НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

СИБІРНА Наталія Олександрівна

УДК 577.15: 616.379-008.64-07:616-008.

852+616-008.851+616.115.34-07

Молекулярні основи змін структурно-функціонального стану клітин крові за
умов цукрового діабету 1-го типу

03.00.04 — біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005 Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського
національного університету імені Івана Франка

Науковий консультант – доктор біологічних наук, професор

ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович,

Київський національний
медичний університет

імені О.О.Богомольця,

професор кафедри
біоорганічної, біологічної та

фармацевтичної хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

КУЧЕРЕНКО Микола
Євдокимович,

Київський національний
університет

імені Тараса Шевченка,

головний науковий
співробітник кафедри біохімії;

доктор медичних наук,
старший науковий співробітник

МИКОША Олексій Степанович,

Інститут ендокринології та
обміну речовин

імені В.П. Комісаренка АМН
України,

головний науковий
співробітник лабораторії

гормональної регуляції
обміну речовин;

доктор біологічних наук,
професор

КІБІРЄВ Володимир
Констянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії
білка.

Провідна установа — Інститут фізіології імені О.О.Богомольця НАН
України,

відділ експериментальної
кардіології

Захист відбудеться „ 28 ” лютого 2005 р. о 14 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України ( 01601, Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В.Паллладіна НАН України ( Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий „ 27 ” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) є однією з найголовніших
проблем медицини і належить до трійки захворювань, які найчастіше
виявляються причиною ранньої інвалідності і летальності серед населення
практично у всіх країнах світу. ЦД супроводжується порушеннями
вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до
формування ряду ускладнень, зокрема, інтенсифікації процесів зсідання
крові при одночасному гальмуванні механізмів фібринолізу. Для мікро- та
макроангіопатії, які розвиваються за умов ЦД, поряд із прискореним
прогресуванням атеросклерозу характерним є порушення кровообігу та
підвищення ризику тромбозу, що може бути причиною раптової смерті.
Найбільш важливими функціональними змінами, що викликають ангіопатії є
підвищення проникності судинної стінки, гемодинамічні розлади, зміни
в’язкості крові, субактивація нейтрофільних гранулоцитів (НГ) і
порушення адгезивної та агрегаційної здатності тромбоцитів, які є
узалежненими від їхнього морфофункціонального стану.

Аналіз біохімічного та патофізіологічного профіля системи крові ссавців
та людини при цукровому діабеті показав, що залежність проліферативної і
функціональної активності її клітин від інсуліну є функцією еволюційного
часу даної системи, а сам гормон володіє властивостями спільного
гемопоетину. Вивчення функціонального стану системи еритрона за умов
інсулінзалежного цукрового діабету є актуальним, оскільки для цієї
патології харктерне посилення гіпоксії тканин пропорційно до розвитку
діабетичних ускладнень.

Кров’яним пластинкам, еритроцитам та нейтрофілам належать провідні ролі
у патогенезі пізніх діабетичних ускладнень. Підтвердження гіпотези про
первинність порушень функціонального стану ендотеліоцитів у патогенезі
ангіопатій за умов цього захворювання та включення у комплексну терапію
антиагрегантів послужило поштовхом до дослідження молекулярних
механізмів активації тромбоцитів та НГ, опосередкованих впливом оксиду
азоту, продуктами вільнорадикального окислення і змінами в процесах
сигналювання під дією індукторів агрегації. Виявлення змін у
функціонуванні протеїн- та ліпідкіназ, з’ясування причин підвищеної
чутливості кров’яних пластинок та НГ до агоністів дозволить вести
ефективний пошук нових медичних препаратів скерованої дії для лікування
діабетичних ангіопатій.

Підвищена агрегаційна здатність кров’яних пластинок при цукровому
діабеті є наслідком дії ряду факторів. Сповільнення швидкості
метаболізму NO, інгібування активності основних ферментів
антиоксидантного захисту та пов’язана з цим інтенсифікація процесів
перекисного окислення ліпідів призводять до зниження плинності
плазматичної мембрани. Зростання рівня глікозилювання рецепторів на
поверхні клітин крові, інтенсифікація обміну фосфоінозитидів, зміна
активності NO-синтази (NOS), підвищення внутрішньоклітинної концентрації
Са2+ спричиняє активацію сигнальних мереж, що забезпечують реалізацію
біологічних відповідей, включаючи зміни в архітектурі цитоскелету,
адгезії і метаболізмі клітин. Провідна роль у перебудові актинового
цитоскелету належить сигнальним шляхам, залежним від низькомолекулярних
GTP-зв’язуючих білків (G-білків). Порушення функціонування сигнальних
білків є однією з основних причин, що пояснюють підвищену чутливість
тромбоцитів до дії агоністів.

Тривала гіперглікемія спричиняє збудження НГ, аналогічне стану
активації. Під впливом гіперглікемії відбувається лише попередня,
неповна активація клітин, яка супроводжується чітко вираженим станом
пониженої функціональної активності нейтрофілів у хворих на ЦД. У свою
чергу перехід у збуджений стан поліморфноядерних лейкоцитів спричиняє
суттєве посилення екстрацелюлярних патологічних процесів, які руйнують
організм.

За умов ЦД чітко виражений зв’язок між рівнем продукування NO в
організмі і проявами окислювального стресу, який характеризується різким
зниженням вмісту оксиду азоту в кров’яному руслі на фоні накопичення
вільних радикалів кисню і перекисів. З’ясування особливостей
функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ) та NO-залежних
сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану клітин крові
дозволить розширити наші уявлення про механізми виникнення і розвитку
мікро- та макроангіопатій за умов ЦД 1-го типу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету
Львівського національного університету ім. Івана Франка згідно плану
науково-дослідної роботи кафедри за темами: 1). “Діагностика та розробка
засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№
держреєстрації 0193U024092); 2). „Регуляторна дія NAD та
гістидинумісних дипептидів у корекції метаболічних порушень при гіпоксії
різної етіології” (№ держреєстрації 0100U001443 ); 3).
„Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові
за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).

Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було дослідження
молекулярних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та
функціонального стану клітин крові ( тромбоцитів, еритроцитів,
мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитів) та пошук шляхів корекції
патологічних змін метаболічних процесів, які викликають виникнення і
розвиток ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

Дослідити активність NO-синтази в тромбоцитах, еритроцитах та лейкоцитах
у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам per os її
субстрату (L-Arg) та неселективних конкурентних інгібіторів L-NAME
(N?–nitro-L-arginine methyl ester) і L-NMMA
(N?-nitro-monomethyl-L-arginine) та селективного неконкурентного
інгібітора iNOS – AG (аміногуанідину).

Оцінити вплив L-Arg, L-NAME та AG на стан системи антиоксидантного
захисту та рівень перекисного окислення ліпідів у кров’яних пластинках
та еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального
стрептозотоцинового діабету.

Дослідити роль внутрішньоклітинних сигнальних білків
(фосфатидилінозит-3-кінази , с-Src протеїнкінази, високоафінних GTPаз
Rac, Rho та Cdc42) в активації тромбоцитів при ЦД 1-го типу.

Вивчити вплив селективного інгібітора фосфатидилінозит-3-кінази
( РІ-3-кінази) вортманіну на активність NOS та агрегаційну
здатність тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

Дослідити ультратонку структуру тромбоцитів після впливу L-Arg, L-NAME,
AG та вортманіну in vitro та in vivo у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

Дослідити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним
стрептозотоциновим діабетом.

З метою дослідження процесів депонування NO за умов модельного ЦД 1-го
типу дослідити динаміку вмісту лігандних форм Hb та процес нітрозування
Hb in vitro, а також проаналізувати електронні спектри HbNO у нормі, за
умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення селективного
інгібітора iNOS – аміногуанідину.

Дослідити зміни структурно-функціонального стану лейкоцитів периферичної
крові за умов ЦД 1-го типу, охарактеризувавши фагоцитарну активність,
стан бактерицидної системи, клітинного і гуморального імунітету,
вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів нейтрофільних
гранулоцитів, апоптоз імунокомпетентних клітин та активність і
локалізацію ключового фермента глюконеогенезу —
фруктозо-1,6-дифосфатази.

Об’єкт дослiдження: тромбоцити і еритроцити контрольних щурiв та тварин
із експериментальним стрептозотоциновим діабетом, а також еритроцити,
лейкоцити та кров’яні пластинки здорових донорів та людей, хворих на ЦД
1-го типу, з констатованими ангiопатiями.

Предмет дослiдження: ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та
індуцибельна NOS) і ферментативна система антиоксидантного захисту
(супероксиддисмутаза — СОД, каталаза, глутатіонпероксидаза — ГПО,
глутатіонредуктаза — ГР, рівень продукції оксиду азоту — NO2Ї та NO3Ї) і
перекисного окислення ліпідів ( ПОЛ — ТБК-позитивні продукти),
агрегаційна здатність тромбоцитів та нейтрофільних гранулоцитів,
ультраструктура кров’яних пластинок на фоні впливу досліджуваних речовин
in vitro та in vivo, РІ-3-кіназа, с-Src протеїнкіназа, високоафінні
GTPази — Rac, Rho та Cdc42, лігандні форми гемоглобіну, функціональний
стан лейкоцитів, фруктозо-1,6-дифосфатаза.

Методи дослiдження: біохімічні, молекулярно-біологічні, методи
трансмісійної електронної мікроскопії та абсорбційної спектроскопії,
цитологічні, імуноцитохімічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Застосування сучасного методу
дослідження агрегації тромбоцитів за декількома параметрами дозволило
встановити, що тромбоцити в периферичній крові при ЦД 1-го типу
знаходяться в активованому стані та виявляють підвищену чутливість до
дії агоністів агрегації – ADP та тромбіну.

Отримані результати свідчать, що еNOS не є домінуючою в регуляції
агрегаційної активності тромбоцитів при діабеті. Вперше показано, що
високий рівень продукції оксиду азоту в тромбоцитах за умов
досліджуваної патології забезпечується активацією індуцибельної
NO-синтази, значна експресія якої була продемонстрована імуноцитохімічно
та за допомогою імуноблотингу з використанням моноклональних антитіл.

Вперше виявлено, що в основі активації тромбоцитів лежать зміни їхньої
ультраструктурної організації та кількісний перерозподіл фракцій білків
цитоскелету. Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних
ефекторних білків з низькомолекулярними G–білками підродини Rho за умов
ЦД 1-го типу. Встановлено підвищення рівня фосфорилювання по тирозину
ряду специфічних білків тромбоцитів у хворих на ЦД 1-го типу та
проаналізовано динаміку його зміни в процесі агрегації, індукованої
тромбіном. Виявлені закономірності фосфорилювання білків кров’яних
пластинок при даній патології свідчать про активацію внутрішньоклітинних
сигнальних шляхів, які залучені у процес агрегації тромбоцитів.

Вперше продемонстровано динаміку перерозподілу внутрішньоклітинного пулу
ключових сигнальних білків с-Src-кінази та РІ-3-кінази у тромбоцитах
хворих на ЦД 1-го типу між цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями.
Встановлено, що процес транслокації с-Src кінази у цитоскелетну фракцію
тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу опосередковується
SH3-доменом молекули ферменту. Посилення включення протеїнкінази с-Src у
цитоскелетну фракцію у кров’яних пластинках при ЦД 1-го типу свідчить
про її активацію.

Вперше показано коригуючий вплив AG — інгібітора індуцибельної ізоформи
NOS та неферментативного глікозилювання — на активність ферментів
антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення
ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів та кров’яних пластинок
щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості у периферичній
крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у
поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм
розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та
при ЦД 1-го типу на фоні введення основного субстрату та інгібіторів
NO-синтази. Показано, що за умов ЦД у еритроцитах значно зростає
активність іNOS та інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.

Встановлено, що ЦД 1-го типу супроводжується змінами функціонального
стану лейкоцитів і перерозподілом вуглеводних детермінант
глікопротеїнових рецепторів НГ та зростанням активності NOS у
мононуклеарних та поліморфноядерних клітинах білого ряду. За здатністю
нейтрофільних гранулоцитів до лектиніндукованої агрегації показано
збільшення вмісту N-ацетил-?,D-глюкозамінo- та N-ацетилнейраміновмісних
і зменшення ?,D-манозо-, ?,D-глюкозо-, N-ацетил-?,D-галактозамінo- та
?,D-галактозовмісних глікокон’югатів у складі вуглеводних детермінант
глікопротеїнових рецепторів цих клітин у хворих на ЦД 1-го типу.

Виявлено суттєве зростання частоти морфологічних ознак апоптозу та
збільшення числа CD95-позитивних нейтрофільних гранулоцитів і CD95
-позитивних мононуклеарних клітин крові за умов ЦД 1-го типу.

Досліджено активність та внутрішньоклітинну локалізацію
фруктозо-1,6-дифосфатази – ключового фермента глюконеогенезу у
мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитах людей у нормі та за умов
ЦД 1-го типу.

Практичне значення одержаних результатів. Оскільки введення AG викликало
зниження рівня глюкози, глікозильованого гемоглобіну і вмісту продуктів
ПОЛ, нормалізувало активність ферментів системи антиоксидантного захисту
та здійснювало коригуючий вплив на морфофункціональний стан клітин крові
та депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання Hb за
умов ЦД 1-го типу, доцільно на його основі вести пошук та розробку нових
фармакологічних препаратів для комплексної терапії ЦД, скерованих на
нормалізацію функціональної активності кров’яних пластинок та системи
транспорту кисню.

Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних ефекторних
білків з низькомолекулярними G–білками підродини Rho за умов ЦД 1-го
типу можуть бути покладені в основу молекулярної діагностики генетичних
передумов маніфестації і прогресування захворювання.

Комплексне цитохімічне вивчення функціонального стану нейтрофілів з
використанням у якості індукторів агрегації лектинів є новим напрямком
розробки діагностичних і прогностичних підходів у терапії даної
патології. Використаний нами набір лектинів для дослідження агрегаційної
здатності нейтрофілів є оптимальним з точки зору інформативності
отриманих результатів для характеристики вуглеводної специфічності
рецепторного апарату НГ. Така тест-система є перспективною для
з’ясування патогенезу даної патології.

Співпадіння напрямленості та пропорційність змін величини апоптичних
індексів за морфологічними апоптичними ознаками та за визначенням
CD95-позитивних лейкоцитів, може бути основою для рекомендації щодо
використання у клінічній лабораторній практиці морфологічного аналізу
апоптозу як дешевшого і більш доступного, але водночас достовірного
критерію.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах, які
читаються на кафедрах біохімії біологічних факультетів університетів.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто
або за безпосередньої участі. Дисертаційна робота – завершене
дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних
досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1992-2004
рр. Дисертантом особисто обгрунтовано концепцію роботи, розроблено
методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних
літератури, запропоновано гіпотетичні схеми. Основні положення і
висновки обговорено та сформульовано разом із науковим консультантом —
доктором біологічних наук, професором кафедри біоорганічної, біологічної
та фармацевтичної хімії Київського національного медичного університету
імені О.О.Богомольця Великим М.М. Робота виконана у межах
держбюджетних тематик, які виконувалися на кафедрі біохімії Львівського
національного університету імені Івана Франка, науковим керівником
однієї з яких є автор. Частина досліджень була виконана у відділі
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України у
рамках договору про співпрацю між відділом і кафедрою біохімії.
Електронно-мікроскопічні дослідження виконано в Міжфакультетській
лабораторії електронної мікроскопії Львівського національного
університету імені Івана Франка спільно із завідувачем лабораторії
к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Співучасть співробітників кафедри
біохімії , відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології та
лабораторіі електронної мікроскопії у виконанні роботи відмічена у
спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були
представлені на Українських біохімічних з’їздах: VІ ( Київ, 1992), VІІ
(Київ, 1997), VІІІ (Чернівці, 2002), на V Міжнародній конференції
„Биоантиоксидант” (Москва, 1998), на науково-практичних конференціях —
Международные дни диабета „ Диабет-проблема общечеловеческая”
(Дніпропетровськ 1999, 2003), на VІІІ Конгресі Світової Федерації
Українських Лікарських Товариств (Трускавець-Львів, 2000), на VI
Всеукраїнському з’їзді ендокринологів (Київ, 2001), на V Європейському
конгресі з ендокринології (Турин, Італія, 2001), на ІV конференції імені
Парнаса (Вроцлав, Польща, 2002), на ІІІ з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002), на науково-практичній конференції “Актуальні
проблеми тромбозу і порушень гомеостазу в клінічній медицині” (Київ,
2003), на ІІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та
клінічної біохімії (Львів, 2004), на Установчому З’їзді Українського
Товариства клітинної біології (Львів, 2004), на ІV Національному
конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), на 29 конгресі
Федерації Європейських біохімічних товариств — FEBS (Варшава, Польща,
2004), на Пленумі з клінічної лабораторної діагностики (Київ, 2004), на
міжнародній науково-практичній конференції „Сучасний стан і проблеми
експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 46 робіт, з яких 26 —
статті у фахових наукових журналах і збірниках, 20 — тези доповідей у
матеріалах наукових з’їздів, конференцій та конгресів.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладеня на 321 сторінці
друкованого тексту і складається зі вступу, аналітичного огляду
літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів власних
досліджень, аналізу та узагальнення досліджень, висновків та списку
літератури. Текст дисертації ілюстрований 48 рисунками та 30 таблицями.
Перелік використаних джерел становить 452 посилання.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано
сучасні дані стосовно виникнення і розвитку цукрового діабету 1-го типу.
Охарактеризовано систему L- аргінін/ оксид азоту та її вплив на
ферментативну антиоксидантну систему, а також на морфофункціональний
стан тромбоцитів, еритрону та лейкоцитів у нормі і за умов цукрового
діабету.

Матеріали і методи досліджень. У роботі були викopиcтaні моноклональні
анти-р85? антитіла, люб’язно надані д-ром І. Гутом (Людвігівський
інститут ракових досліджень, Лондон, Велика Британія), моноклональні
анти-iNOS антитіла (“Sigma”, США), поліклональні анти-FBPase (“Sigma”,
США), анти-мишачі IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Sigma”, США),
анти-кролячі козячі кон’юговані з золотом антитіла ( Anti-rabbit IgG
gold conjugated, Sigma, США), анти-мишачі IgG кон’юговані з золотом
антитіла (Anti-mouse IgG, Sigma, США), анти с-Src поліклональні антитіла
(“Santa Cruz Biotechnology” CША ), нітроцелюлозна мембрана (“Osmonics”,
США), реагенти для посиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика
Британія) та набори реактивів для виділення плaзмідної ДНК “NucleoSpin
System” (“NT”, Велика Британія).

Бактерії E.coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene” США) вирощували в
середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії
штаму BL-21 з плазмідою резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі
LB з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл,
відповідно) на шейкері при 370С. Для трансформації E. coli штаму Bl-21
використовували відповідні pGEX-2T плазмідні вектори, люб’язно надані
д-ром І. Гутом.

Забір крові проводили з пальця або вени у стерильні силіконізовані
пробірки. При дослідженні фунціонального стану сегментоядерних
нейтрофілів процесу згортання запобігали попередньо додавши в посуд
гепарин (кінцеве розведення 1:100). Для оцінки імунного статусу
використовували кров, яку отримували з вени, у якості антикоагулянта
використовували 1,5% водний розчин ЕДТА (на 2 мл крові брали 0,1 мл
розчину).

Експериментальний цукровий діабет у щурів викликали введенням
стрептозотоцину фiрми “Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла
внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в
крові, яку визначали з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія)
[Tringer, 1969]. В експериментi використовували тварин із рівнем глюкози
14-16 ммоль/л. Вплив L-аргініну, L-NMMA, L-NAME та AG оцінювали in
vitro: при інкубації периферичної крові людей з цими речовинами та in
vivo: при введенні цих речовин per os з питною водою щурам. У дослідах
in vitro проби інкубувалася 10 хв при 37?С з L-аргініном (“Reanal”,
Угорщина) — субстратом досліджуваного фермента, а також з інгібіторами:
з L-NMMA (“Beckenham”, Велика Британія), L-NAME (“Beckenham”, Велика
Британія) та з аміногуанідином (“Sigma”, США). Кінцева концентрація усіх
речовин, використаних для інкубації – 10 мкМ. У експериментах in vivo з
моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини
з питною водою : L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів;
L-NMMA та L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у
концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких
групах:1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + L-NMMA;
5. К + AG; 6. Діабет (Д); 7. Д + L-аргінін; 8. Д + L-NAME; 9. Д +
L-NMMA; 10. Д + AG.

Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий
О.І., 1998]. Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому
через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту,
який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні
розчинів NaNO2 та аскорбінової кислоти [Gross S.S., 1999].

Забір крові для отримання тромбоцитів людей, хворих на ЦД 1-го типу,
проводили зранку (натще і до прийому інсуліну) у силіконізовані
пробірки, що містили 1:10 об’єму 3,8%-ного розчину цитрату натрію у
якості антикоагулянту і 1,5 од/мл апірази (“Fluka”, Швейцарія).
Агрегаційну здатність кров’яних пластинок досліджували у збагаченій
тромбоцитами плазмі на автоматичному аналізаторі “Биола” (Росія) згідно
з [Gabbasov et al., 1989]. Збагачену тромбоцитами плазму інкубували з
вортманіном (кінцева концентрація 100 нМ) протягом 30 хв.при кімнатній
температурі.Тромбоцити виділяли шляхом диференційного центрифугування
згідно роботи [Ferrell et al., 1989]. Лізис тромбоцитів проводили
протягом 30 хв на льодяній бані холодним буфером лізису такого складу:
10 мМ трис-HCl, 150мМ NaCl, 1% тритон Х-100, 5мМ ЕДТА, 50мМ NaF, 1мМ
фенілметилсульфонілфторид (“Fluka”, Швейцарія), 5мМ бензамідин
(“Sigma”), 10мкг/мл апротиніну (“Sigma”), 10мкг/мл лейпептину (“Sigma”),
2мкг/мл пепстатину (“Fluka”), 0,25 мМ Na3VO4 1:10 за об’ємом.
Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням при 12000 g і
40С протягом 15 хв. Дослідження активності ферментів проводили в
супернатанті. Концентрацію білка вимірювали за методом [Peterson, 1977].
Супероксиддисмутазну активність (СОД, КФ 1.15.1.11) визначали методом,
який ґрунтується на відновленні нітросинього тетразолію супероксидними
радикалами [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6)
визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом
амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (ГПО, КФ
1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток
кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана
[Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] оцінювали
за зменшенням вмісту NADPH [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що
реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали
за методикою [Тимирбулатов и др., 1981]. Активність NO-синтази визначали
як описано в роботах [Онуфриев М.В.,1995, Сумбаев, 2000] у нашій
модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих
продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989],
нітратів за методом [Cawse, 1967]. Глікозильований гемоглобін визначали
колориметричним методом [van Kampen, 1983]. Білки лізатів тромбоцитів
розділяли електрофорезом в блоках градієнтного (5-18%) поліакриламідного
гелю в присутності SDS [Laemmli, 1970] з наступним імуноблотингом
[Towbin, 1979]. Денситометричний аналіз результатів імуноблотингу
здійснювали з використанням пакету програми “Image Tool”.

Білок-білкові взаємодії вивчали in vitro з використанням кон’югованих з
глутатіон-S-трансферазою (GST) рекомбінантних форм GTPаз. Очистку
GST-кон’югованих білків із оброблених на ультразвуковому дезінтеграторі
(УЗДН-1, Росія) бактерійних лізатів здійснювали за допомогою
глутатіон-сефарози 4B (“Pharmacia Biotech”, Швеція) згідно протоколу
фірми — виробника. Білки, що специфічно зв’язались із
глутатіон-сефарозою, розділяли електрофорезом в блоках градієнтного
(5-18%) ПААГ в присутності SDS. Для оцінки рівня неспецифічного
зв’язування лізати тромбоцитів інкубували з GST-глутатіон-сефарозою.
Зафарбовування електрофореграм проводили за допомогою азотнокислого
срібла [Wray, 1981]. Для визначення молекулярної маси білків
використовували білкові стандарти фірм “Pharmacia” та “TRIZМA”.

Дослідження ультратонкої структури тромбоцитів проводили методом
трансмісійної електронної мікроскопії на зрізах за допомогою
електронного мікроскопа ПЕМ-100. Виділення, відмивання та фіксацію
тромбоцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою
[Васильева, 1982, Slot J.W.1983,].

Цитологічні методи дослідження клітин периферичної крові та кісткового
мозку виконувались згідно [Сибірна Н.О.,1997], імунологічні [Лаповець
Л.Є.,2002].

Статистичну обробку даних проводили з використанням коефіцієнту t
Ст’юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на морфофункціональний стан
тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу. Дослідження впливу L-аргініну та
інгібіторів NOS на морфофункціональний стан тромбоцитів проведено у
експериментах із введенням досліджуваних речовин per os контрольним
тваринам та на фоні стрептозотоцинового діабету. У таблиці 1 зведені
показники агрегаційної здатності тромбоцитів та суми вмісту кінцевих
продуктів метаболізму оксиду азоту: нітритів — NO2Їта нітратів — NO3Ї, у
збагаченій тромбоцитами плазмі, адже саме цей показник є індексом
продукції NO. У нормі введення L-аргініну викликало збільшення продукції
NO, який здійснював властивий йому фізіологічний вплив: знижується
агрегаційна здатність тромбоцитів і збільшується час агрегації.
Підтвердженням дії конкурентних інгібіторів у контрольній групі тварин є
достовірне зниження продукції оксиду азоту, що, відповідно, призводило
до зростання агрегації тромбоцитів більше ніж у два рази і до скорочення
часу агрегації у порівнянні до контролю. Незначне інгібування продукції
NO аміногуанідином свідчить про невеликий вклад iNOS у здійснення
фізіологічної регуляторної функції цією ізоформою у нормі.

При введенні L-аргініну, L-NMMA та L-NAME тваринам із експериментальним
діабетом ми не спостерігали яскраво вираженого регуляторного впливу NO
на агрегаційну здатність тромбоцитів. Основний і вирішальний вклад у
продукцію NO за умов інсулінзалежного цукрового діабету має
аміногуанідинзалежний синтез оксиду азоту, тобто синтез за участю iNOS.

Нами була досліджена ультраструктура тромбоцитів у нормі та за умов
інсулінзалежного цукрового діабету. При порівнянні мікроелектронограм
слід відмітити, що тромбоцити, виділені з крові хворих тварин, мають
характерні ознаки активації та деградації. Процес супроводжується
втратою тромбоцитами дископодібної форми, утворенням численних
псевдоподій. В самих клітинах відбувається зменшення електронної густини
та зниження кількості ?-гранул. Вони переміщаються до центру клітини та
зливаються з вакуолями поверхневовакуолярної системи, де їхній вміст
секретується у міжклітинний простір.

При введенні L-аргініну значно зростав рівень глюкози у крові тварин
(табл.1.), тобто усугублявся їхній патологічний стан. Електронограма
тромбоцитів цієї дослідної групи наглядно демонструє значні пошкодження
кров’яних пластинок. Введення AG знижувало рівень глюкози в крові і
вміст глікозильованого гемоглобіну за рахунок пригнічення
неферментативного глікозилювання білків, що, незаперечно, має
протекторний вплив на увесь організм за умов даної патології.

Отримані дані, на нашу думку, свідчать не просто про зміну рівня
продукції NO у тромбоцитах, а про перерозподіл вкладу у цей синтез
різних ізоформ NOS при інсулінзалежному ЦД, а також про зміну шляху його
утилізації. У нормі основну роль у продукції NO відіграє еNOS. Це
ендотеліальна конститутивна кальцій-кальмодулін (Са2+- СаМ)-залежна
ізоформа, котрій притаманна фізіологічно-регуляторна функція, яку вона
здійснює через продукцію помірних кількостей оксиду азоту (пікомолі). За
умов гіперглікемії, яка супроводжує ЦД, глікозилювання СаМ є однією з
причин зниження активності еNOS. Додатковим фактором зниження активності
цього ферменту є розвиток гіпоксичного стану, характерного для ЦД,
оскільки утворення оксиду азоту з L-аргініну за участю цієї ізоформи
відбувається в присутності кисню.

Таблиця 1

Зміни досліджуваних показників in vivo при введенні L –аргініну, L-NMMA,

L-NAME та аміногуанідину щурам у нормі і при стрептозотоциновому
діабеті,

( М?m, n=14)

Показники

Групи

NO2- + NO3- мкM

Вміст Hb A?c,

%

Ступінь агрегації, у.од.

Час агрегації, с Рівень глюкози в крові, ммоль/л

К 23,25 ± 0,45 4,53 ± 0,05 24,8 ± 0,42 192,5 ± 5,4 5,6 ± 0,5

К + L–арг 27,42 ±0,51* 4,47 ± 0,11 21,16 ± 0,3* 206,75± 9,4* 5,8 ± 0,6

К +

L-NAME 19,65 ±0,44* 4,60 ± 0,12 50,46 ± 0,7* 51,2 ±4,3* 6,9 ± 0,7*

К +

L-NMМА 14,53 ±0,62* 4,39 ± 0,23 48,7 ± 0,23* 48,5 ± 3,4* 5,8 ± 0,4

К + AG 21,7 ± 0,51 4,49 ± 0,07 30,8 ± 1,2* 120,3 ± 6,8* 5,16 ± 0,9

Д 32,6 ± 0,61* 8,81 ± 0,41* 61,7 ± 1,5* 62,3 ± 3,2* 12,5 ± 0,5*

Д + L–арг 29,3 ± 0,42** 9,92 ± 0,63** 55,4 ± 1,2** 89,5 ± 4,1** 14,2 ±
1,1**

Д +

L-NAME 13.5 ± 0.71** 8.01 ± 0.47 58.2 ± 0.9 49.8 ± 2.2** 12.2 ± 0.4

Д +

L-NMМА 10,7 ± 0,60** 7,92 ± 0,39 59,5 ± 1,1 43,1 ± 2,1** 11,9 ± 0,5

Д + AG 24,8 ± 0,80** 6,03 ± 0,28** 67,6 ± 1,5** 46,4± 4,2** 8,6 ± 0,4**

* — різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05 ** - різниця вірогідна порівняно із стрептозптоциновим діабетом, р<0.05 Натомість у тромбоцитах за умов ЦД 1-го типу відбувається значне посилення експресії іNOS, що показано нами методом імуноблот-аналізу ( рис.1.) Індуцибельній ізоформі NO-синтази властива висока продуктивність оксиду азоту (наномолі), а також О?-2. Взаємодія цих двох радикалів призводить до утворення нового, потужного оксиданта - пероксинітриту (ONOО-), і таким чином виключається сигнальна функція нестійкого оксиду азоту. У нормі нейтралізація ONOО- відбувається завдяки зв’язуванню його з тіолвмісними сполуками, такими як глутатіон. При ЦД вміст глутатіону в тромбоцитах знижується. Оскільки пероксинітрит є високореактивною сполукою, він приймає участь у внутрішньотромбоцитарних пошкодженнях білків, плазматичних мембран, ДНК, порушуючи тим самим функцію кров’яних пластинок. При патологічній гіпергенерації NO імовірність утворення ONOО- збільшується. У цих умовах NO з фактора регуляціі перетворюється у ланку патогенезу. Таким чином, у наших дослідженнях показано, що інгібітори NOS не виявляють антиагрегаційного впливу на кров’яні пластинки, але мають протекторний вплив на структуру тромбоцитів за умов інсулінзалежного ЦД. Найбільш яскраво виражену протекторну дію виявляв AG. Вплив L-аргініну мав протилежну напрямленість: він характеризувався зниженням агрегаційної здатності тромбоцитів, але мав посилюючу патологію дію на структуру цих клітин за рахунок підвищення продукції NO індуцибельною ізоформою NO-синтази. Рис. 1. Виявлення іNOS методом імуноблот-аналізу в лізатах тромбоцитів здорових (1) та хворих на ЦД 1-го типу донорів (2). Дослідження впливу L-аргініну, L-NAME та AG на активність NOS, рівень ПОЛ та стан системи АОЗ тромбоцитів щурів за умов експериментального діабету. NO у високих концентраціях може стати фактором, який відіграє важливу роль у перебігу патологічних станів. Характер рівноваги ПОЛ-АОС відображає рівень ендогенної інтоксикації в організмі і значною мірою узалежнений від рівня продукції NO. У хворих на ЦД 1-го типу порушена рівновага між інтенсивністю процесів ПОЛ та можливостями антиоксидантного захисту організму, а швидкість перекисного окислення перевищує здатність АОС нівелювати вплив надлишкової кількості вільних радикалів. Підвищення рівня NO сприяє ушкоджуючій дії продуктів ПОЛ і суттєво підсилює ефект вільнорадикального окислення. Ця обставина диктує необхідність пошуку і застосування усе нових антиоксидантів у комплексній терапії ЦД. Аналіз відомих способів і засобів послаблення токсичної дії NO і корекції патологічних станів, пов’язаних з його гіперпродукцією в організмі, свідчить про те, що лише використання інгібіторів NOS вибіркової дії, які пригнічують, передусім, індуцибельну ізоформу ферменту, є перспективним для усунення значної загальнотоксичної дії продуктів метаболізму NO, властивої їм як антиметаболітам. При зростанні концентрації NO вище наномолярного рівня оксид азоту функціонує як внутрішньоклітинна пастка для О?-2, адже це єдина молекула, яка конкурує із СОД за даний субстрат. Це може модулювати активовані АФК сигнальні шляхи або залучати альтернативні, які активуються NO. Тому стан антиоксидантної системи за досліджуваних умов нами розглядався у ракурсі зміни активності NOS. У таблиці 2 представлені дані активності NOS у тромбоцитах щурів у нормі та за умов ЦД, а також на фоні введення досліджуваних речовин. Характеризуючи динаміку змін цього показника у нормі, слід вказати, що введення L-Arg викликало збільшення активності NOS, а неспецифічний інгібітор - L-NAME, який є структурним аналогом L-Arg і конкурентно інгібує усі ізоформи NOS, значно знижував вихідний рівень активності фермента. AG – селективний інгібітор іNOS, мав дуже слабку дію, що свідчить про незначний вклад індуцибельної ізоформи у сумарну активність NOS у нормі. За умов індукованого стрептозотоцином діабету ми спостерігали іншу картину. Введення L-Arg викликало зниження активності NOS. Імовірно, такий ефект можна пояснити інгібуванням активності фермента за принципом негативного зворотного зв’язку за умов значного збільшення концентрації NO. Оксид азоту має здатність зв’язуватися з гемовою групою ферменту, знижуючи тим самим його активність [Albakri Q.A.,1996]. При введенні інгібіторів за умов ЦД спостерігалося пригнічення активності NOS у тромбоцитах щурів. Цікаво відзначити, що зниження активності цього ферменту при введенні AG за умов ЦД є у три рази стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов патології. Аналіз вмісту ТБК-позитивних продуктів та активності СОД, каталази, ГР і ГПО в тромбоцитах (табл. 2.) свідчить про порушення рівноваги між інтенсивністю процесів ПОЛ і функціонуванням системи антиоксидантного захисту за умов цукрового діабету 1-го типу. Введення L-аргініну та інгібіторів NO-синтаз як у нормі, так і за умов ЦД мало ефект підвищення супероксиддисмутазної активності різного ступеня. Каталаза реагувала на запропоновані модельні ситуації подібним чином. Глутатіонпероксидазна активність у випадку індукованого стрептозотоцином діабету на фоні введення L-Arg не зазнавала суттєвих змін, в той час як інгібітори мали нормалізуючий вплив, тобто підвищували її активність. Введення аргініну призводило до підвищення активності ГР лише у нормі, тоді як інгібітори NO-синтаз однаковою мірою знижували цей показник тільки у випадку ЦД. Аналізуючи зміни активності ферментів системи АОЗ організму в контексті динаміки змін вмісту ТБК-позитивних продуктів на фоні введення інгібіторів NO-синтази, слід відмітити антиоксидантні властивості L-NAME та AG, введення яких супроводжувалося нормалізацією співвідношення процесів ПОЛ та інактивації АКМ. Таблиця 2 Умови Показники NO-синтаза, нмоль NADPH за 1хв на 1 мг білка СОД, ум. од. на 1 мг білка Каталаза, мкмоль Н2О2 за 1 хв на 1 мг білка ГПО, нмоль GSH за 1 хв на 1 мг білка ГР, нмоль NADPH за 1 хв на 1 мг білка ТБК – позитивні продукти, нмоль на 1 мг білка Контроль 0,38±0,05 1,85?0,03 3,80?0,10 580,20?23,50 105,11?8,56 3,98?0,25 Діабет 0,87±0,09 * 1,12?0,09 * 2,70?0,09 * 406,14?15,10 * 161,73?6,87 * 7,08?0,25 * К + L-Arg 0,56±0,05 * 2,41?0,11 * 4,03?0,28 638,22?17,42 137,69?9,73 * 4,46?0,39 Д+L-Arg 0,62±0,02** 1,41?0,07** 3,53?0,14** 458,94?29,71 153,64?13,45 7,61?0,08 К + L-NAME 0,21±0,02 * 2,22?0,08 * 4,59?0,17 * 661,43?51,7 129,28?10,71 4,45?0,33 Д + L-NAME 0,45±0,04** 1,57?0,09** 3,46?0,29** 491,14?17,93** 108,54?9,81** 5,09?0,28** К + AG 0,33±0,03 2,09?0,13 4,74?0,39* 655,63?21,81 * 122,97?11,71 4,18?0,23 Д + AG 0,48±0,03** 1,57 ?0,12** 3,64?0,29** 507,67?19,98** 107,11?8,33** 5,06?0,44** Активність ферментів антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів у тромбоцитах щурів за досліджуваних умов, (M?m, n=8-10) * - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,05; ** - різниця вірогідна порівняно із стрептозотоциновим діабетом, р<0,05. Особливо потрібно відзначити позитивний вплив AG, що може надавати йому статус антиоксиданта. Детекція рівня p85? регуляторної субодиниці PI-3-кінази в лізатах тромбоцитів. Морфофункціональний стан тромбоцитів людини в нормі тісно пов’язаний з функціонуванням як NOS, котра продукує дезагрегуючий фактор - NO, так і РІ-3-кінази, яка сприяє процесам незворотної агрегації кров’яних пластинок [Pigazzi A.,1999]. Такий різнонапрямлений вплив є цікавим у разі дослідження патології, пізні ускладнення якої до певного ступеня зумовлені зміною морфофункціонального стану тромбоцитів, тобто за умов ЦД. З використанням методу імуноблот-аналізу нами було виявлено, що в лізатах тромбоцитів хворих на ЦД 1-го типу, вміст регуляторної субодиниці p85? РІ-3-кінази значно вищий, ніж у лізатах тромбоцитів здорових донорів (рис.2.). Це може бути однією із причин преактивації кров’яних пластинок за умов досліджуваної патології, яка виявляється у їхній підвищеній чутливості до агоністів агрегації. Вплив селективного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну на активність NOS, агрегаційну здатність та на ультратонку структуру тромбоцитів. Дослідження впливу селективного неконкурентного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну на продукцію NO та агрегаційну здатність тромбоцитів здорових донорів та хворих на ЦД 1-го типу представлені в таблиці 3. Отримані показники АDP-індукованої агрегації тромбоцитів здорових людей та хворих на ЦД 1-го типу після інкубації з вортманіном ілюструють ефект падіння агрегаційної здатності кров’яних пластинок у нормі, що є результатом адитивної дії підвищеного вмісту NO та інгібування РІ-3-кінази, і відсутність такого ефекту при патології. Вортманін має, незаперечно, сильно виражений вплив на стан білків цитоскелету тромбоцитів у нормі. На електронограмах кров’яних пластинок здорових донорів після інкубації з вортманіном видно абсолютно інертні клітини. ?-гранули та щільні тільця рівномірно розподіляються у цитоплазмі, тромбоцити мають округлу форму, характерну для незбудженої клітини. У хворих донорів кров’яні пластинки залишаються збудженими, їхній грануломер переміщений у центр клітини, є псевдоподії. Таблиця 3 Вміст нітритів і нітратів та агрегаційна здатність тромбоцитів після інкубації з вортманіном плазми, збагаченої тромбоцитами, здорових донорів та людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу (М±m, n=8-10) Показники Умови Ступінь агрегації, ум.од. Час агрегації, сек NO2- + NO3-, мкМ Контроль 23,90±0,15 220 ±20 18,87±0,67 Контроль+вортманін 7,60±0,44* 50±4* 21,61±0,45* Діабет 53,80±2,50* 54±5* 24,37±0,50* Діабет+вортманін 48,10±2,10 41±6** 23,87±0,87 * - p<0,05 щодо здорових донорів; **- p<0,05 щодо хворих на ЦД 1-го типу. Вивчення динаміки транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної p85? субодиниці РІ-3-кінази за умов індукції агрегації кров’яних пластинок різними концентраціями ADP. Нами було проаналізовано вплив in vitro різних концентрацій індуктора агрегації ADP (0,5 мкМ; 1 мкМ; 5 мкМ) на рівень р85? тромбоцитів здорових людей та хворих на ЦД 1-го типу.Отримані результати дозволяють прослідкувати, як змінювався вміст р85? у цитозольній фракції тромбоцитів за досліджуваних умов, а також динаміку транслокації регуляторної субодиниці РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію, покажчик якої розраховувався нами як відсоток від вихідного рівня. У здорових донорів вміст р85? у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів спадає по мірі підвищення концентрації індуктора, а крива, яка характеризує динаміку транслокації РІ-3-кінази, констатує поступально зростаючу інкорпорацію у цитоскелетну фракцію. Для хворих на ЦД 1-го типу характерною є сповільнена інкорпорація при дії низьких концентрацій ADP (двофазна агрегація) і лише за умов дії високої концентрації агоніста агрегації (однофазна агрегація) були відмічені достовірні зміни вмісту р85? у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів та транслокації РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію кров’яних пластинок. Аналіз робіт, присвячених впливу NO на агрегаційну функцію тромбоцитів, свідчить про те, що він здійснюється на ранніх етапах активації кров’яних пластинок, тобто ще до інтегрин-залежної інкорпорації РІ-3-кінази у цитоскелет клітини [ Guinebault C., 1995]. Уповільнена транслокація РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу при дії ADP у низьких концентраціях на фоні високої агрегаційної здатності може свідчити про зниження контролю NO над процесами, що забезпечують зміни морфофункціонального стану кров’яних пластинок за умов досліджуваної патології. Аналіз спектру фосфотирозинвмісних білків тромбоцитів при ЦД 1-го типу. Процеси фосфорилювання і дефосфорилювання сигнальних білків відіграють ключову роль в активації тромбоцитів, оскільки стимуляція тромбоцитів агоністами супроводжується значним зростанням рівня фосфорилювання клітинних білків по залишках тирозину [Ferrell J.E., 1989]. На сьогоднішній день ідентифіковано декілька протеїнкіназ, які активуються під час стимуляції тромбоцитів агоністами, а їх інгібування блокує агрегацію тромбоцитів [Fox J.B.,1996, Lipfert L., 1992]. Аналіз загального спектру фосфотирозинумісних білків методом імуноблотингу показав, що рівень вихідного фосфорилювання ряду білків із молекулярною масою 125, 97, 68 кДа у нестимульованих тромбоцитах хворих на ЦД 1-го типу є вищим, ніж у тромбоцитах здорових донорів (Рис.3, треки 1, 5). Стимуляція тромбіном індукувала швидке зростання фосфорилювання білків, як в тромбоцитах здорових, так і хворих на ЦД людей, яке проходило у декілька етапів. На першому етапі, під час так званої ранньої хвилі фосфорилювання, у контролі зростав ступінь модифікації білків із молекулярною масою 125, 97, 68, 35, кДа. Друга хвиля фосфорилювання пов’язана із модифікацією білків р185/180, р125, р120, р97, р85, р70 та р56 (Рис. 3., треки 2-3). У тромбоцитах хворих на ЦД 1-го типу вже на 30 сек спостерігалось різке зростання фосфорилювання білків р125, р120 та поява фосфотирозинумісного білка з р85, який в контролі проявлявся тільки під час другої хвилі фосфорилювання. Цікаво, що на 30 сек спостерігалось зниження ступеня фосфорилювання білка р 42 та на 4 хв білків р180, р125, р42 та р35 у тромбоцитах хворих на ЦД. Очевидно, за цих умов відбувається активація компенсаторних механізмів клітини, в основі яких лежать процеси дефосфорилювання [Ezumi Y.,1995, Fox J.B,1996]. Особливості функціонування с-Src-кінази у тромбоцитах при ЦД 1-го типу. Однією з найбільш широко представлених фосфотирозинових протеїнкіназ у тромбоцитах, є с-Src-кіназа. Її вміст становить близько 0,4% від загальної кількості білка у тромбоцитах. Відомо, що с-Src кіназа під час стимуляції тромбіном активується і транслокується у цитоскелет кров’яних пластинок [Clark E.A.,1993, Dash D.,1995]. Імуноблотинг с-Src кінази за допомогою поліклональних антитіл у тритон X-100 розчинній фракції тромбоцитів здорових донорів та людей з ЦД 1-го типу представлений на рис. 4. Отримані результати свідчать, що у нестимульованих тромбоцитах, ізольованих із крові здорових донорів, основний пул с-Src-кінази зосереджений у тритон Х-100 розчинній фракції. Після додавання тромбіну, зменшення кількості протеїнкінази у детергент-розчинній фракції кров’яних пластинок у контролі відбувається поступово, пропорційно часу інкубації з тромбіном. Згідно даних літератури, в основі вказаного феномену лежить транслокація с-Src-кінази у цитоскелет [Clark E.A.,1993, Gutking J.S.,1990]. При ЦД 1-го типу рівень с-Src у детергент-розчинній фракції нестимульованих тромбоцитів був нижчим ніж у контролі (трек 2), що свідчить про активацію ферменту і, як наслідок, перерозподіл пулу с-Src між цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями. Динаміка рівня c-Src-кінази у детергент-розчинній фракції тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу при дії тромбіну характеризується чітко вираженим фазним характером: зниження на 30 сек і 4 хв та підвищення на 1 хв у порівнянні з контролем. $ B $ R > @ ¶ F

oe

O

„o

`„o

O

#

O

?uououeaueuUouUoueuauOeuouauIuCOeCOeau?uauauaCOeauu¦uou¦uauau¦u¦u¦uu

EHuy

$

O

O

O

$

O

$

O

>

@

~ ’ –
ueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoe
ueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeue?ea?e?e?e?
ue?UO?

O

$

O

oioieaeiUOioiIiAI?I?IµIµIµIµIµI®IµI®IµI®IµI®IµI®IµI®I®IµI®IµIµIµI®

???`??

???

O

h //

$

O

»

O

»

O

O

»

O

?

?

O

O

?

?

O

»

O

O

?

?

O

»

O

»

O

»

O

»

O

O

O

печується білок-білковими взаємодіями, опосередкованими SH3-доменом
ферменту, за рахунок розпізнавання пролін-багатих послідовностей у
білках мішенях [Brown M.T.,1996, Malarkey K.,1995]. Для з’ясування
можливих змін у функціонуванні с-Src-кінази при цукровому діабеті нами
був використаний такий методичний підхід, як зв’язування білків лізатів
тромбоцитів із рекомбінантним SH3-доменом с-Src-кінази, кон’югованим з
GST, in vitro. При відсутності стимуляції зв’язування білків з
SH3-доменом у контролі відсутнє. За цих же умов при ЦД 1-го типу ми
спостерігали асоціацію SH3-домену з білком з мол масою 70 кДа.
Стимуляція тромбіном контрольних тромбоцитів викликала поступове
зростання рівня зв’язування білків, які мають молекулярні маси 80, 70,
65, 68, 29 кДа з рекомбінантним SH3-доменом.

За умов ЦД 1-го типу динаміка асоціації SH3-домену з вказаними білками
характеризувалась фазним характером, причому зв’язування з білками
спостерігалось на 30 сек і на 4 хв стимуляції. Отримані результати
корелюють з даними імуноблотингу с-Src-кінази. Таким чином, отримані
результати свідчать про те, що SH3-домен c-Src кінази відіграє виключно
важливу роль у транслокації молекули до цитоскелету у нормі та за умов
ЦД 1-го типу.

Рис. 4. Імуноблотинг с-Src-кінази у Тритон Х-100 розчинній фракції
нестимульованих тромбоцитів, ізольованих із крові здорових донорів (1)
та людей, хворих на ЦД 1 –го типу (2).

Виявлені зміни зв’язування SH3-домену c-Src з ефекторними білками можуть
свідчити про порушення процесів полімеризації та реполімеризації актину
у кров’яних пластинках за даної патології. У тромбоцитах, ізольованих з
крові здорових донорів, перехід глобулярного G-актину у фібрилярний
F-актин відбувається поступово і пропорційно до часу стимуляції
тромбіном [Harwing J.H.,1995].

Провідна роль у запуску цього процесу належить іонам кальцію,
внутрішньоклітинна концентрація яких зростає при стимуляції [Dash D.,
1995, Harwing J.H.,1995]. Оскільки концентрація Са2+ у тромбоцитах людей
хворих на цукровий діабет є вищою, порівняно із здоровими [Mazzanti L.,
Mutus B.1997, Winocour P.D.1992], то це може призводити до спонтанної
полімеризації актину, інтенсифікації процесів фосфорилювання
/дефосфорилювання білків [Mazzanti L., Mutus B.1997], активації
рецепторів агоністів, спряжених із G-білками, що можуть ініціювати
зростання протеїнкіназної активності c-Src. Не виключена також
можливість модифікації самої кінази та її субстратів як глюкозою, так і
вільними радикалами кисню.

Вплив цукрового діабету на динамічний стан системи еритрону. Метаболічні
порушення, які розвиваються внаслідок абсолютної або відносної
інсулінової недостатності при цукровому діабеті, значно ускладнюють
функціонування систем підтримання гомеостазу, важливою ланкою якого є
еритроцити периферичної крові. Нами були проведені дослідження
цитологічних та фізико-хімічних показників периферичної крові тварин з
експериментальним цукровим діабетом. Вміст ретикулоцитів у периферичній
крові за умов ЦД 1-го типу є у 1,4 рази більший в порівнянні до норми.

Добова продукція еритроцитів при досліджуваній патології збільшувалася у
1,3 рази, а швидкість дозрівання ретикулоцитів зростала у півтора рази.
Посилення еритропоезу, яке супроводжується збільшенням кількості
ретикулоцитів, слід розглядати як компенсаторну реакцію, спрямовану на
збільшення кисневої ємності крові у відповідь на генералізовану тканинну
гіпоксію. Дослідження вмісту фетального гемоглобіну в еритроцитах
контрольних та діабетичних щурів показали, що розвиток
стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого
гемоглобіну F. Таке зростання виправдане в умовах гіпоксичного стану,
який розвивається за умов ЦД, з огляду на більшу спорідненість
фетального гемоглобіну до кисню.

Для підтвердження виявлених динамічних змін системи еритрону на
клітинному рівні проводилися цитологічні дослідження кісткового мозку
щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. Аналізуючи
показники таблиці 4, потрібно відмітити зниження процентного вмісту
поліхроматофільних та оксифільних нормоцитів при стрептозотоциновому
діабеті. Виявлені зміни в складі нормоцитів можна пояснити сповільненим
дозріванням цих еритрокаріоцитів та швидкими темпами елімінації
ретикулоцитів у русло крові. Отримані дані узгоджуються з підвищенням
вмісту ретикулоцитів у периферичній крові щурів при експериментальному
ЦД 1-го типу.

Таблиця 4

Морфологічний склад препаратів кісткового мозку щурів у нормі та при
експериментальному ЦД 1-го типу, ( М?m, n=17)

Групи

Еритрокаріоцити Контроль, % Стрептозотоциновий

діабет, %

Еритробласти 4,1?0,01 8,0?0,2?

Пронормобласти 10,3?0,1 11,8?0,1

Нормоцити

1) базофільні

18,6?0,3

30,5?0,2?

2) поліхроматофільні 51,6?0,5 38,6?0,2?

3) оксифільні 16,1?0,04 9,3? 0,4?

?- різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05 Вплив системи L-аргінін: NO на динаміку вмісту лігандних форм та спектральні характеристики гемоглобіну за умов ЦД 1-го типу. Система L-аргінін:NO може приймати участь у формуванні киснево-транспортної функції крові, тобто впливати на основну функцію клітин еритрону. NO у реакціях з гемоглобіном (Hb) утворює метгемоглобін (Met-Hb), нітрозилгемоглобін (NO-Hb – нітрозування по Fe2+ у гемовій групі ) та S-нітрозогемоглобін (SNO-Hb - нітрозилювання по ?-93-цистеїну). Біологічна функція NO-похідних Hb досить широка (транспорт NO, його депонування, елімінація і т. ін.). Вони також приймають участь у генезі багатьох патологічних станів. Присутність різних сполук Hb з NO може по-різному впливати на спорідненість гемоглобіну до кисню крові [Gross S.S., 1999]. Існує О2 – залежна рівновага між SNO-Hb та NO-Hb. Припускають, що SNO-Hb діє як „алостерично контрольований буфер NO” [Зінчук В.В., 2003], який обмінює свою NO-групу з тіолами середовища, у тому числі з глутатіоном, і тим самим змінює кровоплин ( як вазодилататор), виконуючи роль критичного фактора постачання О2. Аналіз лігандних форм гемоглобіну показав достовірне зростання вмісту Met-Hb за умов ЦД та при введенні L-аргініну (рис. 5). Разом з тим за умов ЦД 1-го типу в еритроцитах значно зростає активність NOS, причому її індуцибельної ізоформи (табл. 5) [Сибірна Н.О., Бурда В.А., 2004]. Натомість, при введенні L-аргініну на фоні діабету спостерігається падіння активності NO-синтази найімовірніше за рахунок інгібування кінцевим продуктом, шляхом приєднання NO до гемової групи фермента [Kroncke K.D., 1996]. Введення in vivo інгібіторів NO-синтази як у нормі так і за умов ЦД викликало зниження цього показника. Рис.5. Вміст Met Hb в крові щурів у нормі та при діабеті на фоні введення L-Arg та AG Метаболічний цикл NO може активуватися при різноманітних гіпоксичних станах, так як за умов дефіциту О2 відновлені і гемумісні білки переносять електрони на іони NO2?, відновлюючи їх до NO. Виявлений ефект може бути пояснений і тим фактом, що при ЦД додатковим донорами електронів можуть бути глікозильовані амінокислотні залишки в складі Hb і кінцеві продукти глікозилювання. Вивчення взаємодії гемоглобіну з NO є цікавим ще і тому, що оксид азоту має набагато більшу спорідненість (у 8000 раз) до гемової групи дезоксигемоглобіну ніж О2, що дозволяє припустити його конкуренцію з киснем за відповідні ділянки на молекулі відновленого, а навіть, і частково оксигенованого гемоглобіну [Gladwin M.T., 2000]. Таблиця 5 Активність NOS і вміст нітритів та нітратів і при введенні in vivo L –arg, L-NAME та аміногуанідину щурам у нормі і при стрептозотоциновому діабеті ( М?m, n=14) Показники Групи NO3- + NO2- у еритроцитах, мкM Активність NOS у еритроцитах пмольNADPH(H+)/хв. на 1мг білка Контроль 15,73 ? 2,17 0,831 ± 0,028 К + L–арг 22,32 ? 2,07* 1,080 ± 0,098* К + L-NAME 6,45 ? 0,024* 0,590 ? 0,041* К + AG 14,65 ? 1,35 0,673 ± 0,051* Діабет 33,62 ? 1,79* 1,288 ± 0,101* Д + L–арг 26,92 ? 1,85** 0,843 ± 0,070** Д +L-NAME 7,16 ? 0,70** 0,360 ± 0,033** Д + AG 11,19 ? 1,21** 0,450 ± 0,039** * - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05 ** - різниця вірогідна порівняно із діабетом, р<0.05 Нами були проведені експерименти з нітрозування Hb у системі in vitro. Як виявилось, цей процес мав особливості для кожної зокрема серед усіх досліджуваних груп (табл.6.). Час переходу дезокси-Hb у NO-Hb за умов індукованого стрептозотоцинового діабету зростав приблизно на 70%. Зростання кількості Met-Hb у поєднанні із зниженням активності NOS може вказувати на те, що при введенні L-аргініну за ЦД 1-го типу відбувається переключення NO-синтазної ланки циклу оксиду азоту на нітритредуктазну, а зменшення швидкості нітрозування опосередковано свідчить про інтенсифікацію нітрозилювання по ?-93-цистеїну і утворення S-нітрозогемоглобіну. Таблиця 6 Швидкість нітрозування гемоглобіну в системі in vitro (M ?m, n=8-10) Групи Досліджувана речовина Контроль, хв ЦД 1-го типу,хв. Без введення 120 ± 11,3 200 ± 18,4* L-arg 60 ± 8,4* 40 ± 5,9** L-NAME 100 ± 9,7* 80 ± 10,1** AG 75 ± 6,5* 60 ± 5,9** * - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0,05 ** - різниця вірогідна порівняно з діабетом, р<0,05 Морфофункціональна характеристика імунокомпетентних клітин крові при ЦД 1-го типу. Для оцінки стану різних ланок імунної системи хворих на ЦД 1-го типу було проведено аналіз змін у лейкоцитарній формулі периферичної крові. Достовірних відмінностей в абсолютній кількості лейкоцитів у контрольній і дослідній групах не виявлено, але привертає увагу зменшення вмісту сегментоядерних нейтрофілів (на 12% по відношенню до контрольних показників) і достовірне підвищення кількості лімфоцитів (на 21%). При патології суттєво і достовірно зростає лімфоцитарно-гранулоцитарний індекс (на 35%), який дозволяє диференціювати аутоінтоксикацію та інфекційну інтоксикацію. Така зміна зумовлена відносним лімфоцитозом. Отже можна стверджувати, що у випадку ЦД 1-го типу показники лейкоцитарної формули свідчать про розвиток аутоінтоксикаційних процесів. За умов інсулінозалежного цукрового діабету вміст катіонних білків зменшується до 75,75 ? 2,81% проти 86,41 ? 1,40% в контролі (зниження на 12%). Отримані дані узгоджуються з нашими дослідженнями, в яких показане достовірне зниження фагоцитарної активності поліморфноядерних лейкоцитів на 20% за умов даної патології. Показане у наших дослідженнях зниження актианості мієлопероксидази нейтрофілів внаслідок дегрануляції теж свідчить про незадовільний стан бактерицидної системи клітин, що може бути пов’язано із хронічними запальними процесами в організмі, які супроводжують ЦД 1-го типу, особливо це стосується процесів запалення ендотелію судин, що призводить до функціонального виснаження мікрофагальної ланки імунного захисту організму. Таблиця 7 Активність NOS (пмоль/хв на 1 мг білка) у поліморфноядерних та мононуклеарних лейкоцитах крові здорових донорів та хворих на ЦД 1-го типу (М±м, n=12-14) Групи Лейкоцити Здорові донори ЦД 1-го типу Поліморфноядерні 0,43±0,08 1,09±0,13* Мононуклеарні 0,98±0,33 5,47±1,04* Вірогідність відмінностей у порівнянні з показниками в контролі: * - p < 0.01. Як видно з даних таблиці 7, за умов ЦД 1-го типу у поліморфноядерних лейкоцитах хворих людей активність NO-синтази зростає приблизно у 2 рази, а у мононуклеарних клітинах таке зростання є п’ятикратним. Показники клітинного і гуморального імунітету у хворих на ЦД 1-го типу. Механізми порушень функції імунокомпетентних клітин крові за умов даної патології пов’язують з несприятливим впливом різних метаболітів: глюкози, речовин ліпідної природи, гормонів, прокоагулянтів, вміст яких може значно підвищуватись у зв’язку з загальними розладами метаболізму [Мустафина Ж.Г.,1999]. Сучасні методи визначення субпопуляцій імунокомпетентних клітин мають велике значення для ідентифікації порушеної ланки імунітету, прогнозування важкості патологічного процесу та оцінки ефективності лікування. При дослідженні окремих показників клітинного і гуморального імунітету виявлено зміни субпопуляційного складу лімфоцитів периферичної крові. Як видно із отриманих даних у хворих з ЦД 1-го типу спостерігається активна імунна відповідь організму в основному за В-клітинним типом, про що свідчить збільшення кількості лімфоцитів, які експресують антигени СD19 та СD23 відповідно на 31% і 55% у порівнянні до контролю. Відомо, що СD19 виконує функцію ініціюючого рецептора при антигенній стимуляції В лімфоцитів, а СD23 є рецептором до ІgЕ. Є дані про позитивний корелятивний зв’язок між експресією антигену СD23 на В-лімфоцитах і рівнем розчиненого СD23 у периферичній крові та високим ризиком розвитку ЦД 1-го типу [Kretowski A.,1999]. Кількість лімфоцитів, що експресують Рan-Т-антиген СD3 достовірно знижується (на 34%). Це може бути пов’язано з дефектом експресїї білка р56lck у відпочиваючих лімфоцитах, який зумовлює гіпофосфорилювання ? ланцюга СD3 з наступним порушенням проліферації Т-лімфоцитів при даній патології [Nervi S., 2000]. Зменшення загальної кількості Т-лімфоцитів відбувається, передусім, за рахунок значного зменшення популяції Т-хелперів (СD4+) та Т-супресорів (СD8+) на 21% і 28% відповідно. За експресією СD16 антигенів виявлено підвищенний вміст NК-клітин (на 33%) при ЦД 1-го типу. Особливо суттєві відмінності встановлено при дослідженні експресії СD95 антигену, кількість якого була у 4 рази вищою від норми при даній патології. Лектиніндукована агрегація нейтрофільних гранулоцитів у хворих на цукровий діабет 1-го типу. Змінена структура вуглеводного компоненту експресованих рецепторів може бути сигналом або пристосуванням для швидкої елімінації макрофагами клітин із порушеною функціональною активністю, або ушкоджених клітин. Про рівень експресії на поверхні клітин відповідних глікокон'югатів можна робити висновки за ступенем агрегації, використовуючи лектини, які зв'язують різні вуглеводні детермінанти [Тимошенко А.В.,1991, Хомерики С.Г.,1993]. Показники лектиніндукованої агрегації НГ здорових донорів представлені у таблиці 8. Високі значення ступеня і швидкості агрегації НГ отримані при використанні в якості індукторів агрегації RCA і WGA. Слід зазначити, що час досягнення максимального ступеня і швидкості агрегації для цих двох лектинів був практично однаковим. Менш виражені показники ступеня і швидкості агрегації НГ спостерігались при використанні SBA, а найнижчі – для LCL (табл. 8). Наведені дані вказують на те, що на мембрані НГ здорових донорів знаходяться глікопротеїнові рецептори, які містять незначну кількість вуглеводних ланцюгів такої просторової структури. N-ацетил-?,D-галактозамінспецифічний SBA викликає порівняно невисокий ступінь і дуже низьку швидкість агрегації НГ, тобто N-ацетил-?,D-галактозамін, як вуглеводний компонент глікопротеїнових рецепторів НГ, відіграє незначну роль в опосередкуванні їхньої агрегації. Сильна і швидка агрегація НГ при використанні в якості індуктора агрегації RCA і WGA є наслідком того, що у структурі глікопротеїнових рецепторів мембрани НГ здорових донорів наявні у значній кількості ?,D-галактозні, N-ацетил-?,D-глюкозамінові і N-ацетилнейрамінові детермінанти, які впливають як на динамічні, так і на кінетичні показники процесу агрегації НГ. У хворих на ЦД 1-го типу агрегаційна здатність НГ при дії різних лектинів мала різноспрямовані зміни. Рівень агрегації нейтрофілів за даної патології при використанні WGA зростав, що може свідчити про підвищення рівня експресії на поверхні клітин комплементарних цьому лектину глікокон'югатів. Є літературні дані про те, що ці вуглеводні детермінанти (N-ацетил-?,D-глюкозамін та N-ацетилнейрамінова кислота) можуть маскувати різноманітні специфічні рецептори на поверхні клітин. У окремих роботах вказується, що WGA може викликати хемілюмінесценцію при взаємодії з нейтрофілами, а також інгібувати їхній хемотаксис у відповідь на дію fMLP (форміл-мет-лей-фен) [Хомерики С.Г.,1993]. Це свідчить про значну роль цих рецепторів у забезпеченні певного рівня функціонального стану сегментоядерних нейтрофілів, тобто про їхню значну активованість. Таблиця 8 Показники лектиніндукованої агрегації нейтрофільних гранулоцитів у здорових донорів та у хворих на ЦД 1-го типу (М ± m; n = 14) Показники Групи Ступінь агрегації, % Час досягнення максимального ступеня агрегації, с Швидкість агрегації, %/хв Час досягнення максимальної швидкості агрегації, с RCA- лектин рицини К 95,8±1,1 606,7±35,9 45,2±1,9 57,1±2,9 ЦД 82,7±3,2** 651,5±14,0 41,8±4,0 81,9±7,9* WGA- лектин зародків пшениці К 66,4±3,5 608,5±25,9 34,9±3,2 57,3±5,2 ЦД 85,8±6,7* 720,0±10,0** 49,2±2,0** 65,4±3,2 SBA -лектин сої К 47,5±4,5 773,0±18,9 5,1±0,5 242,0±18,7 ЦД 28,1±1,3* 711,3±15,2* 2,9±0,2** 219,7±12,5 LCL -лектин сочевиці К 17,9±0,9 682,3±17,5 4,9±0,4 76,9±6,9 ЦД 9,4±0,8** 657,5±15,6 1,8±0,3** 135,0±15,6* Вірогідність відмінностей у порівнянні з показниками в контролі: - р ? 0,05; ** - р ? 0,01. У той же час, за умов ЦД 1-го типу виявляється спадання показників агрегаційної здатності НГ при взаємодії з RCA: незначне зменшення ступеня і швидкості агрегації та зростання часу досягнення показників агрегації (табл.8.). Як відомо, ?,D-галактозовмісні рецептори характерні для клітин низького рівня диференціації у гранулоцитарному ростку. Отже, отримані дані можуть опосередковано свідчити про пришвидшення диференціації і старіння нейтрофільних лейкоцитів за умов ЦД 1-го типу. ?,D-галактокон'югати задіяні в молекулярних механізмах міжклітинної адгезії [Луцик А.Д.,1989], а зменшення їхньої експресії на поверхні НГ свідчить про порушення цієї функції у хворих на ЦД 1-го типу. Довготривала гіперглікемія та підвищення рівня інфекційних захворювань за умов досліджуваної патології викликають багаточисельні зміни в функціональній активності НГ [Александровский Я.А.2002, Сибірна Н.О., 2003 ], а знижений рівень ?,D-галактозовмісних глікопротеїнових рецепторів на поверхні НГ може вказувати на недостатню елімінацію нейтрофілів із порушеною реактивністю. Отримані нами результати про зниження рівня агрегації нейтрофілів у відповідь на дію SBA у хворих можуть вказувати на зменшення рівня експресії на поверхні клітин N-ацетил-?,D-галактозаміновмісних глікокон'югатів. За умов дії LCL також виявляється знижена агрегаційна здатність НГ у хворих на ЦД 1-го типу. Такі дані вказують на те, що за умов досліджуваної патології в структурі глікопротеїнових рецепторів відбулося зменшення вмісту або інтерналізація ?,D-манозо- і ?,D-глюкозоспецифічних вуглеводних детермінант. Дослідження апоптозу імунокомпетентних клітин при ЦД 1-го типу. Апоптоз - клітинний суїцид, виступає активним процесом клiтинного метаморфозу, і своїм морфологiчним втiленням має дегенеративні зміни у ядрі та цитоплазмі клітин, до яких можна віднести: фрагментацію та пікноз ядра, вакуолізацію і токсичну зернистість цитоплазми, клазмоцитоз цитоплазми, зменшення розміру самої клітини та ін. Строго кількісним параметром активації апоптозу лейкоцитів є визначення на їхній поверхні Fas-молекули, яка виявляється за допомогою моноклональних антитіл до CD95. Нами були виявлені суттєве збільшення як числа CD95+ - нейтрофільних гранулоцитів, так і CD95+-мононуклеарних клітин крові за умов ЦД 1-го типу. Слід відзначити, що зміни досліджуваних показників по своїй інтенсивності були більше вираженими для нейтрофільних гранулоцитів, ніж для мононуклеарів. Саме тому для виявлення ендогенної інтоксикації організму доцільно аналізувати активацію апоптозу нейтрофілів. Імовірно, підвищення чутливості НГ до активуючих апоптоз факторів пов’язане з коротким життєвим циклом цих клітин і закладеною в них функцією не лише фагоцитувати чужорідні клітини, але і знищувати їх у вогнищі запалення за рахунок викиду у момент своєї загибелі великої кількості ферментів та інших біологічно активних речовин. Дослідження активності фруктозо-1,6-дифосфатази у імунокомпетентних клітинах периферичної крові здорових донорів і хворих на ЦД 1-го типу. Фруктозо-1,6-дифосфатаза ( Ф-1,6-ДФ, КФ 3.1.3.11) описана, як один із ключових ферментів, що лімітує глюконеогенез у печінці та нирках [Gomori G., 1943 ] , а також у м’язах [Ryan C., 1995; Gleeson T., 1996]. Зміна активності Ф-1,6-ДФ описана для ряду патологічних станів [Dzugaj A.,1993; Kikawa Y., 1994]. Ф-1,6-ДФ відіграє важливу роль у обміні глюкози у організмі людини, тому актуальність дослідження активності та локалізації цього ферменту у імунокомпетентних клітинах крові за умов ЦД 1-го типу не викликає сумнівів. У поліморфноядерних і мононуклеарних клітинах людей, хворих на ЦД 1-го типу, активність Ф-1,6-ДФ була вищою ніж у нормі на 30% і 127% відповідно (табл.9.). Результати прямого вимірювання активності повністю підтверджені імуноцитохімічними дослідженнями із застосуванням стрептавідинбіотинової системи з використанням світлової мікроскопії. Для дослідження локалізації фруктозо-1,6-дифосфатази проведено імуноцитохімічну детекцію на ультратонких зрізах за допомогою електронної мікроскопії (рис.6.). Як видно з електронограм, позитивна реакція присутня як у ядрі, так і у цитоплазмі лейкоцитів. Таблиця 9 Активність фруктозо-1,6-дифосфатази у лейкоцитах здорових донорів та хворих на ЦД 1-го типу, (M±m, n = 8-10) Показники Групи Активність ферменту, mU на 1 млн. клітин Сегментоядерні гранулоцити Мононуклеарні лейкоцити Здорові донори 1,09 ± 0.039 0,976 ± 0.126 ЦД 1-го типу 1,42 ± 0.142* 2,22 ± 0.689* Вірогідність відмінностей у порівнянні з показниками в контролі: * - p < 0.05. Така субклітинна локалізація Ф-1,6-ДФ ставить питання про фізіологічну роль цього фермента у клітинах білої крові. У роботi [Gizak A., 2003] висловлюється гіпотеза про те, що Ф-1,6-ДФ може індукувати експресію своїх власних генів, для посилення процесів глюконеогенезу. Очевидно, присутність фермента у ядрі імунокомпетентних клітин може бути експериментальним підтвердженням такої гіпотези. Рис.6. Локалізація Ф-1,6-ДФ у сегментоядерних лейкоцитах здорових донорів (А,В) і хворих на ЦД 1-го типу (C, D). На рисунках A,B,C,D bar = 1 мкм , а на вставках bar = 2 мкм. Чорні крапки на фотографіях (В, D) утворені частинками золота (10 nm), кон’югованими з другим антитілом, які вказують на локалізацію фермента в клітині. У контрольній реакції (A,C) у якості першого антитіла була використана неімунна сироватка. ВИСНОВКИ Отримані результати обгрунтовують молекулярні механізми функціонування NO-залежних сигнальних шляхів, процесів фосфорилювання, глюконеогенезу, нітрозування і нітрозилювання та ферментативної антиоксидантної системи, що задіяні у регуляції морфологічного і функціонального стану клітин крові за умов ЦД 1-го типу, та можливості корекції метаболічних порушень при даній патології. Посилення фосфорилювання сигнальних білків по тирозину, неферментативне глікозилювання, посттрансляційне нітрозилювання білків за участю пероксинітриту та активація нейтрофільних гранулоцитів є провідними молекулярними механізмами порушення морфофункціонального стану клітин крові, яке виступає у ролі однієї з основних етіологічних причин розвитку діабетичних мікро- та макроангіопатій. За умов ЦД 1-го типу у клітинах крові відбувається зміна співвідношення активності ендотеліальної та індуцибельної ізоформ NOS. Зниження активності eNOS і посилення експресії та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежать у основі розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації і ведуть до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії. У тромбоцитах людей при ЦД 1-го типу за рахунок активації тирозинових протеїнкіназ посилюється процес фосфорилювання по залишках тирозину ряду специфічних білків, які приймають участь у передачі внутрішньоклітинного сигналу. Стимуляція тромбоцитів тромбіном супроводжується активацією і транслокацією протеїнкінази с-Src із цитозольної у цитоскелетну фракцію. За умов ЦД 1-го типу у тромбоцитах людей включення с-Src кінази у детергент-нерозчинну фракцію відбувається інтенсивніше, а динаміка процесу має чітко виражений фазний характер. Показано, що основна роль у інтеграції протеїнкінази с-Src у цитоскелет належить SH3-домену молекули ферменту, що специфічно зв’язується з білками з молекулярною масою 70 та 125 кДа. Зміни у зв’язуванні специфічних ефекторних білків ( p60, p75, р90, p116, p135, p155, p170) з низькомолекулярними G–білками підродини Rho у тромбоцитах людей, хворих на ЦД 1-го типу, можуть бути покладені в основу молекулярної діагностики генетичних передумов маніфестації і прогресування захворювання. У тромбоцитах за умов ЦД 1-го типу показано зростання експресії та порушення процесу транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної субодиниці р85? ферменту РІ-3-кінази. Це може бути ланкою реципрокної регуляції активностей РІ-3-кінази та NOS. Досліджено ультратонку структуру тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу після впливу L-Arg, L-NAME, L-NMMA, AG та вортманіну in vitro та in vivo. Показано, що AG має найбільший протекторний вплив на структуру тромбоцитів за умов ЦД. Для L- Arg характерна посилююча патологію дія на структуру цих клітин. Вортманін володіє сильно вираженим впливом на стан білків цитоскелету тромбоцитів у нормі, але не виявляє такої дії за умов ЦД 1-го типу. Зміни в системі еритрону при цукровому діабеті виявляються в посиленні еритропоезу (зростає кількість ретикулоцитів периферичної крові і швидкість дозрівання та виходу пізніх попередників еритроцитів та ретикулоцитів з кісткового мозку в русло крові) і з’ясовують механізм розвитку анемії при ЦД 1-го типу на клітинному рівні. Підвищення вмісту фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією організму на розвиток тканинної гіпоксії за даної патології. ЦД 1-го типу супроводжується вираженим перерозподілом вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів нейтрофільних гранулоцитів. На поверхні цих клітин збільшується вміст N-ацетил-?,D-глюкозаміно- та N-ацетилнейраміновмісних та зменшується вміст ?,D-манозо-, ?,D-глюкозо-, N-ацетил-?,D-галактозаміно- і ?,D-галактозовмісних глікокон'югатів. Комплексне цитохімічне вивчення функціонального стану нейтрофілів з використанням у якості індукторів агрегації лектинів є перспективним напрямком з'ясування патогенезу ЦД 1-го типу та розробки діагностичних і прогностичних підходів у терапії даної патології. При патології виявлено суттєве зростання частоти морфологічних ознак апоптозу та збільшення числа CD95 - позитивних нейтрофільних гранулоцитів та CD95 - позитивних мононуклеарних лейкоцитів людей, що є ознакою ендогенної інтоксикації організму за умов ЦД 1-го типу. Стрес-лімітуюча дія NO має різні форми вияву у нормі та за умов ЦД 1-го типу. Введення селективного інгібітора іNOS – AG, може бути фактором напрямленого модулювання процесу утворення і розпаду депо NO, яке контролюється швидкістю та інтенсивністю нітрозування і нітрозилювання і є перспективним напрямком для подальших досліджень з метою виявлення етіології багатьох патологічних станів та методів їх корекції. Для послаблення токсичної дії NO і корекції патологічного стану, пов’язаного з його гіперпродукцією у організмі за умов ЦД 1-го типу, доцільним є використання аміногуанідину як селективного інгібітора iNOS, інгібітора неферментативного глікозилювання, антиоксиданта, а також чинника, здатного попереджати посттрансляційні модифікації білків за участю пероксинітриту. Інгібітори NOS можуть бути використані у перспективному створенні препаратів, які запобігатимуть розвиткові цукрового діабету або коригуватимуть діабетичні ускладнення. СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М. Вплив L-аргініну на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Науковий вісник ЛДАВМ ім. С.З.Гжицького, Львів, 2000.- Т.2,№2, (ч.2.) - С. 244-248. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М., Романишин Я.М. Дослідження системи еритрону при гіпоксіях різної етіології // Лабораторна діагностика.- 2000.- № 4.- С.36-39 Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М Вплив NО на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті. Морфофункціональні зміни кров’яних пластинок // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2000.- Вип. 26.- С.15-20 Бурда В.А., Біронт Н.В., ВеликийМ.М., Сибірна Н.О., Клевета Г.Я., Федорович А.М. Характеристика динамічного стану еритрону за умов експериментального стрептозотоцинового діабету // Наукова спадщина академіка І.М.Буланкіна та її розвиток у сучасній біології. Харків, 2001.- С.24-25. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М. Участь різних ізоформ NO-синтази в регуляції метаболізму оксиду азоту при стрептозотоциновому цукровому діабеті // Лабораторна діагностика. - 2001.- №4.- С.22-25. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О. Зміна активності NO-синтази тромбоцитів людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2002.- Вип. 28.- С.47-50. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О. Дослідження функціонального стану цитоскелета тромбоцитів у разі інсулінзалежного цукрового діабету // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2002.- Вип. 28.- С.41-46. Бурда В.А., Біронт Н.В., Сибірна Н.О., Клевета Г.Я. Дослідження функціонального стану еритрону при експериментальному стрептозотоциновому діабеті // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2002.- Вип. 28.- С.21-27. Зарицька М.В., Сибірна Н.О., Великий М.М., Кулачковський О.Р., Плешанів Є.В. Дослідження ультраструктури тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія.- 2002.- №2.- С.83-86. Сибірна Н.О., Барська М.Л. Функціональний стан нейтрофілів при цукровому діабеті 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2003.- № 2.- С. 33-37 Сибірна Н.О., Вовк О.І., Дробот Л.Б. Роль фосфатидилінозит-3-кінази та індуцибельної NO-синтази у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2003.- Вип. 34.- С.52-56. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Грищук І.В. Морфофункціональна характеристика імунокомпетентних клітин крові за умов цукрового діабету 1 типу // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2004.- Вип. 35.- С.77-83. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Лаповець Л.Є. Деякі показники клітинного та гуморального імунітету у хворих цукровим діабетом 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2003.- №4.- С.47-50. Сибірна Н.О. Молекулярні механізми регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів при цукровому діабеті 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2004.- № 1.- С.9-16. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Дробот Л.Б. Зміни функціонального стану низькомолекулярних G-білків тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Український біохімічний журнал. – 2004. - № 2. - С.117-120. Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на морфофункціональний стан тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Досягнення біології та медицини . – 2004. - № 1. - С.67-72. Сибірна Н.О., Бурда В., Люта М. Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Клінічна та експериментальна патологія.- 2004.- Т.3, №2. - С.210-212. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Бродяк І.В. Дослідження рецепторного апарату сегментоядерних нейтрофілів за допомогою лектинів // Клінічна та експериментальна патологія.- 2004.- Т.3, №2. - С.204-206. Сибірна Н., Вовк О., Кулачковський О., Горбачевська І. Вплив вортманіну на ультратонку структуру тромбоцитів у нормі та за умов цукрового діабету 1 типу // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004. - №2. - С. 121-124. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Великий М.М. Роль фосфатидилінозит-3-кінази у регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Український біохімічний журнал. – 2004. - №5. - С.96-101. Makhnevych T., Sybirna N., Veliky M., Drobot L Changes in c-Src-dependent signaling can contribute to the increased platelet aggregation in the IDDM patient // Annales universitatis Mariae Curie-Sklodovska.- 2004.-Vоl. XVI., N2. - P. 43-47. Махневич Т.Р., Сибірна Н.О., Великий М.М., Дробот Л.Б. Дослідження фосфорилювання сигнальних білків, залучених до процесів активації тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004. - № 3. - С. 99-105. Сибірна Н., Вовк О., Бурда В., Федорович А. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Вісник Львівського університету. Сер. біол. - 2004.- Вип. 38.- С.51-57. Сибірна Н.О., Бродяк І.В., Барська М.Л., Лектиніндукована агрегація нейтрофільних гранулоцитів у хворих на цукровий діабет 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2004.- № 3.- С.57-61 Сибірна Н.О., Вовк О.І., Бурда В.А., Люта М.Я. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи за умов цукрового діабету 1 типу // Лабораторна діагностика. - 2004.- № 4.- С.47-51. Сибірна Н., Люта М., Бурда В., Біронт Н., Федорович А., Дудок К. Вплив системи „L-аргінін :NO” на динаміку вмісту лігандних форм та спектральні характеристики гемоглобіну за умов цукрового діабету 1-го типу // Медична хімія. - 2004. - Т.6, № 3. - С.26-29. Бурда В.А., Великий М.М., Сибірна Н.О., Федик М.Я., Обросова І.Г. Структурно-функціональний стан еритрону при цукровому діабеті // Матеріали УІ Українського біохім. з’їзду. - Київ, 1992. - C.114. Бурда В.А., Махневич Т.Р., Сибірна Н.О., Біронт Н.В. Перекисне окислення ліпідів і фізико-хімічний стан плазматичних мембран еритроцитів при цукровому діабеті // Матеріали УІІ Українського біохімічного з’їзду. - Київ, 1997. - C.56-57. Біронт Н.В., Бурда В.А., Сибірна Н.О. Система антиоксидантного захисту в еритроцитах та кістковому мозку щурів при стрептозотоциновому діабеті // Матеріали УІІ Українського біохімічного з’їзду. - Київ, 1997. - C.9-10. Бурда В. А., Великий Н.Н., Биронт Н.В., Барская М.Л., Сибирная Н.А. Никотинамид в регуляции антиоксидантной системы организма // Материалы У международной конференции “Биоантиоксидант”. - Москва, 18-20 ноября 1998 года. - Москва, 1998. - C.142-143. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Кулачковський О.Р., Великий М.М. Корегуючий вплив NO на агрегаційну функцію тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті// Матеріали VIII Кнгресу світової федерації українських лікарських товариств. - Львів- Трускавець, 2000. - С.272. Токарєва Л.В., Сибірна Н.О., Великий М.М. Зміна активності NO-синтази в регуляції функціонального стану тромбоцитів при стрептозотоциновому цукровому діабеті // Матеріали УІ з’їзду ендокринологів України. Київ, 23-25 травня 2001 року. - Ендокринологія.-Т.6(додаток).- 2001. - С.300. Sybirna N., Burda V., Biront N., Kulachkovs’ky A. Studies on the State of Antioxidant System in Rats with Streptozotocin-Induced Diabetes // Abstract, 4-th Parnas Conference, September 15-17, 2002, Wroclaw, Poland.- 2002.- P.91. Сибірна Н.О., Зарицька М.В., Кулачковський О.Р., Барська М.Л. Участь різних ізоформ NO-синтази в регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів за інсулінзалежного цукрового діабету // Матеріали VІІІ Українського біохімічного з’їзду, 1-3 жовтня 2002 року, Чернівці. -Укр. біохім. журнал. - Т.74, № 4а. - Спец. вип. - 2002.- С.78. Кулачковський О.Р., Сибірна Н.О., Зарицька М.В. Вивчення ультраструктури тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Тези доп. ІІІ з’їзду Укр. біофіз. товариства , Львів, Україна, 8-11 жовтня 2002 року. -2002. - С.216. Биронт Н.В., Бурда В.А., Федорович А.Н., Коробов В.Н., Чайка Я.П., Сибирная Н.А. Состояние антиоксидантной системы клеток костного мозга крыс при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Материалы VІ Международной конф. „Биоантиоксидант” 16-19 апреля 2002 года, Москва, Россия. - 2002. - С. 671-672. Сибірна Н., Дробот Л., Кулачковський О., Зарицька М., Вовк О. Дослідження механізмів регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу // Матеріали науково-практичної конференції „Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині”, Київ, 20 березня 2003 року. - Київ.- 2003. - С.85-86. Сибірна Н.О., Барська М.Л., Грищук І.В., Старикович М.О. Вплив продуктів неферментативного глікозилювання білків на деякі показники функціональної активності сегментоядерних нейтрофілів за умов інсулінзалежного цукрового діабету у разі гіперглікемії in vitro // Матеріали науково-практичної конференції „Актуальні проблеми тромбозу і порушень гемостазу в клінічній медицині”, Київ, 20 березня 2003 року. - Київ. - 2003. - С. 86-87. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Зарицька М.В., Федорович А.М., Кулачковський О.Р. Функціональна активність тромбоцитів при цукровому діабеті 1 типу // Тези доповідей міжнародної наукової конференції „Гомеостаз: фізіологія, патофізіологія, фармакологія і клініка”, Одеса, 18-19 вересня 2003 року. - Одеса. - 2003. - С. 31-32. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Кулачковський О.Р., Вовк О.І., Зарицька М.В. Вплив аміногуанідину на структурно-функціональні властивості тромбоцитів при стрептозотоциновому діабеті у щурів // Тези доповідей Науково-практичної конференції „Діабет-проблема загальнолюдська” у рамках Х Міжнародних Днів Діабету, Дніпропетровськ, 24-25жовтня 2003 р. - Дніпропетровськ. - С.116-117. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Вовк О.І., Біронт Н.В., Федорович А.М. Вплив аміногуанідину на систему антиоксидантного захисту та активність індуцибельної NO-синтази при цукровому діабеті 1 типу // Тези доповідей Науково-практичної конференції „Діабет-проблема загальнолюдська” у рамках Х Міжнародних Днів Діабету, Дніпропетровськ, 24-25жовтня 2003 р. - Дніпропетровськ. - С.117-118. Sybirna N., Vovk O., Kulachkovsky O. Role of phosphoinositide 3-kinase in platelet aggregation under the type 1 diabetes mellitus // Abstracts of the 29th Meeting of the FEBS, Warsaw, Poland, 26 June – 1 July 2004. - The FEBS Journal. – 2004. - Vol. 271, №1. - P.130. Sybirna N., Barska M., Dzewulska-Szwajkowska D., Dzugaj A. Mononucleares and polymorphonucleares show increased fructose-1,6- bisphosphatase activity in patients with type 1 diabetes mellitus // Матеріали Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології, Львів, 25-28 квітня 2004р. – Львів. – 2004. - C.295. Вовк О., Бурда В., Федорович А., Зарицька М., Сибірна Н. Вплив інгібіторів NO-синтази на антиоксидантний статус щурів за умов стрептозотоцинового діабету // Матеріали Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології , Львів, 25-28 квітня 2004р. – Львів. – 2004. - C.214. Федорович А., Сибірна Н., Бурда В. Вплив аміногуанідину на процеси інгібування автоокислення адреналіну супероксиддисмутазою гемолізатів еритроцитів крові щурів із експериментальним цукровим діабетом // Матеріали VII міжнародної науково-практичної конференції „Наука і освіта ‘2004 ”, 10-25 лютого 2004 р. - Т.56.- Біологічні науки. - С. 8-9. Зарицька М., Сибірна Н., Дробот Л. Роль вортманіну – селективного інгібітора фосфоінозитид-3-кінази - в активації тромбоцитів при інсулінозалежному цукровому діабеті // Матеріали міжнародної науково-практичної конференції „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини”, 11-12 листопада 2004 р., Тернопіль. - Медична хімія. - Т.6, № 3. - 2004. - С.181. АНОТАЦІЯ Сибірна Н.О. Молекулярні основи змін структурно-функціонального стану клітин крові за умов цукрового діабету 1-го типу. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005. Дисертація присвячена дослідженню молекулярних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин крові ( тромбоцитів, еритроцитів, мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитів) і способам корекції метаболічних процесів, які призводять до виникнення та розвитку ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу. Показано, що в основі біохімічних порушень, які зумовлюють зміни структурно-функціонального стану клітин крові при ЦД 1-го типу, лежить значне зростання продукції оксиду азоту (NO), викликане зміною співвідношення активності ізоформ NO-синтази за рахунок пригнічення активності ендотеліальної конститутивної і посилення експресії та зростання активності індуцибельної NO-синтази (iNOS). Розвиток оксидативного стресу при ЦД 1-го типу викликає активацію вільно-радикальних процесів та акумуляцію значних кількостей активних форм кисню, які ініціюють трансформацію ефектів NO із захисних у цитотоксичні. Посилення фосфорилювання сигнальних білків по тирозину, порушення у процесах транслокації із цитозольної у цитоскелетну фракцію і зміни у експресії та активності c-Src кінази і регуляторної субодиниці р85? фосфатидилінозит-3-кінази, зміна функціонального стану низькомолекулярних G-білків родини Rho, неферментативне глікозилювання та посттрансляційне нітрозилювання білків за участю пероксинітриту є провідними молекулярними механізмами порушення функціонального стану клітин крові, які ведуть до розвитку мікро- та макроангіопатій. Ключові слова: цукровий діабет 1-го типу, тромбоцити, еритроцити, мононуклеарні та поліморфноядерні лейкоцити, NO-синтаза, фосфорилювання, нітрозилювання. АНОТАЦИЯ Сибирная Н.А. Молекулярные основы изменений структурно-функционального состояния клеток крови при сахарном диабете 1-го типа. – Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2005. Диссертация посвящена исследованию молекулярных механизмов, опосредующих изменения морфологического и функционального состояния клеток крови ( тромбоцитов, эритроцитов, мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов) и способам коррекции метаболических процессов, вызывающих возникновение и развитие осложнений при сахарном диабете 1-го типа. Показано, что в основе биохимических нарушений, предопределяющих изменения структурно-функционального состояния клеток крови при сахарном диабете 1-го типа , лежит значительное возрастание продукции оксида азота (NO), вызванное изменением соотношения активности изоформ NO-синтазы за счёт угненения активности эндотелиальной конститутивной и усиления экспрессии и возрастания активности индуцибельной NO-синтазы. Pазвитие оксидативного стресса при СД 1-го типа вызывает активацию свободно-радикальных процессов и аккумуляцию значительных количеств активных форм кислорода, которые инициируют трансформацию эффектов NO из защитных в цитотоксические. Усиление фосфорилирования сигнальных белков по тирозину, нарушения в процессах транслокации из цитозольной в цитоскелетную фракцию и изменения в экспрессии и активности c-Src киназы, а также регуляротной субъединицы р85? фосфатидилинозит-3-киназы, изменения функционального состояния низкомолекулярных G-белков семейства Rho, неферментативное гликозилирование и посттрансляционное нитрозилирование белков при участии пероксинитрита являются ведущими молекулярними механизмами нарушения функционального состояния клеток крови, вызывающих развитие микро- и макроангиопатий. Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, тромбоциты, эритроциты, мононуклеарные и полиморфноядерные лейкоциты, NO-синтаза, фосфорилирование, нитрозилирование. ANNOTATION Sybirna N.O. Molecular basis of structural and functional changes in the blood state under type 1 diabetes mellitus.- Manuscript. Thesis on the approaching the scientific degree of doctor of biological sciences, field 03.00.04 – biochemistry.- O.V.Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005. The goal of the thesis is to study the molecular mechanisms controlling changes in morphology and functional state of blood cells (platelets, erythrocytes, mononuclear and polymorphonuclear leucocytes) and the approaches to correct metabolic processes responsible for evolving and development of type I diabetes mellitus (DM) complications. It was found out that the basis of the biochemical impairment which cause the structural and functional state of blood cells under type 1 DM, is the significant increase in nitrogen oxide (NO) production resulting in changes in ratio between NO synthase isozymes due to inhibition of endothelial constitutive form and increase in activity of inducible NO synthase (iNOS). Development of oxidative stress under type 1 DM induces activation of free radical processes and accumulation of the significant amounts of active oxygen forms, which initiates transformation of defence effects of NO into cytotoxic ones. Activation of signal protein phosphorylation at tyrosine residues, impairment in translocation from cytosolic to cytoskeleton fraction and changes in expression and activity of c-Src kinase and that of regulatory subunit р85? of phosphatidyl inositol-3-kinase, changes in functional state of Rho family low molecular weight G proteins, non-enzymatic glycosylation and posttranslational protein nitrozylation are the leading molecular mechanisms of impairment of functional state of blood cells leading to micro- and macroangiopathies. Using transmission electron microscopy, the platelet ultrastructure in normal state and under DM type I after effect of main NOS substrate (L-arg), inhibitors of this enzyme (L-NAME, L-NMMA, aminoguanidine) and wortmannin was studied in vivo and in vitro. It was found out that aminoguanidine has the highest protective effect on the platelet morphology under DM. At the same time, L-arg potentiate pathology changes. Wortmannin showed strong effect on cytoskeleton proteins in normal state and did not show such changes under type 1 DM. The mechanism of the anemia development under type 1 DM at cellular level was studied. It was found that stress limiting NO actionis different in normal state and under type 1 DM. Addition of aminoguanidine, the iNOS selective inhibitor, can be the factor modulating production and degradation of NO depot, controlling by velocity and intensity of nitrylation and nitrizylation. To study changes of structural and functional state of peripheral blood leucocytes under type 1 DM, phagocytic activity, the state of bacteriocide system. Cellular and humoral immunity, carbohydrate determinants of glycoprotein receptors of neutrophylic granulocytes, apoptosis of immunocompetent cells as well as activity and localization of key enzyme of gluconeogenesis, fructose-1,6-bisphosphatase, were studied. Aminoguanidine is proposed to use for pharmacological correction of NO biosynthesis. Aminoguanidine, being the selective iNOS inhibitor, antioxidant and the factor eliminating posttranslational protein nitrozylation, weaken the toxic effects of NO and positively modulates the pathological state caused by NO hyperproduction Key words: type 1 diabetes mellitus, platelets, erythrocytes, mononuclear and polymorphonuclear leucocytes, NO synthase, phosphorylation, nitrozylation. PAGE \* Arabic 42 Рис. 2. Виявлення p85? регуляторної субодиниці PI-3-кінази в лізатах тромбоцитів здорових (1) та хворих на ЦД 1-го типу (2) донорів. Час інкубації з тромбіном, хв 66,2 ? 116,3 ? 97,4 ? 31,5 ? 45,0 ? 200,0 ? кДа 0 0,5 1 4 0 0,5 1 4 1 2 3 4 5 6 7 8 р35 p180 р125 р120 р95 р56 Рис. 3. Імуноблотинг фосфотирозинвмісних білків лізатів тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) та хворих на ЦД 1-го типу (треки 5-8), стимульованих тромбіном (0,7 од/мл). р68 р85 р70 c-Src 1 2

Похожие записи