НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КЛЕСТОВА Зінаїда Сергіївна

УДК 619:578.891:575.113: 576

Теоретичне та експериментальне обгрунтування контролю геному клітин
при вірусних інфекціях тварин та в процесі розробки засобів їх
специфічної профілактики

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

КИЇВ — 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії вірусології та лабораторії по розробці
технології виготовлення інактивованої вакцини проти класичної чуми
свиней Інституту ветеринарної медицини УААН

Наукові консультанти :

доктор ветеринарних наук, професор, член-кор. УААН і
РАСГН

Собко Анатолій Іванович, Інститут ветеринарної медицини УААН;

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Фукс Поліна Павлівна, Інститут експериментальної і
клінічної ветеринарної

медицини УААН

Офіційні опоненти :

доктор ветеринарних наук, професор

Скибицький Володимир Гурійович,

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів
України,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор

Берднік Василь Петрович,

Полтавська державна аграрна академія Мінагрополітики України,

завідувач кафедри анатомії та фізіології

доктор біологічних наук, професор, член-кор.НАНУ

Співак Микола Якович, Інститут мікробіології та вірусології ім.

Д.К.Заболотного НАН України,

завідувач відділом проблем інтерферону та
імуномодуляторів

Провідна установа — Одеський державний аграрний університет
Мінагрополітики

України, кафедра епізоотології та
паразитології, м.Одеса.

Захист дисертації відбудеться “ 29 “ червня 2006 р. о 10 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному
аграрному університеті за адресою : 03041, м.Київ-41, вул.Героїв
оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд.65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного
університету за адресою : 03041, м.Київ-41, вул. Героїв оборони, 13,
навчальний корпус 4, к.41

Автореферат розісланий “27“ травня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
_______________________________Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вірусні інфекції сільськогосподарських тварин широко
розповсюджені в світі і часто завдають значних економічних збитків
промисловому тваринництву. Вони є серйозною загрозою для сприйнятливих
біологічних обґєктів через циркулювання великої кількості патогенів, а
також і через відсутність або недосконалість, у деяких випадках,
ефективних, безпечних заходів профілактики і боротьби з ними.

Серед поширених інфекційних хвороб, спричинених патогенними
РНК-вмісними вірусами тварин, є ротавірусна хвороба свиней (РВХС),
лейкоз великої рогатої худоби, класична чума свиней (КЧС), трансмісивний
гастроентерит свиней (ТГС), а також патологія відтворення у свиней, яка
пов’язана із синдромом SMEDI ентеровірусної етіології (Dunn H.W. et
all., 1965; Ercegan M., 1975; Kubin G. et all., 1979; Собко А.І., 1981;
Гаврилов Н. та інш., 1983; Debouck F. Et all., 1984; Нахмансон В.М.,
1986; Белянко Л.В., 1991; Alfieri A., 1991; Depner K.R. et all., 1996;
Dodet B. et all., 1997; Сюрін В.М. та інш., 1998; Шиков О.Т., 2005).
Наприклад, серед п’яти хвороб, що в останні роки лідирують в
тваринництві Росії, реєструються КЧС і ТГС, незважаючи на посилені
заходи профілактики та боротьби з ними. Так, за період 1997–2001 роки
летальність серед поголівґя свиней від ТГС становила 59,9 % (кількість
неблагополучних пунктів – 42), від КЧС – 58,8 % (кількість
неблагополучних пунктів – 66) (Рахманов А.М., 2003).

В Україні у 1988 – 1998 рр. ситуація по КЧС була неоднозначною (Прискока
В.А., 2000; О.Т. Шиков, 2005). Так, за даними В.А. Прискоки із
співавторами (2000) у 1994 році захворювання було діагностовано в 51
неблагополучному пункті, у 1995 – в 21, у 1996 році – лише в одному, а у
1997 – 1998 — в жодному. Зусиллями О.Т. Шикова із співробітниками
(2005) проведені тривалі дослідження розповсюдження КЧС в Україні:
створено кадастр неблагополучних пунктів по КЧС за період 1961 – 2004
рр., і також показано тенденцію до зменшення поширення даної інфекції в
останні роки. Але, слід звернути увагу на застереження О.І. Бузуна та
інших (наведені В.А. Прискокою, 2000) про те, що відсутність хвороби
серед поголівґя свиней через 5–7 років на території ліквідованого
вогнища інфекції, ще не означає відсутності там збудника захворювання, а
лише показує, що на цій території немає його вірулентної форми.

Відмітимо негативні наслідки, які відомі крім основних клінічних ознак,
при деяких із вищезгаданих хвороб, причини виникнення яких досі не
досліджені. Так, організм тварин вразливий до дії збудника класичної
чуми в пренатальний період розвитку. Хвороба сприяла виникненню абортів,
муміфікації, водянки плодів та їх загибелі (Сюрін В.М., 1991; Курінов
В.В., 1995; Floegel G., 1999). Існують дані, що при ТГС у 3 % випадків
свиноматки абортували, а ті що перехворіли – втрачали репродуктивну
здатність на 30–40 %. Перехворілі поросята нерідко відставали в рості і
розвитку (Гаврилов Н., 1983; Mayer A., 1984; Сюрін В.М., 1998).

Ентеровіруси, що спричиняють патологію відтворення у свиней із синдромом
SMEDI, також сприяють муміфікації, мертвонародженню плодів, загибелі
ембріонів і безпліддю у тварин (Dunn H.W., 1965). Встановлена в
свинарських господарствах України їх циркуляція (Тацька В.Н., 1997;
Клестова З.С., Тацька В.Н., 2003), а також і циркуляція збудника
ротавірусної хвороби свиней (Клестова З.С., 2003). Крім того, нерідко
спостерігають перебіг вірусних інфекцій у тварин, спричинених двома
патогенами, наприклад, при сумісному перебігу гастроентеритів, рота- та
коронавірусної етіології (Апатенко В.М., 1978; Theil K.W. et all., 1979;
Bohl E.H., 1979; Слободенюк В.К. та інш., 1984; Собко А.І. та ін.,
1988).

Для багатьох країн СНД: Росії, Білорусії, Узбекистану, Таджикистану,
Казахстану, України все ще залишається актуальною проблема лейкозу
великої рогатої худоби (Валіхов А.Ф. та інш., 1980; Лемеш В.М. та інш.,
1987; Бусол В.А., 1988; Бурба Л.Г. та інш., 1988; Коломицев А.А. та
інш., 1995; Епачинцева О.В., 1995; Цимбал В.І., 1998; Аранчій С.В.,
1999; Коромислов Г. Ф. та інш., 1999; Мандигра М.С., 1999, 2000;.
Нагаєва Л.І. та інш., 2003; Атамась В.Я., 2003; Кісера Я.В.,2005). Але,
початковий етап взаємодії ретровірусу лейкозу і геному клітин ще
малодосліджений.

Віруси, які викликають вищеозначені захворювання відрізняються між собою
морфологією, хімічним складом, способом реплікації і трансляції,
тропізмом до чутливих клітин, взаємодією з ними і сприйнятливими
організмами тварин, багато аспектів якої залишилось поза увагою
дослідників, таких, наприклад, як вплив вірусів на геном інфікованих
клітин. Це важливо також із-за постійної небезпеки спалахів як відомих,
так і нових вірусних хвороб.

Система вірус-клітина виступає в ролі унікальної живої системи,
кардинальною відмінністю якої від всіх інших систем, є наявність двох
геномів, здатних одночасно реалізувати свій генетичний код, що утруднює
дослідження їх впливу на перебіг внутрішньоклітинних процесів. Питання
матеріальних основ спадковості соматичних клітин є складовою як
загальнобіологічної проблеми – організації і функціонування геному
евкаріотичних організмів, так і ветеринарної медицини, бо значною мірою
повґязані із станом здоровґя продуктивних тварин. Але відомі різні
чинники, що порушують ці матеріальні основи спадковості тваринних
клітин. Так, відомо, що віруси, як атенуйовані (які використовують для
вакцинації), так і польові вірулентні штами, а також інтегровані в геном
клітин хазяїна належать до мутагенів біологічної природи (Блюмкін В.Н.,
1973; Гершензон С.М., 1975; Засухіна Г.Д., 1983; Ільїнських А.А.,1984;
Бужієвська Т.І., 1984,), генотоксична дія яких спричиняє значне
пошкодження геному уражених клітин.

На даний час генотоксична дія РНК-вмісних патогенів тварин – ротавірусу
свиней, ентеровірусів свиней, що спричиняють синдром SMEDI, вірусу
класичної чуми свиней, вірусу лейкозу великої рогатої худоби майже не
досліджена. Це слід зауважити, оскільки наслідки впливу цих вірусів, у
комплексі із дією негативних факторів зовнішнього середовища, можуть
бути значними і небезпечними для геному клітин як продуктивних, так і
племінних тварин, що може призвести не тільки до спадкових патологій, а
й до порушень нормального функціонування на рівні клітин та організмів.
Тому дослідження біологічних властивостей вірусів, в тому числі і
мутагенної активності, виявлення змін в їх популяціях сприятиме
встановленню особливостей перебігу інфекційних хвороб та розкриттю
особливостей взаємодії патогена і чутливого до нього біологічного
обґєкта. Від цього залежить і ефективність розробки та створення засобів
специфічної профілактики вірусних хвороб тварин.

Комплексний підхід, поєднуючий генетичну, діагностичну та
профілактично-лікувальні методології, сприятиме розробці нових
ефективних схем та засобів профілактики вірусних хвороб продуктивних та
племінних тварин, захисту геному їх клітин від негативних чинників. Тому
виявлення нових мутагенів біологічної природи, в тому числі і
розповсюджених патогенних РНК-вмісних вірусів тварин, як і розробка та
створення препаратів з протективною, антимутагенною дією, допоможе у
збереженні здоров’я тварин. Тестування виявлених вірус-індукованих змін
(під впливом патогенних вірусів тварин) у клітинах і популяціях тварин,
особливо племінних, створить додаткові контрольні заходи з біобезпеки
при застосуванні лікувально-профілактичних засобів у тваринництві, що
сприятиме розвитку ветеринарної медицини в сучасних умовах.

Вищеозначене вимагало вирішення цих проблем, що і зумовило вибір теми.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота є складовою частиною досліджень, передбачених тематичними планами
Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук:

“Розробити і впровадити технологію виготовлення інактивованої вакцини
проти класичної чуми свиней та визначити перспективу її використання в
системі специфічної профілактики” (1988–1992) (Постанова ДКНТ №290 від
10 серпня 1988 року); державна реєстрація № 03.06/007-92 “Вивчити
епізоотологію найбільш поширених інфекційних захворювань свиней,
розробити сучасні методи діагностики, профілактики та терапії
“(Постанова ДКНТ від 4 травня 1992р.) (1992–1996); державна реєстрація №
01.04 “Діагностика, корекція і профілактика структурних пошкоджень
генетичного апарату клітин тварин, зумовлених дією інфекційних,
технологічних та екологічних факторів” (1993–1996); державна реєстрація
№ 0197U012751 “Вивчити вплив патогенів на генетичний апарат тваринних
клітин та розробити методи його корекції при дії інфекційних,
технологічних та екологічних факторів” (1996–1998); державна реєстрація
№ 0201U001345 “Розробити засоби діагностики та системи профілактики
корона-, ентеро-, парвовірусної інфекції та SMEDI свиней” (1996–2000);
державна реєстрація № 0101U000871 “Розробити та впровадити засоби
діагностики гастроентеритів у свиней вірусної етіології” (2001–2004);
державна реєстрація № 0197U012749 “Створити нові
лікувально-профілактичні засоби на основі лікарської рослинної сировини”
(1996–1998); державна реєстрація № 0197U012747 “Розробити засоби і
методи діагностики та профілактики вірусного артереїту, грипу і вивчити
епізоотологію енцефаломієліту коней” (1996–2000).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи полягала у визначенні впливу
патогенних РНК-вмісних вірусів тварин (представників родин Reoviridae,
Picornaviridae, Сoronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) на геном
інфікованих клітин; виявленні особливостей їх взаємодії з чутливими
біологічними системами (клітинами і організмами тварин); використанні
цих особливостей для індикації та спрямованої зміни біологічних
властивостей збудників при розробці та створенні нових засобів
специфічної профілактики вірусних хвороб тварин.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

виділити та ідентифікувати патогенні РНК-вмісні віруси, збудники
досліджуваних хвороб тварин;

визначити біологічно чутливі системи культивування досліджуваних
збудників (РНК-вмісних вірусів) хвороб тварин і адаптувати віруси до цих
систем та спрямовано змінити їх властивості ;

отримати придатний для подальших спрямованих змін та вірусологічних
досліджень матеріал з достатньою інфекційною активністю;

виявити біологічну взаємодію в системі вірус-клітина на різних етапах
дії патогену на клітину і окремі її структури;

дослідити біологічні властивості патогенних РНК-вмісних вірусів тварин,
визначених для вивчення;

спрямовано змінити інфекційну активність досліджуваних вірусів,
застосовуючи ультразвук, хімічні речовини та рослинні препарати;

вивчити зміни в популяції збудника при довготривалій взаємодії з
чутливою біологічною системою і виявити закономірності існування
популяції вірусу (на прикладі ротавірусу свиней);

виявити дію РНК-вмісних вірусів тварин (вакцинних і епізоотичних штамів)
на генетичний аппарат клітин тварин в умовах in vivo та in vitro;

порівняти вплив одного вірусу та сумісну дію двох вірусів на генетичний
апарат однакових соматичних клітин тварин;

розробити тест-систему для перевірки антимутагенного впливу;

розробити методичні підходи щодо зменшення мутагенної дії вірусів на
геном соматичних клітин тварин;

створити препарат з антимутагенною дією та випробувати його в
лабораторних умовах;

застосувати отримані результати для створення профілактичних препаратів
та розвитку біотехнологічного напрямку з біобезпеки вірусних вакцин та
навколишнього середовища.

Об’єкт дослідження : — взаємодія патогенних РНК-вмісних вірусів тварин
(ротавірусу свиней, коронавірусу свиней, ентеровірусів свиней групи
SMEDI, вірусу кластичної чуми свиней, вірусу лейкозу великої рогатої
худоби) і чутливих біологічних систем на генетичному, клітинному,
організменному, популяційному рівнях; — стан спадкового апарату
соматичних клітин свиней та великої рогатої худоби під дією РНК-вмісних
вірусів тварин; — способи виявлення і зниження мутагенної дії вірусів
тварин; — способи спрямованої зміни біологічних властивостей збудників
інфекційних хвороб тварин;- антимутагенні та антивірусні властивості
рослин;- технологія виготовлення засобів специфічної профілактики
ротавірусної хвороби свиней та класичної чуми свиней.

Предмет дослідження :- штами РНК-вмісних вірусів тварин: ротавірусу
свиней, коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней, вірусу
класичної чуми свиней, ентеровірусів свиней, причетних до синдрому
SMEDI, лейкозу ВРХ; — кров; — інфіковані, РНК-вмісними вірусами тварин,
клітини та тварини; — метафазні пластинки хромосом клітин свиней; —
ділянки ДНК лімфоцитів великої рогатої худоби; — морфологічні
особливості структури РНК-вмісних вірусів тваринг та морфогенез в
інфікованій клітині; — популяція ротавірусу свиней в інфікованій клітині
та культурі клітин; — показники гуморального імунітету (постінфекційного
та поствакцинального) у свиней; — інфекційна активність вірусів; —
первинні та перещеплювані культури клітин свиней; — хімічні речовини; —
рослини.

Методи дослідження : — біологічний експеримент (відтворення
захворювання у біопробі на безмолозивних поросятах та
тваринах-гнотобіотах з метою виділення збудників, відтворення клінічної
картини захворювання, визначення вірулентності ізолятів вірусів,
отримання і відбір матеріалу для електронно-мікроскопічних і
цитогенетичних досліджень); — мікроскопічні (для контролю стану клітин
у моношарі при культивуванні та характеристики цитопатичної дії вірусів
in vitro, для дослідження метафазних пластинок хромосом соматичних
клітин тварин, для виявлення вірусу КЧС у культурі клітин за
імунофлуоресценцією); -електронно-мікроскопічні (дослідження морфології
і структури вірусів інфекційних хвороб свиней та ВРХ: родин
Coronaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Picornaviridae); —
вірусологічні (виділення вірусів з органів хворих тварин та з
патологічного матеріалу загиблих, культивування та атенуація вірусів,
перевірка на реверсибельність, визначення стійкості вірусів проти дії
різних чинників, титрування вірусів, виявлення змін інфекційної
активності вірусів під дією хімічних речовин та в процесі адаптації до
чутливих систем культивування); -серологічні (визначення титрів антитіл
до збудників вірусних хвороб тварин при дослідженнях сироваток крові,
молозива, молока і типування збудників); — бактеріологічні (при
перевірці контролю на стерильність очищених вірусних суспензій та
фітопрепаратів); — клінічні (виявлення у тварин симптомів ротавірусної
хвороби, класичної чуми, трансмісивного гастроентериту свиней);
-імунологічні (дослідження показників гуморального і колострального
імунітету тварин, одержання специфічних гіперімунних сироваток,
застосування ФІТЦ-імуноглобулінів для виявлення вірусу КЧС в інфікованих
клітинах); — цитогенетичні (для каріотипування, виявлення пошкоджень
хромосомного апарату клітин тварин, виявлення геномних мутацій); —
молекулярно-біологічний (для виявлення змін у локусах ДНК); —
біотехнологічні (при культивуванні калусної культури кореня женьшеню,
вирощування культур клітин тварин, тестуванні вірусних патогенів у
чутливих системах, культивуванні сировини для виробництва вакцин); —
хімічні (екстрагування біологічно активних речовин рослин); -статистичні
методи (підрахунки ймовірності одержаних результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлений ранній етап
взаємодії коронавірусу і ротавірусу з ентероцитом кишечника свиней:
пошкодження структури мікроворсинок цих клітин, що відбувається до
моменту адсорбції на специфічних рецепторах клітинної мембрани.

Вперше встановлена структура популяції ротавірусу свиней та її зміни при
довготривалій адаптації (протягом 85 пасажів) до чутливих систем
культивування. Виявлена гетерогенність популяції збудника (за S-ознакою
та методом електронної мікроскопії), в якій постійно присутня стабільна
мікропопуляція патогену.

Вперше встановлена генотоксична дія патогенних РНК-вмісних вірусів,
збудників інфекційних хвороб тварин.

Виявлений і порівняний мутагенний ефект патогенних РНК-вмісних вірусів
свиней при моно-та асоційованих інфекціях (у випадку сукупного та
роздільного інфікування епізоотичними штамами рота- та коронавірусу
свиней) в умовах in vivo. Встановлено пошкодження хромосомного апарату
клітин свиней (in vivo та in vitro) при застосуванні живих вакцинних
противірусних препаратів. Виявлено, що одночасний вплив двох РНК-вмісних
вірусів підсилює генотоксичний ефект в клітинах свиней порівняно з дією
одного патогену.

Встановлена відмінність впливу вакцинних штамів вірусу класичної чуми
свиней (живого і інактивованого) на хромосомний аппарат клітин цих
тварин.

Виявлені зміни інфекційної активності коронавірусу і ротавірусу свиней
(інгібіцію та підвищення) під дією настою кореня женьшеню, отриманого з
калусної культури, що можливо використовувати у виробництві
інактивованих і живих вакцин.

Встановлена можливість зниження мутагенного впливу РНК-вмісних вірусів
тварин за допомогою фітопрепаратів.

Пріоритет роботи, наукова новизна досліджень підтверджена Державним
департаментом України з інтелектуальної власності патентами: № 95125530
від 4.03.97 “ Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини
для виробництва біологічних препаратів”; № 95052507 від 15.07.97 “Спосіб
інактивації вірусів”; № 95073164 від 15.07.97 “Способ получения
экспресс-модели испытания антимутагенных препаратов при вирусных
повреждениях геномов клеток свиней”; № 96030913 від 04.11.97 “ Спосiб
очищення основи для приготування поживних середовищ”.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлення мутагенного ефекту
дії вірулентних і вакцинних штамів ротавірусу свиней, вірусу класичної
чуми свиней, ентеровірусів свиней, причетних до патології відтворення із
синдромом SMEDI, вірусу лейкозу ВРХ, а також сукупної дії двох
збудників, набуває важливого практичного значення у збереженні здоров’я,
продуктивних якостей і генофонду тварин, у селекційній роботі, створенні
нових підходів у профілактично-лікувальній справі при запобіганні та
боротьбі з вірусними хворобами тварин. Це має теоретичне та важливе
практичне значення при виявленні нових аспектів патогенезу цих хвороб та
розробці і створенні нових високоефективних та безпечних вакцинних
препаратів.

Виявлення ранньої взаємодії між вірусом і чутливою клітиною, що
призводить до пошкодження останньої, важливе у зґясуванні розвитку
інфекційного процесу, а також при створенні нових захисних
противірусних препаратів.

Результати електронно-мікроскопічних досліджень допомогли в діагностиці
вірусних хвороб при спалахах інфекцій в господарствах, при підтвердженні
результатів біопроби, при визначенні оптимальних строків відбору
матеріалів для вірусологічних досліджень, а також при дослідженні
ультраструктурних змін в інфікованій клітині та виявленні особливостей
морфогенезу РНК-вмісних вірусів тварин, що важливо для пояснень
механізмів патогенезу вірусних хвороб на ранніх стадіях.

Отримані результати серологічного моніторингу дозволили встановити
циркулювання збудників ротавірусної хвороби, патології відтворення
свиней ентеровірусної етіології із синдромом SMEDI в тваринницьких
господарствах, а також в оцінці постінфекційного та поствакцинального
імунітетів у свиней при дії вакцинних і вірулентних штамів корона- і
ротавірусів свиней.

Проведені дослідження створили базис для подальшого розширення напряму з
біобезпеки в галузі тваринництва, особливо у племінній справі, для чого
запропоновано використання розроблених нами “Методичних рекомендацій по
виявленню, обліку аберацій хромосом клітин свиней при вірусних
інфекціях” (2005). Крім того, одержані результати допомогли створити
тест-систему для перевірки антимутагенних властивостей препаратів та
довести можливість зменшення мутагенного інфекційного навантаження на
спадковий аппарат соматичних клітин тварин, викликане патогенними
РНК-вмісними вірусами, застосовуючи природні ресурси рослин, безпечні
для тварин, що важливо для зниження ризику генетичних порушень.

Виявлення стабільної частини популяції ротавірусу свиней при змінах
чутливих біологічних систем (культур клітин) слугує моделлю для
створення передумови нового підходу досліджень біологічних складових
епізоотичного процесу, а також сприяє новим шляхам у розробці
противірусних вакцин.

Розроблені методи застосування препаратів з кореня женьшеню дають
можливість спрямовано змінити інфекційну активність вірусів, що
запропоновано використовувати при виробництві противірусних засобів.

Відібрано хімічну речовину (хлороформ), розроблені методи її
застосування для інактивації вірусу класичної чуми свиней, що
використано при розробці інактивованої вакцини проти класичної чуми
свиней.

В результаті досліджень встановлені оптимальні системи та параметри
культивування збудників, патогенних РНК-вмісних вірусів тварин, що
допомогло змінити їх біологічні властивості при розробці технологій
виготовлення противірусних препаратів.

Результати досліджень використовуються у навчальному процесі у ВУЗ-ах
біологічного та ветеринарного профілів при підготовці вірусологів,
фахівців ветеринарної медицини, біотехнологів.

У технологію виготовлення вакцини проти ротавірусної хвороби свиней
закладений штам “К” ротавірусу, який був нами адаптований до чутливих
культур клітин при визначених оптимальних параметрах, охарактеризований
за морфологією, імуногенністю, мутагенною активністю, структурою
популяції.

При розробці технології створення та виготовлення інактивованої
хлороформ-ад’ювант вакцини проти класичної чуми свиней із лапінізованого
вірусу використані дослідження біологічних властивостей збудника та його
чутливість до різних хімічних речовин, результати з інфекційного
мутагенезу вірусу КЧС вірулентного та вакцинних штамів (“Ши-Минь”,
“Малазія”, “ЛК-ВНДІВВіМ”, лапінізований штам “К”).

Для поліпшення епізоотичної ситуації в Україні з ротавірусної хвороби
свиней та класичної чуми свиней, запропоновані розроблені і створені
вакцини: 1) “Вірусвакцина ліофілізована із штаму “К” проти ротавірусної
хвороби свиней для парентерального застосування”, ТУУ 19024865, термін
введення до дії з 1.12.93 р., застосування якої необхідно здійснювати
згідно з розробленими нами “Настанови на застосування вірусвакцини
ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для
парентерального застосування” та “Інструкції по виготовленню і контролю
вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хвороби
свиней для парентерального застосування”, затверджених у 1993р.
Державним департаментом ветеринарної медицини України;

2) “Хлороформ-ад’ювант вакцина проти чуми свиней із лапінізованого
вірусу”, ТУУ 15-15/3, термін введення до дії 1.01.93 р. Зразки препарату
застосовували згідно з розробленими нами “Настанови по застосуванню
хлороформ-ад’ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого вірусу”
1992 р. та “Інструкціїї по виготовленню і контролю хлороформ-ад’ювант
вакцини проти чуми свиней із лапінізованого вірусу”, затвердженою у 1992
р. Державним департаментом ветеринарної медицини України.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто за участю наукових
консультантів докторів ветеринарних наук, професорів, член-кор. УААН і
РАСГН А.І. Собко та академіка УААН П.П. Фукс обґрунтовано науковий
напрям, визначена тематика та програма досліджень, шляхи її вирішення.
Самостійно розроблені наукові положення, схеми наукових експериментів,
проведені науково-виробничі та лабораторні досліди, виконано патентний
пошук, проведено аналіз одержаних результатів та їх інтерпретація,
аналіз літературних даних, виконано статистичну обробку матеріалів,
сформульовано висновки.

Здобувач розробила наукові положення, самостійно виконала весь обсяг
методичних та експериментальних робіт з виявлення пошкоджуючої дїї
патогенних РНК-вмісних вірусів тварин на генетичний апарат соматичних
клітин тварин in vivo та in vitro (окремого вірусу, так і сумісній дії
двох вірусів); по спрямованій зміні інфекційної активності рота-,
коронавірусів, пестивірусу (ВКЧС) свиней дією різних чинників; з
індикації та адаптації вірусів у чутливих системах культивування; при
застосуванні настою калусної культури кореня женьшеню для змін
інфекційних властивостей двох представників родини РНК-вмісних вірусів;
з дослідження біологічних властивостей та змін у популяції ротавірусу
свиней при його взаємодії з популяціями чутливих клітин; з проведення
серологічного моніторингу розповсюдження збудника ротавірусної хвороби
свиней; з розробки принципів створення та застосування антимутагенних
препаратів з використанням природної сировини рослин для зменшення
генотоксичної дії при інфекційному мутагенезі.

Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із старшим
науковим співробітником ІВМ, кандидатом медичних наук Л.Г.Купчинським та
завідувачем сектору електронної мікроскопії ІВМ, кандидатом ветеринарних
наук І.П.Олексієнко. Дослідження з впливу вірусу лейкозу на стан ділянок
ДНК соматичних клітин великої рогатої худоби виконані за участю
аспіранта ІВМ Р.А. Голубця та кандидата біологічних наук Інституту
свинарства УААН (м. Полтава), завідувача лабораторією В.М. Балацького.

Автор висловлює щиру подяку професорам, докторам ветеринарних наук В.П.
Риженко, Старчеусу А.П., доктору ветеринарних наук, В.А. Прискоці,
завідувачам лабораторіями ІВМ, співробітникам лабораторії вірусології
ІВМ, лабораторії по розробці технології виготовлення інактивованої
вакцини проти класичної чуми свиней ІВМ, лабораторії анаеробних інфекцій
ІВМ за методичну допомогу при виконанні частини експериментальних
досліджень, а саме: кандидатам ветеринарних наук Ф.С. Вабіщевичу, І.В.
Сидорову, кандидату медичних наук В.Н.Тацькій, кандидату
сільськогосподарських наук Є.І.Марчишиній, кандидату хімічних наук Т.М.
Таїровій, науковим співробітникам О.В. Макаренко, М.В. Білоусу, Н.М.
Буканевій, ветлікарям В.І. Кирилову, В.Ю. Гапусенко, С.С. Сергеєву,
інженеру А.І. Горік, всьому технічному персоналу цих лабораторій, хто
допомагав у підготовці до дослідів, а також кандидату біологічних наук
В.М.Стефановій Російського інституту генетики та розведення тварин
(м. Пушкін, Санкт-Петербург, Росія) за методологічну допомогу у
дослідженнях геному клітин свиней.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень за темою
дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на засіданнях вченої
ради Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук
(1991–2004), а також на 30 наукових форумах різного рівня, в тому числі:

10-му з’їзді товариства мікробіологів України (м. Одеса, 15–17 вересня
2004 р); IV міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (м. Киів,
27–30 вересня 2004 р.); Міжнародному семінарі з біобезпеки і непоширення
для Центральної Азії і Кавказу (м. АлмаАти, Казахстан; 20–21 вересня,
2004 р.); науково-практичному семінарі “Проблеми отримання та
використання генетично-модифікованих і клонованих організмів” (м. Біла
Церква, 11 березня 2004 р.); Міжнародному семінарі “Biotehnoloqy,
commercialization and security” (м. Ташкент, Узбекистан, 14–17 жовтня
2003 р.); Европейській конференції “4th European Cytogenetics
conference“ (Bologna, Italy; September 6–9 2003); Европейській
конференції “European Humen Genetics Conference” ( Strasbourq — France;
May 25–28, 2002); Міжнародній конференції “ WAСRA EUROPE e.v., XIX
International conference long term responsibility for sustainable life”
( BRNO, Czeech Republic, August 7–11 2002); науково-практичній
конференції “Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого
рогатого скота” (м. Володимир, Росія, 27–28 лютого 2002 р.);
Міжнародному семінарі “Workshop: GIS emergency preparedness and health
reduction” (м. Будапешт, Угорщина, квітень 2001 р.); Міжнародній
науково-практичній конференції “Проблеми інфекційної патології тварин”,
присвяченої 70-річчю з дня народження член-кор. УААН, РАСГН, проф. А.І.
Собко” (смт. Новий Світ, Автономна республіка Крим, Україна, 17–21
вересня 2001 р); Міжнародному семінарі “On Children and Genotoxicity
Networks” (м. Копенгаген, Данія, 12–14 січня, 2001р.); Міжнародній
конференції “Phytosfere”- 99/ Nighlights in European Plant Biotehnology
research tehnoloqy transfer” (Rome, Italy, June 7–9 1999); Міжнародній
конференції “ Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных”,
присвяченої 100-річчю з дня народження В.Т. Котова (м. Воронеж, Росія,
19–21 травня, 1999 р.); Міжнародній конференції “Використання сучасних
молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у
генетико-селекційних дослідженнях” (м. Одеса-Київ, жовтень 1998 р.); II
міжнародній конференції “Біоресурси і віруси” (м. Київ, 7–10 вересня
1998 р.); Міжнародній конференції “15th International Conference of
WACRA –EUROPE e.v. environmental Management in Statas with loastal
Problems: Through research, education and leadership to sustainable
developmtnt” (Riga, Latvia, July 8–12 1998); Міжнародній
науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини,
зооінженерії та технологій продуктів тваринництва” (м. Львів, 9–11
жовтня 1997 р.); Міжнародному семінарі “IFAC International Federation of
Automatic Control.Mathematical and control application in agriculture
and horticulture” (м. Ганновер, Німеччина, 28 вересня – 2 жовтня 1997
р.); конференції “Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных
животных» (м. Володимир, Росія, 27–31 жовтня 1997 р.); Міжнародному
симпозіумі “YIII Simpozium of the international society for veterinary
epidemiology and economics” (м. Париж, Франція; 1997 р.); Міжнародній
конференції “First European cytogenetics conference” (м.
Афіни, Греція; 1997 р..); конференції “ Биология и культивирование
вируса КЧС” (м. Москва-Покров, Росія, 1996 р.); Міжнародному симпозіумі
“The third ESVV Simposium of pestivirus infection” (м. Лелістад,
Нідерланди, 19–20 вересня 1996 р.); Всесвітньому конгресі “ХХ1 World
Congress of Small Animal Veterinary Association “ (м. Єрусалим, Ізраїль,
20–23 жовтня 1996 р.); науково-практичній конференції ВНІІВВіМ
“Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики” (м.
Покров, Росія, 1995 р.); Міжнародній науковій конференції “Общая
эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические
проблемы” (м. Харків, 20–25 вересня 1995 р.); Всеукраїнській конференції
з фізіології і біохімії тварин (м. Львів, 1994 р.); Українській
конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини” (м. Київ, 1994 р.);
Міжнародному симпозіумі “Молекулярная генетика и биотехнология в оценке
и изменении геномов с/х животных” (м. Санкт-Петербург – Пушкін, Росія,
24–25 травня 1994 р.).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в 64
наукових працях, із них: у 28 наукових статтях, опублікованих у фахових
наукових виданнях, затверджених переліком ВАК України (18 із них
написані одноосібно), у 4 деклараційних патентах на винаходи, та у 24
матеріалах симпозіумів та конференцій, з яких 14 – у закордонних.

Матеріали дисертаційної роботи увійшли до затверждених заключних восьми
наукових звітів державних науково-дослідних робіт : ДКНТ № 290
(1988–1992), ДКНТ № 03.06/007-92 (1992–1996), № 01.04 (1993–1996), №
0197U012751 (1996–1998), № 0197U012749 (1996–1998), № 0201U001345
(1996–2000), № 0197U012747 (1996–2000), N 0101U00871 (2001–2004).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу;
огляду літератури; вибору напрямків досліджень, матеріалів і методів
виконання роботи, результатів експериментальних досліджень; аналізу і
узагальнення, висновків, пропозицій для практики, списку використаних
джерел і додатків. Робота викладена на 415 сторінках компґютерного
тексту і вміщує 19 таблиць та 54 рисунки. Список літератури включає 788
джерел, у тому числі 449 іноземних. До додатків увійшли: акти
виробничих випробувань, паспорти на штами вірусів, методичні
рекомендації, технічні умови, настанови, інструкції з виготовлення і
застосування вакцин, патенти та інші документи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ

Дисертаційна робота виконана упродовж 1991-2006 років. Експериментальна
частина роботи, апробація та виробнича перевірка результатів досліджень
була проведена в Інституті ветеринарної медицини УААН: в лабораторії
вірусології, лабораторії по розробці технології виготовлення
інактивованої вакцини проти класичної чуми свиней, секторі по вивченню
генетичної резистентності тварин, Державному науково-виробничому
підприємстві “Біоветпрепарат”, тваринницьких господарствах Молдови,
Вірменії, Північно-Осетинської Республіки та України (Одеської,
Херсонської, Дніпропетровської, Луганської, Донецької, Львівської,
Вінницької, Івано-Франківської, Тернопольської, Черкаської, Київської
областей) .

Матеріалом для досліджень слугували проби органів і тканин хворих,
інфікованих (РНК-вмісними вірусами) збудниками хвороб, забитих з
діагностичною метою та контрольних тварин різних вікових груп свиней
(тонкий відділ кишечника, печінка, нирки, легені, серце, селезінка,
кров, фекалії, лімфовузли, мигдалики, кістковий мозок грудної кістки).
Проби крові використовували для серологічних, імунологічних досліджень,
отримання культур лімфоцитів. Визначення імуноглобулінів в крові свиней
досліджували методом імунодифузії в гелі (Mancini G.J. et all., 1963;
Тихомірова О.А., 1977). Вірусовиділення, культивування, атенуацію,
титрування вірусів, реакції нейтралізації, дифузійної преципітації
здійснено, застосовуючи загальноприйняті методи (Сюрін В.М.,Фоміна
Н.В., 1979; Лярські З., 1980). При культивуванні і титруванні вірусу
класичної чуми свиней використовували метод прямої і непрямої
імунофлуоресценції із застосуванням ФІТЦ-імуноглобулінів до вірусу КЧС у
відображенному синьому світлі на люмінісцентних мікроскопах різних марок
(МЛ-1, МЛ-3, МЛ-4, МЛД-1, ЛЮМАМ та інші) із збуджуючими світлофільтрами
ФС-1-2, СС-І5-2, БС-8-2, (СЕС-14) і замикаючим №1 або №2 (Ж-18, ЛС-1).
Реакцію імунодифузії проводили згідно “Наставления по применению наборов
для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота”
(затвердженого Департаментом ветеринарії Мінсільхозпроду РФ, 1997).
Використанні первинно-трипсинизовані та перещеплювані культури клітин
(КК) тестикулів, нирок, щитовидної залози (СН, СНЕВ, СНЕВ-М, ПСН, ПТП,
КЩС, РК-15), лімфоцитів поросят, вирощених за “Методичними вказівками…”
ІВМ (розробленими: Субаєвим Г.Х., 1981 та Жуковським А.М. із
співробітниками, 1987).

Використані тварини : 479 кролів породи шиншила масою 2,5 – 3 кг, 80
кроленят 1-3- добового віку, 739 голів свиней (поросята-гнотобіоти,
безмолозивні неімунні поросята, 3-5- місячні підсвинки, живою масою тіла
в межах 35-70 кг, свиноматки), 20 голів великої рогатої худоби
чорно-рябої породи віком 2-2,5 роки живою масою тіла в межах 300-350 кг.
Свиней інфікували вірусумісними рідинами (вільними від бактеріального
забруднення) у відповідних дозах. При постановці біопроб на
поросятах-гнотобіотах використовували стерильний корм та створювали
особливі умови для попередження потрапляння сторонніх мікроорганізмів.
Дослідні і контрольні тварини, утримували в однакових умовах, виключаючи
можливість контакту. При необхідності створювали додатково групу
контактуючих тварин.Перевірку вірусів на патогенність і реверсибельність
здійснювали на поросятах-гнотобіотах із щоденним клінічним оглядом і
термометрією, відбором дослідного матеріалу.

Специфічні імунні сироватки до досліджуваних референтних, вакцинних і
епізоотичних штамів РНК-вмісних вірусів свиней отримували від клінічно
здорових кролів та підсвинків 3-5 -місячного віку. Для виявлення свіжих
випадків захворювання тварин в господарствах використовували дослідження
зразків парних сироваток крові (відібраних перший раз через 4-5 днів
після прояву перших симптомів хвороби, другий- через 14 днів).
Серологічні дослідження з виявлення підвищення титрів антитіл до
збудників проводили паралельно з обома сироватками в однакових умовах в
реакції нейтралізації.

Для роботи використані штами РНК — вмісних вірусів тварин: —
ентеровірусів свиней (родини Picornaviridae, роду Enterovirus) —
референтні штами, які викликають синдром SMEDI, одержані з колекції
патогенних мікроорганізмів тварин Ветеринарного науково-дослідного
інституту м.Брно (Чехія), люб’язно передані для дослідження, з
відповідними паспортами, провідним науковим співробітником лабораторії
вірусології ІВМ, к.м.н. В.Н. Тацькою: — штам “PS 34” / CAPM v-305/,
серотип 1(SMEDI C);- штам “02 b“/ CAPM v-248/,серотип 3 (SMEDI B);- штам
“PS 37” / CAPM v-251/,серотип 6 (SMEDI E);- штам “PS 27” / CAPM v-252/,
серотип 8 (SMEDI A ). Ці штами були адаптовані до перещеплюваних культур
клітин СН , СНЕВ, ПСН (до 31 пасажу) з титром інфекційності 5,5 -7,5 lg
ТЦД 50 / смі , (штами із відповідними паспортами);

коронавірусу свиней (родини Coronaviridae, роду Coronavirus): —
референтний штам вірусу ТГС (ВТГС) “Пурдью-115”, 45 пасаж в
перещеплюваній культурі клітин СНЕВ з титром інфекційної активності 5,75
± 0,1 lg ТЦД50/смі, який зберігали при — 20 ± 2 є С; — вакцинний штам
“M-42”, отриманий із референтного центру Ветеринарного інституту м.Брно
(Чехія); — штам “П 1439 /81”, 65-й пасаж в культурі клітин ПТП з титром
інфекційної активності 3,5 ± 0,21 lg ТЦД50/смі та 80 –й пасаж в
культурі клітин СНЕВ, які зберігали при – 20 ± 2 є С ( з відповідними
паспортами);

ротавірусу свиней (родини Reoviridae, роду Rotavirus) : — штам ”К”
ротавірусної хвороби синей, одержаний із лабораторії хвороб свиней
Всесоюзного Інституту експериментальної ветеринарії (ВІЕВ), Москва,
Росія в 1990 році, з відповідним паспортом, з титром інфекційності в
моношарових перещеплюваних культурах клітин нирок та тестикул поросяти
(СНЕВ, ПТП) 6,0-7,5 lg ТЦД50 /смі, (штам з відповідним паспортом);

— пестівірусу класичної чуми свиней (родини Flaviviridae, роду
Pestivirus): — вакцинні штами “ЛК-ВНДІВВІМ”, лапінізований штам “К”,
“Малазія”, вірулентний — ”Ши-Минь”, передані для досліджень завідуючим
лабораторією по розробці технології виготовлення інактивованої вакцини
проти класичної чуми свиней ІВМ, д.в.н. В.А. Прискокою. Зразки
лапінізованого штаму “К” вірусу КЧС отримували і із Сумської біологічної
фабрики з титром інфекційності 104 ІД50/ см3 , “ЛК-ВНДІВВіМ” — із
ліофілізованої вакцини Покровського заводу біопрепаратів серій № 15 та
№ 95).

При встановленні структури популяції ротавірусу свиней за S-ознакою
досліджено і проаналізовано 6711 негативних колоній ротавірусу під
агаровим покриттям (за методом Ysiung G.D. i Melnick J.L., 1957).
Стійкість вірусів до дії жиророзчинників визначали обробкою вірусумісних
рідин 5 %-вим розчином хороформу.

Дослідження морфологічної структури вірусів тварин, їх морфогенезу в
інфікованих клітинах, виявлення вірусів в пробах патологічного матеріалу
від тварин та виділених з культур клітин проводили, застосовуючи методи
електронномікроскопічних досліджень: прямої електронної мікроскопії,
негативного контрастування із використанням 2-4 % -го розчину
фосфорно-вольфрамової кислоти, 2-4 %-го розчину молібденовокислого
амонію, 0,5 — 1 %-го розчину уранілацетету.

При вирощуванні біомаси калусної культури кореня женьшеню за основу
брали виготовлення поживного середовища (Т. Murashige, F. Skoog, 1962) з
використанням наступних етапів: приготування маточних розчинів солей №
1 та № 2, хелату заліза, альфа-нафтилоцтової кислоти, тіамінхлориду,
кінетину; приготування наважок мезоінозиту, гідролізату казеїну,
сахарози; приготування агарового гелю; формування остаточного варіанту
поживного середовища.

Вивчення спадкового апарату клітин свиней проводили із застосуванням
цитогенетичних методів досліджень метафазних пластинок хромосом клітин
тварин (по 200 на одне дослідження) за методами (Moorhead P.S. et all.,
1960; Дарлінгтон С.Д., Кур Л.Ф.,1980; Яковлев О.Ф., 1981; Макгрегор Г.,
Варлі Д., 1986). Всього проаналізовано 7150 метафазних пластинок
хромосом соматичних клітин свиней. Полімеразну ланцюгову реакцію
виконували згідно прийнятих методів (K.Mullis, F.Faloona F., 1987;
L.A.Donehower, 1990; A.Limansky, O.Limanskaya, 2002). Використані водні
екстракти рослин: Rosmarinum officinalis L., (Lamiaceae), Angelica
silvestris L. (Apiaceae), Brassica oleracea: Broccoli (Brassicaceae),
Hyppophae rhamnoides (Elaeagnaceae), Panax radix ( Araliaceae),
приготовані за відомими прописами фармакологічних довідників.

Бактерицидну і лізоцимну активності сироватки крові визначали за
методами, описаними О.О. Смірновою, Т.А. Кузьміною, 1966; В.Е. Чумаченко
та ін., 1990. Статистична обробка результатів – за методом Стьюдента,
Д.У.Стедекора, 1961; Г.Ф.Лакіна, 1980.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Виділення та індикація РНК-вмісних вірусів тварин-збудників інфекційних
хвороб

В результаті комплексу досліджень із застосуванням біопроб на
поросятах-гнотобіотах та безмолозивних одноденних поросятах, електронної
мікроскопії, серологічної діагностики виявлено наявність збудників:
рота- та коронавірусів свиней в пробах матеріалів від інфікованих,
хворих і загиблих свиней при спалахах вірусних гастроентеритів в
господарствах України, Вірменії, Молдови. Виділені віруси представлені:
на рис.1 — польовий ізолят ротавірусу свиней, виділений з фекалій хворих
тварин радгоспу “Заря” Любашівського району Одеської області; на рис.2 –
коронавірусні часточки, виділені від поросят-гнотобіотів з біопроби; на
рис.3 — польовий ізолят вірусу ТГС, виділений від поросят Советошинської
свинофабрики (Вірменія). Встановлено, що взаємодія вірусів і чутливих
клітин відбувалась постадійно. Кожна стадія мала характерні ознаки, які
спостерігали при інфікуванні клітин досліджуваними патогенами
(ротавірусом, ентеровірусами, коронавірусом свиней).

Переважна більшість дослідників вважають, що початковою стадією
взаємодії рота- та коронавірусів свиней з ентероцитом кишечнику поросят
(клітиною-мішенню) є адсорбція вірусної часточки на мембрані клітини. За
нашими даними, розвиток ранньої взаємодії цих вірусів з ентероцитом дещо
інший: його мікроворсинки пошкоджувались ще до адсорбції цих вірусів на
специфічних рецепторах клітини (рис. 5 та рис.6). Для порівняння
представлено частину інтактного ентероциту кишечнику контрольного
поросяти з неушкодженою мікроворсинковою каймою (рис. 4). Але, розвиток
інфекційного процесу залежить від взаємодії всієї популяції патогену та
популяцій чутливих біологічних обґєктів.

Виявлення змін в популяції ротавірусу свиней в процесі адаптування до
культури клітин за S-ознакою. Пристосування вірусів до чутливих хазяїв
відбувалось завдяки тривалій еволюції цих обґєктів. Розвиток
епізоотичного

процесу залежить від взаємодії патогенів і чутливих організмів, а саме-
їх популяцій. Виявлення закономірностей існування популяцій збудників
слугуватиме новим підходам у створенні профілактично-лікувальних
засобів. Оскільки нами встановлені однакові стадії морфогенезу
ротавірусу свиней в інфікованій клітині різних чутливих обґєктів
(культур клітин і тварин), тому, як модель взаємодії вірусу і
сприйнятливого хазяїна ми обрали ротавірус свиней та перещеплювану
культуру клітин ПТП свинячого походження, до якої вірус адаптований
тривалим пасажуванням. Досліджена взаємодія патогену і чутливих клітин
протягом їх тривалого контакту на рівні популяцій і змін їх поколінь (що
відбувається і при перебігу епізоотичного процесу). Встановлені зміни,
що виникають у структурі популяції (за S-ознакою) збудника ротавірусної
хвороби свиней штаму ”К”. На рис.9 представлений її вигляд під

агаровим покриттям (за S-ознакою). Результати наведені в табл. 1.
Паралельно з дослідженням змін в структурі популяції ротавірусу
визначали його інфекційну активність, а також вплив на спадковий апарат
клітин in vitro. Аналіз наведених в табл. 1. результатів виявив, що
склад вірусної популяції (за S-ознакою) протягом 85 пасажів у культурі
клітин ПТП змінювався (діаметр бляшок, утворених вірусом був від (1,0 мм
до 5,0 мм). Кількість утворюваних вірусом бляшок певного розміру у межах
груп коливалась від пасажу до пасажу. Однак, основна категорія — це
дрібні бляшки, з діаметром ( 1,0 мм та ? 1,0–1,49 мм. Слід відмітити, що
в популяції вірусу виявили незмінну складову, так зване “ядро”, яке
складалось з бляшкоутворюючих одиниць (БУО), постійно присутніх у 85
пасажах, що викликали бляшки діаметром ( 1 мм, інші категорії —
змінювались від пасажу до пасажу. До того ж, у вірусній популяції
з’являлись з різних причин БУО, які не постійно присутні в популяції
збудника.

Таким чином, встановили, що популяція ротавірусу свиней гетерогенна,
мінлива за S-ознакою. Присутність стабільної мікропопуляції не впливала
на зміну інфекційної активності вірусу і не залежала від неї. Існування
стабільної складової у вірусній популяції важливо враховувати при
епізоотологічних дослідженнях, а також при розробці профілактичних
препаратів та вивченні еволюції вірусів.

Виявлення мутагенної дії РНК-вмісних вірусів тварин

Виявлення мутагенної дії ротавірусу, збудника ротавірусної хвороби
свиней. Паралельно із моніторинговими дослідженнями розповсюдження
збудника ротавірусної хвороби свиней, виявлення етіологічної структури і
патогенезу хвороби, тестуванні створенних вакцин, а також проведення
профілактичних заходів, нами досліджено вплив як епізоотичних
(вірулентних) штамів ротавірусу свиней, так і вакцинного культурального
штаму „К” ротавірусу на хромосоми клітин свиней (таблиця 2).
Дослідженнями, проведеними у біопробі на поросятах-гнотобіотах,
встановлено, що у контрольних тварин рівень клітин з абераціями хромосом
був 6,75 ± 0,2 %, у інфіковних польовим ізолятом ротавірусу — 39,08 ±
0,3 %. Серед ушкоджень значну частку становили розриви хромосом (19,2 %)
і хроматид (15,4 %). При дослідженні метафазних пластинок хромосом
лімфоцитів хворих поросят-віднятих з господарства, де ротавірусна
хвороба перебігала як моноінфекція, найбільшу частину пошкоджень
становили подвійні та поодинокі розриви хромосом з утворенням
фрагментів. Якщо порівнювати дані, отримані в системі in vivo, то
найбільшу кількість клітин з абераціями хромосом спостерігали у
поросят-гнотобіотів, інфікованих польовим ізолятом вірусу, що перевищило
контрольний рівень майже у 6 разів (Р<0,001). У поросят-віднятих 2-4 тижневого віку з господарства, хворих на ротавірусну хворобу, рівень клітин з абераціями хромосом був 34,4 ± 0,3 % і перевищував контрольний (10,5 ± 0,2 %) майже в три рази, але був меншим, ніж у поросят-гнотобіотів (Р<0,02). Таблиця 2 Результати вивчення мутагенного впливу ротавірусу свиней на спадковий апарат чутливих клітин, М ± m Об`єкти досліджень Дослідні групи Кількість клітин з абераціями хромосом, % Титр інфекційної активності, lg ТЦД 50/см3 In vitro культура клітин ПТП Контроль 5,14 ± 0,4 0 РВ 3 пасаж 26,4 ± 0,2 4,0 ± 0,04 Контроль 7,02 ± 0,1 0 РВ 10 пасаж 34,7 ± 0,15 6,14 ± 0,33 Контроль 6,9 ± 0,12 0 РВ 19 пасаж 35,2 ± 0,2 6,5 ± 0,15 Контроль 9,08 ± 0,1 0 РВ 30 пасаж 30,1 ± 0,3 5,7 ± 0,02 Контроль 11,3 ± 0,1 0 РВ 80 пасаж 31,3 ± 0,8 5,6 ± 0,02 In vivo, лімфоцити (поросят-гнотобіотів) Контроль 6,75 ± 0,2 0 РВ 39,08 ± 0,3 5,0 ± 0,05 In vivo, лімфоцити (поросят-віднятих, хворих на РВХС Контроль 10,5 ± 0,2 0 РВ 37,4 ± 0,3 Н/д In vivo, лімфоцити свиноматок Контроль 8,47 ± 0,2 0 Щеплені вакциною із штаму “К” 32,6 ± 0,3 6,0 ± 0,03 Необхідно відмітити,що поросята-відняті і поросята-гнотобіоти підпадали під дію одного й того ж самого вірулентного епізоотичного штаму вірусу. Імунізовані вакциною (із культурального штаму “К” ротавірусу) свиноматки з господарства мали рівень клітин з ушкодженнями хромосом 32,6 ± 0,3 %, що порівняно з контролем (8,47 ± 0,2 %) був вищим достовірно майже у 4 рази (Р<0,01). Незважаючи на тривалий процес аттенуації ротавірусу до культур клітин ПТП (80 пасажів), виявлена значна кількість клітин з абераціями хромосом у всіх досліджуваних пасажах, але яка зменшувалась після 19 пасажу. Таким чином, встановлено мутагенну дію ротавірусу свиней в системах іn vitro та іn vivo. Індикація дії ентеровірусу свиней на хромосомний аппарат клітин культури ПТП. При дослідженні мутагенного впливу ентеровірусів, причетних до синдрому SMEDI у свиней, на спадковий апарат їх клітин in vitro використано чотири штами: “02 в”, “PS 27”, ”PS 34”, “PS 37”. Виявили, що вони пошкоджували хромосомний апарат культури клітин ПТП (таблиця 3) достовірно порівняно з контролем (Р <0,01). Показано,що кількість клітин з абераціями хромосом була значною і сягала до 43,39 % (у штаму “PS 27”). Ентеровіруси свиней, що викликають синдром SMEDI, проявили більшу мутагенну активність порівняно з коронавірусом свиней (встановлену нами раніше) і збудником ротавірусної хвороби свиней, хоча спектр аберацій хромосом був майже подібним. Основну масу становили хромосомні і хроматидні розриви з утворенням фрагментів. Таблиця 3 Вплив ентеровірусів свиней на хромосомний апарат клітин культури ПТП, M ( m, Об’єкт досліджень: ентероровіруси cиндрому SMEDI Кількість клітин з абераціями хромосом, %, п=по 200 Титр інфекційної активності, lg ТЦД50 /см3 контроль, дослід, Штам “02в” 11,3 (0,2 -“- -“- v x † c ¤ >

f

B

v

x

x

z

|

~

?

c

¦

O

O

< >

l

??????????

?????????? ??????????????????

UeTH6cle@ i

„kd§

( 0,19

Штам ”PS27”

43,39 ( 0,4 7,8( 0,1

Штам ”PS34”

41,40 ( 0,3 7,1 ( 0,03

Таким чином, виявлено, що чотири штами ентеровірусів свиней,
які спричиняють синдром СМЕДІ, викликали достовірно пошкодження геному
клітин в системі in vitro.

Виявлення дії сумісного впливу рота- та коронавірусу свиней на
хромосомний аппарат соматичних клітин.

Встановлений вплив вірусів трансмісивного гастроентериту і ротавірусної
хвороби свиней в умовах перебігу цих захворювань в господарствах у
вигляді моноінфекцій (вірусних), так і при їх асоційованому перебігу, а
також при застосуванні живих вакцин та при одночасному інфікуванні
культури клітин обома патогенами (таблиця 4). Застосовані культуральні
вакцини: проти ТГС із штаму “П1439/81” і проти РВХС із штаму “К”.
Використана культура клітин ПТП, яка була чутлива як до коронавірусу,
так і до ротавірусу свиней. Їх інфекційна активність становила в
культурі клітин ПТП: 4,0 х 10-7 БУО/смі для штаму “П1439/81” вірусу ТГС;
та 6,5 ± 0,15 lg ТЦД50/смі для культурального штаму “К” ротавірусу
свиней. При цьому частота метафаз з пошкодженими хромосомами достовірно
збільшилась у 6,5 раза в порівнянні з контролем (Р<0,001). Таблиця 4 Мутагенний вплив рота- та коронавірусів свиней на хромосомний аппарат лімфоцитів, M(m, % Штами вірусів Об’єкт дії вірусів Кількість клітин з абераціями хромосом Коронавірус ТГС (епізоотичний штам) Хворі 5–7-денні поросята з господарства Контроль 10,5 ± 0,2 Дослід 35,9 ± 0,3 Інфіковані поросята-гнотобіоти з біопроби Контроль 6,75 ± 0,17 Дослід 37,1 ± 0,3 Ротавірус свиней (епізоотичний штам) Хворі поросята-відлученці Контроль 10,5 ± 0,2 Дослід 37,4 ± 0,3 Інфіковані поросята-гнотобіоти з біопроби Контроль 6,75 ± 0,2 Дослід 39,08 ± 0,4 Сумісна дія епізоотичних штамів ВТГС+РВ Хворі тижневі поросята з господарства Контроль 12,9 ± 0,3 Дослід 58,1 ± 0,2 Вакцинний культуральний штам “К” ротавірусу свиней Супоросні свиноматки з господарства Контроль 8,47 ± 0,1 Дослід 32,6 ± 0,1 Вакцинний культуральний штам “П1439/81” коронавірусу свиней Супоросні свиноматки господарства Контроль 7,1 ± 0,4 Дослід 22,2 ± 0,2 Сумісне застосування вакцинних культуральних штамів “К” (РВ) + ”П1439/81 (ВТГС) Супоросні свиноматки з господарства Контроль 9,3 ± 0,1 Дослід 36,5 ± 0,2 Примітка: –п=5, метафазних пластинок хромосом - по n=200; Р<0,05 З’являлась значна кількість клітин з багаточисельними тяжкими пошкодженнями хромосом типу фрагментації, пульверизації, а також з’являлись клітини з К-мітозами, що були відсутні в контролі. Проведення дослідів із паралельним інфікуванням культури клітин цими вірусами, але при зниженні дози інфікування в 10 разів виявило, що і за таких умов 25–30 % метафазних пластинок хромосом були із структурними абераціями хромосом типу розривів. Таким чином, зниження інфікуючої дози вірусів не зняло ефект їх мутагенної дії при сумісному інфікуванні чутливих клітин (Р>0,05) .

При асоційованому перебігу ТГС та РВХС (із господарств Вірменії:
свинокомплексів №1 та №2, свинорепродуктора Баграмянського району та
Советошинської свинофабрики) від хворих свиней відібрана кров. Із
отриманої культури лімфоцитів досліджені метафазні пластинки хромосом.
Виявили, що сумісна дія збудників хвороб вплинула на стабільність геному
соматичних клітин свиней, призвівши до аберацій хромосом, серед яких
значну частину займали розриви. Частота ушкодження хромосом клітин
наведена в таблиці 4. Для порівняння наведені дані, отримані при
інфікуванні тварин моноваріантами збудників. Перебіг асоційованої
інфекції ТГС та РВХС у свиней в господарстві спричиняло значні
пошкодження хромосом соматичних клітин свиней, які з’являлись раніше (на
півгодини) і перевищували їх кількість майже у 1,5 рази, ніж при
перебігу моноінфекцій, що спостерігалось і при дослідах in vitro (у
1,1-1,.6 рази).

Таким чином, інфікування свиней двома РНК-вмісними вірусами, збудниками
гастроентеритів, призводить до мутагенної дії на спадковий апарат їх
клітин, у тому числі при застосуванні живих вірусних вакцин, що слід
враховувати як у дослідженнях з патогенезу хвороб, так і при створенні
нешкідливих для геному профілактичних засобів.

Виявлення мутагенної дії вірусу класичної чуми свиней. Оскільки існують
дані щодо негативної дії вірусу КЧС на плід свиней в пренатальний
період, ми дослідили вплив цього патогену на стан спадкового апарату
соматичних клітин цих тварин (in vivo та in vitro).

Виявили, що інактивована вакцина із лапінізованого штаму “К” суттєво не
підвищувала пошкодження хромосом порівняно з контролем, а жива вакцина
із штаму „ЛК-ВНДІВВіМ” спричиняла аберації хромосом лімфоцитів 3-5-
місячних підсвинків (структурні пошкодження). Серед аберацій хромосом
при дії вірусу КЧС переважали розриви (до 17,1 ± 0,2 %). Аномальні
мітози виявили у 1,2 — 6,0 % клітин. Мутагенна дія вірусу КЧС на
хромосомний апарат клітин свиней представлена в таблиці 5. Наведені
результати свідчать про те, що живі вакцини проти КЧС проявляли
мутагенний вплив на спадковий апарат лімфоцитів свиней (Р<0,01). Крім того, цей ефект залежав від кратності введення антигену. Підсумовуючи результати досліджень, прийшли до висновку, що патогенні РНК-вмісні віруси свиней (ротавірус, ентеровіруси, які спричиняють синдромСМЕДІ, вірус класичної чуми свиней) проявляли значну генотоксичну дію різною мірою. Основні ушкодження хромосом – це розриви з утворенням фрагментів, підвищенням кількості “гепів”, виникнення патологічних мітозів (до 6 %). Комплексна дія двох патогенів сприяє більш значному пошкодженню спадкового апарату соматичних клітин свиней, ніж дія одного вірусу. Таким чином, важливо враховувати мутагенний вплив вірусів тварин на спадковий аппарат їх клітин у племінних господарствах, при проведенні профілактичних заходів, а також при утриманні тварин у екологічно неблагополучних зонах. Спрямована зміна патогенних властивостей РНК- вмісних вірусів свиней. Інактивація вірусу класичної чуми свиней. Розробка інактивованої вакцини проти КЧС призвела до пошуків цілеспрямованих способів змін властивостей вірусу КЧС, в тому числі і вибору його інактиванту. З цією метою випробувані такі хімічні речовини як формалін, (-пропіолактон, хлороформ та фізичний фактор – ультразвук. Формалін випробувано із вмістом формальдегіду в кінцевих концентраціях 0,03 %; 0,02 %; 0,01 %, в-пропіолактон - в концентраціях 0,05 %; 0,1 %; 0,15 %, хлороформ – в: 0,01 %; 0,1 %; 1,0 %; 10,0 %. На вірус КЧС діяли ультразвуком протягом 5 і 10 хвилин при 44 кГц, силою струму 0,55 А. Ступінь інактивації вірусу досліджували за температурною реакцією тварин, яким ввели оброблений відповідним інактивантом вірус. Після цього тварин заразили вірулентним штамом вірусу КЧС "Ши-Минь". Результати представлені в таблиці 6. Виявлення вірусу КЧС в дослідному матеріалі контролювали титруванням з використанням методу імунофлуоресценції (рис.7). Виявили неповну інактивацію при застосуванні досліджуваних речовин і способів обробок вірусу, за виключенням використання хлороформу (0,01 %). При використанні вірусу, обробленого 0,01 %-м розчином хлороформу, не виявили в МФА специфічного світіння, яке характерне для вірусу КЧС ні в одному з розведень (10-1 до 10-4). Негативні результати отримані також у РНГА з антитільним діагностикумом. Після контрольного інфікування вірулентним штамом тварини залишились клінічно здоровими. Таким чином, можемо зробити висновок про інактивацію вірусу КЧС. У підсвинків групи № 2, де тваринам вводили вірус, оброблений 0,1 %-м розчином хлороформу, всі вони були клінічно здоровими, але у деяких з них короткочасно підвищувалась температура тіла на 0,1 – 0,8°С. В групах № 3 та № 4, де підсвинкам вводили вірус, оброблений 1,0 %-м та 10 %-м розчином хлороформу, при контрольному зараженні всі тварини захворіли з ознаками: втратою апетиту і рухливості, набряку слизової оболонки верхніх дихальних шляхів, кон'юнктивіту, діареєю, з другої доби у них підвищувалась температура тіла до 41,9 ° С, надалі розвивалась лейкопенія (2–4,35 тис. клітин/ммі). Вони загинули на 4–10-й день після введення вірулентного вірусу. Таким чином, доведено, шо обробка вірусу підвищеними концентраціями хлороформу 1–10 % не захищала тварин від контрольного зараження вірулентним штамом “Ши-Минь" (що за припущенням було повґязано з пошкодженням вірусу вказаними концентраціями хлороформу). Визначення імуногенності вакцинних штамів вірусу КЧС, оброблених різною концентрацією хлороформу проводили на 3–5-місячних підсвинках, у яких були відсутні антитіла до вірусу КЧС. Щеплення здійснювали внутрішньом’язово в дозі 3,0 смі двократно з інтервалом у 30 днів. За тваринами проводили клінічні спостереження та термометрію. Контрольне інфікування вірулентним штамом “Ши-Минь” (по 1 смі кожній тварині внутрішньом’язово), на 14-й день після другої імунізації підсвинків, виявило захист тварин, щеплених вакциною, обробленою 0,01 % хлороформу (підсвинки залишились здоровими протягом всього терміну спостереження). Невакциновані тварини загинули на 5-6 добу після введення вірулентного вірусу. Таким чином, в якості інактиванта вірусу КЧС, який створював імунний захист у свиней, можна використовувати 0,01% хлороформ. Аналогічні результати отримані і з лапінізованим штамом "К" вірусу КЧС, обробленим 0,01 % хлороформом на кролях (по 4 кролі в групі, яким введено внутрішньовенно оброблений вірус по 1,0 смі). За результатами титрації вірусовмісної рідини та температурною реакцією тварин, після контрольного зараження, підтвердили інактивацію вірусу КЧС обробкою 0,01 % хлороформом. Досліди проводили у п’ятикратній повторності. Зміна морфологічної структури ротавірусу свиней. При захворюванні поросят на ротавірусну хворобу, методом електронної мікроскопії встановлено, що частина ротавірусних часток, виділених у просвіт кишечнику, утворювала масивні скупчення, включені в цистернах ендоплазматичної сітки, які представлені окремо або зв’язані з більш масивними фрагментами клітин. Такі конгломерати часто заважали ідентифікації ротавірусу при діагностичних дослідженнях. Для усунення цих конгломератів нами був досліджений вплив ультразвуку (потужністю 500 Вт при частоті 22 кГц протягом 10–120 секунд) на дезагрегацію ротавірусу в неочищених вірусутримуючих суспензіях патологічного матеріалу. Короткочасна соніфікація (10–20 секунд) не спричиняла помітного порушення конгломератів, проте при цьому зростала кількість ротавіріонів із пошкодженою структурою. Найбільш чутливим виявився зовнішній капсид вірусу, що представлено на рис.8. З продовженням терміну соніфікації дезагрегація конгломератів поліпшувалась, але суспензія вміщувала практично однокапсидні часточки вірусу. Таким чином, для пошкоджень капсиду вірусу або для отримання фрагментів його зовнішнього капсиду обробка ультразвуком (згаданих параметрів) – процедура доцільна. Однак, для поліпшення якості препаратів при проведенні діагностичних досліджень (з використанням методу електронної мікроскопії ) - вона малопридатна. Спрямована зміна інфекційної активності рота-, коронавірусу свиней застосуванням калусної культури кореня женьшеню. У практиці біотехнологічних виробництв, особливо при виготовленні біопрепаратів (вакцин, діагностикумів, специфічних гіперімунних сироваток та ін.), є необхідність у високоімуногенних атенуйованих вірусних штамах. Іноді у процесі їх адаптації та інших процедурах, у вірусів знижується інфекційна активність, що негативно впливає на якість сировини, з якої отримують вакцини та інші біопрепарати. Її підвищення досягають застосуванням специфічних відомих прийомів та підходів, кожен з яких має свої недоліки. Досягнення змін інфеційної активності вірусів необхідні і при розробці антивірусних препаратів. Нашою метою була зміна інфекційних властивостей штамів вірусів тварин із застосуванням екологічно безпечної рослинної сировини. З іншого боку – знайти нові підходи до інгібіції вірусної активності, що важливо при розробці лікувально-профілактичних засобів. Для цього застосували калусну культуру кореня женьшеню, вирощену in vitro, з якої отримали настій, за визначеною нами технологією. В якості моделі РНК-вмісних вірусів застосували адаптовані до культур клітин СНЕВ та ПТП вірус трансмісивного гастроентериту свиней (вакцинний штам “П1439/81” 80-го пасажу та референтний штам “Пурдю-115” 45-го і 80–85 пасажів) та ротавірус свиней (культуральний штам “К”, 70–85 пасажів). Вплив настою на зміну інфекційної активності вірусів досліджували, застосовуючи його в різних варіантах. Дослідним шляхом виявили оптимальний варіант для проведення досліджень в культурах клітин СНЕВ та ПТП. Встановили, що обробка настоєм калусної культури кореня женьшеню, застосована в різних дозах призводить до різних ефектів - підвищення інфекційної активності коронавірусу свиней ( Р<0,001 порівняно з контролем більше, ніж на один логарифм) та її інгібіції. Відмітили зниження інфекційної активності вірусу ТГС: у штаму “Пурдю-115” - в межах 2,69 - 3,31 lg ТЦД 50/смі (Р<0,05), у штаму “П1439/81” –в межах 1,4–2,7 lg ТЦД 50/смі (Р<0,01) та ротавірусу свиней культурального штаму “К” – в межах 1,1–1,5 lg ТЦД 50/смі. Таким чином, застосування настою калусної культури кореня женьшеню змінювало інфекційні властивості вірусів. Зміна мутагенних властивостей РНК-вмісних вірусів свиней. Встановлена нами мутагенна дія РНК-вмісних вірусів тварин родин Reoviridae, Pestiviridae, Picornaviridae, Coronaviridae призвела до пошуків речовин (і способів їх застосування), які мають антимутагенну або протективну дію. З цією метою ми дослідили можливість створення препаратів з антимутагенною дією на базі рослинної сировини (Rosmarinum officinalis L., (Lamiaceae), Angelica silvestris L., (Apiaceae), Brassica oleracea L.: Broccoli, (Brassicaceae), Hyppophae rhamnoides, (Elaeagnaceae), Panax radix, (Araliaceae). Робочу суміш (водні препарати) випробували in vitro при різних методах застосування: за 2 години до інфікування вірусом, одночасно з інфікуванням вірусом та через 1 годину після інфікування культур клітин вірусом. Результати наведені в таблиці 7. Моделлю слугував вірус ТГС штам “П1439/81” з титром 4,0 х10-7 БУО/смі в культурі клітин ПТП, який призводив до аберацій хромосом у 38,1 % клітин, (у контролі - 9,8 %), (Р<0,001). Застосування рослинних препаратів за 2 години до інфікування вірусом і подальшою її присутністю в підтримуючому середовищі протягом 4-х діб зменшило кількість клітин з абераціями хромосом (з 38,09 % до 28,7 %), що становило 24,7 % від кількості аберантних клітин (Р<0,025). Кількість гетероплоїдних клітин значно зменшилась (з 14,3 % до 5,4 %), відсутнім стало злиття хроматид. При внесенні робочої суміші паралельно з вірусом, кількість клітин з абераціями хромосом теж зменшилась (з 38,09 % до 32,4 %) Р< 0,05, але менше, ніж при застосуванні суміші рослинних препаратів до інфікування вірусом. Використання рослинних препаратів через 1 годину після інфікування вірусом, зменшило кількість клітин з абераціями хромосом з 38,09 % до 34,9 % (що склало 8,4 % від кількості клітин з абераціями хромосом) (Р< 0,01). Цей показник виявився суттєво нижчим, ніж при застосуванні Таблиця 7 Частота хромосомних аберацій в культурі клітин ПТП, інфікованої вірусом ТГС, при застосуванні лікарських рослин , % , М ± m, n=по 200 № п/п групи Варіанти досліду Кількість клітин з абераціями хромосом Кількість клітин з абераціями хромосом Р Застосування суміші водних препаратів ЛР, см3 0,01 0,03 0,05 0,07 0,1 435 1 Контроль-1 +НЛР як в п.5 9,8 ± 0,2 9,6 ±0,2 9,0 ±0,2 8,7±0,2 8,2±0,2 7,8±0,2 Р<0,1 2 Контроль-2 +НЛР за 2 год, як в п.5 9,8 ±0,2 9,6±0,2 8,9±0,4 8,4±0,2 8,0 ±0,2 7,5±0,2 Р<0,1 3 Контроль-3 +НЛР через 1 год, як в п.6 9,8 ±0,2 9,8±0,2 9,4±0,4 8,8 ±0,2 8,1±0,2 7,9±0,2 Р<0,1 4 ВТГС +НЛР одночасно 38,09±0,3 38±0,3 37,3±0,3 36,8±0,3 35,9±0,3 32,4± 0,3 Р<0,05 5 ВТГС +НЛР за 2 год 38,09±0,3 37,5±0,3 36,9±0,2 35,2±0,3 33,8±0,3 28,7±0,3 Р<0,02 6 ВТГС +НЛР через 1 год 38,09±0,3 38±0,3 37,5±0,3 37,0±0,3 36,3±0,3 34,9± 0,3 Р<0,01 Примітки: ЛР –лікарські рослини; НЛР – суміш настоїв лікарських рослин; контроль- незаражена вірусом КК ПТП рослинних препаратів двома іншими методами. Таким чином, в системі in vitro виявлена можливість зміни генотоксичної дії, викликаної коронавірусом ТГС штаму “П1439/81”, при використанні водних препаратів рослин. Зміна властивостей збудника ротавірусної хвороби шляхом адаптації в культурах клітин. Розробка і створення вакцин проти вірусних хвороб вимагає наявності вакцинного атенуйованого штаму збудника, позбавленого вірулентних властивостей. Одними із вимог до вакцин є те, що вони мають бути безпечними для тварин і імуногенними. При розробці вакцини проти ротавірусної хвороби, нами було здійснено атенуацію ротавірусу свиней штаму “К” у перещеплюваних культурах клітин, з обовґязковим контролем вірусу на реверсибельність. На перших етапах збудник важко адаптовувався до культур клітин. Для культивування збудника були визначені оптимальні культури клітин - ПТП та СНЕВ (серед використаних культур клітин свиней СНЕВ, ПТП, РК-15, ПСП, КЩС). Ротавірус був нами адаптований до них (протягом 80 і вище пасажів), що використано при виробництві вакцини. Протягом процесу адаптації досліджені зміни інфекційних, мутагенних та імуногенних властивостей вірусу, враховуючи які була розроблена та створена вакцина проти ротавірусної хвороби свиней із штаму “К”. Вона виявилась високоімуногенною і захищала тварин від контрольного зараження вірулентним штамом. При встановленні імуногенних властивостей було досліджено розвиток створеної поствакцинальної відповіді у тварин на застосування вакцини різними методами її введення (внутрішньом’язове, пероральне, внутрішньошкірне) за показниками гуморальної імунної відповіді. Вакцину вводили супоросним свиноматкам двократно з інтервалом у два тижні – за 30 і 15 днів до опоросу. Всі методи введення вакцини були ефективними. Вакцинація супоросних свиноматок суттєво впливала на створення поствакцинального імунітету як у свиноматок, так і у їх поросят, у яких через 2 місяці після вакцинації рівень противірусних антитіл в крові становив 12,5 ± 0,17 0,1 log2. Напружений поствакцинальний імунітет зберігався до 12 місяців після другої імунізації. Вакцинація свиноматок вакциною із культурального штаму “К” захищала народжених поросят від вірулентного збудника. Таким чином, проведені нами цілеспрямовані зміни інфекційних, імуногенних, мутагенних властивостей ротавірусу свиней дали можливість використати культуральний штам “К” при розробці та створенні технології виготовлення вакцини проти ротавірусної хвороби свиней. Вакцина захищала тварин від інфікування вірулентним штамом ротавірусу. ВИСНОВКИ 1. У дисертаційній роботі подано теоретичне та експериментальне обгрунтування необхідності контролю геному клітин при вірусних інфекціях, спричинених патогенними РНК-вмісними вірусами тварин (із родин Сoronaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Picornaviridae, Flaviviridae) та в процесі розробки засобів специфічної їх профілактики, що базувалось на дослідженнях біологічних аспектів взаємодії вірусів і чутливих систем на генетичному, клітинному та організменному рівнях. 2. Епізоотичні та вакцинні штами РНК-вмісних вірусів свиней - ротавірусу, вірусу класичної чуми, ентеровірусів (спричиняючих патологію відтворення із синдромом СМЕДІ) викликали мутації хромосом соматичних клітин свиней в системах in vitro та in vivo. 3. Вірулентний штам ротавірусу свиней мав мутагенну дію, виявлену в соматичних клітинах цих тварин в системі in vivo (лімфоцитах). Вона найбільш виражена у поросят-гнотобіотів, викликаючи аберації хромосом у 39,08 % випадків (в контролі - 6,75 %, Р<0,001). Штам “К” ротавірусу свиней із живої вакцини проти ротавірусної хвороби пошкоджував хромосомний апарат лімфоцитів поросних свиноматок при їх імунізації у 32, 6 % випадків (в контролі - 8,47%) (Р<0,01). 4. В процесі адаптації збудника ротавірусної хвороби свиней до культури клітин ПТП протягом 80 послідовних пасажів спостерігали зменшення генотоксичної дії вірусу (із 19-го пасажу), яка все ще залишалась на значному рівні (31,3 %) в порівнянні з контролем (11,3 %, Р<0,01). 5. Вірус класичної чуми свиней вакцинних штамів “ЛК-ВНДІВВіМ” та лапінізованого “К” проявляв мутагенну дію в лімфоцитах імунізованих 3-5 - місячних підсвинків. П(ятиразове введення цих антигенів підвищувало частоту аберацій їх хромосом достовірно вище порівняно із двократним застосуванням вакцин (Р<0,01). 6. Серед чотирьох штамів ентеровірусів (“PS 34”-SMEDI C; “02 b”- SMEDI D; “PS 37”-SMEDI E; “PS 27”-SMEDI A), причетних до патології відтворення свиней із синдромом СМЕДІ, найбільший мутагенний ефект в культурі клітин ПТП притаманний штаму “PS 27”, який викликав появу в 43,39 % клітин аберації хромосом (контроль -11,3 %, Р<0,01). 7. Комплексна (сумісна) дія збудників трансмісивного гастроентериту і ротавірусної хвороби свиней іn vitro та in vivo викликала достовірно вищу частоту виникнення аберацій хромосом, ніж окремо один із названих патогенів (Р<0,05). 8. Досліджено та спрямовано змінено інфекційні та імуногенні властивості ротавірусу, вірусу класичної чуми, вірусу трансмісивного гастроентериту свиней з використанням чутливих біологічних систем, хімічних сполук природнього та синтетичного походження, та дією ультразвуку, що використано для створення засобів специфічної профілактики, зокрема вакцин проти ротавірусної хвороби та класичної чуми свиней. 9. Хлороформ у кінцевій концентрації 0,01% інактивував вірус класичної чуми свиней із збереженням імуногенних властивостей, що використано нами при виготовленні інактивованої вакцини проти цієї хвороби. 10. Ультразвук (потужністю 500 Вт при частоті 22 кГц протягом 10-20 секунд і більше) викликав пошкодження зовнішнього капсиду ротавірусу свиней, інтенсивність якого збільшувалась з підвищенням терміну соніфікації, що виявлено методом електронної мікроскопії. 11. Застосування різних доз настою калусної культури кореню женьшеню викликало in vitro зміну інфекційної активності ротавірусу та коронавірусу свиней від інгібіції до її підвищення. На основі цього явища розроблені способи зміни інфекційної активності вірусів та отримані патенти України на винаходи (№ 950525507, № 95125530). 12. Патогені РНК-вмісні віруси, збудники гастроентеритів у свиней (рота- та коронавірус), викликали в чутливій мішені (ентероциті кишечника поросят), ще до їх адсорбції на клітинній мембрані, пошкодження мікроворсинок. 13. Збудник ротавірусної хвороби свиней в процесі адаптації до перещеплюваної культури клітин тестикул поросят протягом 85 пасажів, (при розробці вакцини), мав гетерогенну популяцію (за S-ознакою), структура якої змінювалась. Але в ній зберігалась незмінна складова, яка під агаровим покриттям утворювала бляшки діаметром ( 1,0 мм. Присутність цієї стабільної мікропопуляції не впливала на зміну інфекційної активності вірусу і не залежала від неї. 14. Суміш водних препаратів лікарських рослин (Rosmarinum officinalis L., Angelica silvestris L., Brassica oleracea L.(Broccoli), Hyppophae rhamnoides, Panax radix) зменшувала в системі in vitro (перещеплюваній культурі клітин ПТП) мутагенний ефект, викликаний коронавірусом трансмісивного гастроентериту свиней. Він варіював від дози і способу їх застосування (Р<0,01). Для виявлення антимутагенної дії запропонована тест-система (патент України на винахід № 95073164 від 15.07.97). ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ Рекомендуються використовувати у ветеринарній медицині та в біопромисловості розроблені та запропоновані: Вірусвакцину ліофілізовану із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування - ТУУ 19024865 –1993. Настанову по застосуванню вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування, затвердженої 2.12.1993 р. Головним управлінням ветеринарної медицини Мінсільхозпрод України. Інструкцію по виготовленню і контролю вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування, затвердженої 1.07.1993 р. Хлороформ - ад’ювант вакцину проти чуми свиней із лапінізованого вірусу - ТУУ 15-15/3-1993. Настанову по застосуванню хлороформ - ад’ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого вірусу, затвердженої Головним управлінням ветеринарної медицини Мінсільхозпрод України 25.01.1993 р. Інструкцію по виготовленню і контролю хлороформ - ад’ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого вірусу, № 15-15/3 ,затвердженої Головним управлінням ветеринарної медицини Мінсільхозпрод України 25.01.1993 р.. Спосіб інактивації вірусів (Деклараційний патент України № 95052507 від 15.07.97). Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини для виробництва біологічних препаратів (Деклараційний патент України № 95125530 від 4.03.97). Спосіб отримання експрес-моделі випробування антимутагенних препаратів при вірусних пошкодженнях геномів клітин свиней (Деклараційний патент України № 95073164 від 15.07.97). 10. Спосiб очищення основи для приготування поживних середовищ (.Деклараційний патент України № 96030913 від 04.11.97). СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Клестова З.С., Собко А.І. Проблемы неинфекционной патологии воспроизводства животных // Вісник аграрної науки . – 1994. – № 4. – С.75 – 82. (Дисертант проаналізувала ряд причин виникнення патологій відтворення у тварин, неінфекційної природи, серед яких патології, повґязані із порушеннями генетичного апарату клітин). Клестова З.С., Собко А.І. Изменение состава популяции возбудителя ротавирусной болезни свиней в процессе его культивирования // Микробиологический журнал. – 1994. – №5. – С.80 – 81. (Дисертант дослідила зміни популяції ротавірусу свиней за S–ознакою в процесі його адаптування до культур клітин). Klestova Z. The influence of swine fever virus on the chromosome apparatus of porcine cells // Proceeding of “ Third ESVV symposium on pestivirus infections”.– (ID–DLO), Lelystad.–1996. – P.46 – 47. Клестова З.С. Пошкодження хромосом клітин свиней під дією інфекційних агентів // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – Львів. – 1997. – С.183 – 184. Клестова З.С. Здоровґя продуктивних тварин як реалізація їх генетичного статусу // Ветеринарна медицина України. – 1998. – №5. – С.34 – 35. Клестова З.С. Пошук нових композицій з антимутагенною дією // Наук. Вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – Львів, 2000.–т.2. – №2. – ч.4. – С.81 – 83. Клестова З.С. Нові проблеми сучасного свинарства // Ветеринарна медицина України.–2000. – №8. – С. 27 – 28. Клестова З.С. Проблеми травлення у свиней при вірусних захворюваннях // Вісник Полтавського державного с/г інституту. – 2000. – №5. – С.43 – 44. Клестова З.С. Воздействие ротавируса на хромосомы клеток свиней // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. – Чернігів, 2000. – №7. – С.58 – 59. Клестова З.С., Балацький В.Н., Голубець Р.А. Виявлення мутацій у великої рогатої худоби, позитивно реагуючих в РІД на лейкоз // Науковий вісник Національного аграрного університету. – 2001. – 36. – С.143 – 146. (Дисертант визначила науковий напрям і мету досліджень, для їх вирішення розробила завдання та схеми проведення дослідів, приймала участь в узагальненні і аналізі отриманих результатів, сформулювала висновки). Клестова З.С., Риженко В.В. Поліпшення екологічної ситуації в тваринництві нетрадиційними методами біотехнології // Науковий вісник Ужгородського університету. – 2001. – № 9. – С.108 – 109. (Дисертант провела досліди, що засвідчили можливість зміни епізоотичної та екологічної ситуації при застосуванні біотехнологічних методів рослинництва у ветеринарній медицині з одночасною можливістю збереження природних ресурсів цінної лікарської рослини–женьшеню). Клестова З.С., Тацька В.Н. Екологічні аспекти інфекційного мутагенезу ентеровірусної етіології у патології геному свиней // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Харків,ІЕКВМ, 2002. – Вип. 80. – С.293 – 295. (Дисертант виявила пошкодження генетичного апарату клітин свиней ентеровірусами, які спричинюють патологію органів відтворення, змінила інфекційну активність штамів вірусів та проаналізувала екологічні аспекти вірусного мутагенезу, сформувала висновки). Клестова З.С. Розвиток біотехнології у тваринництві // Ветеринарна біотехнологія. Бюл. Інституту ветеринарної медицини. – Київ, 2002. – № 1. – С.86 – 95. Клестова З.С., Макаренко О.С., Безименний М.В., Самородов Є.Л. Перспективні напрямки розвитку ветеринарної науки: біо – та інформаційні технології // Наукові праці Полтавської державної аграрної академії . – Полтава, 2002. – т.2, (21). – С.190 – 192. (Дисертант проаналізувала необхідність та запропонувала обговорення питання застосування сучасних інформаційних технологій (геоінформаційних систем та методу нейронних мереж) для розвитку ветеринарної медицини). Клестова З.С. Зміна популяцій ротавірусу та його дія на геном клітин свиней| // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. –Харків,ІЕКВМ, 2003. – Вип. 82. – С.282 – 284. Клестова З.С. Роль исследований генетической резистентности животных к инфекционным заболеваниям в ветеринарной биотехнологии // Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини. – Київ, 2003. – №3. – С.49 –64. Клестова З.С. Гуморальный иммунный ответ у свиней при оценке биологических свойств ротавируса // Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини – Київ, 2003. – №3. – С.64 – 71. Клестова З.С., Тацька В.Н. Дія вірусів на генетичний аппарат клітин свиней // Біологія тварин. – 2003. – т.5, №1–2. – С.257 – 263. (Дисертант рекультивувала в культурі клітин чотири штами представників родини Picornaviridaе, причетних до синдрому СМЕДІ, після їх дворічного зберігання в умовах низьких температур, адаптувала до чутливих перещеплюваних культур клітин протягом 14–19 пасажів, визначила їх інфекційну та мутагенну активність у системі in vitro, проаналізувала результати та сформувала висновки). Клестова З.С. Биологические аспекты существования вирусной компоненты паразитоценозов в стадах свиней // Збірник наукових праць Луганського Національного аграрного унівеситету. – Ветеринарні науки. – 2003. – № 31/43. – С.271 – 276. Клестова З.С., Голубець Р.А. Молекулярні механізми дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – Львів, 2003. – т.5 (№2). – ч.3. – С.90 – 94. (Дисертант обгрунтувала одне із припущень молекурярних механізмів дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на ділянки клітинного геному, проаналізувала результати інших авторів, обгрунтувала необхідність застосування методів ПЛР та RAPD-ПЛР, сформувала висновки). Клестова З.С., Бойко А.Л. Застосування калусної культури кореня женьшеню для підвищення інфекційної активності вірусів // Вісник Київського Національного університету ім. Т.Г.Шевченко. – 2003. – вип.41.- С.154 – 156. (Дисертант досягла в системі in vitro підвищення інфекційної активності РНК–вмісних вірусів тварин при застосуванні певним, розробленим нею способом, настою калусної культури кореня женьшеню). Клестова З.С., Купчинський Л.Г. Раннє виявлення збудників гастроентеритів свиней // Вісник Полтавської державної аграрної академії. – 2003. – №1 – 2(26–27). – С.47 – 49. (Дисертант провела виділення і культивування польових ізолятів вірусів, збудників гастроентеритів свиней, провела серологічне типування, підготовчу роботу до проведення електронномікроскопічних досліджень, сформувала висновки). Клестова З.С. Дослідження біологічної дії женьшеню на віруси тварин.// Науковий вісник Ужгородського університету. – Серія біологія. – 2003. – № 12. – С.210 – 213. Клестова З.С. Дослідження біологічних складових епізоотичного процесу // Аграрний вісник Причорномор”я. – Ветеринарні науки. – Одеса,2003. – вип.21. – С.36 – 38. Клестова З.С. Коронавірусні інфекції //Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини. – Київ, 2004. – №4. – С.88 – 100. Клестова З.С. Сучасні біотехнологічні підходи у створенні нових засобів захисту тварин // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Харків.–ІЕКВМ, 2004. – Вип. 84. – С.338 – 341. Клестова З.С. Конфликт интересов общества и науки при развитии современной биотехнологии и генетики // Ветеринарна біотехнологія.– Бюллетень інституту ветеринарної медицини. – Київ, 2004. – №5. – С.41 – 55. Клестова З.С., Голубець Р.А. Аналіз поліморфних локусів ділянок ДНК соматичних клітин великої рогатої худоби на ранній стадії лейкозу // Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини. – Київ, 2005. – 6. – С.3 – 11. (Дисертант приймала участь в аналізі ділянок ДНК, розташованих на 4 та 5 хромосомах лімфоцитів крові ВРХ (інфікованих вірусом лейкозу), в динаміці розвитку ранніх стадій інфекційного процесу, сформувала висновки) . Клестова З.С. Особливості взаємодії вірусу, клітини та організму свиней при ротавірусній хворобі // Наук. Вісник Львівської академії вет. медицини ім. С.З. Гжицького. – 2005.–т.7. – №3 (26). – ч.1. – С.74 – 79. Клестова З.С. Антимутагенний ефект комбінації рослинних препаратів // Ветеринарна біотехнологія. – Бюллетень інституту ветеринарної медицини.– Київ, 2005. – №7. – С.41–54. Клестова З.С., Макаренко О.С., Риженко В.П., Риженко В.В. Патент України на винахід № 95125530 від 04.03.97, Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини для виробництва біологічних препаратів. (Диссертант особисто спланувала та провела дослідження по обробці РНК–вмісних вірусів тварин настоєм калусної культури кореня женьшеню, встановила дози та метод застосування настою). Клестова З.С., Собко А.І., Риженко В.П. Патент України на винахід № 950525507 від 15.07.97, Спосіб інактивації вірусів. ( Диссертант особисто спланувала та провела дослідження по обробці РНК–вмісних вірусів тварин настоєм калусної культури кореня женьшеню, встановила інактивуючі дози, та метод застосування настою, визначала інфекційну активність вірусів). Клестова З.С., Собко А.І.,Риженко В.П. Патент України на винахід № 95073164 від 15.07.97, Способ получения экспресс–модели испытания антимутагенных препаратов при вирусных повреждениях геномов клеток свиней. (Дисертант визначила модель досліджень взаємодії в системі вірус–клітина, придатну для тестування препаратів з протективною та антимутагенною дією ) Клестова З.С., Таїрова Т.М., Макаренко О.С. Патент України на винахід № 96030913 від 04.11.97, Способ очищення основи для приготування поживних середовищ. (Дисертант визначила необхідність покращення основи поживного середовища, яке застосовують у вірусології, провела тестування ряду замінників, а також варіантів основи при різних способах очищення). Клестова З.С. Состояние генома клеток свиньи при ротавирусной инфекции// Материалы междунар.симпоз. "Молекулярн. генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с/х животных". – Санкт–Петербург – Пушкин, Россия, 1994. – С.77–78. Клестова З.С. Необхідність цитогенетичного моніторингу тварин // Матеріали Української конф. молодих вчених "Сучасні проблеми ветеринарної медицини. – Київ, 1994. – С.28 – 29. Клестова З.С. Дія вірусів на генетичний апарат соматичних клітин свиней // Матеріали Всеукраїнської конф. з фізіології і біохімії тварин. – Львів, 1994.– С.72 – 73. Собко А.І., Алексеенко И.П,.Вабишевич Ф.С, Клестова З.С., Макаренко А.В. Изучение распространения ротавирусной болезни свиней // Материалы международной науч. конф. “Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы”. – Харьков, 1995. – С.176 – 177. Рыженко В.П., Клестова З.С., Шейна Е.В. Математическое моделирование инфекционного процесса и защитных реакций организма при классической чуме свиней // Материалы международной науч. конф. “Общая эпизоотология : иммунологические, экологические и методологические проблемы”. – Харьков, 1995. – С.234 –236. Рыженко В.П , Собко А.И., Клестова З.С. , Гома М.А, Перспективы разработки нового поколения вакцин против КЧС // Материалы науч.–практич. конф. ВНИИВВиМ “Класическая чума свиней – неотолжные проблемы науки и практики” – Покров, 1995. –С.123 – 124. Кlestova Z. Swine fever virus influence on chromosome apparatus of swine cells// Матеріали европейського симпозіуму “ Third ESVV symposium on pestivirus infections.” – (ID – DLO), Lelystad, The Netherlands, 1996. – P.84. Клестова З.С. Воздействие вируса КЧС на хромосомный аппарат клеток свиней // Материалы конф. по биологии и культивированию вируса КЧС. – М.– Покров, 1996. – С.23. Кlestova Z. Interrelation between the chromosome damages of swine cells by infection agents influence // Матеріали европейської конф. “First European cytogenetics conference”. – Athens ,Greece,1997. – P.22 – 27. Клестова З.С. Повреждения хромосом клеток свиней инфекционными агентами // Материалы конф. “Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных”. – Владимир, Россия, 1997. – C.133. Makarenko A.S., Кlestova Z. Modeling and control of the infection processes in industrial cattlebreeding // Матеріали міжнародного семінару “IFAC International FEDEration of Automatic Control. Mathematical and control application in agriculture and horticulture”.– Pergamon press .– Hannover, Germany, 1997. – P.213 – 217. Makarenko A.S., Кlestova Z. The influence of environmental changes of management processes and practice of cattlebreeding in Ukraine // Матеріали міжнародної конф. “15th International Conference of WACRA–EUROPE environmental management in States with Coastal Problems: Through research, education and leadership to sustainable development. – Riga , Latvia. – 1998. – Part 1. – P.16. Клестова З.С. Повреждение хромосом клеток свиней инфекционными агентами // Матеріали II Міжнародної конф. “Біоресурси та віруси”. – Київ, 1998. – С.25. Клестова З.С. Нетрадиционные методы изменения инфекционной активности вирусов–возбудителей заболеваний животных // Материалы 7–й международной науч.–практ. конф. ” Нетрадиционное растиниеводство, экология и здоровье”. – Алушта, 1998.–С.773 – 774. Клестова З.С. Відбір штамів вірусів для виробництва вакцин // Збірник матеріалів II Міжнародної конф.“Використання сучасних молекулярно–генетичних і біотехнологічних розробок у генетико–селекційних дослідженнях” . – м.Одеса, Київ: Аграрна наука, 1998. – С.104 – 105. Кlestova Z. Medical Plant in biotechnological production of animal vaccines // Матеріали европейської конф. ”Phytosfere’99 / Highlights in European Plant Biotechnology research and technology transfer ”. – Rome , Italy. – 1999. – P.24. Кlestova Z. Farming today, farming tomorrow // Европейська брошура “Plant biotechnology”. – 2000. – Printed by EPBN and EU Commission. – P.4. Клестова З.С. Состояние хромосом клеток животных при вирусной агрессии// Актуальне проблемы патологи свиней, крупного и мелкого рогатого скота. – Владимир, Россия, 2002. – С.137 – 141. Кlestova Z., R.A. Golubetz ., V.N. Balatsky . Leucosis virus influence on animal cells genome // Матеріали европейської конф. “European Human Genetics Conference”. – Strasbourg, France, 2002. – Р. 0136. Кlestova Z., V.N. Balatsky R.A., Golubetz. Leucosis virus influence on animal’s cell genome // Матеріали европейської конф. “4th European Cytogenetics conference. “, опубл. в журналі “ Elsevier”.– Bologna, Italy, 2003. – http:// web.feccbologna.it\ 8_21.htm.– 1р. Кlestova Z. Vaccine Production Biotechnology and Biological Safety // Матеріали міжнародного семінару “Internаtional Workshop on Biotechnology commercialization and security “– Tashkent, Uzbekistan, 2003. – P. 47 – 48. Кlestova Z., V.P. Rushenko. Impact of Biotechnologically produced Plant Products on Infective Intensity of animal viruses // Матеріали міжнародного семінару “Internаtional Workshop on Biotechnology commercialization and security “. – Tashkent, Uzbekistan, 2003. – P. 48. Кlestova Z.,. Golubetz R.A ,. Balatsky V.N . The Use of New Molecular and Genetic Methods in the Study of Mechanisms of Bovine Leucosis virus action // Матеріали міжнародного семінару “Internаtional Workshop on Biotechnology commercialization and security “– Tashkent, Uzbekistan, 2003. – P.50. Клестова З.С. Сучасні біотехнології та біобезпека // Матеріали наук.–практ. семінару “Проблеми отримання та використання генетично модифікованих і клонованих організмів”. – м. Біла Церква, 2004. – С. 26 – 31. Клестова З.С. , Голубець Р.А. Аналіз поліморфних локусів ділянок ДНК соматичних клітин великої рогатої худоби на ранній стадії лейкозу // Матеріали міжнародної конф. “Біоресурси та віруси”.– Київ, 2004. – С.131. Клестова З.С. Вірусні вакцини та біобезпека // Матеріали Х з’їзду Товариства мікробіологів України. – м.Одеса, 2004. – С. 361. Кlestova Z. Impact of Biotechnology Produced Plant Products on Inspective Intencity of Animal Viruses // Матеріали европейської конф: The 2nd EPSO Conference. “Interactions in Plant Biology, cells, plant and communities.” – P.084. Session “Interaction between organisms – Pathogens/Symbionts”.– Ischia (Naples), Italy, 2004. – P. 178. http://www.epsoweb.org/catalog/conf2004.htm Методичні вказівки з виявлення, обліку аберацій хромосом клітин свиней при вірусних інфекціях / Клестова З.С., Собко А.І., Прискока В.А. – Київ, 2005. – 24 с. Собко А.І., Прискока В.А., Сидоров І.В., Кирилов В.І., Сергеєв С.С., Клестова З.С. НТД: “Хлороформ–адґьювант вакцина проти чуми свиней із лапінізованого вірусу“.– Київ,1992, – Технічні Умови України (ТУУ 15–15/3.), Настанова по застосуванню…, Інструкція по виготовленню… Тацька В.Н., Прискока В.А., Клестова З.С., Собко Ю.А., Гапусенко В.Ю., НТД: “ Вірусвакцина ліофілізована із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування”.– Київ, 1993. – Технічні Умови України (ТУУ 19024865), Настанова по застосуванню…, Інструкція по виготовленню... Клестова З.С.Теоретичне та експериментальне обгрунтування контролю геному клітин при вірусних інфекціях тварин та в процесі розробки засобів їх специфічної профілактики. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. – Національний аграрний університет, Київ, 2006. Дисертація присвячена питанням виявлення впливу патогенних РНК–вмісних вірусів тварин (представників родин Reoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) на геном інфікованих клітин; виявленні особливостей їх взаємодії з чутливими біологічними системами (клітинами і організмами тварин); використанні цих особливостей для індикації та спрямованої зміни біологічних властивостей збудників при розробці та створенні нових засобів специфічної профілактики вірусних хвороб тварин. Встановлено наявність і циркулію серед тварин промислових господарств вищеперелічених патогенів, здійснено їх виділення, ідентифікацію та адаптацію в біологічних чутливих системах культивування (за визначеними оптимальними способами і умовами). Виявлено пошкодження мікроворсинок ентероцитів кишечника поросят під дією рота- та коронавірусу свиней до їх адсорбції на клітинній мембрані. Виявлена мутагенна дія представників досліджуваних родин РНК-вмісних вірусів тварин на геном інфікованих соматичних клітин, яка підсилювалась сумісним впливом іншого вірусу. Розроблена тест-система з виявлення антимутагенів та встановлена можливість змін мутагенної та інфекційної активності рота- і коронавірусів свиней шляхом застосування препаратів, отриманих з рослинної сировини. Встановлено інактивуючу дію 0,01 % розчину хлороформу на вірус класичної чуми свиней, що використано при створенні вакцини. Виявлено пошкодження зовнішнього капсиду ротавіріонів свиней ультразвуком (потужністю 500 Вт при частоті 22 кГц протягом 10-20 секунд). Виявлена гетерогенність популяції ротавірусу свиней, за S–ознакою, та зміна її структури в процесі тривалої адаптації патогена до чутливої біологічної системи. Встановлено наявність стабільної мікропопуляції, яка не впливала на його інфекційну активність і не залежала від неї. Розроблені, створені вакцини проти ротавірусної хвороби та класичної чуми свиней. Ключові слова: інфекції, віруси, тварини, клітини, популяція, взаємодія, вакцини, хромосоми, аберації, антимутагени. Клестова З.С.Теоретическое и экспериментальное обоснование контроля генома клеток при вирусных инфекциях животных и в процессе разработки средств их специфической профилактики. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени доктора ветеринарных наук по специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология. – Национальный аграрный университет, Киев, 2006. Диссертация посвящена вопросам установления влияния патогенных РНК-содержащих вирусов животных (представителей семейств Reoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) на геном инфицированных клеток; выявлении особенностей их взаимодействия с чувствительными биологическими системами (клетками и организмами животных); использовании этих особенностей для индикации и направленных изменений биологических свойств возбудителей при разработке и создании новых средств специфической профилактики вирусных болезней животных. Установлено присутствие и циркуляция среди животных промышленных хозяйств вышеперечисленных патогенов; проведено их выделение, идентификация и адаптация в биологических чувствительных системах культивирования (при установленных оптимальных способах и условиях). Установлено повреждение микроворсинок энтероцитов кишечника поросят под воздействием рота- и коронавирусов свиней до их адсорбции на клеточной мембране. Установлено мутагенное действие в условиях in vitro и in vivo представителей исследуемых РНК-содержащих вирусов животных, которые в разной мере вызывали повреждение генетического материала клеток в зависимости от штаммов (вакцинных и вирулентных) и семейств вирусов. Выявлено, что инактивированная вакцина против КЧС не вызывала изменений в структуре наследственного аппарата соматических клеток свиней, в отличие от живых вакцинных штаммов. Установлено, что четыре референтные штамма энтеровирусов свиней (“PS 34”, “02 b”, “PS 37”, “PS 27”), причастных к патологии воспроизводства у свиней существенно повреждали хромосомы их клеток. Выявлено, что основными типами повреждений хромосом при инфекционном мутагенезе под воздействием исследуемых патогенов являются двойные и одиночные разрывы хромосом с образованием фрагментов. Установлено, что совместное действие двух патогенных РНК-содержащих вирусов (при взаимодействии рота-, коронавируса свиней) в одном объекте приводит к усилению мутагенного действия, чем при инфицировании одним патогеном. Разработана тест-система для выявления антимутагенов. Установлено, что по окончании морфогенеза в клетке, популяции возбудителей гетерогенны по S – признаку. Выявлено изменение структуры популяции ротавируса свиней при их длительном взаимодействии с популяциями клеток хазяина (in vitro) в процессе адаптации патогена. Установлена стабильная микропопуляция, которая постоянно присутствует в каждом пассаже возбудителя, что позволило установить закономерности существования популяции вируса. Биологические свойства патогенных РНК-содержащих вирусов животных изменены действием ультразвука, химических веществ (хлороформа, в-пропиолактоном, формальдегидом), растительными препаратами и адаптацией в чувствительных биологических системах. Установлено повреждающее внешний капсид ротавирионов действие ультразвука мощностью 500 Вт при частоте 22 кГц на протяжении 10-20 секунд. Увеличение времени сонификации приводило к разрушению внешнего капсида вируса с образованием фрагментов Установлено инактивирующее действие хлороформа в концентрации 0,01 % на вирус классической чумы свиней, а также мутагенные свойства вакцинных и вирулентных штаммов возбудителя, что было использовано для разработки безопасной хлороформ-адъювант вакцины. С учетом эпизоотических данных, установленных биологических свойств РНК-содержащих вирусов, выявленных биологических аспектов взаимодействия вирусов с клетками, их изменений в процессе адаптации к системам культивирования, а также мутагенных свойств вакцинных и вирулентных штаммов ротавируса свиней и пестивируса КЧС были разработаны и созданы “Вирусвакцина лиофилизованная из штамма “К” против ротавирусной болезни свиней для парентерального применения” и “Хлороформ-адъювант вакцина против чумы свиней из лапинизированного вируса”, применение которых предусмотрено для супоросных свиноматок. Ключевые слова: инфекции, вирусы, животные, клетки, популяция, взаимодействие, вакцины, хромосомы, абберации, антимутагены. Klestova Z.S. Theoretical and experimental substantiation of the cell genome’s control in the course of animal viral infections and in the process of the development of means of their specific prophylaxis. – Manuscript. The thesis is submitted for the degree of Doctor of Veterinary Science, according to the specialization 16.00.03 – veterinary microbiology and virology. – National Agricultural University, Kyiv, 2006. The thesis is devoted to the problems of revealing the influence of pathogenic animal RNA – viruses (members of the families Reoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) on the genome of infected cells: the determination of the features of their interaction with sensitive biological systems (animal cells and organisms); the use of these features for indication and directed alterations of biological properties of causative agents in the development and creation of new means of specific prophylaxis of viral diseases in animals. The presence and circulation among animals at specialized farms and units of these pathogens was established; their isolation, identification and adaptation in biological sensitive systems of cultivation were carried out (according to the determined optimal methods and conditions). The damage of microvilli of intestinal enterocytes in piglets was revealed under the influence of swine rota- and coronavirus before their adsorption on cell membrane. Mutagenic effect of members of five families of RNA – containing animal viruses was revealed. This effect was enhanced by combined influence of the pathogen on the genom of infected cells. A test-system for the detection of antimutagens was developed and the possibility of viruses’ mutagenic activity alterations by means of preparations produced from plant raw materials was investigated. Inactivating effect of 0,01 % chloroform solution on the classical swine fever virus determined. Damages of the structure of swine rotavirions were identified under the influence of ultrasound power of 500 W, frequency 22 kHz during 10-20 sec., which causes the damage of outer capsid of the virus. Heterogeneity of swine rotavirus population and the alteration it’s structure in process of pathogen adaptation to a sensitive biological system were determined. A stable micropopulation of the causative agent was identified. Vaccines against rotaviral disease and classical swine fever were developed and produced. Key words: infections, viruses, animals, cells, population, interaction, vaccines, chromosomes, abberation, antimutagens. PAGE 21 PAGE 61

Похожие записи