НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

СКЛЯР ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 579.222.6

Особливості енергетичного обміну штамів neisseria gonorrhoeae з різною
стійкістю до антибіотиків

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології
Дніпропетровського національного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Вінніков Альберт Іванович,

Дніпропетровський національний університет,

завідувач кафедри мікробіології та вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник

Пирог Тетяна Павлівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів

доктор медичних наук, професор

Кременчуцький Геннадій Миколайович

Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри
мікробіології,

вірусології та імунології

Провідна організація: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет
Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “21 ” вересня 2005 року о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту дисертацій при
Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
за адресою: Д 03680 Київ ГСП, вул. Академіка Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології

і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 Київ
ГСП, вул. Академіка Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано 11 серпня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема стійкості до антибіотиків є актуальною як
для мікробіології, так і для медицини в цілому. Незважаючи на велику
кількість досліджень у даній галузі, проблема далека від розв’язання.
Відкриття і застосування нових антибіотиків проблему не вирішує. Шляхи
її вирішення пов’язані з детальним вивченням біології патогенних
мікроорганізмів, пошуком факторів, що знижують резистентність. Все це
відкриває нові можливості та підходи у раціональній антибіотикотерапії
інфекційних захворювань. Особливе значення це має по відношенню до
штамів гонококів, які спричиняють різні інфекційні захворювання, котрі
впливають на статеву систему людини (Коляденко, 1993).

Поява все більшої кількості резистентних штамів гонокока, на думку ряду
авторів, пов’язана з пластичністю метаболічних реакцій, котрі лежать в
основі біохімічних механізмів стійкості (Knapp, 1999; Кубанова, 2004).
Дані літератури стосовно генерації протонрушійної сили, величини її
компонентів (мембранного потенціалу і концентраційного градієнту
протонів, генераторів трансмембранного електрохімічного потенціалу іонів
водню, динаміці синтезу АТФ при наведенні мембранного потенціалу і
градієнту протонів) у штамів Neisseria gonorrhoeae з різною стійкістю до
антибіотиків, відсутні. Що стосується функціонування Н+-АТФазного
комплексу, то є лише поодинокі роботи, присвячені ультрацитохімічному
вивченню АТФази у клітинах штамів гонокока (Дмитриев, 1987).

Все це свідчить про те, що стійкість до антибіотиків є складним
біологічним явищем, пов’язаним з еволюцією патогенних бактерій та
метаболізмом мікробної клітини. Тому необхідне всебічне вивчення
фізіолого-біохімічних властивостей, реакцій енергетичного обміну у
чутливих та стійких до антибіотиків штамів гонокока з метою пошуку
високоефективних препаратів, які підвищують ефективність боротьби з
ними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлені
дослідження є частиною роботи, яка виконується на кафедрі мікробіології
та вірусології Дніпропетровського національного університету в рамках
програми науково-дослідної держбюджетної теми № 4-031-03
“Фізіолого-біохімічні процеси, які лежать в основі синтезу біологічно
активних речовин, патогенності і взаємовідносин у мікроорганізмів”, і
яка координується планом науково-дослідних тем Міністерства освіти і
науки України.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було порівняльне вивчення
основних біологічних властивостей і енергетичних процесів у гонококів з
різною стійкістю до антибіотиків.

Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

визначити основні параметри росту штамів гонококів, стійких і чутливих
до антибіотиків;

вивчити фактори патогенності та їх взаємозв’язок з наявністю ознак
стійкості до антибіотиків;

визначити основні джерела конвертованої енергії в клітинах досліджуваних
штамів гонокока;

вивчити компоненти і величину протонрушійної сили, а також вплив
енергетичних інгібіторів на її генерацію;

визначити АТФазну активність у штамів Neisseria gonorrhoeae, стійких до
антибіотиків, і вплив факторів навколишнього середовища на активність
цього ферменту;

дослідити динаміку синтезу АТФ при наведенні мембранного потенціалу і
градієнту протонів у клітинах гонокока.

Об’єкт дослідження – штами Neisseria gonorrhoeae, з різним спектром і
рівнем стійкості до антибіотиків із музею культур кафедри мікробіології
і вірусології Дніпропетровського національного університету.

Предмет дослідження – процеси трансформації енергії, які відбуваються на
мембрані клітин гонокока.

Методи дослідження – мікробіологічні, вірусологічні, біохімічні,
фізико-хімічні, хімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що в клітинах
гонококів присутні два основних джерела конвертованої енергії:
трансмембранна різниця електрохімічних потенціалів і внутрішньоклітинний
пул АТФ. Показано, що шляхом утворення іонних градієнтів, можливо
наведення мембранного потенціалу і градієнту протонів, в результаті чого
іде синтез АТФ.

Вперше визначена величина протонрушійної сили (183-192 мВ) клітин
N. gonorrhoeae та її компонентів: трансмембранної різниці електричного
потенціалу (103-145 мВ) і концентраційного градієнту протонів
(80-47 мВ).

Показана наявність основних генераторів мембранного потенціалу
гонококів: дихальний ланцюг, Н+-АТФаза і трансгідрогеназа.

Встановлено основні параметри функціонування Н+-АТФазного комплексу у
штамів N. gonorrhoeae з різним рівнем стійкості до антибіотиків:
оптимальне значення рН для мембранної АТФази гонококів знаходиться в
межах 6,0-6,5; температурний оптимум 37о-45оС.

Показано, що Na+, Ca2+ спричиняють незначний вплив на АТФазну
активність, у той час як Mg2+ збільшують АТФазну активність в 1,5-2,0
рази.

Вперше встановлено, що у антибіотикорезистентних штамів N. gonorrhoeae,
АТФазна активність у 2,0-2,5 рази вища, ніж у чутливих, що свідчить про
інтенсивніший енергетичний обмін.

Практична значимість роботи. Отримані в процесі виконання роботи
експериментальні результати є науковою основою для розробки методів
раціонального використання антибіотиків і інших лікарських препаратів у
терапії інфекційних захворювань, що спричиняються штамами
N. gonorrhoeae, стійкими до антибіотиків.

Використання лікарських препаратів, які пригнічують систему
енергозабезпечення, зможе підвищити ефективність антибіотикотерапії за
інфекцій, етіологічним фактором яких є гонокок.

Матеріали дисертаційної роботи використані у програмах таких дисциплін
кафедри мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного
університету: “Мікробіологія”, “Вірусологія”, “Медична мікробіологія”,
“Вчення про антибіотики”, “Фізико-хімічні методи в мікробіології” і
“Сучасні методи дослідження інфекційних захворювань”.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Експериментальна робота виконана особисто здобувачем. Автор
проаналізувала наукову літературу з даної проблеми, узагальнила одержані
експериментальні дані, провела порівняльний аналіз з відомими
літературними даними. Автором самостійно визначена величина
протонрушійної сили та її компонентів (мембранного потенціалу і
концентраційного градієнту протонів) клітин гонокока, АТФазна активність
чутливих і стійких штамів N. gonorrhoeae; також встановлено
внутрішньоклітинний вміст АТФ у цих штамів. Планування основних
напрямків роботи, обговорення одержаних результатів і підготовка
публікацій за результатами досліджень проходило за безпосередньої участі
наукового керівника д.б.н., проф. А.І. Віннікова. Вивчення
культурально-фізіологічних властивостей гонококів здійснювалось спільно
з к.б.н. В.Г. Гаврилюк, ас. О.В. Крисенко, котрі є співавторами
відповідних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені
на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), ІІ з’їзді
Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), V Міжнародній
конференції “Альянс Франсез” (Дніпропетровськ, 1998), ІІ Міжнародній
конференції “Наука і освіта” – 1999 (Черкаси, 1999); ІІ з’їзді
Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); V
Міжнародній конференції “Наука і освіта” – 2002 (Дніпропетровськ-2002),
ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); VIII
з’їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002); VІ
Міжнародній конференції “Наука і освіта” – 2003 (Дніпропетровськ-2003),
Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 22 наукових праці, із них –
8 статей у фахових виданнях та 14 тез конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури (3 розділи), експериментальної частини (4 розділи),
обговорення результатів, висновків, списку цитованої літератури, який
включає 169 найменувань (з яких – 133 іноземні). Робота викладена на
131 стор. машинописного тексту, ілюстрована 18 рисунками і 17 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1. Особливості культурально-фізіологічних властивостей і обмінних
процесів бактерій роду Neisseria

У даному розділі наведені основні таксономічні ознаки гонококів,
особливості їх фізіологічних властивостей, а також основні катаболічні
шляхи гонококів.

РОЗДІЛ 2. Процеси трансформації енергії у бактерій роду Neisseria

Наведені основні положення хеміосмотичної концепції Мітчела. Розглянуті
основні джерела конвертованої енергії у бактерій: АТФазний комплекс,
дихальний ланцюг, протонрушійна сила.

РОЗДІЛ 3. Механізми стійкості гонокока до клінічно значимих антибіотиків

У цьому розділі наведені дані стосовно біохімічних і генетичних
механізмах стійкості гонокока до найефективніших у клінічному значенні
антибіотиків, таких як пеніцилін, аміноглікозиди, цефалоспорини ІІІ
покоління, фторхінолони.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

РОЗДІЛ 4. Матеріали та методи досліджень

Характеристика штамів гонокока та умови їх культивування

Об’єктом дослідження були штами N. gonorrhoeae із колекції культур
кафедри мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного
університету (табл. 1).

Вирощування здійснювали на поживному середовищі, запропонованому
Бідновою і Яцухою (1993 р.). Культивування гонокока проводили при 37оС в
10% атмосфері СО2 протягом 16-18 годин.

Таблица 1

Характеристика досліджуваних штамів Neisseria gonorrhoeae

Штами Neisseria

gonorrhoeae Стійкість

до антибіотиків Наявність

плазміди Розмір плазміди,

kb

“А” Sр Криптична 4,2

“В” – Криптична 4,2

“С” Str, (Pn, Tc)* Криптична 4,2

“Д” Pn, Tс, Str,

(Cm, Cfr, Cfk)* Криптична

Кон’югативна 4,2

38,9

“Е” Pn, Str, (Tc)* Криптична

Африканська 4,2

5,1

Примітки: 1. * — знижена чутливість; 2. Tс – тетрациклін; 3. Cm –
хлорамфенікол; 4. Pn – пеніцилін; 5. Sp – спектиноміцин; 6. Str –
стрептоміцин; 7. Cfr – цефуроксим; 8. Cfk – цефокситин.

Визначення фізіолого-біохімічних властивостей

Вирощування гонококів здійснювали в рідкому поживному середовищі при
струшуванні на шутелі при температурі 37оС протягом 24-48 год. Оптичну
густину проб вимірювали спектрофотометричним засобом при довжині хвилі
540 нм. Кількість життєздатних клітин (колонієутворюючих одиниць – КУО)
визначали методом Коха. Для оптимізації склада поживного середовища
використовували поживні середовища з різним вмістом сироватки ВРХ – від
0 до 20%, а також середовища з різною концентрацією гумату натрію – від
0,005 до 0,02%.

Параметри росту (швидкість поділу клітин і тривалість генерації)
обчислювали загальноприйнятим методом (Шлегель, 1988). Здатність
окислювати і зброджувати вуглеводи визначали за методикою,
запропонованою Коліковою (1978). Протеазну активність визначали за
методикою, яка була описана Ізмайловою (1968). Гемолітичну і
гіалуронідазну активність реєстрували згідно загальновизнаним методикам
(Герхард, 1984). При вивченні лізоцимної активності у даних штамів був
використаний метод “п’ятачків” (Воронина, 1988).

Одержання безклітинного гомогенату і фракцій мембранних везикул гонокока

Вивчення обмінних процесів у гонокока проводились на цілих клітинах,
безклітинному гомогенаті і фракції мембранних везикул. Клітини гонококів
вирощувалися на МПБ до кінця експоненціальної фази росту при 37оС в
атмосфері 10% СО2 у стаціонарних умовах. Далі клітини відділяли
центрифугуванням при 5000 об/хв упродовж 20 хв., двічі промивали і
ресуспендували залежно від мети експерименту: або в 40 мМ трис-HCl
буфера (рН 7,0 або 8,0) з додаванням 3 мМ MgCl2, або в 40 мМ розчині
морфолінетанолсульфонової кислоти (рН 5,0 або 6,0) з додаванням 3 мМ
MgCl2.

Безклітинний гомогенат одержували в результаті ультразвукової обробки
клітин при 22 кГц протягом 3 хв. з інтервалом 30 секунд на
ультразвуковому дезінтеграторі УЗДН-А, незруйновані клітини, видаляли
центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 20 хвилин. Фракцію мембранних
везикул одержували диференційним центрифугуванням при 22000 g (30 хв.)
для осадження цілих клітин і великих клітинних фрагментів та при 144000
g (60 хв.) на холоді (при температурі – 4оС).

Методи визначення активності АТФази гонокока

АТФазну активність мембран гонокока визначали за приростом неорганічного
фосфору (Рн) при гідролізі АТФ. Неорганічний фосфор визначали в
надосадочній рідині за методом Лоурі-Лопеса в модифікації Скулачова.

Активність АТФази виражали в нмолях АТФ, гідролізованого 1 мг білка за 1
хв. Розрахунок активності АТФази проводили за формулою:

де: Pн – приріст неорганічного фосфору; ? – мг білка в пробі;

k = 0,031 – середнє значення екстинції при 1 мкг Рн у пробі.

Концентрацію білку оцінювали за методом Lowry (1951).

Вимірювання протонрушійної сили та її компонентів

Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів на мембранних
везикулах гонококів вивчали методом Liberman, Skulachev з використанням
синтетичних проникаючих іонів: тетрафенілфосфонію (ТРР+) та
фенілкарбаундекаборану (ФКБ–). У дослідах з мембранними везикулами
використовували тефлонову кювету, яка була поділена на дві ячейки
фосфоліпідною мембраною, яка використовувалась як селективний електрод.
Вимірювальна схема складалася з хлорсрібних електродів порівняння,
іономера ЭВ-74 і самописця КСП-4 з вбудованою схемою компенсації.

При визначенні величини компонентів протонрушійної сили: (?Р)
мембранного потенціалу (??) і концентраційного градієнту протонів (?рН)
на цілих клітинах гонококів, як зонди використовували іони ТРР+ і
саліцилової кислоти (SAL–) і електроди, селективні за цими іонами,
конструкції Грінюса. Вимірювання проводили в термостатованій кюветі
об’ємом 5 мл при 37оС при перемішуванні на магнітній мішалці.

Розрахунок величин ?? і ?рН здійснювали по рівнянням, запропонованим
Грінюсом, на основі даних по розподіленню ТРР+ і SAL– відповідно.

В експериментах по індукуванню іонних градієнтів клітини гонококів
навантажували KCl, при інкубації їх у розчині 0,3 М KCl на 40 мМ
трис-HCl (рН 7,0) протягом 30 хв, потім відмивали від KCl при
центрифугуванні на холоді (2-4оС). Градієнтний потік К+ на
цитоплазматичній мембрані клітин утворювали додаванням валіноміцину в
концентрації 1 мкМ, градієнт рН – додаванням у середовище HCl або
трис-основи.

Для визначення кількості АТФ, яка синтезується при утворенні мембранного
потенціалу або градієнту рН, проводили екстракцію клітин 30%-ною
трихлороцтовою кислотою за методом Коля. Кількість АТФ в екстрактах
визначали за методом Хемплінга, при використанні додаткової
ферментативної системи, яка містить гексокіназу і
глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу. Кількість АТФ розраховували за кількістю
вимірюваного при 340 нм відновленого НАДФН.

Використовували такі інгібітори: інгібітор дихального ланцюга ціаністий
калій (KCN) – 10-3 М; інгібітор Н+-АТФаза N1N1-дициклокарбодиімід (ДЦКД)
– 10-6-10-3 М; протонофорний роз’єднувач
m–хлоркарбонілціанідфенілгідразон (ХКФ) – 10-5М.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Лакіним (1990).
Достовірність результатів досліджень оцінювали згідно з t-критерієм
Стъюдента при 5% рівні значимості.

РОЗДІЛ 5. Особливості фізіолого-біохімічних властивостей штамів
гонококів, чутливих та стійких до антибіотиків

Аналізували такі фактори патогенності гонококів: протеазна, лізоцимна та
гіалуронідазна активність.

Протеазна активність виявлена у всіх досліджуваних штамів. Лізоцимна
активність була присутня у всіх штамів Neisseria gonorrhoeae, за
винятком штаму “В”. Штами “А” і “Е” — низьколізоцимактивні, діаметр зон
затримки росту 6,5±0,5 мм і 7±1 мм відповідно. Штами “Д” і “Е” —
високолізоцимактивні, діаметр зон затримки росту – 12±2 мм і 10±1 мм
відповідно. Також у ході досліджень було відмічено, що максимальна
продукція літичного ферменту відбувається у перші 24-48 год. інкубації.
У цей же час відбувається автоліз гонококів.

Гіалуронідазна активність була виявлена у штамів “Д”, “Е”, “С”, відсутня
була у штамів “А” і “В” N. gonorrhoeae. Нами був визначений мінімальний
об’єм взвесі штамів гонокока, який забезпечує руйнування згустку
гіалуронової кислоти. Для штаму “Д” – 0,2 мл; для штаму “Е” — 0,3 мл;
для штаму “С” — 0,4 мл. Отримані результати узгоджуються з результатами
експериментів, які були отримані на клінічних штамах гонокока (Вороніна,
1982, 1998; Жукова, 1988, 1994).

Наведені дані свідчать про те, що набуття стійкості до антибіотиків
впливає на деякі фізіолого-біохімічні властивості досліджуваних
гонококів, які належать до факторів патогенності.

Досліджені закономірності росту 5 колекційних штамів гонококів на
поживних середовищах різноманітного складу, за різних рН середовища і
температурному режимі з метою підбору оптимальних умов для одержання
популяцій фізіологічно активних клітин.

Вивчалась можливість культивування досліджуваних штамів гонококів у
рідкому поживному середовищі, яке не містить сироватки ВРХ. Встановлено,
що на рідкому поживному середовищі, що не містить сироватки ВРХ, не
спостерігали росту жодного із штамів. З метою оптимізації поживного
середовища за вмістом сироватки ВРХ і встановленню її оптимальної
концентрації, дослідили ріст всіх штамів у середовищах, що містили від 5
до 20% сироватки ВРХ (табл. 2).

При порівнянні динаміки росту всіх штамів гонококів був виявлений
однотиповий її характер, у зв’язку чим у табл. 2 наведено дані для штаму
“В” чутливого до антибіотиків та для штаму “А” — стійкого. При зміні
вмісту сироватки ВРХ із 5% — до 20% в поживному середовищі, константа
швидкості поділу коливалася в межах 0,58-0,96 клітинних поділів за
годину, а тривалість генерації становила з 1,75 до 1,03 год. З
збільшенням концентрації сироватки ВРХ від 0 до 20% змінюються параметри
росту гонокока, скорочується лаг-фаза, збільшується константа швидкості
поділу, скорочується тривалість генерації. Все це можна розглядати,
можливо, як рістстимулюючу дію даної добавки на обмінні процеси
бактерій.

Таблиця 2

Фізіологічні параметри росту Neisseria gonorrhoeae (штамів “А” і “В”) на
рідких поживних середовищах з різним вмістом сироватки ВРХ і гумату
натрію

Номер

середовища Параметри росту

Тривалість

лаг-фази (Тlag, год.)

Константа швидкості поділу (?, год-1)

Тривалість генерації (g, год)

штам “А”

штам “В”

штам “А”

штам “В”

штам “А”

штам “В”

1 – – – – – –

2 3,6 3,8 0,57 0,58 1,75 1,72

3 2,0 2,0 0,70 0,70 1,43 1,43

4 1,7 1,7 0,96 0,97 1,04 1,03

5 1,8 1,8 0,62 0,62 1,61 1,61

6 1,6 1,6 0,91 0,93 1,09 1,08

7 1,5 1,5 0,98 0,98 1,02 1,02

8 1,1 1,1 1,08 1,08 0,93 0,93

Примітки: 1 – середовище без сироватки; 2-4 – середовища з різним
вмістом сироватки ВРХ (2 – 5%, 3 – 10%, 4 – 20%); 5-8 – середовища з
20%-м вмістом сироватки, збагачені гуматом натрію в концентрації
відповідно 0,02, 0,015, 0,005 і 0,01%

У своїх дослідженнях ми також аналізували вплив гумату натрію на
параметри росту N. gonorrhoeae з метою оптимізації поживного середовища
(табл. 2) Показано, що при збільшенні концентрації гумату натрію до
0,01% лаг-фаза скорочується до 1,1 год., константа швидкості поділу
збільшується до 1,08 клітинних поділів за год., тривалість генерації
скорочується з 1,08 до 0,93 год. Однак за концентрації гумату натрію
0,02% у середовищі спостерігали зворотну картину. Можна припустити, що
гумат натрію в низьких концентраціях стимулює ріст і розмноження
гонокока, а у вищих – його затримує.

Встановлено, що 20% сироватки ВРХ і 0,01% гумату натрію в середовищі для
культивування гонокока є оптимальним для росту і розмноження даного
мікроорганізму.

На наступному етапі дослідили ріст штамів у процесі періодичного
культивування при температурі від 23оС до 42оС. Одержані результати
вказують на залежність росту гонококів від температури. Константа
швидкості поділу збільшується до 0,92 у фазі експоненціального росту з
підвищенням температури до 36,5оС, тривалість генерації скорочується до
1,09 год., що можна розглядати як оптимальну температуру культивування
даного мікроорганізму.

Наступна серія експериментів була присвячена вивченню впливу рН
середовища на ріст і розмноження даних штамів.

Ріст гонококів спостерігався при рН=6,5-7,7. Із підвищенням рН
спостерігається збільшення числа КУО. Найбільше значення КУО (5?1010)
відмічено за рН 6,8-6,9, а найменше – за рН 7,7-102, що можна розглядати
як оптимальне значення рН для росту і розмноження гонокока.

Отже не виявлено істотної різниці між ростовими характеристиками штамів
N. gonorrhoeae, чутливих і стійких до антибіотиків.

РОЗДІЛ 6. Генерація протонрушійної сили у гонококів

У даному розділі наведено експериментальні дані з вивчення основних
джерел конвертованої енергії у гонококів.

Залежність величини протонрушійної сили та її складових (мембранного
потенціалу і концентраційного градієнту протонів) від рН середовища
інкубації, для досліджуваних штамів мала однотиповий характер, тому на
рисунках представлені дані для штаму “В” чутливого до антибіотиків, та
для штаму “А” – стійкого.

При зміні рН середовища інкубації ми спостерігали зміну величини
мембранного потенціалу (??) і рН-градієнту (?рН) (рис. 1).

а б

Рис. 1. Вплив рН на величину протонрушійної сили і її складових у клітин
N. gonorrhoeae а — штаму “В”, б – штаму “А”, t=37оС (середовище
інкубації: 40 мМ MES-буфер (рН 5,0-6,0) або 40 мМ трис-HCl буфер (рН
7,0-8,0),

1 мкМ ТФФ+, 80 мкМ саліцилової кислоти і клітин (5,0 мг/мл))

При зміні рН середовища від 5 до 8 ?рН знижувався з –80 мв до – 47 мв, а
?? зростав з – 103 мВ до – 145 мВ. Протонрушійна сила (?р) зі зміною рН
практично не змінювалася і становила 192-183 мВ. Таким чином, у
слабокислому середовиші переважає концентраційний градієнт іонів
водорода, а в слаболужному – мембранний потенціал, а величина
протонрушійної сили за різних значеннях рН практично не змінюється.
Отже, можна зробити висновок, що обидві складові протонрушійної сили
(трансмембранна різниця електричних потенціалів і концентраційний
градієнт іонів водню) – еквівалентні, що відповідає основним постулатам
теорії Мітчела.

Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів на мембранних
везикулах вивчали за допомогою аніонів фенілдикарбаундекарборону (ФКБ)–.

Встановлено, що додавання сукцинату, АТФ індукує поглинання ФКБ–
вивернутими везикулами. Характер поглинання ФКБ– вказує на наявність
двох генераторів мембранного потенціалу (дихального ланцюга і
Н+-АТФази). Аналізували дію на мембранний потенціал гонокока інгібіторів
енергетичного обміну клітини: KCN, ДЦКД і ХКФ. Показано, що при
додаванні KCN в інкубаційну суміш мембранний потенціал знижується до 62
мВ. При додаванні ДЦКД в інкубаційну суміш ?? зменшується до 65 мВ.
Розсіюється мембранний потенціал лише за одночасного пригнічування
дихального ланцюга і Н+-АТФази.

o

o

oe

` – N

T

z

e

&

o

oe

` – P

???P

R

T

z

e

$

O

$

O

?l???0??’?

?l?0??’?

?l?0??’?

O

$

O

O

O

O

$

O

!?!O!FcPc”c–c c¤c(Y,Y¬§E§ c°oicississioioioissississioioissississississi
ssi*ississississiOiEiEiAic1/4cµi*ioissiAiEissi

EH

$

E

@

@

???$?tFvF3Ekd?

¬

¬

??????FoF3EkdF

¬

¬

¬

¬

¬

h¬EaCJ

?сгідрогеназа являє собою додаткову ділянку накопичення енергії в
дихальному ланцюзі гонокока.

Енергія, яка вивільняється за окисленні НАДФН у ході трансгідрогеназної
реакції, витрачається на поглинання ФКБ–. Енергозалежне поглинання ФКБ–
є індикатором генерації мембранного потенціалу. Таким чином, акумуляція
ФКБ– у мембранах N. gonorrhoeae є доказом того, що трансгідрогеназна
реакція спряжена з генерацією мембранного потенціалу, зі знаком “+” у
внутрішньовезикулярному просторі.

Встановлено, що величина мембранного потенціалу клітин гонокока, яка
генерується трансгідрогеназною реакцією, знаходиться в межах 62-86 мВ.
Вона набагато нижча величини ?? в інтактних клітинах N. gonorrhoeae
(103-145 мВ).

Оскільки нами було показано, що додавання АТФ у ході функціонування
Н+-АТФазного комплексу приводить до генерації трансмембранної різниці
електричних потенціалів, у подальших експериментах вивчали синтез АТФ
при створенні іонних градієнтів. Дослідження проводили з використанням
штаму “В”.

З метою оцінки можливості синтезу АТФ при наведенні трансмембранної
різниці потенціалів, клітини, навантажені іонами К+, інкубували в
безкалієвому середовищі, що містило 40 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4; 0,6 мг
білку на 1 мл, без субстратів; 10 мМ KCN, щоб виключити окисні процеси в
клітині. Початковий вміст АТФ у клітинах штаму “В” – (0,053?0,011) мМ
(табл. 3).

Внесення валіноміцину після 3 хв. інкубації при 37оС приводить до
синтезу АТФ. Збільшення концентрації валіноміцину до 30 мкм спричиняє
приріст концентрації внутрішньоклітинного АТФ на 0,225 мМ (табл. 3).

Таблиця 3

Залежність синтезу АТФ від концентрації валіноміцину

при наведенні градієнту К+ у клітинах штаму “В”

№ п/п Валіноміцин, мкМ ХКФ, 10-5 М ДЦКД, 10-4 М Внутрішньоклітинний
вміст АТФ, мМ

1 0 – – 0,053 ? 0,011

2 10 – – 0,055 ? 0,012

3 20 – – 0,076 ? 0,014

4 30 – – 0,280 ? 0,02

5 20 + – 0,02 ? 0,01

6 20 – + 0,01 ? 0,002

В експериментах по наведенню градієнту рН на мембрану інкубаційне
середовище містило 40 мМ трис-HCl, рН 7,4; 10 мМ KCN, 0,5 мг білка на
1 мл середовища. Наведення градієнту рН приводило до синтезу АТФ
(0,10 мМ) за 30 с. Внесення в середовище трис-основи збільшувало рН від
5,0 до 7,4, що приводило до дисипації градієнту рН. Концентрація АТФ при
цьому знижувалася до початкового рівня (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив градієнту рН на внутрішньоклітинну концентрацію АТФ

штаму “В” N. gonorrhoeae

Добавка рН середовища Концентрація АТФ, мМ

– 7,4 0,053 ? 0,011

HCl 5,0 0,153 ? 0,011

Трис-основа 7,4 0,058 ? 0,012

Синтез АТФ при перенесенні іонів К+ через мембрану, індукованого
валіноміцином, залежить від дії енергетичних інгібіторів (рис. 3).
Роз’єднувач окислювального фосфорилювання ХКФ і інгібітор Н+-АТФази ДЦКД
ефективно пригнічують синтез АТФ.

Підсумовуючи дані, наведені в цьому розділі, можна заключити, що
величина протонрушійної сили у штамів гонококів, чутливих і стійких до
антибіотиків, знаходиться в межах 183-192 мВ. У досліджених штамів
присутні генератори ??Н+ — дихальний ланцюг, Н+-АТФаза і
трансгідрогеназа. Крім того, можливе наведення мембранного потенціалу і
градієнту рН шляхом створення іонних градієнтів, у результаті чого
відбувається синтез АТФ.

РОЗДІЛ 7. Характеристика АТФазного комплексу у гонококів,

чутливих і стійких до антибіотиків

У процесі вивчення характеристик АТФазного комплексу у штамів
N.gonorrhoeae, з різним рівнем чутливості до антибіотиків, було
показано, що АТФазна активність у штаму, чутливого до антибіотиків,
нижча, ніж у антибіотикорезистентних (табл. 5).

Таблиця 5

АТФазна активність мембран клітин гонокока

Штами Активність, (нмоль / хв ? мг білка) t = 37оС

“А” 1,17 ? 0,02

“В” 0,83 ? 0,01

“С” 1,50 ? 0,02

“Д” 2,33 ? 0,03

“Е” 1,83 ? 0,02

Встановлено, що оптимальне значення рН для мембранної АТФази гонококів
перебуває в межах 6,0-6,5. Слід зазначити, що оптимальне значення рН для
інших бактеріальних АТФаз знаходиться в більш лужній області. Проведений
нами гідроліз АТФ за різних температурних режимів (28оС, 37оС, 45оС)
показав, що за зміни температури від 28оС до 45оС АТФазна активність
всіх штамів гонокока збільшується. Нами було вивчено вплив Na+, Ca2+ і
Mg2+ на АТФазну активність N.gonorrhoeae. Na+, Ca2+ виявляють незначний
вплив на активність АТФазного комплексу досліджуваних штамів. Відсоток
зниження активності для Na+ був у межах 12-17%, для Са2+ – 14%-16%. На
відміну від Na+ і Ca2+, іони магнію стимулювали АТФазну активність усіх
досліджуваних штамів гонокока. За збільшення концентрації Mg2+ від 10-4
до 10 2М активність АТФазного комплексу всіх штамів підвищується в
1,5-2,0 рази.

Специфічний інгібітор мембранної АТФази мікроорганізмів ДЦКД знижує
активність ферменту до його повного пригнічення. За збільшення
концентрації ДЦКД до 10-3 М активність АТФазного комплексу гонокока
знижується на 50-70%.

Можливо припустити, що разом з іншими компонентами цитоплазматичної
мембрани прокаріотичної клітини, АТФазний комплекс, може бути залучений
до системи механізму дії ряду антибіотиків.

У зв’язку з цим, на наступному етапі ми аналізували вплив
суббактеріостатичних концентрацій антибіотиків на АТФазну активність
штамів N. gonorrhoeae, чутливих і стійких до них, що дало змогу виявити
функціональні зміни АТФази під дією антибіотиків. Для проведення цих
дослідів використовували пеніцилін і тетрациклін. Так у колекції штамів
гонококів, штам “Д” стійкий до тетрацикліну, штами “Д”, “Е” і “С” стійкі
до дії пеніциліну. Як видно з рис. 4, вирощування клітин гонокока на
середовищах з суббактеріостатичними концентраціями тетрацикліну
приводило до пригнічення АТФ-гідролазної реакції в штамів “В”, “А” і
“Е”, чутливих до тетрацикліну, а максимальний рівень активності
спостерігається у штаму “Д”, стійкого до цього антибіотика.

% від контролю

Рис. 4. Вплив тетрацикліну на АТФазну активність гонокока

(за 100% прийнята АТФазна активність штаму “В” за стандартних умов)

У процесі вирощування гонокока на середовищах з суббактеріостатичними
концентраціями пеніциліну (рис. 5) спостерігали зниження АТФазної
активності у штамів “А”, “В”, чутливих до дії цього антибіотика. У той
же час штами “С”, “Д” і “Е”, які стійкі до пеніциліну характеризувались
вищим рівнем АТФазної активності.

Наведені дані показали, що антибіотики (тетрациклін і пеніцилін)
впливають на функцію мембранного ферменту енергетичного обміну – АТФазу.
Вирощування клітин гонокока у присутності суббактеріостатичних
концентрацій антибіотиків призводило до зниження АТФазної активності у
штамів, чутливих до антибіотиків.

% від контролю

Рис. 5. Вплив пеніциліну на АТФазну активність гонокока

(за 100% прийнята АТФазна активність штаму “В” за стандартних умов)

Отже, можна припустити, що молекули антибіотиків при взаємодії з
мембраною мікробної клітки ініціюють глибокі структурні перебудови в
ній, наслідком яких є підвищення проникності і можливе пригнічення
фізіологічних функцій, що приводить до зміни функціонування ферментів,
які знаходяться на цитоплазматичній мембрані.

Отримані результати становлять особливий інтерес в зв’язку з тим, що
стійкість до антибіотиків носить комплексний характер, обумовлена
одночасно декількома механізмами і тому дослідження основних
закономірностей енергетичного обміну патогенних бактерій допоможе
вирішити проблему розповсюдження резистентних штамів. В зв’язку з цим,
можна рекомендувати в ході терапії інфекційних захворювань комплексне
використання антибіотиків з лікувальними препаратами, котрі впливають на
енергетичний обмін бактерій.

ВИСНОВКИ

Підібрано оптимальний склад поживного середовища для культивування
Neisseria gonorrhoeae з 20%-м вмістом сироватки великої рогатої худоби і
встановлено, що оптимальний розвиток гонокока відбувається за рН =
6,8-6,9 і температури – 36,5оС – 37,5оС.

Показано залежність факторів патогенності у досліджуваних штамів
гонокока від наявності стійкості до антибіотиків. Так, лізоцимна і
гіалуронідазна активності були відсутні у штамів Neisseria gonorrhoeae,
чутливих до антибіотиків.

Встановлено наявність двох основних джерел конвертованої енергії у
штамів гонокока – внутрішньоклітинного пулу АТФ і трансмембранного
електрохімічного потенціалу протонів — ??Н+, який генерується у процесі
функціонування дихального ланцюга, Н+-АТФази і трансгідрогеназної
реакції.

Визначено величину протонрушійної сили, яка коливається в межах
183-192 мВ. Встановлено наявність двох її компонентів – трансмембранного
електричного потенціалу і концентраційного градієнту протонів.

Клітини гонокока характеризуються наявністю внутрішньоклітинного пулу
АТФ, що становить 0,053–0,064 мМ. Синтез АТФ відбувається під час
наведення мембранного потенціалу і градієнту протонів.

Встановлено, що АТФ-гідролазна активність у штамів N. gonorrhoeae,
стійких до антибіотиків, у 2-2,5 разів вища, ніж у чутливих, що свідчить
про інтенсивніші витрати конвертованої енергії.

Показано, що антибіотики тетрациклін і пеніцилін впливають на функцію
мембранної Н+-АТФази. Вирощування клітин гонококів у присутності
суббактеріостатичних концентрацій цих антибіотиків призводило до
зниження АТФазної активності у чутливих штамів і інтенсифікації
АТФ-гідролазної реакції у штамів, стійких до антибіотиків.

СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Скляр Т.В., Крысенко А.В., Винников А.И. Сравнение питательных сред для
культивирования Neisseria gonorrhoeae // Микробиол. журнал, 1997. Т.59,
№1. С.82-86. (Здобувач вивчив характер росту Neisseria gonorrhoeae на
різноманітних поживних середовищах).

Скляр Т.В., Крысенко А.В., Гаврилюк В.Г., Винников А.И. Сравнение
параметров развития культур Neisseria gonorrhoeae и Staphylococcus
аureus на питательных средах различного состава // Микробиол. журнал,
1998. Т.60, №1. С.25-31. (Здобувачем особисто визначено параметри
розвитку культур Neisseria gonorrhoeae на поживних середовищах
різноманітного складу).

Крысенко А.В., Скляр Т.В., Винников А.И. Вопросы
антибиотико-устойчивости бактерий Neisseria gonorrhoeae // Вісник ДДУ.
Біологія. Екологія, 2000. № 7. С. 122-126. (Здобувач провів аналіз
літературних даних стосовно антибіотикостійкості гонокока).

Скляр Т.В., Крысенко А.В., Козицкая С.Н., Гаврилюк В.Г., Винников А.И.
АТФ-азная активность штаммов Neisseria gonorrhoeae и St. aureus //
Микробиологический журнал, 2001, Т.63, №5. С. 21-27. (Здобувач особисто
визначив АТФ-азну активність штамів гонококу).

Крысенко А.В., Скляр Т.В., Козицкая С.Н., Голодок Л.П., Винников А.И.
Окислительная активность и накопление конечных продуктов обмена у
плазмидсодержащих штаммов гонококка и стафилококка // Микробиол. журнал,
2001, Т.63, №6. С. 19-25. (Здобувач безпосередньо приймав участь в
експерименті, провів аналіз отриманих даних).

Скляр Т.В. Генерация протондвижующей силы в клетках Neisseria
gonorrhoeae // Биохимический журнал Т. 74. №1, 2002. С. 39-43. (Здобувач
особисто визначив величину протонрушійної сили та її компонентів у
клітинах гонокока).

Скляр Т.В., Винников А.И. Особенности генерации протондвижующей силы в
клетках Neisseria gonorrhoeae чувствительных и устойчивых к антибиотикам
// Вісник ДНУ. Біологія. Екологія. 2002, С. 113–116. (Здобувач особисто
визначив величину мембранного потенціалу у чутливих і стійких штамів
гонокока).

Скляр Т.В., Винников А.И. Источники конвертируемой энергии у Neisseria
gonorrhoeae // Микробиологический журнал, 2004, т. 66, №5. С. 23-30.
(Здобувач особисто визначив початковий вміст АТФ у клітинах гонокока).

Krissenko O., Skliar Т., Vinnikov A. Particularites de la croisance de
Neisseria gonorrhoeae dans un boullon colture // Actes de la V-e
Conference Inter. France et Ukraine, 1998, Dniepropetrovsk. V.3, P.
68-69

Скляр Т.В., Вінніков А.І. Активність АТФ-ази бактерій Neisseria
gonorrhoeae // Мат. ІІ З’їзду українського біофізичного товариства.
Харків. 1998 р. С. 93.

Крысенко А.В., Скляр Т.В., Винников А.И. Антибиотикоустойчивость
клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae // Мат. Междунар. конгресса
“Актуальные вопросы инфектологии в акушерстве и гинекологии”. Донецк,
1998, т.2, с. 30.

Скляр Т.В., Винников А.И. Применение метода конселективных электродов
для измерения трансмембранной разности электрических потенциалов на
целых клетках гонококка // Мат ІІ Міжнародн. конф. “Наука і освіта”.
Черкаси, 1999. С. 48.

Крысенко А.В., Скляр Т.В., Винников А.И. Физиолого-биохимические
различия представителей рода Neisseria, значимые для идентификации //
Мат. II Междунар. конгресса “Актуальные вопросы инфектологии в
акушерстве и гинекологии”. Донецк, 1999. С. 2.

Скляр Т.В., Крысенко А.В., Козицкая С.Н., Гаврилюк В.Г., Винников А.И.
Сравнительная активность АТФ-азного комплекса гонококков и
стафилококков, содержащих плазмиды устойчивости к антибиотикам //
Матеріали з’їзду Українського мікробіологічного товариства, Чернігів,
2000. Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології, 2000, №8.
С. 38.

Крысенко А.В., Скляр Т.В., Голодок Л.П., Винников А.И. Активность
катаболических процессов у стафилококков и гонококков, содержащих
плазмиды устойчивости к антибиотикам // Матеріали з’їзду Українського
мікробіологічного товариства. Чернігів, 2000. Бюлетень інституту
сільськогосподарської мікробіології, 2000, №8. С. 39-41.

Скляр Т.В., Винников А.И. Зависимость величины мембранного потенциала
клеток Neisseria gonorrhoeae от условий внешней среды // Мат V Міжнар.
науково-практ. конф. “Наука і освіта”, Дніпропетровськ, 2002. Т. 6.
Біологія. С. 44.

Скляр Т.В., Винников А.И. Вплив інгібіторів енергетичного обміну на
генерацію протонрущійної силі гонокока // Тези доповідей ІІІ з’їзду
Українського біофізичного товариства. Львів, 2002 С. 140.

Скляр Т.В. Влияние ионов натрия, кальция, магния на активность Н+
АТФ-азы гонококка // Укр. біохім. журн., 2002. Т. 74. №4б (додаток 2)
С. 169.

Скляр Т.В., Вінніков А.І., Гаврилюк В.Г. Активність Н+ АТФазного
ферментного комплексу у антибіотикостійких мікроорганізмів // Тези
доповідей ІІІ з’їзду укр. біофізичного товариства. Львів, 2002. С. 131.

Скляр Т.В., Винников А.И. Факторы патогенности гонококков // Мат. VI
Міжн. науково-практич. конф. “Наука і освіта”, Д., 2003. Т. 2. Біологія.
С. 58-60.

Скляр Т.В., Винников А.И. Синтез АТФ в клетках Neisseria gonorrhoeae при
наведении мембранного потенциала // Мат. Міжн. науково-практич. конф.
“Україна Наукова”, Д., 2003, Т. 13. Біологія. С. 26.

Скляр Т.В., Вінніков А.І. Основні генератори трансмембранної різниці
потенціалів в клітинах Neisseria gonorrhoeae // Матеріали Х з’їзду
товариства мікробіологів України. Тези доповідей. Одеса, 2004. С. 169.

АНОТАЦІЯ

Скляр Т.В. Особливості енергетичного обміну штамів Neisseria gonorrhoeae
з різною стійкістю до антибіотиків. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена вивченню основних біологічних властивостей і
енергетичних процесів, які відбуваються на мембрані гонококів. В роботі
наведені результати основних параметрів росту штамів гонококів, вивчені
основні фактори патогенності, визначені основні джерела конвертованої
енергії досліджуваних штамів, вивчена генерація протонрушійної сили,
визначені АТФазна активність і вміст внутрішньоклітинного АТФ.

Підібраний оптимальний склад поживного середовища для культивування
N. gonorrhoeae з 20%-м вмістом сироватки ВРХ і встановлено, що
оптимальний розвиток досліджуваних штамів відбувається при рН = 6,8-6,9
і температурі – 36,5оС – 37,5оС. Показана залежність факторів
патогенності у досліджуваних штамів гонококу від стійкості до
антибіотиків.

Вперше встановлено, що в клітинах досліджуваних штамів присутні два
основних джерела конвертованої енергії: трансмембранна різниця
електрохімічних потенціалів і внутрішньоклітинний пул АТФ. Показано, що
наведення різниці електричних потенціалів або градієнту рН на мембрані
гонококів індукує синтез АТФ, при утворенні іонних градієнтів. Вміст АТФ
в клітинах гонокока знаходиться в межах від 0,053 до 0,064 мМ.

Вперше визначена величина протонрушійної сили (183-192 мв) клітин
N. gonorrhoeae і її складових: трансмембранної різниці електричних
потенціалів (103-145 мв) і концентраційного градієнту протонів (80-47
мв). Трансмембранний електрофорез проникаючих іонів ТФФ+ і ФКБ- показав,
що мембрани інтактних клітин і мембранних везикул гонокока містять три
типи генераторів мембранного потенціалу: дихальний ланцюг, АТФазу і
трансгидрогеназу.

Вперше встановлено, що у досліджуваних штамів Neisseria gonorrhoeae,
стійких до антибіотиків АТФазна активність у 2,0-2,5 рази вище, ніж у
чутливих, що може свідчити про більш інтенсивніший енергетичний обмін у
резистентних штамів.

Ключові слова: Neisseria gonorrhoeae, протонрушійна сила, трансмембранна
різниця електричних потенціалів, концентраційний градієнт протонів,
АТФазна активність, внутрішньоклітинний пул АТФ.

АННОТАЦИЯ

Скляр Т.В. Особенности энергетического обмена штаммов Neisseria
gonorrhoeae с разной устойчивостью к антибиотикам. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению основных биологических свойств и
энергетических процессов происходящих на мембране гонококков,
чувствительных и устойчивых к антибиотикам. В работе приведены основные
параметры роста штаммов гонококков, изучены основные факторы
патогенности, определены основные источники конвертируемой энергии,
изучена генерация протондвижующей силы, определена АТФазная активность и
содержание внутриклеточного АТФ в клетках гонококка.

Подобран оптимальный состав питательной среды для культивирования
N. gonorrhoeae с 20%-м содержанием сыворотки КРС и установлено, что
оптимальное развитие гонококка наблюдается при РН = 6,8-6,9 и
температуре – 36,5оС – 37,5оС. Показана зависимость факторов
патогенности у исследуемых штаммов гонококка от устойчивости к
антибиотикам.

Впервые установлено, что в клетках изучаемых штаммов гонококков
присутствуют два основных источника конвертируемой энергии:
трансмембранная разность электрохимических потенциалов и внутриклеточный
пул АТФ. Показано, что наведение разности электрических потенциалов или
градиента рН на мембрану изучаемых штаммов индуцирует синтез АТФ при
создании ионных градиентов. Содержание АТФ в клетках гонококка находится
в пределах от 0,053 до 0,064 мМ. Отмечено, что при наведении
трансмембанной разности электрических потенциалов синтезируется большее
количество АТФ, клетками гонококков, чем при наведении градиента рН.
Энергетические ингибиторы: ХКФ и ДЦКД эффективно подавляют синтез АТФ.

Впервые определена величина протондвижующей силы (183-192 мВ) клеток
Neisseria gonorrhoeae и ее компонентов: трансмембранной разности
электрических потенциалов (103-145 мВ) и концентрационного градиента
протонов (80-47 мВ). При изменении рН среды инкубации мы наблюдали, что
в слабокислой среде преобладает концентрационный градиент ионов
водорода, а в слабощелочной – мембранный потенциал, а величина
протондвижующей силы при различных значениях рН практически не
изменяется. Исходя из этого, сделан вывод, что обе составляющие
протондвижующей силы — трансмембранная разность электрических
потенциалов и концентрационный градиент ионов водорода – эквивалентны,
при изменении рН среды величина протондвижущей силы не изменяется, а
изменяются значения ее компонентов. Это соответствует основным
постулатам теории Митчела. Генерация мембранного потенциала гонококков
подавляется специфическими ингибиторами: ХКФ, КСN и ДЦКД. При добавлении
КСN в инкубационную смесь ?? падает и его величина равна – 62 мВ, при
добавлении ДЦКД – уменьшается до 65 мВ. Сбрасывается мембранный
потенциал лишь при одновременном подавлении дыхательной цепи и
Н+-АТФазы.

Трансмембранный электрофорез проникающих ионов ТФФ+ и ФКБ- показал, что
мембраны интактных клеток и мембранных везикул гонококка содержат три
типа генераторов мембранного потенциала: дыхательную цепь, АТФазу и
трансгидрогеназу. Ориентация электрического поля противоположна у клеток
– “минус” внутри, у мембранных везикул – “плюс” внутри.

Установлены основные параметры функционирования Н+-АТФазного комплекса у
штаммов Neisseria gonorrhoeae с разным уровнем устойчивости к
антибиотикам: оптимальное значение рН для АТФазы гонококков находится в
области 6,0-6,5; температурный оптимум – 37оС-45оС. Показано, что Na+,
Ca2+, оказывают незначительное влияние на АТФазную активность, угнетая
ее на 12-17%, в то время как Mg2+ увеличивает АТФазную активность в
1,5-2 раза.

Впервые установлено, что у штаммов Neisseria gonorrhoeae, устойчивых к
антибиотикам АТФазная активность в 2,0-2,5 раза выше, по сравнению с
чувствительными, что говорит о более интенсивном энергетическом обмене у
резистентных штаммов.

Показано, что антибиотики: тетрациклин и пенициллин влияют на функцию
мембранного фермента – Н+-АТФазу. Выращивание клеток гонококка в
присутствии суббактериостатических концентраций этих антибиотиков
приводило к снижению АТФазной активности у чувствительных штаммов,
интенсификации АТФ-гидролазной реакции у устойчивых к антибиотикам.

Ключевые слова: Neisseria gonorrhoeae, протондвижущая сила,
трансмембранная разность электрических потенциалов, концентрационный
градиент протонов, АТФазная активность, внутриклеточный пул АТФ.

SUMMARY

Sclyаr T.V. Peculiarities of energy metabolism of strains Neisseria
gonorrhoeae with different resistance to antibiotics. Manuscript.

The dissertation for scientific degree competition of candidate of
biological science by specialty 03.00.07 – Microbiology – Zabolotny
Institute of Microbiology and Virology Ukrainian National Academy of
Sciences, Kyiv, 2005.

The dissertation is dedicated to studying of fundamental biological
properties and energy processes wich take place on the membrane of
gonococci resistance to antibiotics. The results of the main parameters
of the gonococci strains growth are given this work, the principal
factors of pathogenicity were explored, the basic sources of the
converted energy of the reseached strains were defined, generation
protonmotive force was studied, ATPase activity and the content of the
intracellular ATP were determined.

The optimum composition of the culture medium for cultivation
N. gonorrhoeae with 20% content of cattle serum (CS) was selected and it
was determined that the optimum development of the reseaching strains
occures when pH = 6,8-6,9 the temperature is 36,5oC-37,5oC. The
dependence on the factors of pathogenicity in the reseached strains
gonococci from resistance to antibiotics was shown.

For the first time it was determined that there are two main sources of
the converted energy in the cells of the reseached strains:
transmembrane difference of the electrochemical potentials and
intracellular pool ATP. It was shoun that the brining oh the difference
of the electrical potential or gradient of pH on the membrane of
gonococci induce the synthesis ATP, formation of the ionic gradients.
The content of ATP in the gonococcus cells is in limit from 0,053 till
0,064 mM.

For the first time it was determined the magnitude of the protonmotive
force (183-192 mv) cells N. gonorrhoeae and its components:
transmembrane difference of the electrical potentials (103-145 mv) and
concentration gradient of protons (80-47 mv). Transmembrane
electrophoresis of the penetrative ions TPP+ and PCB– showed that the
membrans of the intact cells and the membranes of the gonococcus
vesicles contain theree types of generators of the membrane’s potential:
respiratory chain, ATPase and transhydrogenase.

It was determined for the first time that the reseched strains Neisseria
gonorrhoeae resistance to antibiotics have ATPase activity 2,0-2,5
higher than sensitive it can attest more intensive energetic metabolism.

Key words: Neisseria gonorrhoeae, protonmotive force, transmembrane
diference of the electrical potential, concentration gradient of
protons, ATPase activity, intracellular pool of ATP.

PAGE \* Arabic 30

рН

рН

??

?p?

??

?p?

?р, ??, ?p?, мВ

?р, ??, ?p?, мВ

мМ, АТФ

Рис. 3. Вплив інгібіторів енергетичного обміну на синтез АТФ у клітинах
штаму “В” при наведенні К+-градієнту (середовище інкубації: 40 мМ
трис-HCl, рН 7,4; 10 мМ KCN, 0,8 мг білку на 1 мл)

Контроль ХКФ (10-5М) ДЦКД (10-4М)

Штами

Штами

Похожие записи