.

Потенціалактивовані калієві струми нейронів спінальних гангліїв та гіпокампу щурів: онтогенез і роль у гальмівній синаптичній передачі: Автореф. дис..

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2911
Скачать документ

Національна Академія Наук України
ІIнститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Васильєв Дмитро Васильович

УДК 612.822:577.352.5

Потенціалактивовані калієві струми нейронів спінальних гангліїв та гіпокампу щурів: онтогенез і роль у гальмівній синаптичній передачі

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ – 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник
Доктор біологічних наук
Веселовський Микола Сергійович
Міжнародний Центр молекулярної фізіології НАНУ,
заступник директора по науковій роботі

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, керівник Центру докліничного вивчення лікарських засобів Фармакологічного комітету МЗ України Соловйов Анатолій Іванович

Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця Лозова Наталія Алексіївна

Провідна установа:
Кафедра біофізики Національного Універсітету ім. Т. Г. Шевченка

Захист відбудеться “23“ лютого 1999 р. о 14 годині на засідані спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології
ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4

Автореферат розісланий “22“ січня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук
З. О. Сорокіна-Маріна
ВСТУП
Актуальність проблеми
Дослідження потенціалкерованих калієвих каналів нейрональних клітин в нинішній час привертають зростаючу увагу. Це визначається важливою роллю каналів калієвого струму в регуляції збудливості нейронів, включаючи спроможність інтегрувати синаптичні сигнали, змінювати рефрактерний період, визначаючи частоту генерації потенціалів дії, а також модулювати тривалість та форму окремого потенціалу дії в нервових терміналях, впливаючи завдяки цьому на викид нейромедіатору (Thompson and Aldrich, 1980; Adams and Galvan, 1986). Ці інтегративні властивості калієвих струмів визначаються їхніми специфічними параметрами: рівнем стаціонарної інактивації калієвих каналів при потенціалі спокою клітини, порогом їхньої активації, швидкістю інактивації, а також щільністю струму.
Дослідження потенціалкерованих калієвих струмів центральних нейронів ссавців встановили доволі специфічну послідовність змін щільності калієвих струмів в період ранього онтогенезу (Barish, 1995; Klee et al., 1995). Фізіологічна роль таких процесів та їх особливості в різних ділянках нервової системи ще не до кінця виявлені. Більш того, дослідження змін калієвої провідності нейронів периферичної нервової системи, зокрема нейронів спінальних гангліїв, на сьодняшній момент не проводилися. Модифікації калієвої провідності нейрональної мембрани можуть відігравати суттеву роль в регуляції життєдіяльності як окремої клітини так і цілих нейронних комплексів. Так, функціональна роль калієвих каналів в нейронах гіпокампу зв’язується з їхньою спроможністю модулювати пачечну активність нейронів гіпокампу (Nakajima et al., 1986; Segal et al., 1984; Storm, 1987; Wu and Barish, 1992). Аплікація мікромолярних концентрацій 4-АП призводила до спонтанних епілептичних розрядів в препаратах зрізів гіпокампу, що було пояснене збільшенням викиду нейромедіатору в результаті підвищення рівня деполяризації пресинаптичних терміналей (Rutecki et al., 1987). ТЕА в концентрації 25 мМ викликав Са++-залежну, але NMDA-незалежну долготривалу потенціацію синаптчної передачі СА1 області гіпокапму щурів (Aniksztejn and Ben-Ari, 1991). Однак, механізм впливу блокаторів калієвих каналів на синаптичну передачу нейронів ссавців фактично залишається не з’ясованим. Збільшення постсинаптичної відповіді під впливом блокаторів калієвих каналів може бути зумовлене як втягненням додаткової кількості функціонуючих терміналей так і збільшенням викиду нейромедіатору з окремої синаптичної терміналі. Таким чином, дослідження впливу зміни калієвої провідності на синаптичну передачу центральних нейронів ссавців є актуальним і новим для розуміння фундаментальних механізмів синаптичної передачі нейронів ЦНС.
Мета дослідження
Визначити властивості потенціалкерованих калієвих струмів нейрональної мембрани сенсорних і центральних нейронів на ранніх стадіях онтогенезу та з’ясувати механізм впливу змін калієвої провідності пресинаптичної мембрани на синаптичну передачу.
Завдання дослідження
1. Виконати розподіл та ідентифікацію різних типів потенціалкерованих калієвих струмів соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв і гіпокампу щурів. На основі отриманих даних зробити порівняльний аналіз калієвої провідності соматичної мембрани двох типів нейронів.
2. Дослідити зміни щільності різних типів потенціалкерованих калієвих струмів соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв протягом перших двох тижнів постнатального розвитку.
3. Використовуючи метод позаклітинної електричної стимуляції в умовах відсутності генерації потенціалу дії (в розчині, що містить тетродотоксін, ТТХ), дослідити вплив блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів на гальмівні постсинаптичні струми окремих синаптичних терміналей нейронів гіпокампу.
Наукова новизна роботи
Зроблена ідентифікація різних типів потенціалкерованих калієвих струмів в нейронах спінальних гангліїв і гіпокампу щурів. Досліджені зміни щільності калієвих струмів сенсорних нейронів щурів в ранньому постнатальному періоді.
Вперше показано, що збільшення ефективності гальмівної синаптичної передачі центральних нейронів ссавців під впливом блокаторів калієвих каналів зумовлюється збільшенням середнього квантового вмісту викиду нейромедіатору з окремої синаптичної терміналі.
Теоретичне та практичне значення роботи
Отримані принципово нові дані про механізм дії блокаторів калиєвих каналів на викид нейромедіатору в гальмівному синаптичному закінченні нейронів гіппокампу щурів. Зміни калієвої провідності пресинаптичної мембрани як в процесі онтогенетичного розвитку, так і під впливом зовнішніх факторів можуть відігравати першорядну роль в механізмах синаптичної пластичності.
Особистий внесок
Автором особисто були виконані всі электрофізіологічні експерименти. У розробці концепції досліджень активну участь приймали співавтори друкованих робіт.
Апробація роботи
Основні положення роботи були представлені на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця (Київ, 1996, 1997); Міжнародному симпозіумі Міжнародного Центру Молекулярної Фізиології НАН України (Київ, 1997); Міжнародному конгресі Товариства Нейронаук (Новий Орлеан, США, 1997; ЛосАнжелес, США, 1998); Міжнародному конгресі Біофізичного Товариства (Канзас-сіті, США, 1998).
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єкт досліджень
Спінальні ганглії. В експериментах використовувались неідентифіковані нейрони спінальних гангліїв щурів трьох вікових груп: 1, 5-6 та 14-15 днів постнатального розвитку. Гангліі новонароджених щурів оброблялися 0.1% розчином пронази (Serva) у модифікованому середовищі Ігла (DMEM, Sigma) на протязі 7 хвилин при 330С. Для більш дорослих щурів обробка тривала 15 хвилин при незмінних температурі та концентрації ферменту. Гангліі відмивали на протязі 15-20 хвилин та піпетували в середовищі DMEM, після чого ізольовані нейрони переносилися в склянки Петрі. Клітинна адгезія до дна чашки завершувалася після 1-2 годин і нейрони могли бути використані в експерименті. На протязі досліджень клітини залишалися в середовищі DMEM, а зміна зовнішнього розчину проводилася за допомогою техніки швидкої локальної перфузії (Veselovsky et al., 1996) безпосередньо в області нейрона що досліджується.
Нейрони гіпокампу. Нейрони культивувалися по методиці, описаної раніше (Lux and Veselovsky, 1994). Коротко, нейрони гіпокампу новонароджених щурів лінії Wistar механічно диссоціювалися і переносилися на склянки Петрі, заздалегідь оброблені поліорнитіном. Щільність посадки складала 3000-10000/см2. Культивування нейронів проводилося в модифікованому середовищі Ігла (DMEM, Sigma) з доданням 10% сиворотки крові плодів корови, 1% глюкози, 0.6 мМ глютаміна, 2.3 г/л NaHCO3, 6 мг/мл инсуліна в СО2 інкубаторі при 350С і 5% СО2. Експерименти проводилися на 12-17 день вирощування нейронів.
Розчини
Розчини для зовнішньої перфузії містили (в мМ/л):
1) хлорід холіна-150, KCl-5, CaCl2-1, MgCl2-1, HEPES-20, тетродотоксин (TTX, Sigma) 0.5-1 М, рН доводився до 7.4 доданням Tris-OH.
2) NaCl-140, KCl-3, CaCl2-2, MgCl2-2, HEPES-20, ТТХ-0.25М, D-AP5-20M, DNQX-20M, рН доводився до 7.4 доданням Tris-OH.
Аплікація блокаторів калієвих каналів тетраетіламонія (ТЕА, Sigma) і 4-амінопіридина (4-АП, Aldrich) проводилася за допомогою техніки швидкої локальної перфузії (Veselovsky et al., 1996)
Розчини для внутрішньоклітинної перфузії складалися (в мМ/л):
1) KF-150, Tris-Cl-30, pH доводився до 7.4 з допомогою Tris-OH
2) KGlu-100, KCl-50, EGTA-5, MgCl2-5, pH доводився до 7.4 з допомогою Tris-OH (Sigma).
Зовнішньо/внутрішньоклітинні розчини 1) використовувалися при дослідженні потенціалкерованих калієвих струмів, розчини 2) – при дослідженні гальмівної синаптичної передачи у нейронах гіпокампу.
Електрофізіологічні вимірювання
Дослідження калієвих струмів соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв проводилися з використанням методу одноелектродної фіксації потенціалу з преривчатим зворотним зв’язком з частотою комутації від 15 до 25 кГц (Brennecke and Lindemann, 1972). Даний метод дозволяв контролювати рівень реального мембраного потенціалу, що використовувалася в роботі для обчислення кінетичних та стаціонарних характеристик калієвих струмів. Слід відзначити, що до обробки приймалися дані, в яких найбільша помилка в фіксації потенціалу при найбільших амлітудах калієвого струму складала не більш 5-10 мВ.
Калієва провідність нейрональної мембрани клітин гіпокампу досліджувалася з використанням методики фіксації потенціалу в режимі реєстрації від цілої клітини. Компенсація ємнісних струмів і струму витоку виконувалася з використанням протоколу Р/4 та/або аналогової компенсації в підсилювачі.
Гальмівні постсинаптичні струми (ГПСС) викликалися з використанням методики локальної електричної стимуляції зони синаптичного контакту короткими (3-5 мс) імпульсами струму, що пропускався крізь скляну мікропіпетку з зовнішнім діаметром кінчика близько 1 мкм, заповнену позаклітинним розчином (Katz, 1969 – Liverpool University press; Veselovsky and Grantyn, 1997). Реєстрація ГПСС здійснювалася за допомогою методу “patch-clamp” в конфігурації реєстрації від цілої клітини.
В процесі експерименту дані дискретизувалися при частоті 5-10 кГц за допомогою аналогово-цифрових інтерфейсів (Axon Instruments TL-1 interface) і зберігалися на жорсткому диску комп’ютера з використанням програмного пакету pClamp 6.0 (Axon Instruments, Foster city, CA).
Мікропіпетки витягувалися з боросилікатних скляних капілярів (Clark Electromedical Instruments, UK). Опір мікропіпеток складав 2-4 МОм. Експерименти проводилися при температурі 18-220С.
Обробка результатів експериментів
Аналіз струмів і даних проводився з використанням аналітичних програмних пакетів (pClamp 6.0, Axon Instruments; Origin 3.54, Microcol Software; TIDA for Windows, HEKA elektronik). Криві калієвих струмів були апроксимовані за моделлю Ходжкіна-Хакслі.
Щільність струму визначалася як відношення між максимумом відповідного калиевого струму, викликаного зміщенням потенціалу до +40 мВ, та ємністю соматичної мембрани нейрону. Вимірювання ємності мембран виконувалися обчисленням іинтегралу під кривою струму заряда мембраної ємності, викликаного гіперполярізуючим імпульсом до -90 мВ від підтримуємого потенціалу-60 мВ.
Окрім омовлених випадків, всі експериментальні дані представлені в виді середніх значень зі стандартною помилкою. Т-тест Стьюдента використовувався для оцінки статистичної достовірності розбіжності між двома середніми.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Калієва провідність соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв
Інтегральний калиєвий струм соматичної мембрани спінальніх гангліїв щурів практично в усіх досліджених клітинах міг бути поділений на три різних компонента, незалежно від віку тварини. Для розділення калієвих струмів були використані протоколи стимуляції, в подробиці описані раніше (Klee et al., 1995; Васильев, Федулова и Веселовский, 1998; Fedulova et al., 1998). Реєстрація проводилася з використанням внутрішньоклітинного розчину KF/Tris-Cl, що не містить ЕГТА, але з достатньою концентрацією іонів фтору (150 мМ) для повного блокування кальцій-залежного калієвого струму (Kostyuk et al., 1975). На рис. 1-3 (А) показані сімейства кривих трьох типів калієвих струмів, зареєстрованих в соматичній мембрані нейронів спінальних гангліїв щурів в присутності TTX (1мкМ).
На рис. 1-3 (Б, В) представлені кінетичні та стаціонарні характеристики трьох згаданих типів калієвих струмів в нейронах спінальних гангліїв щурів (відкриті символи,). Постійні часу активації всіх трьох типів калієвих струмів вимірювалися шляхом опису висхідної частини кривої струмів експотенційною функцією в четвертому ступені. Апроксимація інактивації транзиєнтних калієвих струмів проводилася з використанням моноекспотенційної функції для швидко-інактивуючегося струму (рис. 1В) та двухекспотенційної функції для поволі-інактивуючегося струму (графік швидкої постійної часу інактивації як функції мембранного потенціалу представлений на рис. 2В).

Рис. 1. Кінетичні та стаціонарні властивості калієвого струму А-типу у нейронах спінальних гангліїв та гіпокампу. А. Реєстрація швидко-інактивуючегося калієвого струму у нейроні спінального ганглія. Б. Стаціонарні характеристики А-струму у нейронах спінальних гангліїв () та гіпокампу (). В. Залежність постійної часу інактивації А-струму нейронів спінальніх гангліїв () та гіпокампу () від рівня мембранного потенціалу.
Дані залежності стаціонарної активації та інактивації від величини мембранного потенціалу для швидко-інактивуючегося (рис. 1Б), поволі-інактивуючегося (рис. 2Б) та неінактивуючегося калієвого струму затриманого випрямлення (рис. 3Б) представлені на рис. 1-3(Б). Безперервна лінія представляє апроксимацію даних рівнянням Больцмана з параметрами для активації і інактивації відповідно: V1/2=-20 мВ, k=11.8 мВ; V1/2=-84 мВ, k=-9.8 мВ (рис. 1Б); V1/2=-12.8 мВ, k=13.4 мВ; V1/2=-54.6 мВ, k=-12 мВ (рис. 2Б); V1/2= 15.3 mV, k= 12.5 mV (рис. 3Б).

Рис. 2. Кінетичні та стаціонарні властивості поволі-інактивуючегося (IsK) калієвого струму у нейронах спінальних гангліїв та гіпокампу. А. Реєстрація поволі-інактивуючегося калієвого струму у нейроні спінального ганглія. Б. Стаціонарні характеристики поволі-інактивуючегося струму у нейронах спінальних гангліїв () та гіпокампу (). В. Залежність “швидкої” постійної часу інактивації IsK струму нейронів спінальніх гангліїв () та гіпокампу () від рівня мембранного потенціалу.

Рис. 3. Кінетичні та стаціонарні властивості неінактивуючегося (IК) калієвого струму у нейронах спінальних гангліїв та гіпокампу. А. Реєстрація неінактивуючегося калієвого струму у нейроні спінального ганглія. Б. Стаціонарні характеристики IК струму у нейронах спінальних гангліїв () та гіпокампу (). В. Залежність постійної часу актівації IК струму нейронів спінальніх гангліїв () та гіпокампу () від рівня мембранного потенціалу.
Дослідження фармакологічної чутливості потенціалкерваних калієвих струмів соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв до блокаторів калієвих каналів 4-АП і ТЕА виявило різний ступінь фармакологічної чутливості згаданих струмів до блокаторів калієвих каналів. Так, зовнішня аплікація 2мМ 4-АП призводила до блокування амлітуди А-струму на 80 7% (n=8), а поволі-інактивуючегося струму на 55  6% (n=8); неінактивуючийся струм був не чутливий до 4-АП. ТЕА в концентрації 10 мМ блокував поволі-інактивуючийся струм на 40  5% (n=12), а К-струм на 70  5% (n=12) і не викликав вагомої модифікації амлітуди А-струму.
Канали калиєвої провідності у культивованих нейронах гіпокампу
Були досліджені потенціалкеровані канали калієвого струму у тривало культивованих (10-18 днів) нейронах гіпокампу. Для розділення калієвих струмів нейронів гіпокампу були застосовані протоколи стимуляції аналогічні тим, що використовувалися для розподілу калієвих струмів в сенсорних нейронах. На рис. 4А-В представлені швидко-інактивуючийся (А), поволі-інактивуючийся (Б), а також неінактивуючийся калієвий струм затриманого випрямлення (В). На вставках до відповідних рисунків представлені протоколи стимуляції, що використовувалися для розподілу різних типів калієвих струмів.

Рис. 4. Потенціалкеровані калієві струми у культивованих нейронах гіпокампу. Представлені швидко-інактивуючийся (А), поволі-інактивуючийся (Б) та неінактивуючийся (В) калієві струми.
Активація потенціалкерованих калієвих струмів в нейронах гіпокампу задовільно описувалася експотенційною функцією, зведеної у четвертий ступінь. Потенціалакервані калієві струми істотним образом відрізнялися за швидкосттю їхньої активації, хоча ця відмінність декілька зменшувалася при більш позитивних значеннях мембранного потенціалу. Постійні часу активації для швидко-, поволі- та неінактивуючегося калієвих струмів монотонно зменшувалися при збільшенні мембранного потенціалу і складали відповідно 2 мс, 12 мс, 45 мс при Vt=-10 мВ, а також 1.5 мс, 6 мс і 10 мс при Vt=+50 мВ.
Інактивація швидко-інактивуючегося струму апроксимувалась однією експонентою (рис. 1В). Постійна часу значно зменшувалася при збільшенні деполярізуючего зміщення потенціалу від 37 мс при -50 мВ до 17 мс при 50 мВ (рис. 1В). В той же час інактивація поволі-інактивуючегося калієвого струму найкращим чином описувалася сумою двох експонент. Постійна часу повільної (швидкої) експоненти варіювала від 4500 мс (550 мс) при Vt=-20 мВ до 1800 мс (300 мс) при Vt=+40 мВ (рис. 2В).
Для визначення величини стаціонарної активації калієвих каналів величина провідності визначалася як відношення амлітуди струму під час тестуючего зміщення потенціалу до електрорухаючії сили (Vm – Ek), де Ek – рівноважний потенціал для іонів калію, Vm – амлітуда тестуючего потенціалу. Експериментальні точки для стаціонарного рівня активації А-струму (рис. 1Б, ), поволі-інактивуючегося калієвого струму (рис. 2Б, ) та струму затриманого випрямлення (рис. 3Б, ) задовільно описувалися рівнянням Больцмана з параметрами V1/2=-22.1 мВ, k=10. 8 мВ (рис. 1Б); V1/2=-4.5 мВ, k=10. 6 мВ (рис. 2Б); V1/2=18.5 мВ, k=11. 5 мВ (рис. 3Б), де V1/2 – потенціал половиної активації, k – коефіцієнт крутизни. Відповідні дані залежності рівня стаціонарної інактивації від величини мембраного потенціалу були описані рівнянням Больцмана з параметрами V1/2=-80.1 мВ, k=-7.1 мВ (рис. 1Б); V1/2=-77.1 мВ, k=-10. 4 мВ (рис. 2Б).
Потенціалкеровані калієві струми в тривало культивованих нейронах гіпокампу володіли різним ступенем фармакологічної чутливості до блокаторів калієвих каналів 4-АП і ТЕА. На рис. 5 показана дія даних блокаторів калієвих каналів на інтегральні калиєві струми (рис. 5А-Б), а також на калієвий струм А-типу.

Рис. 5. Фармакологічні властивості потенціалкерованих калієвих струмів у культивованих нейронах гіпокампу. А. Блокуючий ефект ТЕА (А) та 4-АП (Б) на інтегральний калієвий струм. Б. Дія 4-АП на калієвий струм А-типу.
Швидко-інактивуючийся калієвий струм був не чутливий до позаклітинного прикладання 10 мМ ТЕА. В той же час 4-АП в концентрації 1мМ блокував А-струм на 20%, а в концентрації 5мМ на 75%. Поволі-інактивуючийся калієвий струм блокувався 10 мМ ТЕА на 55%. Позаклітинне прикладання 4-АП в концентрації 1мМ призводило до блокування поволі-інактивуючегося струму на 45%, а в концентрації 5 мМ на 80%. Неінактивуючийся калієвий струм не володів значущою фармакологічною чутливістю до 4-АП, проте блокувався ТЕА. Додання в позаклітинний розчин 10мМ ТЕА призводило до зменшення амлітуда цього струму на 70%.
Отримані експериментальні дані по дослідженню калієвої провідності в нейронах гіпокампу і спінальних гангліїв зазначають, що потенціалкеровані калієві струми в нейронах гіпокампу за своїми стаціонарними, кінетичними та фармакологічними властивостями не відрізняються істотним образом від відповідних калієвих струмів сенсорних нейронів, незважючи на приналежність останніх до периферічної нервової системи.
Зміни калієвої провідності нейронів спінальних гангліїв в ранньому постнатальному онтогенезі
Дослідження специфічних змін в розподілі описаних вище типів калієвих струмів, що відбуваються впродовж двох перших тижнів після народження тварини було зроблене із застосуванням експериментальних підходів докладно описаних раніше (Fedulova et al., 1994). Щільності калієвих струмів були зміряні для трьох вікових груп тварин: 1, 5-6 та 14-15 днів постнатального розвитку. В кожній групі було досліджено по 50 нейронів.
Таблиця 1.
Вікова
Група Щільність струму, пА/пФ
Ємність мембрани, пФ Площа проекції соми, мкм2
IfK IsK IK
Р1 14.9 8*** (55) 65.1 28.5 (55) 23.2 11.4 (55) 39.6 11*** (55) 488 154***
(55)
Р5.. 6 25.9 16.7 (50) 78.8 34.8 (50) 17.7 8.8
(50) 51 13.5
(50) 689 182***
(50)
Р14.. 15 30.1 23.9 (50) 75.6 38.2
(47) 17.4 11.9 (47) 55.3 17.3
(50) 796 261
(50)
Примітки. Дані в таблиці представлені у виді середнє значення  середнє квадратичне відхилення, в дужках зазначена кількість досліджених нейронів. IfK – швідко-інактивуючийся, IsK – поволі-інактивуючийся, IK – неінактивуючийся калієві струми.
Всі три типу струмів були виявлені практично в кожному досліджуваному нейроні, але амлітуда струмів варіювала в значному ступені. Щільність всіх струмів вимірювалася при зміщенні мембранного потенціалу до +40 мВ – в області потенціалів, де стаціонарний рівень активації всіх струмів досягав максимальної величини (рис. 1-3Б). Результат комп’ютерного аналізу з використанням Т-теста, що до статистичної різниці щільностей по кожному з трьох типів калієвих струмів для двох послідовних вікових груп, наведений в Таблиці 1 (p>0. 95 *; p>0. 99 **).
Добре відомо, що форма потенціалу дії змінюється в процесі клітинного зросту і диференціювання як в сомі, так і в нейрітах клітини (Spitzer and Lamborghini, 1976; Kullberg et al., 1977; Willard, 1980; Костюк, Кришталь, 1981). Здається цілком правомірним припущення, що модифікації калієвої провідності в процесі клітинного зросту не лимітовані областю соми клітини. Таким чином, подальшим завданням дослідження було з’ясування механізму впливу можливих модифікацій калієвої провідності пресинаптичної мембрани на ефективність синаптичної передачі в нейронах гіпокампу щурів.
Спонтанні та викликанні гальмівні постсинаптичні струми (ГПСС)
В зовнішньому розчині, що містіть ТТХ в нейронах, що знаходяться в режимі фіксації потенціалу, спостерігалися спонтанні ГПСС (сГПСС). Середня амлітуда сГПСС мала лінійну залежність від підтримуємого потенціалу із потенціалом реверсії -18..-20 мВ при даних поза/внутрішньоклітинної концентрації іонів хлору. Зовнішня аплікація біккукуліна в концентрації 5 М призводила до повного та зворотнього блокування сГПСС. Ці струми були ідентифіковані як GABA-індуковані гальмівні постсинаптичні Cl- – струми.
ГПСС могли бути також викликані шляхом позаклітинної електричної стимуляції зони пресинаптичного закінчення короткими (3-5 мс) деполярізуючими імпульсами струму, що пропускався крізь скляний мікроелектрод, заповнений позаклітинним розчином (рис. 6А). Викликані ГПСС (вГПСС) були аналогічні сГПСС за кінетикою активації і інактивації. Амлітуда усереднених вГПСС мала лінійну залежність від величини підтрімуваного потенціалу із потенціалом реверсії приблизно -20 мВ (рис. 6Б), що відповідає потенціалу Нернста для даних концентрацій іонів хлору. Таким чином, вГПСС були визначені як GABA-індуковані Cl– струми.

Рис. 6. Статистичний аналіз вГПСС окремих синаптичних терміналей культивованих нейронів гіпокампу. А. Реєстрація вГПСС, наведені 50 перших вГПСС. Б. Залежність амплітуди усередненних вГПСС від рівня підтримуваного потенціалу. В. Апроксимація амплитудної гістограми вГПСС (рис. 6А) сумой незалежних кривих Гауса. Г. Квантовий аналіз амплитуд вГПСС (рис. 6А,В) проведений за моделлю Пуассона (). N – число реєстрацій, m – квантовий вміст.
Розподіл амплітуд вГПСС
При стимуляції окремого синаптичного закінчення вГПСС значно варіювали по амлітуді від 7-8 пА до більш ніж 150 пА при підтримуваному потенціалі -75 мВ. Варіація амлітуди вГПСС в 10 з 12 нейронів мала добре виражений дискретний характер (рис. 6В). Апроксимація амплітудного розподілу вГПСС сукупністю незалежних кривих Гауса показує, що розподіл амлітуд вГПСС має дискретний характер з величиною кванта 20 пА (рис. 6В). Величина кванта варіювала у межах 19-22 пА (середня величина=20 пА, n=10) і не залежила від амлітуди позаклітинного стимулу. Величина підтримуємого потенціалу постсинаптичної клітини в усіх випадках складала -75 мВ.
Таким чином, отримані дані вказують на те, що викид медіатору в окремому синаптичному закінченні нейронів гіпокампу має ймовірнісний характер. Механізм викиду медіатору є квантовим.
Квантовий аналіз амплітудного розподілу вГПСС в рамках моделі Пуассона
Вперше закон Пуассона був застосований при дослідженні механізму синаптичної передачі у нервово-мускульному сполученні жаби (Katz, 1969 – Liverpool University press). На сьогодняшній момент засоби ймовірнісного опису процесів спонтанного та викликаного вивільнення нейромедіатору є загальноприйнятими.

Рис. 7. Порівняння квантового вмісту викиду медіатору, розрахованного з експерименту m= mean IPSC/mini та за моделлю Пуассона m=ln(N/n0), N – число реєстрацій, n0 – число пропусків.
Для застосування закону Пуассона до опису отриманих експериментальних даних вимагається перевести безперервний амплітудний розподіл вГПСС в дискретний. На рис. 6Г представлен кількісний розподіл квантов вГПСС для відповідного амплітудного розподілу вГПСС, показаного на рис. 6В. При побудові дискретного розподілу за один квант приймалися вГПСС c амлітудою в межах -8..-28 пА, за два кванта від -28 пА до-48 пА. Розподіл Пуассона для вірогідності викиду х квантов медіатору записується в виді P (x)=e-mmx/x!, де m – математичне очикування кількості квантов (квантовий вміст). Квантовий вміст визначається як відношення сумарної кількості викинутих квантів в серії з N випробувань до кількості цих випробувань. Як видно з Рис. 6Г, дискретний розподіл викиду медіатору достатньо добре корелює з теоретично обчисленним за законом Пуассона (показаний ). Кореляція між квантовим вмістом, обчисленним по методу “пропусків” m=ln (N/n0), n0 – кількість пропусків, N – кількість випробувань, а також зазначенного як відношення середньої амплітуди постсинаптичного струму до амлітуди одного кванта струму m=meanIPSC/mini зазначає достовірність гіпотези про Пуассоновський характер процесу (рис. 7).
Вплив позаклітинної концентрації іонів кальцію на вГПСС
Був досліджений вплив зовнішньої концентрації іонів кальцію на гальмівну синаптичну передачу в окремому синаптичному закінченні культивованих нейронів гіпокампу. Добре відомо, що процес екзоцитоза в пресинаптичній мембрані опосередкован входом іонів кальцію крізь мембрану терміналі (Katz, 1969 – Liverpool University press). Також добре відомо, що збільшення позаклітинної концентрації іонів кальцію в межах 0.. 5 мМ призводить до збільшення амлітуди кальцієвого струму як крізь низькопороговий так і високопороговий компонент кальцієвих каналів. Отже, слідує очікувати, що зміна концентрації позаклітинного кальцію буде змінювати ймовірність викиду медіатору. Дійсно, в серії з 10 дослідів було установлено, що збільшення позаклітинної концентрації кальцію при фіксованих параметрах позаклітинної стимуляції призводить до збільшення середньої амлітуди вГПСС (рис. 8А). Збільшення концентрації кальцію призводило до збільшення квантового вмісту викиду медіатору і не впливало на середню величину одного кванта вГПСС. Залежність амлітуди вГПСС від позаклітинної концентрації іонів кальцію мала сигмоідальний характер (рис. 8Б).

Рис. 8. Вплив зовнішньоклітинної концентрації іонів Са++ на вГПСС окремих синаптичних терміналей нейронів гіпокампу. А. Зображені усереднені вГПСС, отримані на одній клітині при різних концентраціях іонів Са++. Б. Залежність амплітуди вГПСС від зовнішньоклітинної концентрації іонів Са++. Данні представлені в виді mean  SD.
Збільшення квантового вмісту викиду нейромедіатору в гальмівній синаптичній передачі під вплівом блокаторів калієвих каналів
Був вивчений вплив мілімолярних концентрацій блокаторів калієвих каналів на синаптичну передачу в окремому синаптичному закінченні в умовах відсутності генерації потенціалу дії (в розчині, що містить ТТХ). Зовнішня аплікація 4-АП в концентрації 5мМ призводила до зворотного збільшення середньої амлітуди вГПСС на 90 30% (рис. 9А, n=7). Збільшення середньої амлітуди вГПСС було пов’язане з збільшенням квантового вмісту викиду медіатору (вставлення до рис. 9А) і не змінювало величини одного кванта. Кінетика спаду вГПСС в контролі та присутності 4-АП не змінювалася. Аплікація 20мМ ТЕА призводила до значно меньшого ефекту, амлітуда вГПСС зростала на 20 5% (рис. 9Б, n=5).

Рис. 9. Дія блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів на вГПСС окремих синаптичних терміналей нейронів гіпокампу. А. Зображені усереднені вГПСС в контролі та при аплікації 5мМ 4-АП; зміна квантового вмісту викиду медіатору зображена на вставці к рисунку. Б. Усереднені вГПСС в контролі та при аплікації 20мМ ТЕА.
Таким чином, блокування потенціалкерованих калієвих каналів пресинаптчної мембрани призводить до збільшення квантового вмісту викиду медіатору в окремому синаптичному закінченні.
ОБГОВОРЕННЯ
Порівняння властивостей відповідних типів потенціалкерованих калієвих струмів в нейронах гіпокампу та сенсорних нейронах не виявило статистично достовірних відмінностей більшості їх стаціонарних і кінетичних параметрів. Ймовірно, відповідні типи досліджених калієвих струмів сенсорних та центральних нейронів визначаються аналогічними (принаймні в значному ступені гомологічними) типами каналів. Така аналогія поширена в нервовій системі. Так, кінетичні і фармакологічні властивості описаного в цій роботі швидкого калієвого струму А-типу в значному ступені погодяться з експериментальними даними для аналогічних А-калієвих струмів, отриманими на багатьох інших препаратах центральної нервової системи – нейронах таламуса (Budde et al. 1992), неокортикальних нейронах (Andreasen and Hablitz 1992) та неонатальних сенсорних нейронах (MacFarlane and Cooper 1991, Fedulova et al. 1998). Сюди можна віднести швидку активацію і інактивацію з постійною часу інактивації у межах 15-30 мс, потенціал половиної інактивації -85..-70 мВ та підвищену чутливість до позаклітинного прикладання 4-АП. Деякі відмінності у роботах різних авторів виявляються в характері залежності постійної часу інактивації калієвого струму А-типу, що може бути пов’язане із особливостями функціональних властивостей калієвих каналів А-струму в тканинах різних ділянок нервової системи. В мозку ссавців були ідентифіковані три типу калієвих каналів, що відповідають за калієвий струм А-типу: Kv1. 4 (RCK4), Kv3. 4 (Raw3) та Kv4. 2 (RK5, rat shall: Baldwin et al., 1991; Rettig et al., 1992; Stuhmer et al., 1989). Очевидно, що Kv3. 4 канал не може визначати досліджений тип струму, бо Kv3. 4 канал, отриманий засобом експресії в Xenopus oocytes, володіє підвищеною чутливістю до TЕA (ID50=0.3 mM: Rettig et al., 1992). З іншого боку, Kv1. 4 та Kv4. 2 канали відповідні за калієві струми, в значному ступені схожі з швидким калієвим струмом по своїй чутливості до 4-АП та відносної резистивності до ТЕА. Імуноцитохімічні дослідження, проведені в різних ділянках головного мозку, показали, що канал Kv4. 2 знаходиться в основному в області соми і дендритного дерева нейрона, в той час як Kv1. 4 зосереджений в аксоні та нервових терміналях (Tsaur et al., 1992; Cooper et al., 1998; однак Martunez-Padryn and Ferrus, 1997). Крім того, швидкість виходу з інактивації дослідженого А-типу калієвого струму (постійна часу 45 мс) більш відповідає швидкості виходу з інактивації Kv4. 2 каналу, в той час як Kv1. 4 канал має істотно меньшу швидкість виходу з інактивації. Тому, найбільш вирогідно, що дослідженний тип калієвої провідності відповідає Kv4. 2 типу калієвого каналу.
Поволі-інактивуючийся калієвий струм активується в декілька раз повільніше А-струму. Інактивація описувалася двухекспотенційною функцією з постійними часу декілька сотен та тисяч мілісекунд відповідно. Можна було б припустити, що поволі-інактивуючийся калієвий струм визначається двома типами калієвих каналів. Однак, статистично достовірних відмінностей у кінетичних і фармакологічних параметрах двох вищезазначених компонентів струму виявлене не було. Крім того було показано, що поволі-інактивуючийся калієвий струм (RBK1), по своїм параметрам аналогічний описаному вище калієвому струму, також характеризується двухекспотенційним ходом інактивації з постійними часу порядку 50-100 мс та 5-10 с відповідно (Christie et al., 1989).
Поріг активації калієвого струму К-типу лежить в межах -20 мВ, потенціал половиної активації складає +15 мВ. К-струм активується поволі з постійної часу десятки мілісекунд і не інактивується принаймні впродовж 10-15 с при постійному рівні деполяризації мембрани. Неінактивуючийся калієвий струм не був чутливий до 4-АП, однак блокувався 10мМ ТЕА на 70-80%. Дослідження в області молекулярної біології (Stuhmer et al., 1989) виявили три типу генів, що відповідають за калієві канали затриманого випрямлення з властивостями, близькими до властивостей дослідженного струму: Kv1. 2 (RCK2), Kv1. 1 (RCK1) та Kv1. 5 (RCK5). Ці канали володіють схожими кінетичними параметрами, але відрізняються за фармакологічною чутливості до ТЕА. IC50 для RCK1, RCK2 і RCK5 каналів складає відповідно 0.6, 7 та 129 мМ. Тому, дослідженній калієвий струм затриманого випрямлення, найбільш певно, визначається Kv1. 2 типом калієвого каналу.
Дослідження модифікацій калієвої провідності соматичної мембрани сенсорних нейронів показали, що середня щільність швидко- і поволі-інактивуючихся струмів збільшуюється впродовж перших п’ятих днів постнатального розвитку і не змінюється в наступні десять днів. Середня щільність неінактивуючегося калієвого струму зменшується в перший і не змінюється в другий досліджений період раннього поснатального розвитку. При цьому, кількість нейронів, що мають щільність швидко-інактивуючегося калієвого струму більш 20 рА/рФ, збільшується в процесі онтогенезу. Це означає, що значення швидко-інактивуючегося калієвого струму в регуляції збудливості нейрона зростає з збільшенням віку тварини. В той же час, кількість нейронів, що мають щільність неінактивуючегося калієвого струму більше 25 рА/рФ, зменшується впродовж раннього онтогенезу. Дослідження ряду авторів по калієвій провідності центральних нейронів, в тому числі і нейронів гіпокампу (Bader et al., 1985; Aguayo, 1989; Surmier et al., 1991; Wu and Barish, 1994; Klee et. al, 1995) на ранніх етапах онтогенетичного розвитку вказують на деяку аналогію в процесах змін щільності калієвих струмів в нейронах спінальних гангліїв та нейронах гіпокампу. Так, щільність поволі-інактивуючегося калієвого струму в нейронах СА1 і CA3 області гіпокампу щурів збільшується протягом перших двох тижнів постнатального розвитку. Аналогічні модифікації спостерігалися і в наших дослідженнях калієвих струмів нейронів спінальних гангліїв. Можливо, це явище є частиною фізіологічного механізму, що є спільним для багатьох типів нейрональних клітин. Очевидно, що зміна щільності калієвих каналів призводить до модифікації форми та тривалості потенціалу дії, що в свою чергу тягне за собою варіацію в кількості кальцію, що проникає всередину клітини під час проходження потенціалу дії. Особливу роль в цьому відіграють калієві канали, розташовані безпосередньо в області пресинаптичного закінчення нейрона. Зміна форми потенціалу дії в цій області і відповідна зміна кількості проникаючего всередину кальцію можуть безпосередньо впливати на пресинаптичний механізм викиду медіатору.
Дослідження ряду авторів вказують, що калієві канали пресинаптичного закінчення нейрона можуть бути в значній мірі гомологічні калієвим каналам соматичної мембрани (Martunez-Padryn and Ferrus, 1997; Cooper et al., 1998). Здається правомірним припущення про те, що зміни калієвої провідності соми нейрона можуть в якому-то ступені (принаймні якісно) відбивати відповідні зміни провідності всієї нейрональної мембрани. Дослідження дії блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів (ТЕА, 20мМ і 4-АП, 5 мМ) на синаптичну передачу нейронів гіпокампу показали, що блокування калієвих каналів пресинаптичної мембрани призводить до збільшення імовірності викиду медіатору в окремому синаптичному закінченні. Ефект може бути пояснений слідуючим чином. Блокування калієвих каналів призводить до збільшення величини та тривалості деполярізації пресинаптичної мембрани, що збільшує величину кальцієвого струму крізь потенціалкеровані кальцієві канали. В свою чергу, збільшення кількості кальцію, що проникає всередину пресинаптичної терміналі змінює імовірність викиду медіатору. Раніш було показано, що калієвї струми IfK, IsK та IK – типів сенсорних і центральних нейронів володіють різним ступенем чутливості до ТЕА і 4-АП (McFarlane and Cooper, 1991; Klee et al., 1995; Fedulova et al., 1998). Струм IfK найбільш чутливий до 4-АП і не чутливий до ТЕА, в той час як калієві струми IsK і IK в значному ступені блокуються мілімолярними концентраціями ТЕА. В наших експериментах аплікація 5 мМ 4-АП призводила до збільшення амлітуди вГПСС в середньому на 90%, в той час як ТЕА 20мМ викликав збільшення величини вГПСС в середньому на 20%. Цей факт може вказувати на домінуючу роль калієвого струму IfK (А-типу) в формуванні калієвої провідності пресинаптичної мембрани досліджуваного типу нейронів.
ВИСНОВКИ
1. Аналіз калієвої провідності соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв і гіпокампу показує наявність принаймні трьох типів потенціалкерованих калієвих струмів в досліджених типах клітин. Сюди можна віднести швидко-інактивуючийся, поволі-інактивуючийся та неінактивуючийся калієвї струми. Калієві струми нейронів спінальних гангліїв по своїм стаціонарним, кінетичним та фармакологічним параметрам не відрізняються суттєвим образом від відповідних типів калієвих струмів нейронів гіпокампу.
2. Щільність калієвих струмів IfK і IsK соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв статистично достовірно збільшується протягом перших двох тижнів постнатального періоду, в той час як щільність IK -струму зменшується на тому ж інтервалі.
3. Блокатори потенціалкерованих калієвих каналів 4-АП і ТЕА викликають збільшення середньої амлітуди вГПСС GABAA рецепторів синаптичної терміналі нейронів гіпокампу, при цьому 4-АП (5мМ) викликає значно більший ефект (90 30%) в порівнянні з 20мМ ТЭА (20 5%). Збільшення амлітуди вГПСС також могло бути отримане шляхом збільшення позаклітинної концентрації іонів кальцію.
4. Квантовий аналіз гальмівної синаптичної передачі культивованих нейронів гіпокампу на рівні окремої синаптичної терміналі в даних експериментальних умовах показує адекватність застосування моделі Катца для опису мультивезікулярного викиду медіатору в гальмівних синапсах гіпокампу ссавців.
5. Збільшення середньої амлітуди вГПСС окремої синаптичної терміналі під впливом блокаторів калієвих каналів пояснюється за рахунок збільшення квантового вмісту викиду медіатору при незміній амплітуді кванта вГПСС.

По отриманим даним було опубліковано такі праці:
1. Д. В. Васильев, Н. С. Веселовский и С. А. Федулова. Потенциал-активируемые калиевыe токи соматической мембраны сенсорных нейронов крыс в раннем постнатальном периоде. Нейрофизиология, 1998. – т. 30. – стр. 25-35.
3. Д. В. Васильев., Е. В. Исаева, С. А. Федулова и Н. С. Веселовский. Пресинаптическая регуляция тормозной синаптической передачи нейронов гиппокампа крыс блокаторами калиевых каналов. Нейрофизиология, 1998.-т.30.-стр. 336-340.
2. S. A. Fedulova, D. V. Vasilyev and N. S. Veselovsky Voltage-operated potassium currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons: ontogenetic aspects. Neuroscience, 1998. -v.85. – p.497-508.

Тези доповідей:
1. S. A. Fedulova, D. Owen, D. V. Vasilyev and N. S. Veselovsky. Developmental study of the expression of potassium channels in the somatic membrane of sensory neurons. Society for Neuroscience 27th Annual Meeting, 1997. Abstract Book, 681.4
2. D. V. Vasilyev, S. A. Fedulova, E. V. Isaeva and N. S. Veselovsky. Fast-Inactivating potassium current in cultured rat hippocampal neurons. International Workshop “Intracellular signalling” in association with XXXIII International Congress of Physiological Sciences, 1997, June 26-28, Kiev. Neurophysiology, 1997.-v.29.- p.376.
3. D. V. Vasilyev, S. A. Fedulova, E. V. Isaeva and N. S. Veselovsky. Three distinct types of potassium current in cultured rat hippocampal neurons. Biophysical Society 1998 Annual Meeting. Abstract Book, 05C-05D.
4. S. A. Fedulova, D. V. Vasilyev, E. V. Isaeva, M. E. Barish and N. S. Veselovsky. Multiple potassium channels regulate neurotransmitter release from single boutons of inhibitory hippocampal synapses in culture. Society for Neuroscience 28th Annual Meeting, 1998.
5. D.V. Vasilyev, S.A. Fedulova, E.V. Isaeva, D.S. Faber and N.S. Veselovsky. Effect of different concentration of extracellular Ca2+ on IPSC evoked at single synapse of cultured hippocampal neurons. Society for Neuroscience 28th Annual Meeting, 1998.

Наведена дисертація викладена на 98 сторінках, включаючи список літератури (149 джерел), включає в себе вступ, огляд літератури, методику, результати досліджень, обговорення та висновки. У роботі використано 12 ілюстрацій.

Анотації:

Васильєв Д. В. Потенціалактивовані калієві струми нейронів спінальних гангліїв та гіпокампу щурів: онтогенез та роль у гальмівній синаптичній передачі. – Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальностю 03.00.02 – Біофізика. – Інститут Фізіології їм. О. О. Богомольця, Київ, 1998.
Дисертація присвячена вивченню властивостей потенціалкерованих калієвих струмів нейрональних мембран спінальних гангліїв та гіпокампу щурів під час раннього постнатального розвитку. Результати проведених досліджень показали, що потенціалкеровані калієві струми А -, DR – та К – типу соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв за своїми кінетичними, стаціонарними та фармакологічними параметрами не відрізняються суттєвим образом від відповідних калієвих струмів нейронів гіпокампу. Встановлено, що середні щільності А – і DR-струмів соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв збільшуються впродовж перших п’ятих днів постнатального розвитку, в той час як щільність К-струму зменшується за той же період, і не змінюються у наступні десять днів. Показано, що в умовах відсутності потенціалу дії (в розчині, що містить ТТХ) зміна калієвої провідності мембрани гальмівної синаптичної терміналі (під впливом тетраетіламонію або 4-амінопіридину) призводить до збільшення середньої амлітуди постсинаптичної відповіді при незмінних параметрах зовнішньоклітинної стимуляції. Проведений квантовий аналіз показав, що зміна постсинаптичної відповіді під впливом блокаторів калієвих каналів відбувається за рахунок збільшення квантового вмісту викиду медіатору з окремої синаптичної терміналі при незмінній величині одного кванта.
Ключові слова: калієві канали, онтогенез, синаптична передача, квантовий аналіз.

Васильев Д. В. Потенциалактивируемые калиевые токи нейронов спинальных ганглиев и гиппокампа крыс: онтогенез и роль в тормозной синаптической передаче. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 – Биофизика. – Институт Физиологии им. А. А. Богомольца, Киев, 1998.
Диссертация посвящена изучению свойств потенциалуправляемых калиевых токов нейрональных мембран спинальных ганглиев и гиппокампа крыс в процессе раннего постнатального развития.
В настоящей работе были исследованы три типа потенциалуправляемых калиевых токов нейронов спинальных ганглиев и гиппокампа, определены их стационарные, кинетические и фармакологические характеристики, а так же изменения плотности токов в раннем постнатальном периоде. Более того, были исследованы влияния изменений калиевой проводимости (при помощи блокаторов калиевых каналов) пресинаптической мембраны на свойства синаптической передачи культивируемых нейронов гиппокампа.
Сравнение свойств соответствующих типов потенциалуправляемых калиевых токов в нейронах гиппокампа и сенсорных нейронах не выявило статистически достоверных различий большинства их стационарных и кинетических параметров. По-видимому, соответствующие типы калиевых токов исследованных сенсорных и центральных нейронов определяются аналогичными (или по крайней мере в значительной степени гомологичными) типами одиночных каналов.
В мозге млекопитающих были идентифицированы три типа калиевых канала, продуцирующие калиевый ток, сопоставимый по своим кинетическим параметрам с исследованным в настоящей работе калиевым током А-типа: Kv1.4 (RCK4), Kv3.4 (Raw3) и Kv4.2 (RK5, rat shall: Baldwin et al., 1991; Rettig et al., 1992; Stuhmer et al., 1989). Очевидно, что Kv3.4 канал не может определять исследованный тип тока, так как Kv3.4 канал, полученный методом экспрессии в Xenopus oocytes, обладает повышенной чувствительностью к TЭA (ID50 = 0.3 mM: Rettig et al., 1992). С другой стороны, Kv1.4 и Kv4.2 каналы продуцируют калиевые токи, в значительной степени сходные с быстрым калиевым током по своей чувствительности к 4-АП и относительной резистивности к ТЭА. Иммуноцитохимические исследования, проведенные в различных участках головного мозга, показали, что канал Kv4.2 локализуется в основном в области сомы и дендритного дерева нейрона, в то время как Kv1.4 сосредоточен в аксоне и нервных терминалях (Tsaur et al., 1992; Cooper et al., 1998), однако см. Martunez-Padryn and Ferrus, 1997. Поэтому, наиболее вероятно, что идентифицированный тип калиевой проводимости соответствует Kv4.2 типу калиевого канала.
Калиевый ток DR-типа активируется в несколько раз медленне А-тока; потенциал половинной активации (V1/2) DR-тока, сдвинут относительно V1/2 А-тока на 10мВ в область более положительных потенциалов. Временная инактивация DR-тока описывалась двухэкспоненциальной функцией с постоянными времени несколько сотен и тысяч миллисекунд соответственно. Можно было бы предположить, что медленно-инактивирующийся калиевый ток определяется двумя типами калиевых каналов. Однако, статистически достоверных различий в кинетических и фармакологических параметрах двух вышеуказанных компонентов исследованного типа тока обнаружено не было. Кроме того было показано, что медленно-инактивирующийся калиевый ток DR-типа (RBK1), по своим параметрам аналогичный вышеописанному DR-току, так же характеризуется двухэкспоненциальным ходом временной инактивации с постоянными времени порядка 50-100 мс и 5-10 с соответственно (Christie et al., 1989).
Порог активации калиевого тока К-типа лежит в пределах -20 мВ, потенциал половинной активации составляет +15 мВ. К-ток активируется медленно с постоянной времени десятки миллисекунд и не инактивируется по крайней мере в течение 10-15 с при постоянном уровне деполяризации мембраны. Неинактивирующийся калиевый ток не был чувствителен к миллимолярным концентрациям 4-АП, однако блокировался 10мМ ТЭА на 70-80%. Исследования в области молекулярной биологии (Stuhmer et al., 1989) обнаружили три типа генов, кодирующих калиевые каналы задержанного выпрямления со свойствами, близкими к свойствам исследованного типа К-тока: Kv1.2 (RCK2), Kv1.1 (RCK1) и Kv1.5 (RCK5). Эти каналы обладают сходными кинетическими параметрами, но отличаются по фармакологической чувствительности к ТЭА. IC50 для RCK1, RCK2 и RCK5 каналов составляет соответственно 0.6, 7 и 129 мМ. Поэтому, исследованный калиевый ток задержанного выпрямления, наиболее вероятно, определяется Kv1.2 типом калиевого канала.
Исследования изменений калиевой проводимости соматической мембраны сенсорных нейронов показали, что средние плотности быстро- и медленно-инактивирующихся токов увеличиваются в течении первых пяти дней постнатального развития и не изменяются в следующие десять дней. Средняя плотность неинактивирующегося калиевого тока задержанного выпрямления уменьшается в первый и не изменяется во второй исследованный период раннего поснатального развития. При этом, количество нейронов, имеющих плотность быстро-инактивирующегося калиевого тока более 20 рА/рФ, увеличивается в процессе онтогенеза. В то же время, количество нейронов, имеющих плотность неинактивирующегося калиевого тока больше 25 рА/рФ, уменьшается в течении раннего онтогенеза. Очевидно, что изменение плотности калиевых каналов приводит к изменению длительности потенциала действия, что в свою очередь влечет за собой вариацию в количестве кальция, проникающего внутрь клетки во время прохождения потенциала действия. Особую роль в этом смысле играют калиевые каналы, расположенные непосредственно в области пресинаптического окончания нейрона. Изменения формы потенциала действия в этой области и соответствующее изменение количества проникающего внутрь мембраны кальция могут непосредственно влиять на пресинаптический механизм выброса медиатора.
Используя метод внеклеточной электрической стимуляции в условиях отсутствия генерации потенциала действия (в ТТХ – содержащем растворе), было исследовано влияние изменений калиевой проводимости пресинаптической мембраны, применяя блокаторы калиевых каналов, на тормозные постсинаптические токи нейронов гиппокампа на уровне отдельного синаптического окончания. Показано, что в ТТХ-содержащем расстворе изменение калиевой проводимости мембраны одиночной тормозной синаптической терминали (под действием тетраэтиламмония или 4-аминопиридина) приводит к увеличению амплитуды постсинаптического ответа при неизменных параметрах внеклеточного стимула. Проведенный квантовый анализ тормозной синаптической передачи показал, что изменение постсинаптического ответа под действием блокаторов калиевых каналов происходит за счет увеличения квантового содержания выброса медиатора из отдельной синаптической терминали при неизменной величине одного кванта.
Ключевые слова: калиевые каналы, онтогенез, синаптическая передача, квантовый анализ.

Vasilyev D. V. Voltage-gated potassium currents of neurons of rats: ontogenesis and role in inhibitory synaptic transmission. – Manuscript.
Thesis for PhD degree by specialty 03.00.02 – Biophysics. – Bogomoletz Institute of Physiology, Kiev, 1998.
The dissertation is devoted to investigation of the properties of voltage-gated potassium currents of neurons of rat during early postnatal development. The obtained results indicated that kinetic, steady-state and pharmacological properties of A-, DR- and K-types of potassium currents of DRG neurons did not differ significantly from that of hippocampal neurons. Mean densities of A- and DR- currents of DRG neurons increased while mean density of K-current decreased during first five days of postnatal development and did not change thereafter. Further investigation showed that in TTX-containing solution changes in potassium conductance of a single presynaptic terminal of cultured hippocampal neurons due to action of potassium channel blockers TEA or 4-AP lead to the increasing of the mean quantal content of transmitter release and did not change the value of a single quantum.
Key words: potassium channels, ontogenesis, synaptic transmission, quantal analysis.

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020