.

Поліаміни – маркери злоякісного росту і мішень для протипухлинної терапії (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5184
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ.
Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ЗАЛЄТОК СОФІЯ ПЕТРІВНА

УДК: 616-006. 04:577.218: 616-085

Поліаміни – маркери злоякісного росту і мішень для протипухлинної
терапії

14.01.07 ? онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ ? 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Науковий консультант ? доктор медичних наук, професор

Бердинських Ніна
Констянтинівна,

провідний науковий
співробітник відділу біохімії

пухлин Інституту
експериментальної патології,

онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН

України.

Офіційні опоненти: ? доктор біологічних наук

Кудрявець Юрій
Йосипович,

завідувач відділу
експериментальних клітинних систем

Інституту
експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є.
Кавецького НАН України;

? доктор медичних наук

Колесник Олена
Олександрівна,

провідний науковий
співробітник відділу бдомінальної

онкології Інституту
онкології АМН України;

? доктор біологічних наук,
професор

Матишевська Ольга
Павлівна,

професор кафедри біохімії
біологічного факультету

Київського національного
університету ім.Тараса

Шевченка.

Провідна установа ? Львівський національний медичний
університет

ім. Данила Галицького
МОЗ України, кафедра

онкології та медичної
радіології, м. Львів.

Захист відбудеться “28” березня 2007 р. о 13 годині 30 хвилин на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ, вул.Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького
НАН України.

Автореферат розісланий “27” лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук
Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Злоякісна трансформація пов’язана з порушенням
таких фундаментальних біологічних процесів як ріст, диференціювання та
запрограмована загибель клітин. Важливу роль у контролюванні цих
процесів відіграють низькомолекулярні ендогенні регулятори, особливе
місце серед яких належить поліамінам (ПА), низькомолекулярним
органічним полікатіонам, які відіграють унікальну роль в живих
організмах. За останні три десятиліття інтенсивного дослідження ПА
багато їх функцій в процесах нормального і злоякісного росту було
вивчено і розкрито. Встановлено, що ПА регулюють найважливіші
метаболічні процеси в клітині, зокрема, такі, як синтез нуклеїнових
кислот і білків, модифікують структуру мембран, впливають на
функціонування мембранозв’язаних ферментів (Tabor, Tabor, 1984; Cohen,
1998), а, згідно сучасних даних, беруть участь у передачі регуляторних
сигналів (Bachrach et al., 2001; Gerner, Meyskens, 2004).

Роль ПА в злоякісному рості інтенсивно досліджується в багатьох
провідних лабораторіях світу. Однак, багато питань щодо особливостей
метаболізму ПА та молекулярних механізмів їх дії при пухлинному рості ще
не розкриті і потребують подальшого детального вивчення. Конкретні
відповіді на ці питання мають важливе значення не тільки для розуміння
фундаментальних механізмів злоякісного росту, оскільки ПА абсолютно
необхідні для росту і проліферації клітин, але і тому, що агенти, які
регулюють метаболізм ПА можуть бути використані в клінічній онкології в
якості протипухлинних препаратів “таргетної” дії. Необхідно зазначити,
що в останні роки синтезовані різноманітні аналоги ПА і інгібітори
ферментів обміну ПА, частина з яких вже випробовується в онкологічних
клініках США, Японії, Франції і отримані обнадійливі результати
(Thomas, Thomas, 2001; Casero et al., 2005; Basuroj, Gerner, 2006). Але
проблема застосування інгібіторів/регуляторів метаболізму ПА ще далека
від вирішення, і потребує детального вивчення.

Відомо, що злоякісний ріст супроводжується накопиченням ПА не тільки в
пухлинах, а і в тканинах і біологічних рідинах організму, в якому
розвивається пухлина. Існує низка робіт, присвячених вивченню ПА як
діагностичних маркерів злоякісного росту (Russell et al., 1971; Russell,
1984; Залеток С.П., 1977; Bergeron et al., 1997; Yamaguchi et al., 2005;
Kawakita, Hiramatsu, 2006). Але питання щодо використання ПА як маркерів
ефективності терапії і прогнозу перебігу злоякісного процесу у
онкологічних хворих вивчено недостатньо. У світовій літературі є лише
поодинокі роботи, в яких представлено результати дослідження вмісту ПА
в біологічних рідинах онкологічних хворих в різні періоди розвитку
злоякісних пухлин (при прогресії, ремісії, рецидиві хвороби) (Балицька
О.В., 1992; Leveque et al., 2000; Hiramatsu et al., 2005), але і вони не
дали вичерпної відповіді на питання, наскільки доцільним може бути
використання показників вмісту ПА в сечі та крові в якості маркерів
ефективності традиційної хіміотерапії та для прогнозу перебігу
злоякісного процесу у онкологічних хворих.

Упродовж останніх років значна увага приділяється участі ПА у регуляції
процесів проліферації, росту та диференціювання клітин (Bachrach, 1996;
Cohen, 1998; Сяткін С.П., 1998; Morgan, 1999). Але молекулярні механізми
їх участі в цих процесах, зокрема, вплив ПА на експресію певних генів ще
залишаються в значній мірі нерозкритими. На цей час виявлено
взаємозв’язок між інтенсивністю метаболізму ПА в клітині і експресією
окремих онкогенів, наприклад, с-myc, c-jun (Tabib, Bachrach, 1999;
Bachrach et al., 2001; Jдnne et al., 2005; Hu et al., 2005), однак вплив
ПА на функціонування факторів транскрипції онкогенів вивчений дуже мало.
Це стосується, зокрема, і впливу ПА на функціонування ядерного фактора
транскрипції NF-кB, який, згідно сучасних уявлень, відіграє важливу роль
не тільки в процесах запалення і імунної відповіді, а і в розвитку
злоякісних пухлин, оскільки експресія багатьох клітинних генів, зокрема
онкогенів, залежить від активності цього фактора (Dejardin et al.,
1999; Karin et al., 2002). Механізми регуляції активності NF-кВ при
неопластичному рості вивчені недостатньо; практично нерозкритим
залишається зв’язок між метаболізмом ПА і активністю фактора
транскрипції NF-кВ в злоякісних клітинах, є лише поодинокі роботи,
присвячені вивченню цих питань (Shah et al., 1999; Shah et al., 2001).

Таким чином, дослідження особливостей метаболізму та молекулярних
механізмів участі ПА в неопластичному рості є важливим напрямком
сучасної фундаментальної онкології. Результати таких досліджень можуть
знайти застосування в практичній онкології, зокрема для розробки
протипухлинних препаратів “таргетної” дії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Роботу
виконано в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України у відділі біохімії пухлин в
рамках планових науково-дослідних робіт (номери держреєстрації:
№01.88.0008001; №А01004449Р; №0100U00652; №0103U000786; шифр 2.2.5.206,
№0194017036; шифр 2.2.5.218; №0197U006233; шифр 2.2.5.232, №0103U000786
). Частину роботи виконано за підтримки фонду CRDF (США), грант
UВ1-2446-КV-02; МОН України, грант №Ф7/428-2001; гранту НАН України
(програма “Дослідження у галузі сенсорних систем і
технологій”);Українського науково-технологічного центру , грант Gr-122j.

Мета дослідження: Встановити особливості метаболізму та молекулярні
механізми дії ПА при канцерогенезі і пухлинному рості, з’ясувати
прогностичну значимість показників обміну ПА та обгрунтувати доцільність
використання інгібіторів метаболізму ПА для протипухлинної терапії.

Задачі дослідження:

Дослідити особливості метаболізму ПА при хімічному гепатоканцерогенезі,
індукованному N-нітрозодиетиламіном (N-НДЕА), і канцерогенезі кишковика,
індукованному 1,2-диметилгідразином (1,2-ДМГ), у експериментальних
тварин.

Визначити вміст ПА та активність ключового ферменту їх біосинтезу ?
орнітиндекарбоксилази (ОДК) в пухлинах шлунково-кишкового тракту людини.

Визначити вміст ПА та активність ключового ферменту їх біосинтезу ? ОДК
в пухлинах грудної залози людини.

Визначити вміст ПА в сечі та їх концентрацію в сироватці крові хворих на
злоякісні лімфоми, рак яєчника та рак грудної залози в динаміці
захворювання (в активну фазу, при ремісії та при рецидиві захворювання).

Довести можливість застосування показників вмісту ПА в біологічних
рідинах онкологічних хворих (ПА-тесту) для оцінки ефективності терапії і
прогнозу перебігу пухлинного процесу.

З’ясувати молекулярні механізми дії ПА при пухлинному рості: їх вплив
на активність фактора транскрипції NF-кB.

Дослідити вплив модуляції метаболізму ПА в пухлинах на експресію
білкових продуктів генів, які регулюються NF-кB.

Визначити показники обміну ПА в експериментальних пухлинах при
формуванні резистентності до цисплатину.

B експериментах in vivo дослідити протипухлинну дію інгібіторів синтезу
ПА та обгрунтувати перспективність їх використання для терапії
онкологічних хворих.

Об’єкт дослідження: перещеплювані асцитні і солідні пухлини щурів і
мишей (карцинома молочної залози Са 755, карциносаркома Уокер
(Walker–256), карцинома Л’юїс, гепатома Г-27, чутливі і резистентні до
дії доксорубіцину і цисплатину субштами карциноми Герена, асцитний рак
Ерліха, лімфолейкоз L1210, лімфома Nk/ly), клітинна лінія раку грудної
залози людини MCF-7; печінка і слизова оболонка кишковика та індуковані
N-нітрозодиетиламіном (N-НДЕА) і 1,2-диметилгідразином (1,2-ДМГ) пухлини
печінки і кишковика щурів; операційний матеріал (пухлини та
макроскопічно незмінена тканина грудної залози; пухлини і макроскопічно
незмінена слизова оболонка шлунково-кишкового тракту); кров і сеча
хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника, рак і доброякісні пухлини
грудної залози та практично здорових людей.

Предмет дослідження – вміст ПА і активність ферментів їх метаболізму в
екпериментальних пухлинах і пухлинах людини, вміст ПА в сечі і крові
онкологічних хворих та практично здорових людей; протипухлинна
активність інгібіторів метаболізму ПА; вплив ПА на активність класичного
фактора транскрипції NF-кB (р50/р65) та на взаємодію фактора
транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК(NRE); експресія
білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, в експериментальних
пухлинах молочної залози в умовах модуляції метаболізму ПА .

Методи дослідження: в роботі використані методи експериментальної
онкології (індукція пухлин хімічними канцерогенами; оцінка швидкості
росту пухлин і тривалості життя експериментальних тварин; отримання
резистентних до хіміопрепаратів штамів пухлин); методи виділення ядер та
плазматичних мембран; методи препаративної біохімії: екстракція, діаліз,
ультрацентрифугування; для визначення вмісту ПА використовували методи
тонкошарової (ТШК), рідинної хроматографії високого тиску (РХВТ) та
методи електрофорезу на папері; для визначення активності ферментів
метаболізму ПА використано біохімічні і радіоізотопні методи; для
теоретичного обгрунтування впливу ПА на процес транскрипції застосовано
методи комп’ютерного моделювання і молекулярного докінгу; для оцінки
впливу ПА на зв’язування фактора транскрипції NF-кB з

відповідними послідовностями ДНК використано метод поверхневого
плазмонного резонансу (ППР) і флюоресцентний метод безвипромінювального
переносу енергії (FRET); для оцінки активності фактора транскрипції
NF-кB використано метод трансфекції; для оцінки експресії білків NF-кB і
білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, застосовано методи ППР,
гель-електрофорезу, Вестерн-блот аналіз.

Наукова новизна. В результаті комплексних досліджень отримані нові дані
про особливості метаболізму ПА при хімічному канцерогенезі, які
показують, що процесу малігнізації передують глибокі зміни метаболізму
ПА, котрі проявляються в різкому зростанні активності ОДК (ключового
фермента біосинтезу ПА), зниженні активності фермента катаболізму ПА
(диаміноксидази (ДАО) і значному збільшенні вмісту ПА (путресцину і
спермідину) в тканинах-мішенях. Вперше виявлено, що при
N-НДЕА-гепатоканцерогенезі та при 1,2-ДМГ канцерогенезі кишковика має
місце двофазна інтенсифікація синтезу і накопичення ПА в тканині та
субклітинних фракціях (плазматичних мембранах і ядрах) органів-мішеней:
в ранню (1-4 тижні) і пізню (5-6 місяці) стадії, що свідчить про участь
ПА в ініціації злоякісного росту і неопластичній трансформації клітин
печінки та кишковика. Виявлено, що високий рівень ПА зберігається і в
сформованих пухлинах.

Вперше виявлено зворотню залежність між величиною активності ОДК і
ступенем диференціювання аденокарцином шлунково-кишкового тракту людини.

Проведена оцінка довготривалої (до 4-х років) динаміки вмісту ПА
(ПА-тест) в сечі та сироватці крові у хворих на рак грудної залози,
злоякісні лімфоми та пухлини яєчника. Виявлено, що ПА-тест відображає
перебіг пухлинного процесу: при ремісії спостерігається нормалізація
рівнів ПА в біологічних рідинах, а їх підвищення передує клінічним
проявам рецидиву захворювання.

Виявлено, що введення тваринам з екпериментальними пухлинами синтетичних
(б-дифторметилорнітину, б-ДФМО і полігексаметиленгуанідину, ПМГ) і
природних (поліфенолів зеленого чаю) інгібіторів ОДК призводить до
зниження вмісту ПА в пухлинах, що супроводжується значним гальмуванням
росту пухлин і істотним збільшенням тривалості життя тварин. Показано,
що ПМГ має потужні протилейкозні властивості і, в залежності від дози і
схеми його введення, призводить до значного збільшення тривалості життя
тварин з лімфолейкозом L 1210. Встановлено, що механізм дії ПМГ
пов’язаний не тільки з його прямою інгібіторною дією на ОДК, а і з
впливом на (-глутамілтранспептидазу ? фермент, який бере участь в
регуляції ОДК.

Доведено, що одним із механізмів дії ПА при пухлинному рості є їх
регулюючий вплив на активацію фактора транскрипції NF–кB і експресію
білкових продуктів NF–кB-залежних генів, залучених в пухлинний процес
(c–myc, Bcl–Xl, ОДК). Вперше показано, що за присутності ПА підвищується
спорідненність білка р50 (субодиниці NF-кB) до специфічної послідовності
ДНК за рахунок утворення додаткових електростатичних і водневих
зв’язків, що підтвердило можливість регуляції ПА транскрипції,
контрольованої NF-кB. В експериментах in vitro продемонстровано, що ПА
підвищують зв’язування фактора транскрипції NF-кB з відповідними
ДНК-послідовностями; в дослідах in vivo показано, що в умовах деплеції
ПА активність фактора NF-кB в пухлинних клітинах молочної залози,
знижується. Виявлено, що механізм протипухлинної дії поліфенолів
зеленого чаю пов’язаний з його гальмівною дією на синтез ПА і активацію
фактора транскрипції NF-кB.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про багаторазове
підвищення активності ОДК і вмісту ПА в пухлинах шлунково-кишкового
тракту і грудної залози людини свідчать, що інтермедіанти обміну ПА
можуть бути мішенню для терапії злоякісних пухлин. Ці дані, поряд з
результатами експериментальних досліджень про протипухлинну дію
синтетичних та природних інгібіторів метаболізму ПА, стали основою для
обґрунтування можливості використання досліджуваних інгібіторів
метаболізму ПА для „таргетної” терапії онкологічних хворих.

Встановлена в аденокарциномах шлунково-кишкового тракту залежність між
рівнем активності ОДК і ступенем їх диференціювання може бути
використана як один із маркерів ступеня злоякісності пухлин травного
тракту людини.

На основі тривалих (в різні фази захворювання) досліджень вмісту ПА в
сечі і крові хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника і грудної залози
розроблено і клінічно апробовано поліамінний тест (ПА-тест), чутливість
якого становить 80-90%. Встановлена кореляція між результатами ПА-тесту
і активністю пухлинного процесу та ефективністю терапії, свідчить про
перспективність практичного використання тесту у хворих на злоякісні
пухлини яєчника, грудної залози та злоякісні лімфоми. Цей тест
рекомендовано в практику онкологічних установ.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом обґрунтовано мету і сплановано
завдання дисертаційної роботи, запропоновано підходи до їх виконання.
Автором особисто проведено експерименти по індукції та перещепленню
пухлин, проведено забір біологічного матеріалу у тварин; збір
післяопераційних зразків пухлин та зразків крові і сечі у онкологічних
хворих; автором особисто проведено визначення вмісту ПА та активності
ферментів їх метаболізму в зразках експериментального та клінічного
матеріалу. Автором модифіковано метод визначення ПА в сечі і крові,
розроблено і апробовано на великому контингенті онкологічних і
неонкологічних хворих ПА-тест. Автору належить ідея про залучення ПА в
процес експресії онкогенів шляхом прямого впливу на зв’язування фактора
транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК. Автор брала
участь у розробці способів імобілізації біологічних молекул на поверхні
сенсорних чіпів спектрометра ППР для дослідження впливу ПА на
міжмолекулярну взаємодію NF-кB~ДНК. Автором особисто проведено
дослідження активності NF-кB за допомогою метода трансфекції. Автором
самостійно проведено аналіз отриманих результатів, сформульовано усі
положення та висновки дисертаційної роботи, самостійно підготовлені до
друку публікації, що відображають результати дисертації.

Апробація роботи. Матеріали роботи були представлені та обговорені на:
Міжн. конф. “Polyamines in Life Sciences” (Токіо, 1986); Міжн. конф.
“Пухлинні маркери в онкології” (Київ, 1990); Міжн. конф. “Polyamines in
Molecular and Medical Biology” (Кіото, 1990); ІІ з’їзді онкологів СНД з
участю вчених Європи, Азії, Америки (Київ, 2000); Х з’їзді онкологів
України (Ялта, 2001); 28-му з’їзді Федерації європейських біохімічних
товариств (Стамбул, 2002); III з’їзді онкологів і радіологів СНД
(Мінськ, 2004); І-му Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004); конференції ”Дослідження у галузі
сенсорних систем та технологій” (Київ, 2005); Міжн. конф. “Food,
Nutrition and Cancer” (Вашингтон, 2005); ХІ з’їзді онкологів України
(Судак, 2006); Міжн. конф. “Role of Polyamines and their Analogs in
Cancer and other Diseases” (Рим, 2006).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено в 40
публікаціях, в тому числі 1 монографії, 23 статтях у провідних фахових
виданнях, 1 методичних рекомендаціях, 1 деклараційному патенті на
винахід та у 14 тезах доповідей у матеріалах вітчизняних та міжнародних
конгресів, з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 269 сторінках
машинописного тексту. Дисертаційна робота складається із вступу, 2
розділів огляду літератури, розділу матеріалу і методів дослідження, 5
розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень,
висновків та списку літературних джерел (345 посилань), з них 28 на
українській та російській мовах, 317 на англійській та німецькій мовах.
Дисертація містить 52 таблиці та 47 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана
на 1500 експериментальних тваринах (білих нелінійних щурах та щурах
лінії Wistar, віком 2?3 місяці, масою 80-150г; нелінійних мишах, мишах
лінії С57Вl та мишах-гібридах BDF1, віком 2-2,5 міс, масою 18-20г)
розводки віварію Інституту експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, керуючись міжнародно
прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.

Використовували такі моделі хімічного канцерогененезу: канцерогенез
печінки, викликаний N-НДЕА, і канцерогенез кишковика, викликаний
1,2-ДМГ. Індукцію гепатом проведено на білих нелінійних щурах-самцях 2-х
місячного віку, масою 80-100г, які отримували з питною водою N-НДЕА в
концентрації 0,025%. Контрольні тварини того ж віку і статі ?
неканцерогений аналог диетиламін (ДЕА) в концентрації 0,025%.
Дослідження проводили в ранній період гепатоканцерогенезу (1-4 тижні) та
через 2, 3, 4, 5, 6 місяців. З тканини печінки і пухлин одержували
субклітинні фракції (ядерну, плазматичних мембран і цитозольну).
Виділення фракції плазматичних мембран виконували у градієнті сахарози
за методом Neville (1960), для виділення фракції ядер використовували
метод Рennial et al. (1964).

Канцерогенез кишковика. Дослідження проведені на білих нелінійних
щурах-самцях, масою 80-100г. Для індукції пухлин кишковика тваринам один
раз на тиждень протягом 6 місяців підшкірно вводили 1,2-ДМГ в дозі 20
мг/кг маси (Пожарисский, 1972). Дослідження проводили в процесі індукції
пухлин (через 1, 2, 3, 4, 5 місяців після початку введення канцерогена)
та в індукованих пухлинах. Об’єктом дослідження були гомогенат і
цитозоль слизової оболонки тонкого та товстого кишковика.

Моделі експериментальних пухлин: перещеплювані асцитна карцинома Ерліха
(АРЕ), лімфома NK/ly, лімфолейкоз L1210, а також їх резистентні до
цисплатину субштами, які отримували шляхом багаторазового введення
тваринам з перещепленими пухлинами цисплатину (ЦсП), (ЕБЕВЕ,
Арцнайміттель, Унтерах, Австрія); вихідні та резистентні до цисплатину і
доксорубіцину субштами карциноми Герена (резистентні субштами карциноми
Герена були люб‘язно надані канд. біол. наук І.М.Тодором (відділ
механізмів протипухлинної терапії); карциносаркома Уокер, аденокарцинома
Са755, карцинома Л’юїс, гепатома Г-27.

Протипухлинну дію інгібіторів обміну ПА досліджували у тварин з
перещепленими асцитними (рак Ерліха, лімфолейкоз L1210, лімфома NK/ly та
їх резистентні до цисплатину субштами) і солідними пухлинами
(карциносаркома Уокер, карцинома Л’юїс, гепатома Г-27). В якості
синтетичних інгібіторів біосинтезу ПА використовували: б-ДФМО (”Serva”,
USA) та ПМГ, синтезований в Інституті органічного синтезу АН Латвії і
люб’язно наданий академіком АН Латвії М.Лідаком; в якості природних
інгібіторів ? суміш поліфенолів зеленого чаю, вироблену в Інституті
біохімії і біотехнології ім.С. Дурмішидзе АН Грузії.

Для теоретичного обгрунтування можливості впливу ПА на процес
транскрипції використано методи комп’ютерного моделювання. Пошук
потенційних сайтів зв’язування NF-кВ з ПА проводили методом гнучкого
молекулярного докінгу за допомогою програми “Аutodock vЗ.5″ та ригідного
докінгу (програма НЕХ 2.4). Просторові структури ПА будували за
допомогою програми АgrusLab 1.0. Структуру NF-кВ одержали із
брукхенівської бази даних білків (Рrоtein Data Ваnк). Моделювання
механізму впливу ПА на функціонування NF-кВ проводили згідно програми
МОІL2000. На всіх етапах, як допоміжна, використовувалась програма
АgrusLab.

Для оцінки впливу ПА на зв’язування фактора транскрипції NF-кB з
відповідними послідовностями ДНК застосовано метод поверхневого
плазмонного резонансу (ППР) і метод флюоресцентного безвипромінювального
переносу енергії (FRET). Метод ППР. Використано спектрометри ППР
„Biosuplar-5″ та “Plasmon SPR-05” і супутнє обладнання (сенсорні чіпи,
проточні кювети), розроблені в Інституті фізики напівпровідників НАН
України. Сенсорні чіпи піддавали спеціальній обробці, яка включала
нанесення на чіп проміжного шару (соєвого інгібітора трипсину, СІТ). На
проміжний шар іммобілізували р50-субодиницю; для блокування залишкових
альдегідних груп використовували етаноламін; послідовності ДНК вносили
до кювети в буфері Дігнама (Dignam, 1983).

Метод FRЕТ. У якості донора та акцептора використовували флуоресцентні
барвники родамін В (RВ) і Техаs Red (ТR), відповідно. Перший був
ковалентно приєднаний до білка р50, другий ? до 3′-кінця одного з
ланцюгів штучно синтезованих дволанцюгових олігонуклеотидів NRE:
(послідовність одного з комплементарних ланцюгів:
5′-АСGGСАGGGGАТТСССТСТ-3′). Олігонуклеотиди одержано в Інституті
молекулярної біології Російської академії наук (комерційний препарат).
Ефективність FRЕТ визначали за співвідношенням інтегральних
інтенсивностей піків емісії TR (615 нм) та RВ (575 нм), які було
визначено після розкладання спектрів на компоненти за допомогою програми
„Siano”.

Дослідження впливу ПА на активність фактора транскрипції NF-кB та
експресію білкових продуктів генів, залежних від NF-кB проведено на
перещеплюваних пухлинах молочної залози (карциносаркомі Уокер і
карциномі Са755) та на клітинній лінії раку грудної залози людини
MCF-7. Для виснаження пулу ПА в пухлинах використовували інгібітори ОДК
? б-ДФМО та ПМГ. Інгібітори вводили тваринам внутрішньоочеревинно в
дозі: 500 – 1000 мг/кг маси (б-ДФМО) та 10-15 мг/кг маси (ПМГ) на 1
ін’єкцію, виконували 2-5 ін’єкцій. Через добу після останньої ін’єкції
тварин забивали під ефірним наркозом, пухлини видаляли, зважували та
використовували для досліджень. Клітини MCF-7 культивували на середовищі
Dulbecco-ISCOV (“Sigma”, USA) з додаванням 10% ембріональної телячої
сироватки (“Сяйво”, Львів, Україна) та антибіотикa гентаміцину (в
концентрації 40 мкг/мл) при температурі 370С та при насиченні повітря 5%
СО2 в культуральних флаконах об’ємом 150 см2 (“Sigma”, USA), що містили
20 мл середовища. Для виснаження/накопичення пулу ПА в клітинах MCF-7 в
культуральне середовище вносили б-ДФМО (5мМ) або б-ДФМО (5мМ) +
путресцин (5Ч10-7M). З цими агентами клітини культивували протягом 72
годин, потім клітини механічно збирали, двічі промивали ізотонічним
розчином NaCl і використовували для приготування ядерних та клітинних
екстрактів, які готували за методом Sovak et al.(1997).

Для оцінки експресії білків NF-кB і білкових продуктів генів, залежних
від NF-кB, застосовано методи ППР, гель-електрофорезу та Вестерн-блот
аналіз.

При використанні методу ППР на нанесений на сенсорний чіп проміжний шар
(СТІ), іммобілізували моноклональні антитіла мишей проти досліджуваного
білка (Santa Cruz Biotech., СА, USA) в концентрації 2 мкг/мл у 0,01М
натрій-ацетатному буфері, рН 5,5, після іммобілізації антитіл кювету
промивали цим же буфером, Для блокування залишкових альдегідних груп до
кювети ППР вносили 0,1М розчин етаноламіну в 0,05М натрій-фосфатному
буфері, рН 7,3; надалі в кювету вводили ядерний (або клітинний)
екстракт, який містив 10-100 мкг загального білка в буфері 10мМ НЕРЕS,
150мМ NaС1, 0,1% Tween-20. При інтерпретації даних, одержаних методом
ППР, вважали, що зміна кута ППР (“відгук ППР”) прямо пропорційна
поверхневій концентрації білка.

Аналітичний гель-електрофорез (SDS-PAGE) виконували за модифікованою
методикою Леммлі (1970). Використовували такі буферні розчини: анодний
буфер: 0,2М трис-НС1, рН 8,9; катодний буфер: 0,1М трис, 0,1М трицин, рН
8,25; буфер для концентруючого гелю: 0,71М трис-НСІ, рН 8,45, 0,1% SDS;
буфер для розділяючого гелю: 1М трис-НСІ рН 8,45, 0,1% SDS; акриламід та
метилен-біс-акриламід – у вигляді „Асrуl/Віs 37,5: 1 Sоlution 30%”
(“Аnachem”, USA). Смуги білків забарвлювали Кумасі блакитним R-250
(„Sigma”, USA). Використовували маркери молекулярної маси “Ultra–low
Range Molecular Weight Маrkеr (1,06-26,6)” (“Sigma”, USA).

Вестерн-блот аналіз проводили за методом Tsang et al (1983), білки після
електрофорезу переносили на нітроцелюлозну мембрану Нуbond ECL
(Аmersham Pharmacia Biotech, Швеція). Після блокування вільних місць
зв’язування за допомогою знежиреного молока, мембрану поміщали на 4
години при 370С у розчин моноклональних антитіл миші проти досліджуваних
білків (Santa Cruz Biotech., СА, USA), а потім у розчин вторинних lgG
кози проти антитіл миші, кон’югованих з пероксидазою хріну (Santa Cruz
Biotech., СА, USA). Після цього мембрану інкубували в системі детекції
ЕСL (Santa Cruz Biotech., СА, USA) (0,125 мл кожного реагенту ЕСL на
1см2 мембрани). Після 2-хв інкубації рентгенівську плівку („Фотон”,
Україна) прикладали до мембрани. Дані Вестерн-блотингу було
проаналізовано за допомогою комп’ютерної програми TotalLab.

Для оцінки активності фактора транскрипції NF-кB в пухлинах молочної
залози використано метод трансфекції. В клітини MCF-7 трансфектували
1мкг NF-кB–люциферазної плазміди (LipofectAMINE, USA) згідно протоколу
виробника (Invitrogen, USA).? Для контролю ефективності до кожної
трансфекції була включена рCMV-в-gal плазміда (0,4мкг). Через добу після
трансфекції середовище видаляли, клітини відмивали і інкубували в
свіжому середовищі з або без 5мМ б-ДФМО на протязі 24 год. Активність
в-галактозидази визначали згідно протоколу виробника (Invitrogen, USA).

Клінічний матеріал. Зразки пухлин грудної залози та пухлин
шлунково-кишкового тракту було отримано у відділеннях пухлин молочної
залози та абдомінальної онкології Інституту онкології АМН України. Всі
хворі були проінформовані про дослідження і дали згоду на їх проведення.

Досліджено післяопераційний матеріал 52 хворих з пухлинами грудної
залози: 36 хворих на рак грудної залози (у 26 хворих була встановлена
ІІ-а стадія захворювання; у 10 – ІІІ-я стадія), 9 хворих на фіброаденоми
та 7?на локалізований вузловий фіброаденоматоз. Досліджено
післяопераційний матеріал 95 хворих з пухлинами шлунково-кишкового
тракту: 36 хворих з пухлинами шлунка (ІІІ стадія ?30 чол., IV стадія ?6
чол); 25 хворих з пухлинами ободової кишки (ІІІ стадія ?18 чол., IV
стадія ?7 чол.); 34 хворих –з пухлинами прямої кишки (ІІІ стадія ?20
чол., IV стадія ?14 чол.). За гістологічними ознаками пухлини
шлунково-кишкового тракту віднесені до аденокарцином. За ступенем
диференціювання аденокарциноми були розділені на високо-, помірно- і
малодиференційовані.

Для визначення біохімічних показників зразки операційного матеріалу
швидко заморожували у рідкому азоті. У зразках пухлинної тканини,
тканини, що межує з пухлиною та макроскопічно незміненій тканині
визначали активність ОДК, ДАО та вміст ПА.

Дослідження щодо інформативності ПА-тесту як маркера ефективності
лікування хворих і прогнозу перебігу злоякісного процесу було проведено
на зразках крові і сечі 158 хворих з пухлинами грудної залози (118
хворих на рак грудної залози і 40 ? з доброякісними пухлинами грудної
залози), 140 хворих на рак яєчника і 167 хворих на лімфоми. В якості
контролю досліджено екскрецію ПА з сечею та їх концентрацію у сироватці
крові практично здорових людей (90 чол.). Обстежені хворі знаходились на
лікуванні у відділеннях пухлин молочної залози, онкогінекології та
відділенні системних захворювань Інституту онкології АМН України. Всі
хворі були проінформовані про дослідження і дали згоду на їх проведення.

Екскрецію поліамінів (вміст ПА у сечі за добу) та їх концентрацію у
сироватці крові визначали у хворих до, під час і після лікування
(хіміотерапії чи після хірургічного видалення пухлин), при
профілактичних обстеженнях, при появі рецидиву захворювання.

Визначення вмісту поліамінів в гомогенатах пухлин та нормальних тканин,
субклітинних фракціях, ядерних і клітинних екстрактах пухлин і сироватці
крові виконано за допомогою методів тонкошарової хроматографії
(Abdel-Monem, Ohno, 1975) та високоефективної рідинної хроматографії
високого тиску (Seiler, Knodgen, 1980), в сечі ? методами хроматографії
на папері (Raina, 1967) та тонкошарової хроматографії (Abdel-Monem,
Ohno, 1975). В якості стандартів використовували гідрохлориди ПА:
спермін 4НCl; спермідин 3НCl; путресцин 2НCl („Serva”, USA).

Визначення активності ОДК в зразках експериментальних пухлин
(субклітинних фракціях, ядерних і клітинних екстрактах) та
післяопераційних зразках пухлин і макроскопічно незмінених тканин людини
проводили радіометричним методом (Russell, Snyder, 1968) та методом
Сяткіна С.П., Березова Т.Т. (1980); активність ДАО визначали за методом
Aarsen, Kemp (1964). Активність ферментів виражали у одиницях активності
на 1 мг білка.

Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за допомогою методів
Braddford (1976) та Greenberg і Craddock (1982).

Для статистичної обробки результатів дослідження використано методи
варіаційної статистики (Лакін, 1990) та непараметричні методи оцінки
(Гублер, Генкин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження показників обміну ПА при хімічному канцерогенезі у щурів.
Дослідження виконані на 2 моделях канцерогенезу:
N-НДЕА-гепатоканцерогенезі та канцерогенезі кишковика, індукованого
1,2-ДМГ. При гепатоканцерогенезі вміст поліамінів визначали в
гомогенатах печінки, цитозолі та субклітинних фракціях, ядрах та
плазматичних мембранах, активність ОДК – в цитозолі та ядрах.

Найбільш виражені зміни вмісту ПА і активності ОДК в печінці
спостерігались в ранній період канцерогенезу (протягом І-го місяця) і в
індукованих N-НДЕА пухлинах печінки. Так, у цитозольній фракції клітин
печінки вже через І тиждень виявлено зростання активності ОДК,
максимальних значень активність ОДК досягала через 2 тижні, надалі цей
показник знижувався, але залишався вищим, ніж в контролі (табл.1).

Таблиця 1

Активність ОДК (нмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг
білка)

у цитозолі печінки щурів в ранній період N-НДЕА-гепатоканцерогенезу,
(М ( m).

Об’єкт Термін

(тижні) Активність ОДК Вміст ПА

Путресцин Спермідин Спермін

Печінка тварин, що отримували канцероген 1 1,10 ( 0,20* 3,20 ( 1,0*
15,60 ( 0,50* 3,30 ( 0,70

2 1,62 ( 0,06* 4,65 (1,26* 25,50 ( 2,95* 2,00 ( 0,63

3 1,48 ( 0,11* 4,40 (0,57* 17,70 ( 0,68* 1,93 ( 0,01

4 0,95 ( 0,08* 3,20(0,05* 12,23 ( 2,23* 1,57 ( 0,11*

Печінка контрольних тварин 0,63 ( 0,09 1,6 ( 0,15 6,60 ( 0,82 2,20 (
0,30

*P i? Oe O L ? ‚ „ † † ?   c ¤ O ??6 Ue ?? h ???????¤???? & F 1/4 ”y§ i ”y§ i ”y§ i ”y§ i ”y§ i ”yi ?? ?? ?kde ??????? | ??? h H h H h ?? ???? ?А IV Б Спермін 4,92±1,14 1,72±0,35 1,96±0,87 4,24±2,23 3,90±1,70 4,34±2,8 Спермідин 9,92 ±1,34 12,92±1,32 7,24±1,55 11,41±1,5 11,90±0,99 13,19±2,0 Путресцин 7,56 ±1,77 14,08±0,75 8,40±1,65 6,39±1,56 11,56±1,56 13,39±3,5 Кадаверин 0,75 ± 0,50 2,0 ± 0,58 ? 1,33 ± 0,76 3,36 ± 1,78 0,63±0,63 ? ПА* 23,15±1,99 30,7±3,85 17,6 ±3,38 23,37±3,2 30,72 ±3,84 31,55±4,8 Примітка. *? ПА ? сумарна кількість поліамінів в сечі за добу При ефективному лікуванні кількість ПА в сечі і сироватці крові у хворих на злоякісні лімфоми в перші дні лікування зростала (що, згідно сучасних поглядів, свідчить про загибель пухлинних клітин і виділення з них ПА), а потім істотно знижувалась. Якщо лікування було неефективним, зберігався початковий (виявлений до лікування) рівень ПА. Встановлено, що у більшості хворих на злоякісні лімфоми в стані ремісії вміст ПА в сечі і сироватці крові був суттєво знижений, а при рецидиві захворювання ? підвищений. Отримані дані підтверджують доцільність використання показників вмісту ПА в біологічних рідинах для оцінки ефективності лікування і прогнозу захворювання у хворих на злоякісні лімфоми. ПА в біологічних рідинах у хворих на пухлини яєчника. Встановлено, що сумарна кількість ПА в сечі за добу (?ПА) у хворих на рак яєчника в 3,2 рази вища, в порівнянні з показниками у практично здорових жінок (?ПА=20,52(1,62 і 6,48(0,53 мг/добу, відповідно). Найвищу кількість ПА в сечі виявлено у хворих на первинно множинний рак яєчника (?ПА=26,72(3,54 мг/добу). У тих випадках, коли перебіг захворювання ускладнювався накопиченням асцитної рідини, показники екскреції ПА з сечею у таких хворих були невисокі (?ПА=11,34 (0,83 мг/добу). Об'єм сечі за добу у цих хворих складав 200-350 мл, а об’єм асцитної рідини ? 2-6 л. Аналіз зразків асцитної рідини показав, що концентрація ПА в ній висока. Так, концентрація спермідину в окремих випадках досягала 8,7 мкг/мл, що свідчить про гіперпродукцію ПА і накопичення їх в асцитній рідині. Окрім цього, відмінності у концентрації спермідину в сироватці крові у хворих на рак яєчника з асцитом і без нього були незначні. Це свідчить про те, що в тих випадках, коли перебіг захворювання супроводжується накопиченням асцитної рідини, концентрація спермідину в сироватці крові несе більш об'єктивну інформацію ніж вміст ПА у сечі. Встановлено, що у хворих на рак яєчника, як і у хворих на злоякісні лімфоми екскреція ПА з сечею та концентрація їх у крові корелюють з ефективністю лікування. При ефективній хіміотерапії, в перші 48?72 години після її початку спостерігали значне збільшення екскреції ПА з сечею та концентрації їх у крові (що свідчить про загибель пухлинних клітин і виділення з них ПА), надалі ці показники знижувались. При відсутності ефекту лікування екскреція ПА з сечею та їх концентрація в сироватці крові в ці терміни не знижувались, а, навпаки, підвищувались. Збереження початкового рівня ПА або його зниження в цей період указує на те, що пухлина нечутлива до хіміопрепарата. Виявлено, що більш інформативним для оцінки ефективності лікування є величина співвідношення спд2/пут2 спд1/пут1 , де спд1 і пут1 ? рівні спермідину і путресцину в сечі до лікування; спд2 і пут2 ? через 48 годин після початку лікування. При успішній терапії величина цього співвідношення (індексу) вища за 1,25; а при неефективній – нижча (рис.3). При обстеженні хворих на рак яєчника в процесі лікування виявлено пряму залежність між величиною цього індексу і клінічною оцінкою стану хворих: у 78% випадків встановлена повна відповідність між передбачуваним (на підставі величини даного індексу) результатом лікування і клінічною оцінкою ефективності проведеного курсу лікування. Результати дослідження вмісту ПА в сечі хворих на протязі 1?4 років показали, що зміни в екскреції ПА корелюють з перебігом пухлинного процесу: при ремісії вміст ПА в сечі хворих на рак яєчника значно нижчий, ніж при прогресуванні, рецидиві або генералізації процесу. Рис.3. Величина співвідношення спд2/пут2 спд1/пут1 у хворих з пухлинами яєчника в залежності від ефективності лікування. У ряді випадків, на фоні уявного “клінічного благополуч-чя”, результати ПА?тесту дозволили при-пустити наявність прогресії захворювання до його клінічних проявів. ПА сечі у хворих на пухлини грудної залози. Результати дослідження вмісту ПА у сечі хворих на рак грудної залози показали, що існує залежність між цим показником і ефективністю лікування. При променевій і хіміотерапії виділення ПА з сечею в перші дні лікування збільшувалось, а при досягненні терапевтичного ефекту знижувалось, у деяких хворих навіть до нормальних величин. Визначення вмісту ПА в сечі хворих на протязі 1,5?2 років показало, що при ремісії рівні ПА в сечі були значно нижчі порівняно з такими при прогресії захворювання (рис.4). Рис. 4. Екскреція ПА у хворих на рак грудної залози при прогресуванні захворювання і ремісії (а – І стадія; б – ІІ стадія; в – ІІІ стадія; г – IV стадія); по осі ординат – екскреція ПА з сечею; (на осі ординат ? ?ПА, мг/24 год); *Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020