КОКУЛЬТУРІ З КЛІТИНАМИ КУПФЕРА

Спеціальність
03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

КИЇВ 1999 р.

Роботу виконано у відділі імунології та цитотоксичних сироваток
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук,
Алексєєва Ірина Миколаївна
Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,
завідувач відділу імунології та цитосироваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
Жаліло Любов Іванівна
Українська Академія державного управління при
Президентові України, професор кафедри валеології

кандидат біологічних наук
Марченко Галина Іванівна
Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,
старший науковий співробітник відділу
експериментальної кардіології

Провідна установа: Київський університет ім.Т.Г.Шевченка,
кафедра фізіології людини та тварин

Захист відбудеться “30”листопада 1999 р. о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024 Київ, вул.Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Автореферат розісланий “20”жовтня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми
Печінка здійснює свої численні функції як цілісна система, яка складається з різних видів клітин, що взаємодіють між собою [Маянский Д.Н., 1992; Щеголев А.И., 1992; Spitzer J., 1995]. Гепатоцити виконують основні метаболічні функції, такі як підтримка в організмі гомеостазу вуглеводів, білків та ліпідів, детоксикаційну та екзокринну функції. Серед клітин сполучної тканини ключове положення займають макрофаги печінки (клітини Купфера) – є високореактивні клітини, біологічні якості яких вар”юють в широких межах в залежності від конкретної ситуації, а тому вони мають унікальну можливість реагувати та миттєво включатися в регуляцію гомеостазу і розвиток патологічного процесу. Показано, що важливими ендогенними регуляторами функцій клітин печінки та медіаторами їх взаємодії є продукти метаболізму арахідонової кислоти, цитокіни, NO. Аутокринна та паракринна регуляція функцій клітин печінки, поряд з нервовими та ендокринними впливами, забезпечує діяльність цього органу в фізіологічних умовах, а їх порушення в умовах патології є одним з найважливіших патогенетичних механізмів.
Відомо, що печінка синтезує простагландини та лейкотрієни з арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами метаболізму, відповідно[Huber M., 1990; Hagmann W., 1991; Kawada N., 1990; Meng X., 1994], а також є основним органом елімінації та деградації ейкозаноїдів системного походження [Brass E., 1988; Hagmann W., 1989; Keppler D., 1989; Leier I., 1992; Parthe S., 1990; Stene D., 1988; Shirley M, 1990; Shirley M., 1992; Tran-Thi T., 1994; Wettstein M., 1995; Wheelan P., 1995]. Дія простагландинів на печінку вивчена в більшій мірі, ніж лейкотрієнів. Показана участь простагландинів в регуляції вуглеводного обміну та деяких інших функцій гепатоцитів [Huber M., 1990; 4, Bjornsson O., 1992; Decker K. 1990; Kanemaki T., 1993; Mitkov D. 1990; Muschol W., 1991; Okumura T., 1990; Plumley D., 1995; Satoh M., 1993], а також в регуляції функціонального стану непаренхіматозних клітин печінки [Callery M., 1990; Georgakopoulos E., 1995; Goss J., 1993; Lysz T., 1990; Karck U., 1989; Peters T., 1989; West M., 1993]. Є окремі дані про вплив лейкотрієнів на функції печінки в нормі, а саме на процеси секреції жовчі [Rodriguez-Ortigosa C., 1995]. При виникненні пошкоджень печінки змінюється метаболізм арахідонової кислоти. Підвищення рівня лейкотрієнів в печінці було показано на цілому ряді видів її ураження in vivo, а блокада синтезу лейкотрієнів призводила до суттєвого зменшення пошкождень, що свідчить про участь цих похідних арахідонової кислоти в розвитку патологічного процесу [Kawada N., 1990; Meng X., 1994; Agha A., 1995; Gonzalez R., 1994; Hiroichi N., 1989; Kawada N, 1990; Parry E. 1993; Reyes M., 1995]. Показана також патогенетична роль тромбоксану – продукту циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти. Його концентрація підвищується при дії чотирихлористого вуглецю на печінку in vivo та на культивовані гепатоцити. Введення мишам тромбоксану призводило до ураження печінки, а блокада рецепторів до тромбоксану попереджала ушкодження [Meng X., 1994; Engin A., 1995; Marinovich M., 1989; Nagai H., 1989]. Поряд з патогенетичною дією метаболітів арахідонової кислоти виявлена і протективна дія таких простагландинів, як ПГЕ1, ПГЕ2 та простациклін [Bang S., 1991; Chamulitrat W., 1994; Chamulitrat W., 1995; Jones D., 1995; Kaminski D., 1989; Lim S., 1995; Masaki N., 1992; Nakano H., 1994;Totsuka E., 1995; Quiroga J., 1993]. Протективна чи ушкоджуюча дія ейкозаноїдів in vivo може бути пов”язана зі змінами мікроциркуляції, з міграцією та активацією або інгібіцією нейтрофілів, дією NO, що показано в ряді досліджень [Fukumura D., 1996; Gaudio E., 1997; Herbert K., 1989; Kurose I., 1996; Kurose I., 1997; Stadler J., 1995; Zhang B., 1997], а також з прямим впливом ейкозаноїдів на функції клітин печінки, що практично не досліджено. Адекватною моделлю для вивчення безпосередньої участі ейкозаноїдів в регуляції функцій клітин печінки є культура клітин. Культивування різних типів клітин печінки сумісно дозволяє вивчати взаємодію між ними. Вважають, що в печінці основними продуцентами ейкозаноїдів є клітини Купфера [Kuiper J., 1988; Mion F., 1995]. Останнім часом доведено, що гепатоцити також синтезують простагландини та лейкотрієни, які можуть виконувати роль аутокринних регуляторів [Huwyler J., 1990; Otomo Y., 1993; Yu M., 1998]. Таким чином, представляє особливий інтерес вивчення участі ейкозаноїдів в ауто- та паракринній регуляції функцій гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. На сучасному етапі змінам синтезу інформаційних молекул, в тому числі ейкозаноїдів, та порушенню міжклітинної взаємодії надається важливе значення в розвитку патологічних процесів у печінці. Для виявлення ролі продуктів метаболізму арахідонової кислоти в експерименті широко використовується фармакологічний підхід із застосуванням блокаторів синтезу відповідних ейкозаноїдів.
У зв”язку з вищенаведеним уявляєтся актуальним вивчення впливу блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на функціональний стан гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера, в нормі та при їх ураженні.

Зв”язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Тема дисертації пов”язана з дослідженнями, які виконуються відділом імунології і цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України “Вивчення участі продуктів метаболізму арахідонової кислоти у взаємодії імунокомпетентних клітин та антитіл з клітинами печінки, серця, статевих залоз” (1993-1998рр.).

Мета і задачі дослідження
Вивчити вплив блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на функціональну активність гепатоцитів щурів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в нормі та при дії гепатотоксичного агенту – чотирихлористого вуглецю. Для досягнення поставленої мети були поставлені слідуючі завдання:
Одержати та охарактеризувати первинну культуру гепатоцитів та їх кокультуру з клітинами Купфера.
Вивчити зміни функціонального стану гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в умовах блокади ліпоксигенази (за допомогою нордігідрогуаяретової кислоти) в нормі та при дії чотирихлористого вуглецю.
Вивчити зміни функціонального стану гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в умовах блокади циклооксигенази (за допомогою індометацину) в нормі та при дії чотирихлористого вуглецю.
Вивчити зміни функціонального стану гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в умовах блокади тромбоксансинтетази (за допомогою бензилімідазолу) в нормі та при дії чотирихлористого вуглецю.

Наукова новизна одержаних результатів
Вперше проведено комплексні дослідження по вивченню впливу продуктів циклооксигенази в порівнянні з впливом продуктів ліпоксигенази на життєздатність, функціональну активність мітохондрій та синтез сечовини в гепатоцитах при їх окремому та сумісному з клітинами Купфера культивуванні.
Вперше виявлено, що блокада ліпоксигенази призводить до змін показників загальних характеристик функціонального стану гепатоцитів – активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій та життєздатності інтактних культур гепатоцитів, а блокада циклооксигенази змінює специфічну функцію гепатоцитів – синтез сечовини.
Вперше показана протективна дія нордігідрогуаяретової кислоти – блокатора ліпоксигенази та протективна дія бензилімідазолу – блокатора тромбоксансинтетази в дослідах in vitro на гепатоцитах, культивованих окремо та в кокультурі з клітинами Купфера при ураженні їх ССl4.

Практичне значення одержаних результатів
Результати дослідження мають фундаментальне значення для виявлення деяких механізмів ауто- і паракринної регуляції функцій клітин печінки. В прикладному аспекті одержані дані важливі для розуміння розвитку токсичного ураження печінки, опосередкованого ейкозаноїдами, що надасть можливість обгрунтувати методи впливу на його перебіг за допомогою використання специфічних блокаторів метаболізму арахідонової кислоти.

Особистий внесок здобувача
При виконанні роботи здобувачем проведено науковий пошук та обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконано експерименти по вивченню впливу блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на гепатоцити в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. Проведено аналіз одержаних результатів. Експериментальна робота по одержанню та культивуванню клітин проведена спільно з співробітниками відділу імунології та цитосироваток Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації
Основні положення дисертації слухали та обговорювали на Пленумі науково-медичного товариства патофізіологів України (Львів, 1993); 3-му Міжнародному симпозіумі “Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе” (Київ, 1993); 14-му з”їзді Українського фізіологічного товариства ім.І.П.Павлова (Київ, 1994); ХV з”їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998); Пленумі товариства патофізіологів України (Чернівці, 1998).

Публікації
Результати дисертації викладені в 13 публікаціях: статті – 4, тези конференцій, сімпозиумів, з”їздів, пленумів – 9.

Обсяг та структура дисертації
Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури. Робота викладена на 131 сторінці, ілюстрована 22 рисунками і таблицею. Список літератури охоплює 280 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи
Об”єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів, клітин Купфера та їх сумісна культура. Для отримання клітин печінки були використані дорослі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г та в деяких експериментах (дослідження дозозалежної дії блокаторів) – миші лінії СВА масою 18-20 г. Гепатоцити (Г) та клітини Купфера (КК) виділяли за допомогою двохетапної колагеназної перфузії з подальшим очищенням в градієнті густини Перколу. Клітини Купфера додатково очищали за допомогою адгезії. Ступінь очищення одержаних фракцій гепатоцитів оцінювали за морфологічними ознаками, клітин Купфера – за допомогою забарвлення суспензії клітин на пероксидазу та неспецифічну естеразу.
Культивування клітин проводили в оброблених колагеном планшетах для культур клітин (Sigma) в поживному середовищі RPMI 1640 з 15 ммоль HEPES, 15 % ембріональної телячої сироватки та антибіотиками (у 96-, 24- або 6-лункових планшетах в залежності від умов експерименту). Посадка клітин: 96-лунковий планшет – 4104 Г на лунку та 4105 КК на лунку, 24-лунковий планшет – 1105 Г на лунку та 1106 КК на лунку, 6-лунковий планшет – 1106 Г на лунку. Через 3 години після посадки прикріплені гепатоцити відмивали шляхом заміни середовища. Для сумісного культивування до гепатоцитів додавали клітини Купфера в співвідношенні 1:10. Після 18 годин культивування при 37оС у вологій камері з 5 % СО2 клітини відмивали, замінювали середовище інкубації на середовище RPMI 1640 без ембріональної телячої сироватки і інсуліну та здійснювали відповідні впливи, а саме: додавали нордігідрогуаяретову кислоту (НДГК) – блокатор ліпоксигенази; індометацин (ІНД)- блокатор циклооксигенази; бензилімідазол (БІА) – блокатор тромбоксансинтетази (кінцева концентрація блокаторів складала 210-5 моль). Розчинений в DMSO CCl4 додавали в культури гепатоцитів та кокультури гепатоцитів та клітин Купфера до кінцевої концентрації 5 ммоль через 30 хвилин після блокаторів.
Біохімічний аналіз культурального середовища (активність аланін-амінотрансферази в культуральному середовищі, синтез сечовини гепатоцитами, концентрація малонового діальдегіду, концентрація NO2-) проводили на протязі 24 годин. Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій вимірювали через 4 та 24 години культивування після впливів.
Морфологічну оцінку культур проводили за допомогою світлової мікроскопії з використанням імерсійного об”єктиву ( х 100) на фіксованих ізопропанолом препаратах, забарвлених азур-еозином за Романовським.
Активність аланін-амінотрансферази (АЛТ) в культуральному середовищі визначали колориметричним методом в мікромодифікації [Коровкин Б.Ф., 1965]. Активність АЛТ виражали у ммоль пірувату/годмл культурального середовища.
Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів оцінювали за допомогою МТТ-тесту та виражали в умовних одиницях (У.О.), що відповідали значенню оптичної густини розчину формазану, утвореного в культивованих гепатоцитах (4104 клітин) за одну годину,  1000 [Reichner J., 1995].
Концентрацію сечовини в культуральному середовищі вимірювали колориметричним методом за допомогою тест-системи “Біо-Ла-Тест” (Брно). Кількість сечовини виражали в мкг/106 клітин.
Перекисне окислення ліпідів оцінювали за накопиченням в культуральному середовищі одного з кінцевих продуктів – малонового діальдегіду – колориметричним методом в мікромодифікації [Ohkawa H., 1979].
Продукцію NO оцінювали через визначення концентрації його метаболіта – NO2- в культуральному середовищі колориметричним методом з використанням реактива Грісса [Archer S., 1993].
Представлені дані є результатом трьох-шести незалежних експериментів для кожного показника. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур клітин. Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію Стьюдента для пар даних [Ойвин И., 1960].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Проведена морфологічна та цитохімічна оцінка гепатоцитів та клітин Купфера свідчить, що клітини, використані для одержання культур, мали високий ступінь життєздатності та чистоти. Виділені клітини Купфера давали виражену специфічну реакцію на маркерні ферменти клітин макрофагально-моноцитарного ряду – неспецифічну естеразу та пероксидазу. Після початкового культивування первинна культура гепатоцитів мала вигляд моношару полігональних клітин, яку можна віднести до культур високої щільності. Гепатоцити, культивовані на протязі 24 годин, зберігали функції, притаманні їм in vivo.
На основі аналізу літератури та наших досліджень встановлена ефективна доза блокаторів ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти – 2х10-5 моль.

Зміни функціональної активності інтактних та уражених ССl4 гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера під впливом блокаторів метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним
шляхами

Зміни активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в культурі і кокультурі
Як інтегральну характеристику фізіологічного стану гепатоцитів оцінювали активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій за МТТ-тестом. Результати, одержані за допомогою МТТ-тесту, корелюють з даними споживання клітинами кисню, одержаними полярографічним методом, що дає змогу використовувати МТТ-тест, як показник мітохондріального дихання [Klostergaard et.al., 1987]. Мітохондріальне дихання є основним, поряд з гліколізом, процесом, в ході якого генерується АТФ, що забезпечує енергією глюконеогенез в гепатоцитах, синтез сечовини, синтез білків, дію АТФаз та інші. В нормі активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культивованих клітин була: гепатоцити – 644, 897 (У.О.), гепатоцити в кокультурі з клітинами Купфера – 1096, 7512 (У.О.) через 4 та 24 години культивування, відповідно. Виявлено, що в присутності НДГК цей показник суттєво підвищується через 4 години після впливу: в культурах гепатоцитів з 644 до 12310 (У.О.), в кокультурах з 1096 до 20515 (У.О.), р0,01 в усіх випадках. Після 24 годин культивування НДГК пригнічувала активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, культивованих окремо з 897 (У.О.) в інтактних клітинах до 302 (У.О.) при дії блокатора (р0,01). Імовірно, деякий рівень лейкотрієнів та інших продуктів ліпоксигенази є необхідним для тривалої підтримки функціонування гепатоцитів, а інгібіція ліпоксигенази на протязі 24 годин може призводити до зниження мітохондріальної активності. В той же час, при сумісному культивуванні гепатоцитів та клітин Купфера не виявлено вірогідного зниження активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при тривалій блокаді ліпоксигенази; цей показник в інтактних культурах становив 7512 У.О., при дії НДГК на протязі 24 годин – 588. Ці дані свідчать, що продукти ліпоксигенази відіграють фізіологічну ауторегулюючу роль по відношенню до мітохондріального дихання гепатоцитів і, таким чином, приймають участь в регуляції функціонального стану інтактних клітин.
Не виявлено вірогідних змін активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при дії ІНД на культивовані клітини в усі терміни досліджень. Відсутність змін цієї загально-фізіологічної характеристики культивованих клітин може бути пов”язана з тим, що ІНД блокує синтез цілого ряду простагландинів, серед яких є як протективні, так і патогенетичні. Досліди з блокадою тромбоксансинтетази за допомогою БІА, проведені в 24-годинний термін, показали, що БІА, на відміну від ІНД, підвищує активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культивованих гепатоцитів на 25 % по відношенню до інтактних клітин, р0,05. Спостерігається деяке підвищення цього показника в кокультурі (на 16 %). Це свідчить про аутокринну down-регулюючу роль тромбоксану по відношенню до мітохондріального дихання гепатоцитів.
Виходячи з встановленої in vivo патогенетичної ролі лейкотрієнів, ми вивчали дію блокатора ліпоксигенази в умовах токсичного ураження гепатоцитів чотирихлористим вуглецем. СС14 (5 ммоль) пригнічував активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культур гепатоцитів на 84 % через 4 години та на 90 % через 24 години після його застосування (р0,01). В кокультурі цей показник також зменшувався на 88 % та 73 % через 4 та 24 години, відповідно (р0,01, по відношенню до інтактних клітин). Блокада ліпоксигенази за допомогою НДГК запобігала викликаному СС14 порушенню функцій мітохондрій. Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, уражених СС14, збільшувалось в присутності НДГК з 102 до 816 (У.О.) на 4 годині та з 92 до 6211 (У.О.) на 24 годині досліджень (р0,01 в усіх випадках). Аналогічна картина спостерігалася в умовах сумісного культивування. В присутності НДГК активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в кокультурі, оброблених СС14, підвищувалась з 132 до 13112 (У.О.) та з 205 до 657 (У.О.) через 4 та 24 години впливу блокатора, відповідно (р0,01). Ці дані відносно протективної дії НДГК погоджуються з дослідами, проведеними in vivo, коли введення тваринам інгібіторів синтезу лейкотрієнів, зокрема НДГК, запобігало ушкодженню печінки СС14 [Reyes M., 1995; Perez-Alvarez V., 1993]. При цьому суттєво знижувався вихід цитозольних ферментів з гепатоцитів, а також рівень ПОЛ в печінці. Патогенетична роль лейкотрієнів показана в багатьох дослідженнях in vivo [Kawada N., 1990; Agha A., 1995; Hiroichi N., 1989; McGuire G., 1996]. В цьому випадку їх дія може бути пов”язана з впливом на судини, з залученням нейтрофілів. Наші дані свідчать, що продукти ліпоксигенази можуть безпосередньо здійснювати ушкоджуючий вплив на гепатоцити, без участі систем органу та організму. Одним з механізмів прямої уражуючої дії лейкотрієнів чи інших продуктів ліпоксигенази на гепатоцити при їх підвищеному синтезі в умовах патології може бути пригнічення мітохондріального дихання клітин, оскільки блокада синтезу продуктів ліпоксигенази, за нашими даними, призводить до посилення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів.
При дії ІНД в умовах застосування СС14 не було виявлено суттєвих змін активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. На відміну від ІНД, блокатор тромбоксансинтетази – БІА проявляв виражену протективну дію, відновлюючи значення цього показника в гепатоцитах, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера майже до рівня в інтактних культурах (р0,05 по відношенню до дії СС14). Це свідчить про ушкоджуючу дію тромбоксану при токсичному ураженні культивованих клітин. Переважна більшість даних, пов”заних з впливом тромбоксану, отримані в системі in vivo. Показано, що блокада рецепторів до тромбоксану має протективну дію [Meng X., 1994; Engin A., 1995]. Отримані нами результати свідчать на користь того, що блокатор тромбоксансинтетази має протективний вплив при безпосередній дії на гепатоцити, що не опосередкована судинними та іншими реакціями.
В літературі є дані про те, що блокада одного шляху метаболізму арахідонової кислоти може призводити до посиленого утворення продуктів іншого шляху [Meng X., 1994; Griswold Don E., 1996]. Perez-Alvarez з співавторами [Perez-Alvarez V., 1993] вважають, що протективна дія інгібіторів синтезу лейкотрієнів на уражену печінку частково опосередковується збільшенням синтезу простагландинів. Можна припустити, що НДГК, інгібуючи ліпоксигеназу, посилює синтез простагландинів, частина з яких є цитопротективними, тобто захисний вплив НДГК опосередкований дією відповідних простагландинів. Ми, одночасно з блокадою ліпоксигенази за допомогою НДГК, блокували циклооксигеназу індометацином. Виявлено, що НДГК як сама по собі, так і при використанні сумісно з ІНД мала однакову дію на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в нормі та при ураженні СС14, тобто дія НДГК на гепатоцити пов”язана саме з пригніченням утворення продуктів ліпоксигенази, а не з посиленням синтезу простагландинів.
Таким чином, наведені результати виявляють відмінність дії блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в нормі та при ураженні СС14. НДГК суттєво змінювала цей показник, тоді як індометацин практично не впливав на нього. БІА, на відміну від індометацину, посилював активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій в нормі та при ураженні СС14. Була виявлена відмінність дії НДГК на інтактні та СС14-уражені клітини: активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій інтактних гепатоцитів при дії НДГК підвищувалась в 4-годинний термін та знижувалась в подальшому, тоді як в умовах дії СС14, НДГК поліпшувала функціональний стан мітохондрій гепатоцитів в усі терміни дослідженнь. Присутність клітин Купфера в культурі гепатоцитів запобігала зниженню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при дії НДГК на протязі 24-годин.

Зміни активності АЛТ в культуральному середовищі
Активність цитозольного ферменту гепатоцитів АЛТ в культуральному супернатанті відображає вихід ферменту з клітин в результаті їх ушкодження. Менший рівень АЛТ свідчить про більшу життєздатність гепатоцитів в культурі. Оскільки в первинній культурі гепатоцитів відбувається закономірний процес поступової деградації частини клітин, з часом спостерігається поступове збільшення активності АЛТ в середовищі.
Показано, що внесення НДГК в культуру гепатоцитів призводило до зменшення на 38 % виходу АЛТ з клітин через 24 години (р0,01). Зниження активності АЛТ проявлялось в сумісній культурі вже через 4 години після впливу (на 29 % , р0,05 по відношенню до контролю), та було вираженим через 16 та 24 години (р0,01 в обох випадках). Ці дані свідчать, що продукти ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти здатні безпосередньо ушкоджувати гепатоцити. Не виявлено суттєвих змін активності АЛТ при дії ІНД та БІА на культивовані гепатоцити та кокультуру в фізіологічних умовах.
Введення СС14 (5 ммоль) в культуральне середовище призводило до токсичного ураження гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. Це проявлялося в підвищенні активності АЛТ в супернатантах гепатоцитів на 88 %, на 130 % та 92 % через 4, 16 та 24 години, відповідно (р0,01 по відношенню до інтактних клітин, в усіх випадках). В кокулькурі це підвищення складало 110 %, 119 % та 120 % через 4, 16 та 24 години, відповідно (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020