.

Молекулярні основи змін структурно-функціонального стану клітин крові за умов цукрового діабету 1-го типу (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
2 5040
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

СИБІРНА Наталія Олександрівна

УДК 577.15: 616.379-008.64-07:616-008.

852+616-008.851+616.115.34-07

Молекулярні основи змін структурно-функціонального стану клітин крові за
умов цукрового діабету 1-го типу

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського
національного університету імені Івана Франка

Науковий консультант – доктор біологічних наук, професор

ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович,

Київський національний
медичний університет

імені О.О.Богомольця,

професор кафедри
біоорганічної, біологічної та

фармацевтичної хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

КУЧЕРЕНКО Микола
Євдокимович,

Київський національний
університет

імені Тараса Шевченка,

головний науковий
співробітник кафедри біохімії;

доктор медичних наук,
старший науковий співробітник

МИКОША Олексій Степанович,

Інститут ендокринології та
обміну речовин

імені В.П. Комісаренка АМН
України,

головний науковий
співробітник лабораторії

гормональної регуляції
обміну речовин;

доктор біологічних наук,
професор

КІБІРЄВ Володимир
Констянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії
білка.

Провідна установа – Інститут фізіології імені О.О.Богомольця НАН
України,

відділ експериментальної
кардіології

Захист відбудеться „ 28 ” лютого 2005 р. о 14 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України ( 01601, Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В.Паллладіна НАН України ( Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий „ 27 ” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) є однією з найголовніших
проблем медицини і належить до трійки захворювань, які найчастіше
виявляються причиною ранньої інвалідності і летальності серед населення
практично у всіх країнах світу. ЦД супроводжується порушеннями
вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до
формування ряду ускладнень, зокрема, інтенсифікації процесів зсідання
крові при одночасному гальмуванні механізмів фібринолізу. Для мікро- та
макроангіопатії, які розвиваються за умов ЦД, поряд із прискореним
прогресуванням атеросклерозу характерним є порушення кровообігу та
підвищення ризику тромбозу, що може бути причиною раптової смерті.
Найбільш важливими функціональними змінами, що викликають ангіопатії є
підвищення проникності судинної стінки, гемодинамічні розлади, зміни
в’язкості крові, субактивація нейтрофільних гранулоцитів (НГ) і
порушення адгезивної та агрегаційної здатності тромбоцитів, які є
узалежненими від їхнього морфофункціонального стану.

Аналіз біохімічного та патофізіологічного профіля системи крові ссавців
та людини при цукровому діабеті показав, що залежність проліферативної і
функціональної активності її клітин від інсуліну є функцією еволюційного
часу даної системи, а сам гормон володіє властивостями спільного
гемопоетину. Вивчення функціонального стану системи еритрона за умов
інсулінзалежного цукрового діабету є актуальним, оскільки для цієї
патології харктерне посилення гіпоксії тканин пропорційно до розвитку
діабетичних ускладнень.

Кров’яним пластинкам, еритроцитам та нейтрофілам належать провідні ролі
у патогенезі пізніх діабетичних ускладнень. Підтвердження гіпотези про
первинність порушень функціонального стану ендотеліоцитів у патогенезі
ангіопатій за умов цього захворювання та включення у комплексну терапію
антиагрегантів послужило поштовхом до дослідження молекулярних
механізмів активації тромбоцитів та НГ, опосередкованих впливом оксиду
азоту, продуктами вільнорадикального окислення і змінами в процесах
сигналювання під дією індукторів агрегації. Виявлення змін у
функціонуванні протеїн- та ліпідкіназ, з’ясування причин підвищеної
чутливості кров’яних пластинок та НГ до агоністів дозволить вести
ефективний пошук нових медичних препаратів скерованої дії для лікування
діабетичних ангіопатій.

Підвищена агрегаційна здатність кров’яних пластинок при цукровому
діабеті є наслідком дії ряду факторів. Сповільнення швидкості
метаболізму NO, інгібування активності основних ферментів
антиоксидантного захисту та пов’язана з цим інтенсифікація процесів
перекисного окислення ліпідів призводять до зниження плинності
плазматичної мембрани. Зростання рівня глікозилювання рецепторів на
поверхні клітин крові, інтенсифікація обміну фосфоінозитидів, зміна
активності NO-синтази (NOS), підвищення внутрішньоклітинної концентрації
Са2+ спричиняє активацію сигнальних мереж, що забезпечують реалізацію
біологічних відповідей, включаючи зміни в архітектурі цитоскелету,
адгезії і метаболізмі клітин. Провідна роль у перебудові актинового
цитоскелету належить сигнальним шляхам, залежним від низькомолекулярних
GTP-зв’язуючих білків (G-білків). Порушення функціонування сигнальних
білків є однією з основних причин, що пояснюють підвищену чутливість
тромбоцитів до дії агоністів.

Тривала гіперглікемія спричиняє збудження НГ, аналогічне стану
активації. Під впливом гіперглікемії відбувається лише попередня,
неповна активація клітин, яка супроводжується чітко вираженим станом
пониженої функціональної активності нейтрофілів у хворих на ЦД. У свою
чергу перехід у збуджений стан поліморфноядерних лейкоцитів спричиняє
суттєве посилення екстрацелюлярних патологічних процесів, які руйнують
організм.

За умов ЦД чітко виражений зв’язок між рівнем продукування NO в
організмі і проявами окислювального стресу, який характеризується різким
зниженням вмісту оксиду азоту в кров’яному руслі на фоні накопичення
вільних радикалів кисню і перекисів. З’ясування особливостей
функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ) та NO-залежних
сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану клітин крові
дозволить розширити наші уявлення про механізми виникнення і розвитку
мікро- та макроангіопатій за умов ЦД 1-го типу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету
Львівського національного університету ім. Івана Франка згідно плану
науково-дослідної роботи кафедри за темами: 1). “Діагностика та розробка
засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№
держреєстрації 0193U024092); 2). „Регуляторна дія NAD та
гістидинумісних дипептидів у корекції метаболічних порушень при гіпоксії
різної етіології” (№ держреєстрації 0100U001443 ); 3).
„Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові
за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).

Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було дослідження
молекулярних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та
функціонального стану клітин крові ( тромбоцитів, еритроцитів,
мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитів) та пошук шляхів корекції
патологічних змін метаболічних процесів, які викликають виникнення і
розвиток ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

Дослідити активність NO-синтази в тромбоцитах, еритроцитах та лейкоцитах
у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам per os її
субстрату (L-Arg) та неселективних конкурентних інгібіторів L-NAME
(N?–nitro-L-arginine methyl ester) і L-NMMA
(N?-nitro-monomethyl-L-arginine) та селективного неконкурентного
інгібітора iNOS – AG (аміногуанідину).

Оцінити вплив L-Arg, L-NAME та AG на стан системи антиоксидантного
захисту та рівень перекисного окислення ліпідів у кров’яних пластинках
та еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального
стрептозотоцинового діабету.

Дослідити роль внутрішньоклітинних сигнальних білків
(фосфатидилінозит-3-кінази , с-Src протеїнкінази, високоафінних GTPаз
Rac, Rho та Cdc42) в активації тромбоцитів при ЦД 1-го типу.

Вивчити вплив селективного інгібітора фосфатидилінозит-3-кінази
( РІ-3-кінази) вортманіну на активність NOS та агрегаційну
здатність тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

Дослідити ультратонку структуру тромбоцитів після впливу L-Arg, L-NAME,
AG та вортманіну in vitro та in vivo у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

Дослідити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним
стрептозотоциновим діабетом.

З метою дослідження процесів депонування NO за умов модельного ЦД 1-го
типу дослідити динаміку вмісту лігандних форм Hb та процес нітрозування
Hb in vitro, а також проаналізувати електронні спектри HbNO у нормі, за
умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення селективного
інгібітора iNOS – аміногуанідину.

Дослідити зміни структурно-функціонального стану лейкоцитів периферичної
крові за умов ЦД 1-го типу, охарактеризувавши фагоцитарну активність,
стан бактерицидної системи, клітинного і гуморального імунітету,
вуглеводних детермінант глікопротеїнових рецепторів нейтрофільних
гранулоцитів, апоптоз імунокомпетентних клітин та активність і
локалізацію ключового фермента глюконеогенезу –
фруктозо-1,6-дифосфатази.

Об’єкт дослiдження: тромбоцити і еритроцити контрольних щурiв та тварин
із експериментальним стрептозотоциновим діабетом, а також еритроцити,
лейкоцити та кров’яні пластинки здорових донорів та людей, хворих на ЦД
1-го типу, з констатованими ангiопатiями.

Предмет дослiдження: ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та
індуцибельна NOS) і ферментативна система антиоксидантного захисту
(супероксиддисмутаза – СОД, каталаза, глутатіонпероксидаза – ГПО,
глутатіонредуктаза – ГР, рівень продукції оксиду азоту – NO2Ї та NO3Ї) і
перекисного окислення ліпідів ( ПОЛ – ТБК-позитивні продукти),
агрегаційна здатність тромбоцитів та нейтрофільних гранулоцитів,
ультраструктура кров’яних пластинок на фоні впливу досліджуваних речовин
in vitro та in vivo, РІ-3-кіназа, с-Src протеїнкіназа, високоафінні
GTPази – Rac, Rho та Cdc42, лігандні форми гемоглобіну, функціональний
стан лейкоцитів, фруктозо-1,6-дифосфатаза.

Методи дослiдження: біохімічні, молекулярно-біологічні, методи
трансмісійної електронної мікроскопії та абсорбційної спектроскопії,
цитологічні, імуноцитохімічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Застосування сучасного методу
дослідження агрегації тромбоцитів за декількома параметрами дозволило
встановити, що тромбоцити в периферичній крові при ЦД 1-го типу
знаходяться в активованому стані та виявляють підвищену чутливість до
дії агоністів агрегації – ADP та тромбіну.

Отримані результати свідчать, що еNOS не є домінуючою в регуляції
агрегаційної активності тромбоцитів при діабеті. Вперше показано, що
високий рівень продукції оксиду азоту в тромбоцитах за умов
досліджуваної патології забезпечується активацією індуцибельної
NO-синтази, значна експресія якої була продемонстрована імуноцитохімічно
та за допомогою імуноблотингу з використанням моноклональних антитіл.

Вперше виявлено, що в основі активації тромбоцитів лежать зміни їхньої
ультраструктурної організації та кількісний перерозподіл фракцій білків
цитоскелету. Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних
ефекторних білків з низькомолекулярними G–білками підродини Rho за умов
ЦД 1-го типу. Встановлено підвищення рівня фосфорилювання по тирозину
ряду специфічних білків тромбоцитів у хворих на ЦД 1-го типу та
проаналізовано динаміку його зміни в процесі агрегації, індукованої
тромбіном. Виявлені закономірності фосфорилювання білків кров’яних
пластинок при даній патології свідчать про активацію внутрішньоклітинних
сигнальних шляхів, які залучені у процес агрегації тромбоцитів.

Вперше продемонстровано динаміку перерозподілу внутрішньоклітинного пулу
ключових сигнальних білків с-Src-кінази та РІ-3-кінази у тромбоцитах
хворих на ЦД 1-го типу між цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями.
Встановлено, що процес транслокації с-Src кінази у цитоскелетну фракцію
тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу опосередковується
SH3-доменом молекули ферменту. Посилення включення протеїнкінази с-Src у
цитоскелетну фракцію у кров’яних пластинках при ЦД 1-го типу свідчить
про її активацію.

Вперше показано коригуючий вплив AG – інгібітора індуцибельної ізоформи
NOS та неферментативного глікозилювання – на активність ферментів
антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення
ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів та кров’яних пластинок
щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості у периферичній
крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у
поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм
розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та
при ЦД 1-го типу на фоні введення основного субстрату та інгібіторів
NO-синтази. Показано, що за умов ЦД у еритроцитах значно зростає
активність іNOS та інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.

Встановлено, що ЦД 1-го типу супроводжується змінами функціонального
стану лейкоцитів і перерозподілом вуглеводних детермінант
глікопротеїнових рецепторів НГ та зростанням активності NOS у
мононуклеарних та поліморфноядерних клітинах білого ряду. За здатністю
нейтрофільних гранулоцитів до лектиніндукованої агрегації показано
збільшення вмісту N-ацетил-?,D-глюкозамінo- та N-ацетилнейраміновмісних
і зменшення ?,D-манозо-, ?,D-глюкозо-, N-ацетил-?,D-галактозамінo- та
?,D-галактозовмісних глікокон’югатів у складі вуглеводних детермінант
глікопротеїнових рецепторів цих клітин у хворих на ЦД 1-го типу.

Виявлено суттєве зростання частоти морфологічних ознак апоптозу та
збільшення числа CD95-позитивних нейтрофільних гранулоцитів і CD95
-позитивних мононуклеарних клітин крові за умов ЦД 1-го типу.

Досліджено активність та внутрішньоклітинну локалізацію
фруктозо-1,6-дифосфатази – ключового фермента глюконеогенезу у
мононуклеарних та поліморфноядерних лейкоцитах людей у нормі та за умов
ЦД 1-го типу.

Практичне значення одержаних результатів. Оскільки введення AG викликало
зниження рівня глюкози, глікозильованого гемоглобіну і вмісту продуктів
ПОЛ, нормалізувало активність ферментів системи антиоксидантного захисту
та здійснювало коригуючий вплив на морфофункціональний стан клітин крові
та депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання Hb за
умов ЦД 1-го типу, доцільно на його основі вести пошук та розробку нових
фармакологічних препаратів для комплексної терапії ЦД, скерованих на
нормалізацію функціональної активності кров’яних пластинок та системи
транспорту кисню.

Виявлені диференційні зміни зв’язування ряду специфічних ефекторних
білків з низькомолекулярними G–білками підродини Rho за умов ЦД 1-го
типу можуть бути покладені в основу молекулярної діагностики генетичних
передумов маніфестації і прогресування захворювання.

Комплексне цитохімічне вивчення функціонального стану нейтрофілів з
використанням у якості індукторів агрегації лектинів є новим напрямком
розробки діагностичних і прогностичних підходів у терапії даної
патології. Використаний нами набір лектинів для дослідження агрегаційної
здатності нейтрофілів є оптимальним з точки зору інформативності
отриманих результатів для характеристики вуглеводної специфічності
рецепторного апарату НГ. Така тест-система є перспективною для
з’ясування патогенезу даної патології.

Співпадіння напрямленості та пропорційність змін величини апоптичних
індексів за морфологічними апоптичними ознаками та за визначенням
CD95-позитивних лейкоцитів, може бути основою для рекомендації щодо
використання у клінічній лабораторній практиці морфологічного аналізу
апоптозу як дешевшого і більш доступного, але водночас достовірного
критерію.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах, які
читаються на кафедрах біохімії біологічних факультетів університетів.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто
або за безпосередньої участі. Дисертаційна робота – завершене
дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних
досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1992-2004
рр. Дисертантом особисто обгрунтовано концепцію роботи, розроблено
методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних
літератури, запропоновано гіпотетичні схеми. Основні положення і
висновки обговорено та сформульовано разом із науковим консультантом –
доктором біологічних наук, професором кафедри біоорганічної, біологічної
та фармацевтичної хімії Київського національного медичного університету
імені О.О.Богомольця Великим М.М. Робота виконана у межах
держбюджетних тематик, які виконувалися на кафедрі біохімії Львівського
національного університету імені Івана Франка, науковим керівником
однієї з яких є автор. Частина досліджень була виконана у відділі
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України у
рамках договору про співпрацю між відділом і кафедрою біохімії.
Електронно-мікроскопічні дослідження виконано в Міжфакультетській
лабораторії електронної мікроскопії Львівського національного
університету імені Івана Франка спільно із завідувачем лабораторії
к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Співучасть співробітників кафедри
біохімії , відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології та
лабораторіі електронної мікроскопії у виконанні роботи відмічена у
спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були
представлені на Українських біохімічних з’їздах: VІ ( Київ, 1992), VІІ
(Київ, 1997), VІІІ (Чернівці, 2002), на V Міжнародній конференції
„Биоантиоксидант” (Москва, 1998), на науково-практичних конференціях –
Международные дни диабета „ Диабет-проблема общечеловеческая”
(Дніпропетровськ 1999, 2003), на VІІІ Конгресі Світової Федерації
Українських Лікарських Товариств (Трускавець-Львів, 2000), на VI
Всеукраїнському з’їзді ендокринологів (Київ, 2001), на V Європейському
конгресі з ендокринології (Турин, Італія, 2001), на ІV конференції імені
Парнаса (Вроцлав, Польща, 2002), на ІІІ з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002), на науково-практичній конференції “Актуальні
проблеми тромбозу і порушень гомеостазу в клінічній медицині” (Київ,
2003), на ІІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та
клінічної біохімії (Львів, 2004), на Установчому З’їзді Українського
Товариства клітинної біології (Львів, 2004), на ІV Національному
конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), на 29 конгресі
Федерації Європейських біохімічних товариств – FEBS (Варшава, Польща,
2004), на Пленумі з клінічної лабораторної діагностики (Київ, 2004), на
міжнародній науково-практичній конференції „Сучасний стан і проблеми
експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 46 робіт, з яких 26 –
статті у фахових наукових журналах і збірниках, 20 – тези доповідей у
матеріалах наукових з’їздів, конференцій та конгресів.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладеня на 321 сторінці
друкованого тексту і складається зі вступу, аналітичного огляду
літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів власних
досліджень, аналізу та узагальнення досліджень, висновків та списку
літератури. Текст дисертації ілюстрований 48 рисунками та 30 таблицями.
Перелік використаних джерел становить 452 посилання.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано
сучасні дані стосовно виникнення і розвитку цукрового діабету 1-го типу.
Охарактеризовано систему L- аргінін/ оксид азоту та її вплив на
ферментативну антиоксидантну систему, а також на морфофункціональний
стан тромбоцитів, еритрону та лейкоцитів у нормі і за умов цукрового
діабету.

Матеріали і методи досліджень. У роботі були викopиcтaні моноклональні
анти-р85? антитіла, люб’язно надані д-ром І. Гутом (Людвігівський
інститут ракових досліджень, Лондон, Велика Британія), моноклональні
анти-iNOS антитіла (“Sigma”, США), поліклональні анти-FBPase (“Sigma”,
США), анти-мишачі IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Sigma”, США),
анти-кролячі козячі кон’юговані з золотом антитіла ( Anti-rabbit IgG
gold conjugated, Sigma, США), анти-мишачі IgG кон’юговані з золотом
антитіла (Anti-mouse IgG, Sigma, США), анти с-Src поліклональні антитіла
(“Santa Cruz Biotechnology” CША ), нітроцелюлозна мембрана (“Osmonics”,
США), реагенти для посиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика
Британія) та набори реактивів для виділення плaзмідної ДНК “NucleoSpin
System” (“NT”, Велика Британія).

Бактерії E.coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene” США) вирощували в
середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії
штаму BL-21 з плазмідою резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі
LB з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл,
відповідно) на шейкері при 370С. Для трансформації E. coli штаму Bl-21
використовували відповідні pGEX-2T плазмідні вектори, люб’язно надані
д-ром І. Гутом.

Забір крові проводили з пальця або вени у стерильні силіконізовані
пробірки. При дослідженні фунціонального стану сегментоядерних
нейтрофілів процесу згортання запобігали попередньо додавши в посуд
гепарин (кінцеве розведення 1:100). Для оцінки імунного статусу
використовували кров, яку отримували з вени, у якості антикоагулянта
використовували 1,5% водний розчин ЕДТА (на 2 мл крові брали 0,1 мл
розчину).

Експериментальний цукровий діабет у щурів викликали введенням
стрептозотоцину фiрми “Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла
внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в
крові, яку визначали з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія)
[Tringer, 1969]. В експериментi використовували тварин із рівнем глюкози
14-16 ммоль/л. Вплив L-аргініну, L-NMMA, L-NAME та AG оцінювали in
vitro: при інкубації периферичної крові людей з цими речовинами та in
vivo: при введенні цих речовин per os з питною водою щурам. У дослідах
in vitro проби інкубувалася 10 хв при 37?С з L-аргініном (“Reanal”,
Угорщина) – субстратом досліджуваного фермента, а також з інгібіторами:
з L-NMMA (“Beckenham”, Велика Британія), L-NAME (“Beckenham”, Велика
Британія) та з аміногуанідином (“Sigma”, США). Кінцева концентрація усіх
речовин, використаних для інкубації – 10 мкМ. У експериментах in vivo з
моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини
з питною водою : L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів;
L-NMMA та L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у
концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких
групах:1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + L-NMMA;
5. К + AG; 6. Діабет (Д); 7. Д + L-аргінін; 8. Д + L-NAME; 9. Д +
L-NMMA; 10. Д + AG.

Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий
О.І., 1998]. Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому
через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту,
який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні
розчинів NaNO2 та аскорбінової кислоти [Gross S.S., 1999].

Забір крові для отримання тромбоцитів людей, хворих на ЦД 1-го типу,
проводили зранку (натще і до прийому інсуліну) у силіконізовані
пробірки, що містили 1:10 об’єму 3,8%-ного розчину цитрату натрію у
якості антикоагулянту і 1,5 од/мл апірази (“Fluka”, Швейцарія).
Агрегаційну здатність кров’яних пластинок досліджували у збагаченій
тромбоцитами плазмі на автоматичному аналізаторі “Биола” (Росія) згідно
з [Gabbasov et al., 1989]. Збагачену тромбоцитами плазму інкубували з
вортманіном (кінцева концентрація 100 нМ) протягом 30 хв.при кімнатній
температурі.Тромбоцити виділяли шляхом диференційного центрифугування
згідно роботи [Ferrell et al., 1989]. Лізис тромбоцитів проводили
протягом 30 хв на льодяній бані холодним буфером лізису такого складу:
10 мМ трис-HCl, 150мМ NaCl, 1% тритон Х-100, 5мМ ЕДТА, 50мМ NaF, 1мМ
фенілметилсульфонілфторид (“Fluka”, Швейцарія), 5мМ бензамідин
(“Sigma”), 10мкг/мл апротиніну (“Sigma”), 10мкг/мл лейпептину (“Sigma”),
2мкг/мл пепстатину (“Fluka”), 0,25 мМ Na3VO4 1:10 за об’ємом.
Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням при 12000 g і
40С протягом 15 хв. Дослідження активності ферментів проводили в
супернатанті. Концентрацію білка вимірювали за методом [Peterson, 1977].
Супероксиддисмутазну активність (СОД, КФ 1.15.1.11) визначали методом,
який ґрунтується на відновленні нітросинього тетразолію супероксидними
радикалами [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6)
визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом
амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (ГПО, КФ
1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток
кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана
[Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] оцінювали
за зменшенням вмісту NADPH [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що
реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали
за методикою [Тимирбулатов и др., 1981]. Активність NO-синтази визначали
як описано в роботах [Онуфриев М.В.,1995, Сумбаев, 2000] у нашій
модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих
продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989],
нітратів за методом [Cawse, 1967]. Глікозильований гемоглобін визначали
колориметричним методом [van Kampen, 1983]. Білки лізатів тромбоцитів
розділяли електрофорезом в блоках градієнтного (5-18%) поліакриламідного
гелю в присутності SDS [Laemmli, 1970] з наступним імуноблотингом
[Towbin, 1979]. Денситометричний аналіз результатів імуноблотингу
здійснювали з використанням пакету програми “Image Tool”.

Білок-білкові взаємодії вивчали in vitro з використанням кон’югованих з
глутатіон-S-трансферазою (GST) рекомбінантних форм GTPаз. Очистку
GST-кон’югованих білків із оброблених на ультразвуковому дезінтеграторі
(УЗДН-1, Росія) бактерійних лізатів здійснювали за допомогою
глутатіон-сефарози 4B (“Pharmacia Biotech”, Швеція) згідно протоколу
фірми – виробника. Білки, що специфічно зв’язались із
глутатіон-сефарозою, розділяли електрофорезом в блоках градієнтного
(5-18%) ПААГ в присутності SDS. Для оцінки рівня неспецифічного
зв’язування лізати тромбоцитів інкубували з GST-глутатіон-сефарозою.
Зафарбовування електрофореграм проводили за допомогою азотнокислого
срібла [Wray, 1981]. Для визначення молекулярної маси білків
використовували білкові стандарти фірм “Pharmacia” та “TRIZМA”.

Дослідження ультратонкої структури тромбоцитів проводили методом
трансмісійної електронної мікроскопії на зрізах за допомогою
електронного мікроскопа ПЕМ-100. Виділення, відмивання та фіксацію
тромбоцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою
[Васильева, 1982, Slot J.W.1983,].

Цитологічні методи дослідження клітин периферичної крові та кісткового
мозку виконувались згідно [Сибірна Н.О.,1997], імунологічні [Лаповець
Л.Є.,2002].

Статистичну обробку даних проводили з використанням коефіцієнту t
Ст’юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на морфофункціональний стан
тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу. Дослідження впливу L-аргініну та
інгібіторів NOS на морфофункціональний стан тромбоцитів проведено у
експериментах із введенням досліджуваних речовин per os контрольним
тваринам та на фоні стрептозотоцинового діабету. У таблиці 1 зведені
показники агрегаційної здатності тромбоцитів та суми вмісту кінцевих
продуктів метаболізму оксиду азоту: нітритів – NO2Їта нітратів – NO3Ї, у
збагаченій тромбоцитами плазмі, адже саме цей показник є індексом
продукції NO. У нормі введення L-аргініну викликало збільшення продукції
NO, який здійснював властивий йому фізіологічний вплив: знижується
агрегаційна здатність тромбоцитів і збільшується час агрегації.
Підтвердженням дії конкурентних інгібіторів у контрольній групі тварин є
достовірне зниження продукції оксиду азоту, що, відповідно, призводило
до зростання агрегації тромбоцитів більше ніж у два рази і до скорочення
часу агрегації у порівнянні до контролю. Незначне інгібування продукції
NO аміногуанідином свідчить про невеликий вклад iNOS у здійснення
фізіологічної регуляторної функції цією ізоформою у нормі.

При введенні L-аргініну, L-NMMA та L-NAME тваринам із експериментальним
діабетом ми не спостерігали яскраво вираженого регуляторного впливу NO
на агрегаційну здатність тромбоцитів. Основний і вирішальний вклад у
продукцію NO за умов інсулінзалежного цукрового діабету має
аміногуанідинзалежний синтез оксиду азоту, тобто синтез за участю iNOS.

Нами була досліджена ультраструктура тромбоцитів у нормі та за умов
інсулінзалежного цукрового діабету. При порівнянні мікроелектронограм
слід відмітити, що тромбоцити, виділені з крові хворих тварин, мають
характерні ознаки активації та деградації. Процес супроводжується
втратою тромбоцитами дископодібної форми, утворенням численних
псевдоподій. В самих клітинах відбувається зменшення електронної густини
та зниження кількості ?-гранул. Вони переміщаються до центру клітини та
зливаються з вакуолями поверхневовакуолярної системи, де їхній вміст
секретується у міжклітинний простір.

При введенні L-аргініну значно зростав рівень глюкози у крові тварин
(табл.1.), тобто усугублявся їхній патологічний стан. Електронограма
тромбоцитів цієї дослідної групи наглядно демонструє значні пошкодження
кров’яних пластинок. Введення AG знижувало рівень глюкози в крові і
вміст глікозильованого гемоглобіну за рахунок пригнічення
неферментативного глікозилювання білків, що, незаперечно, має
протекторний вплив на увесь організм за умов даної патології.

Отримані дані, на нашу думку, свідчать не просто про зміну рівня
продукції NO у тромбоцитах, а про перерозподіл вкладу у цей синтез
різних ізоформ NOS при інсулінзалежному ЦД, а також про зміну шляху його
утилізації. У нормі основну роль у продукції NO відіграє еNOS. Це
ендотеліальна конститутивна кальцій-кальмодулін (Са2+- СаМ)-залежна
ізоформа, котрій притаманна фізіологічно-регуляторна функція, яку вона
здійснює через продукцію помірних кількостей оксиду азоту (пікомолі). За
умов гіперглікемії, яка супроводжує ЦД, глікозилювання СаМ є однією з
причин зниження активності еNOS. Додатковим фактором зниження активності
цього ферменту є розвиток гіпоксичного стану, характерного для ЦД,
оскільки утворення оксиду азоту з L-аргініну за участю цієї ізоформи
відбувається в присутності кисню.

Таблиця 1

Зміни досліджуваних показників in vivo при введенні L –аргініну, L-NMMA,

L-NAME та аміногуанідину щурам у нормі і при стрептозотоциновому
діабеті,

( М?m, n=14)

Показники

Групи

NO2- + NO3- мкM

Вміст Hb A?c,

%

Ступінь агрегації, у.од.

Час агрегації, с Рівень глюкози в крові, ммоль/л

К 23,25 ± 0,45 4,53 ± 0,05 24,8 ± 0,42 192,5 ± 5,4 5,6 ± 0,5

К + L–арг 27,42 ±0,51* 4,47 ± 0,11 21,16 ± 0,3* 206,75± 9,4* 5,8 ± 0,6

К +

L-NAME 19,65 ±0,44* 4,60 ± 0,12 50,46 ± 0,7* 51,2 ±4,3* 6,9 ± 0,7*

К +

L-NMМА 14,53 ±0,62* 4,39 ± 0,23 48,7 ± 0,23* 48,5 ± 3,4* 5,8 ± 0,4

К + AG 21,7 ± 0,51 4,49 ± 0,07 30,8 ± 1,2* 120,3 ± 6,8* 5,16 ± 0,9

Д 32,6 ± 0,61* 8,81 ± 0,41* 61,7 ± 1,5* 62,3 ± 3,2* 12,5 ± 0,5*

Д + L–арг 29,3 ± 0,42** 9,92 ± 0,63** 55,4 ± 1,2** 89,5 ± 4,1** 14,2 ±
1,1**

Д +

L-NAME 13.5 ± 0.71** 8.01 ± 0.47 58.2 ± 0.9 49.8 ± 2.2** 12.2 ± 0.4

Д +

L-NMМА 10,7 ± 0,60** 7,92 ± 0,39 59,5 ± 1,1 43,1 ± 2,1** 11,9 ± 0,5

Д + AG 24,8 ± 0,80** 6,03 ± 0,28** 67,6 ± 1,5** 46,4± 4,2** 8,6 ± 0,4**

* – різниця вірогідна порівняно з контролем, р $ R >@¶F

oe

O

„o

`„o

O

#

O

?uououeaueuUouUoueuauOeuouauIuCOeCOeau?uauauaCOeauu¦uou¦uauau¦u¦u¦uu

EHuy

$

O

O

O

$

O

$

O

>

@

~ ’ –
ueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoe
ueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeueoeue?ea?e?e?e?
ue?UO?

O

$

O

oioieaeiUOioiIiAI?I?IµIµIµIµIµI®IµI®IµI®IµI®IµI®IµI®I®IµI®IµIµIµI®

???`??

???

O

h //

$

O

O

O

O

O

?

?

O

O

?

?

O

O

O

?

?

O

O

O

O

O

O

O

печується білок-білковими взаємодіями, опосередкованими SH3-доменом
ферменту, за рахунок розпізнавання пролін-багатих послідовностей у
білках мішенях [Brown M.T.,1996, Malarkey K.,1995]. Для з’ясування
можливих змін у функціонуванні с-Src-кінази при цукровому діабеті нами
був використаний такий методичний підхід, як зв’язування білків лізатів
тромбоцитів із рекомбінантним SH3-доменом с-Src-кінази, кон’югованим з
GST, in vitro. При відсутності стимуляції зв’язування білків з
SH3-доменом у контролі відсутнє. За цих же умов при ЦД 1-го типу ми
спостерігали асоціацію SH3-домену з білком з мол масою 70 кДа.
Стимуляція тромбіном контрольних тромбоцитів викликала поступове
зростання рівня зв’язування білків, які мають молекулярні маси 80, 70,
65, 68, 29 кДа з рекомбінантним SH3-доменом.

За умов ЦД 1-го типу динаміка асоціації SH3-домену з вказаними білками
характеризувалась фазним характером, причому зв’язування з білками
спостерігалось на 30 сек і на 4 хв стимуляції. Отримані результати
корелюють з даними імуноблотингу с-Src-кінази. Таким чином, отримані
результати свідчать про те, що SH3-домен c-Src кінази відіграє виключно
важливу роль у транслокації молекули до цитоскелету у нормі та за умов
ЦД 1-го типу.

Рис. 4. Імуноблотинг с-Src-кінази у Тритон Х-100 розчинній фракції
нестимульованих тромбоцитів, ізольованих із крові здорових донорів (1)
та людей, хворих на ЦД 1 –го типу (2).

Виявлені зміни зв’язування SH3-домену c-Src з ефекторними білками можуть
свідчити про порушення процесів полімеризації та реполімеризації актину
у кров’яних пластинках за даної патології. У тромбоцитах, ізольованих з
крові здорових донорів, перехід глобулярного G-актину у фібрилярний
F-актин відбувається поступово і пропорційно до часу стимуляції
тромбіном [Harwing J.H.,1995].

Провідна роль у запуску цього процесу належить іонам кальцію,
внутрішньоклітинна концентрація яких зростає при стимуляції [Dash D.,
1995, Harwing J.H.,1995]. Оскільки концентрація Са2+ у тромбоцитах людей
хворих на цукровий діабет є вищою, порівняно із здоровими [Mazzanti L.,
Mutus B.1997, Winocour P.D.1992], то це може призводити до спонтанної
полімеризації актину, інтенсифікації процесів фосфорилювання
/дефосфорилювання білків [Mazzanti L., Mutus B.1997], активації
рецепторів агоністів, спряжених із G-білками, що можуть ініціювати
зростання протеїнкіназної активності c-Src. Не виключена також
можливість модифікації самої кінази та її субстратів як глюкозою, так і
вільними радикалами кисню.

Вплив цукрового діабету на динамічний стан системи еритрону. Метаболічні
порушення, які розвиваються внаслідок абсолютної або відносної
інсулінової недостатності при цукровому діабеті, значно ускладнюють
функціонування систем підтримання гомеостазу, важливою ланкою якого є
еритроцити периферичної крові. Нами були проведені дослідження
цитологічних та фізико-хімічних показників периферичної крові тварин з
експериментальним цукровим діабетом. Вміст ретикулоцитів у периферичній
крові за умов ЦД 1-го типу є у 1,4 рази більший в порівнянні до норми.

Добова продукція еритроцитів при досліджуваній патології збільшувалася у
1,3 рази, а швидкість дозрівання ретикулоцитів зростала у півтора рази.
Посилення еритропоезу, яке супроводжується збільшенням кількості
ретикулоцитів, слід розглядати як компенсаторну реакцію, спрямовану на
збільшення кисневої ємності крові у відповідь на генералізовану тканинну
гіпоксію. Дослідження вмісту фетального гемоглобіну в еритроцитах
контрольних та діабетичних щурів показали, що розвиток
стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого
гемоглобіну F. Таке зростання виправдане в умовах гіпоксичного стану,
який розвивається за умов ЦД, з огляду на більшу спорідненість
фетального гемоглобіну до кисню.

Для підтвердження виявлених динамічних змін системи еритрону на
клітинному рівні проводилися цитологічні дослідження кісткового мозку
щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. Аналізуючи
показники таблиці 4, потрібно відмітити зниження процентного вмісту
поліхроматофільних та оксифільних нормоцитів при стрептозотоциновому
діабеті. Виявлені зміни в складі нормоцитів можна пояснити сповільненим
дозріванням цих еритрокаріоцитів та швидкими темпами елімінації
ретикулоцитів у русло крові. Отримані дані узгоджуються з підвищенням
вмісту ретикулоцитів у периферичній крові щурів при експериментальному
ЦД 1-го типу.

Таблиця 4

Морфологічний склад препаратів кісткового мозку щурів у нормі та при
експериментальному ЦД 1-го типу, ( М?m, n=17)

Групи

Еритрокаріоцити Контроль, % Стрептозотоциновий

діабет, %

Еритробласти 4,1?0,01 8,0?0,2?

Пронормобласти 10,3?0,1 11,8?0,1

Нормоцити

1) базофільні

18,6?0,3

30,5?0,2?

2) поліхроматофільні 51,6?0,5 38,6?0,2?

3) оксифільні 16,1?0,04 9,3? 0,4?

?- різниця вірогідна порівняно з контролем, р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020