.

Вільнорадикальні процеси в мозку і серці дорослих і старих щурів при іммобілізаційному стресі (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2306
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н.КАРАЗІНА

СУВОРОВА ІРИНА МИКОЛАЇВНА

УДК
612.354.2.085:577.152.1:613.863+612.67

Вільнорадикальні процеси в мозку і серці дорослих і старих щурів при
іммобілізаційному стресі

03.00. 04-біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в інституті біології Харківського національного
університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Давидов Вадим Вячеславович,

Інститут охорони здоров’я дітей і підлітків АМН України, завідувач
лабораторії вікової ендокринології і обміну речовин

Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Перський Євген Ефроїмович,

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна

Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри біохімії;

– доктор біологічних наук, професор

Жуков Віктор Іванович,

Харківський державний медичний університет

Міністерства охорони здоров’я України,

завідувач кафедри біохімії .

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України

(лабораторія регуляції
метаболізму), м. Київ.

Захист відбудеться “ 22 ” червня 2005 року о _1500_ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України за
адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства
освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ _18_ “ травня 2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вільнорадикальні процеси відіграють важливу роль у
регуляції внутрішньоклітинного метаболізму та мембранної проникливості,
реалізації функцій генетичного апарату клітини, а також забезпеченні
обміну інформацією між клітиною і зовнішнім середовищем (Allen R.G.,
Tresini М., 2000; Bogoyevitch Х. et al., 2000; Hensley K. et al., 2000;
Mossman B.T., 2000). Особливе значення серед них, займають перетворення
активних форм кисню, з якими тісно пов’язані процеси перекисного
окислення ліпідів біологічних мембран, окисна модифікація амінокислотних
залишків поліпептидних ланцюгів білків, окислення азотистих основ
нуклеотидів і т.д. (Meagner E.A., FitzGerald G.A., 2000; Shacter E.,
2000).

Посилення вільнорадикальних процесів у клітинах є характерним проявом
оксидативного стресу. Численні дослідження останніх років дозволили
встановити, що даний стан виступає в ролі важливої неспецифічної ланки
патогенезу більшості внутрішніх захворювань (Singal K.P. et al., 1999;
Davies M.J. et al., 1999). Стимуляція вільнорадикальних процесів
відбувається також при деяких фізіологічних станах (стресі, інтенсивному
фізичному навантаженні вагітності і т.д.) (Leenwenburgh C. et al.,1999;
Bijema J. et al., 2000), а також в процесі старіння (Schoneich C., 1998;
Anson R.M. et al., 1999; Mecocci P. et al., 1999; Cadenas E., Davies
K.J., 2000; Rustin P. et al., 2000; Davydov V.V., Shvets V.N., 2002).

Односпрямований характер зрушень у стані вільнорадикальних процесів при
стресі і старінні, визначає зміну чутливості організму до дії
стресорних факторів у пізньому онтогенезі (Чеботарев Д.Ф., Коркушко
О.В., 1977; Docherty I.R., 1990; Барабой В.А. и соавт., 1991). Наслідком
цього є формування цілої групи захворювань, які визначаються як вікова
патологія, особливе значення в якій здобувають захворювання
серцево-судинної та центральної нервової системи. Зважаючи на те, що
стимуляція вільнорадикальних процесів виступає в ролі важливої
неспецифічної ланки патогенезу стресорного ушкодження тканин внутрішніх
органів (Меерсон Ф.З., 1984), можна припустити існування певного
взаємозв’язку між віковим зниженням стійкості організму до ушкоджуючих
факторів стресу та зміною його резистентності до дії прооксидантних
факторів. Разом з тим, зараз у літературі зустрічаються суперечливі дані
про вікові особливості ініціації вільнорадикальних процесів у тканинах
внутрішніх органів при стресі (Lopez – Torres M. et al., 1992; Cutler
R.G., 1995; Davydov V.V., Shvets V.N., 2001, 2003). У зв’язку з цим усе
ще залишаються невияснені молекулярні механізми виникнення вікових
розходжень у стійкості тканин внутрішніх органів до стресу. Їх
з’ясування буде сприяти вивченню механізмів зниження стійкості
організму до дії несприятливих зовнішніх факторів при старінні і
формуванню вікової патології, а також розробці нових ефективних підходів
до її лікування та профілактики.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках держбюджетної теми інституту біології
Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна “Вивчення
механізмів накопичення епігенетичної інформації в процесі старіння і
способи підвищення середньої тривалості життя” N державної реєстрації
0103U004280.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було встановлення
вікових особливостей модуляції процесів вільнорадикального окислення
білків і ліпідів у мозку і серці дорослих і старих щурів, що піддавалися
іммобілізаційному стресу.

Для реалізації поставленої мети були визначені наступні завдання:

Визначити вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків
у мозку і серці дорослих і старих щурів при іммобілізаційному стресі;

Охарактеризувати динаміку утворення карбонільованих білків і продуктів
вільнорадикального окислення ліпідів у мозку і серці дорослих і старих
щурів при іммобілізаційному стресі в умовах стимуляції вільнорадикальних
процесів in vitro;

Дослідити активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту
(СОД, каталази і глутатіонпероксидази) у мітохондріальній і
постмітохондріальній фракції гомогенатів мозку та серця дорослих і
старих щурів при іммобілізації;

Вивчити механізм антиоксидантної дії екстракту аронії та оцінити
можливість використання даного препарату для корекції рівня
вільнорадикальних процесів у мозку та серці дорослих і старих щурів при
іммобілізаційному стресі.

Об’єкт дослідження – вільнорадикальне окислення білків і ліпідів у
півкулях мозку і серцевому м’язі, ферментативна система першої лінії
антиоксидантного захисту мозку і серця.

Предмет дослідження – продукти вільнорадикального окислення ліпідів і
білків, індуковане ПОЛ, ферменти першої лінії антиоксидантного захисту в
півкулях мозку і серці дорослих та старих щурів при іммобілізаційному
стресі.

Методи дослідження. Спектрофотометрія (визначення вмісту продуктів
вільнорадикального окислення, активності антиоксидантних ферментів,
білка); спектрофлюориметрія (визначення вмісту 11-оксикортикостероїдів,
адреналіну, шифових основ); диференціальне центрифугування
(фракціонування гомогенатів мозку і серця); іонообмінна хроматографія
(поділ катехоламінів), статистичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів визначається тим, що в роботі
вивчені вікові особливості стану вільнорадикального окислення білків і
ліпідів у мозку та серці щурів при їх короткочасній іммобілізації.
Встановлено, що головний мозок і серце проявляють неоднакову стійкість
до виникнення оксидативного стресу при 30-хвилинній іммобілізації. Мозок
дорослих щурів більш чутливий ніж серце до дії прооксидантних факторів,
що виникають при формуванні іммобілізаційного стресу. Це проявляється в
більшому рівні накопичення продуктів вільнорадикального окислення білків
і ліпідів, а також особливостях стимуляції індукованого
(аскорбат-залежного і H2O2-стимулюючого) перекисного окислення ліпідів.

Отримано експериментальні дані про особливий внесок мітохондрій у
формування оксидативного стресу в мозку дорослих щурів при 30-хвилинній
іммобілізації. Показано, що карбонільовані білки мітохондрій є більш
чутливими маркерами оксидативного стресу, ніж продукти перекисного
окислення ліпідів.

Установлено, що важливу роль у стимуляції вільнорадикального окислення
білків і ліпідів у мозку дорослих щурів при 30-хвилинній іммобілізації,
набувають зрушення в активності ферментів першої лінії антиоксидантного
захисту, а також зміна співвідношення їх активності в
постмітохондріальній фракції. Попереднє введення антиоксидантного
препарату – екстракту аронії, запобігає виникненню оксидативного стресу
в мозку щурів при їх іммобілізації.

Показано, що низька чутливість серця дорослих щурів до дії
прооксидантних факторів, що виникають у процесі 30-хвилинної
іммобілізації, поєднується з підтримуванням в них високої ефективності
функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в
мітохондріях і постмітохондріальній фракції кардіоміоцитів. При старінні
відбувається обмеження ролі ферментів першої лінії антиоксидантного
захисту в попередженні оксидативного стресу в серці.

Виявлено, що чутливість мозку і серця до дії прооксидантних факторів при
старінні знижується. Виникнення цього феномену визначає обмеження ролі
оксидативного стресу у формуванні пристосувальних реакцій мозку до дії
несприятливих факторів зовнішнього середовища в пізньому онтогенезі.

Теоретична і практична значимість роботи визначається тим, що в ній
встановлені механізми виникнення оксидативного стресу в мозку і серці
дорослих і старих щурів у процесі 30-хвилинної іммобілізації, вивчені
механізми антиоксидантної дії нового перспективного антиоксидантного
препарату рослинного походження – екстракту аронії та оцінена
доцільність його застосування для корекції вікових зрушень з боку
вільнорадикальних процесів у мозку і серці в різні періоди онтогенезу.

Отримані результати вказують на необхідність корекції існуючих уявлень
про доцільність використання антиоксидантних засобів для профілактики
стресорних ушкоджень тканин внутрішніх органів при старінні.

Особистий внесок здобувача. Усі результати, приведені в рукописі, були
отримані здобувачем самостійно. Дисертантом особисто проведені
експериментальні дослідження, статистично оброблені отримані результати
і проанолізована література за темою дослідження. Аналіз отриманих даних
автор роботи провів разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
були повідомлені на Всеукраїнській науково-практичній конференції
“Сучасні технології органічного синтезу і медичної хімії” (Харків,
2003); другій міжвузівській Міжнародній біохімічній науково-практичній
конференції молодих вчених “Обмін речовин при адаптації і ушкодженні”
(Ростов-на-Дону, 2003); четвертій і п’ятій Українській конференції
молодих вчених, присвячені пам’яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2003,
2004); на шостому Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми
старіння” (Харків, 2004), на науково-практичній конференцii молодих
вчених, присвяченій 350-рiччю мiста Харкова (Харкiв, 2004 р.).

Публікації матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей,
7 тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 217
сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів дослідження, трьох розділів результатів
власних досліджень, узагальнення результатів дослідження, висновків.
Перелік використаної літератури включає 308 найменувань цитованої
літератури. Робота ілюстрована 47 таблицями та 38 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМIСТ РОБОТИ

Огляд літератури

У огляді представлені дані літератури, що стосуються механізмів
формування оксидативного стресу та його участі у формуванні стресорних
ушкоджень внутрішніх органів, а також сучасні уявлення про зміну стану
вільнорадикальних процесів при старінні.

Матеріали та методи дослідження

У роботі було використано 238 щурів-самців лінії Вістар. Тварин
забезпечували стандартним раціоном харчування та утримували в умовах
природного освітлення приміщення віварію. Щури розподіляли на дві вікові
групи: дорослі – 10-12 місяців (маса 250 – 350 г) і старі – 22-25
місяців (маса 450-530 г). Кожна група, у свою чергу, ділилася на три
підгрупи: 1 – інтактні, 2 – щури, що піддавалися іммобілізаційному
стресу, 3 – тварини, яким за 60 хвилин до іммобілізації
внутрішньочеревно вводили розчин екстракту аронії (Aronia melanocarpa)
на фізіологічному розчині хлористого натрію в дозі 0,2 г/кг маси/тіла
(Ипатова О.И., Прозоровский В.Н., 2000).

Для відтворення моделі іммобілізаційного стресу щурів позбавляли
рухомості прив’язуючи за кінцівки спиною до нерухомої опори (дошки).
Експозиція – 30 хвилин. Ефективність відтворення іммобілізаційного
стресу контролювали шляхом визначення концентрації адреналіну (Atrac С.,
Madnusson T.A., 1978) і 11-оксикортикостероїдів (Резников А.Г., 1980) у
сироватці крові.

У зразках заморожених тканин півкуль головного мозку і серця визначали
вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (дієнових
кон’югатів і шифових основ) та карбонільованих білків.

Вимір концентрації дієнових кон’югатів проводили за методом Стальной
И.Д. (1977) з урахуванням коефіцієнту молярної екстинкції, що дорівнює
2,2 . 105 М-1 см-1.

У основу кількісного визначення шифових основ був покладений
спектрофлюориметричний метод Rice-Evans C.A. et al. (1991). Виміри
виконували на спектрофлюориметрі Hitachi (Японія) (довжина хвилі
збудження – 360 нм, довжина хвилі емісії – 430 нм).

Визначення вмісту карбонільованих білків проводили в заморожених у
рідкому азоті зразках тканини головного мозку і серця, а також
субклітинних фракціях їх гомогенатів з урахуванням коефіцієнта молярної
екстинкції, що дорівнює 2,1 . 104 М-1 см-1 (Дубинина Е.Е., 2000).

У роботі проводили вивчення особливостей стану індукованого перекисного
окислення ліпідів у гомогенатах мозку і серці щурів, а також
субклітинних фракціях мозку. У якості прооксидантів використовували
перекис водню (Н2О2 – стимулююче ПОЛ) або суміш солі Мору з аскорбіновою
кислотою (Микаелян Е.М. и соавт., 1983). Інтенсивність індукованого ПОЛ
оцінювали по накопиченню в зразках ТБК – реактивних речовин по реакції з
2-тіобарбітуровою кислотою. Розрахунок їх концентрації проводили з
урахуванням величини коефіцієнта молярної екстинкції малонового
диальдегіду при 532 нм (1,53 . 105 см-1 М-1 (Esterbauer H., Cheeseman
K.H., 1990)). Паралельно з визначенням вмісту ТБК – реактивних речовин у
зразках реакційної суміші визначали концентрацію карбонільованих білків
(Дубинина Е.Е., 2000).

У спеціальних експериментах проводили субклітинне фракціонування
головного мозку і серця для одержання субклітинних фракцій. У них
виміряли вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків,
визначали інтенсивність індукованого вільнорадикального окислення та
досліджували активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту
– супероксиддисмутази (Костюк В.А., 1990), глутатіонпероксидази (Mills
G.C., 1959), і каталази (Барабой В.А. и соавт., 1990).

Концентрацію білка в пробах визначали за методом Lowry O. et al. (1955).

Результати досліджень статистично обробляли за методом
Wilcoxon-Mann-Whitney. Вірогідним вважали результати при Р¶u. - " >

@

B

D

F

?

???????

’”u2

ssss??_

j 1/2O

dh^„1/2

j @

?O

dh^„?

j ?O

dh^„?

?O

dh^„7

O

U????•uuuu

?O

O

O

O

„h`„h$

j 1/2O

dh^„1/2`„zo

hb4›B*phy

O

O

$

O

$

O

O

$

O

$

O

hb4›

+

&

&

O

$

O

O

$

O

O

$

O

O

$

O

? що піддавалися іммобілізаційному стресу (нмоль ТБК-реактивних
речовин/мг білка . хв; M + m; n = 4-5)

Фракція

Ф Дорослі

Старі

інтактні

стрес

інтактні

стрес

мітохондріальна

0,87 + 0,15

1,15 + 0,19*

0,90 + 0,21

0,97 + 0,17

мікросомальна

3,5 + 0,3

3, 7 + 0,5

3,1 + 0,4

3,1 + 0,3

Примітка: * – вірогідно відносно до інтактних тварин (P

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020