ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

ЄВСТИГНЄЄВ Максим Павлович

УДК 577.113:541.49

Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і днк у
водному розчині

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному
університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий консультант доктор фізико-математичних наук,

професор Веселков Олексій Никонович,

Севастопольський національний технічний

університет, завідувач кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор, Семенов Михайло Олексійович,
Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України,
старший науковий співробітник відділу біофізики (м.Харків);

доктор фізико-математичних наук, професор, Харкянен Валерій Миколайович,
Інститут фізики НАН України, завідувач відділу фізики біологічних систем
(м.Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор, Прилуцький Юрій Іванович,
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедри
біофізики (м.Київ).

Провідна установа

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН
України, відділ молекулярної біофізики, м.Харків.

Захист відбудеться 02.02.2007 р. о 15_ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному
університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077, м.Харків, пл. Свободи, 4.
ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою:

61077, м.Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 23.12. 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біологічно активні ароматичні сполуки (БАС) утворюють
найважливішу групу фармацевтичних препаратів, що знайшли широке
прикладання в різних медичних застосуваннях. Використання ароматичних
сполук в якості лікарських засобів в багатьох випадках сполучено з
ризиком побічної токсичності, що різко обмежує їх застосування в
клінічній практиці. Разом з тим, ризик побічних ефектів може бути
суттєво знижений, або медико-біологічний ефект посилений при
комбінуванні ароматичних препаратів з іншими ароматичними сполуками в
дозі. Численні дослідження показують, що суміш різних БАС, які присутні
в організмі одночасно, виявляє виражений біологічний синергізм і надає
потенційну можливість спрямованої регуляції біологічного відгуку
ароматичних БАС, що надходять в організм у комбінації.

На даний час не існує чітких уявлень про причини і механізми виникнення
спостерігаємих синергетичних ефектів при одночасному використанні
ароматичних БАС як на клітинному, так і на молекулярному рівнях. Разом з
тим, відомо, що більшість сполук цього класу виявляють свою
медико-біологічну дію шляхом комплексоутворення з біополімерами в
клітині – ДНК або білками, – а також демонструють тенденцію до само-
(взаємодія однотипних молекул) і гетероасоціації (взаємодія різнотипних
молекул) у водному розчині, що носять нековалентний характер. Є підстави
вважати, що гетероасоціація ароматичних сполук і їх конкурентне
зв’язування з рецептором можуть модулювати біологічну активність БАС
через модифікацію параметрів зв’язування БАС з біополімерами і, тим
самим, виступати в якості молекулярних механізмів зміни біологічної
активності ароматичних препаратів, які надходять в організм спільно.
Однак, нековалентні взаємодії різних класів біологічно важливих
ароматичних сполук у присутності біополімеру по цей час залишаються
практично невивченими.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася відповідно до плану науково-дослідних робіт кафедри фізики
Севастопольського національного технічного університету (СевНТУ), у
рамках держбюджетної НДР “Нуклеотид” Міністерства освіти і науки України
(№ держ.реєстр. 0104U000568; керівник теми): “Гідротропний і
синергетичний ефекти при утворенні гетерокомплексів ароматичних
біологічно активних молекул і їх взаємодії з ДНК у водному розчині”,
2003-2006; у рамках персонального гранта НАТО і Королівського товариства
Великобританії “Stochastic model of competitive binding of aromatic
drugs to DNA” (2003-2004 р.); частково в рамках Міжнародного гранта
INTAS-97 31753: “Design, synthesis and testing of novel
biologically-active molecules as potential drugs with sequence-specific
binding to nucleic acids”, 1999-2002; відповідно до договорів про
науково-технічне співробітництво між Беркбек коледжем Лондонського
університету (Великобританія) і СевНТУ (2003-2008 р.) і між Автономним
університетом м.Пуебла (Мексика) і СевНТУ (2002-2007 р.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є встановлення основних
закономірностей процесів взаємодії ароматичних БАС різних за своїми
структурними (моно- і біс-інтеркалятори ДНК) і медико-біологічними
(антибіотики, мутагени, вітаміни) властивостями у водно-сольовому
розчині і з’ясування механізмів спільного (конкурентного) зв’язування
цих сполук із ДНК. У якості ароматичних БАС використовувались сполуки:
антибіотики (дауноміцин — DAU, доксорубіцин — DOX, ногаламіцин — NOG,
митоксантрон — NOV, актиноміцин D — AMD, норфлоксацин — NOR); мутагени
(бромістий етидій — EB, йодістий пропидій — PI, профлавин — PF, кофеїн —
CAF); вітаміни (флавин-мононуклеотид — FMN і нікотинамід — NMD);
біс-інтеркалятори (гомодимер етидію — EBH і акридиновий гомодимер —
AcrH) і фрагмент ДНК – дезокситетрануклеотид 5’-d(TpGpCpА).

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі:

1. Розробка теоретичних підходів для аналізу асоціації і
комплексоутворення ароматичних БАС із ДНК в умовах водного розчину.

2. Структурний і термодинамічний аналіз методом ЯМР-спектроскопії та
молекулярного моделювання процесів само- і гетероасоціації ароматичних
молекул у групах БАС1-БАС2, що мають медико-біологічне значення:
Антибіотик-Антибіотик, Вітамін-БАС, Кофеїн-БАС, Біс-інтеркалятор-БАС.

3. Дослідження комплексоутворення БАС із фрагментом ДНК.

4. Розробка способу кількісного аналізу взаємовпливу ароматичних
препаратів на параметри їх зв’язування з ДНК.

5. Аналіз механізмів спільного зв’язування ароматичних сполук із ДНК у
системах БАС1-БАС2-ДНК і міжмолекулярних взаємодій ароматичних БАС у
багатокомпонентних системах БАС1-БАС2-БАС3; формування уявлень про
спрямовану регуляцію біологічної активності в суміші ароматичних БАС.

Об’єкт дослідження – міжмолекулярні взаємодії за участю ароматичних БАС
та ДНК у водному розчині.

Предмет дослідження – молекулярні механізми асоціації ароматичних
біологічно активних молекул і їх спільного зв’язування з ДНК у водному
розчині.

Методи дослідження: одномірна (аналіз концентраційних і температурних
залежностей протонних хімічних зсувів) і двомірна (2М-TOCSY, 2М-ROESY)
гомоядерна 1H-ЯМР спектроскопія (500 МГц) – для одержання структурних і
термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул, аналізу
динамічної рівноваги молекулярних асоціатів у розчині; пакети програм
молекулярного моделювання X-PLOR і HyperChem для побудови просторових
структур молекулярних комплексів у розчині.

Наукова новизна отриманих результатів. У даній роботі вперше
запропоновано спосіб аналізу й інтерпретації на молекулярному рівні
механізмів регуляції медико-біологічної активності при спільному
використанні різних комбінацій ароматичних БАС. Отримано нову наукову
інформацію про характер міжмолекулярних взаємодій різних груп
ароматичних БАС: Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик,
Біс-інтеркалятор-БАС, що виявляють синергізм медико-біологічної дії при
спільному використанні.

На основі структурного та термодинамічного аналізу встановлено, що
асоціація ароматичних БАС у водно-сольовому розчині носить характер
стекингу хромофорів, переважно стабілізованого дисперсійними і
гідрофобними взаємодіями. Уперше встановлений факт додаткової
стабілізації гетерокомплексів молекул у групах Вітамін-БАС і
Антибіотик-Антибіотик міжмолекулярними водневими зв’язками.

Аналіз асоціації ароматичних біс-інтеркаляторів дозволив уперше зробити
висновок про існування в розчині різних за структурою агрегатів, що
включають відкриту і закриту форми, частково інтеркальовані димери і
тримери.

Запропоновано новий підхід до аналізу багатокомпонентних взаємодій
ароматичних молекул у розчині, заснований на алгоритмічному моделюванні
процесів асоціації молекул, що дозволило уперше вивчити трикомпонентні
змішані розчини ароматичних БАС з урахуванням усіх можливих
міжмолекулярних взаємодій компонентів суміші.

Запропоновано фізичну модель спільного зв’язування різних ароматичних
БАС з ядерною ДНК, на підставі якої проведено аналіз спільного
зв’язування різних комбінацій ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК,
Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК.

Уперше введено поняття інтерцепторного і протекторного механізмів дії в
системах Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК, та запропоновано
спосіб кількісної оцінки відносного внеску цих механізмів у зміну
біологічної активності комбінації БАС.

Для досліджених груп ароматичних БАС продемонстровано потенційну
можливість регулювання біологічної активності в комбінації ароматичних
сполук і можливість кількісної оцінки очікуваного біологічного ефекту.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновані в роботі
теоретичні моделі і методика можуть бути використані для аналізу й
інтерпретації експериментальних даних ЯМР по нековалентній асоціації
будь-яких ароматичних сполук у водному розчині.

Отримані результати можуть мати застосування в області біотехнології
(розробка речовин із заданими медико-біологічними властивостями), оцінки
ефективності лікарських препаратів при їх комбінованому використанні,
при розробці оптимальних режимів комбінованої хіміотерапії,
вітамінотерапії, дієти при хіміотерапії і для інших застосувань,
пов’язаних з необхідністю обліку спільної дії біологічно активних
ароматичних речовин.

Особистий внесок здобувача. У роботах [9-21,23-29,31,36-38,41,43-49] —
постановка ЯМР експерименту, обробка експериментальних даних,
розшифровка і віднесення одно- і двомірних спектрів ЯМР; у роботах
[4-6,12,22,23,28,30,34,35] – розробка моделей багатокомпонентної
гетероасоціації; у роботах [1,13,20,25,32,50-53] – розробка моделі
спільного зв’язування ароматичних БАС із ДНК, формулювання критеріїв
кількісної оцінки багатокомпонентної рівноваги; у роботах
[1-8,12,13,15,19-35,37,38,40,41,43, 44,46-53] — участь у написанні
наукових статей; у всіх роботах без винятку – проведення обчислень,
аналіз і інтерпретація результатів, підбір літератури.

Апробація роботи. Основні результати досліджень, які ввійшли до
дисертації, були представлені й обговорені на: 6-й міжнародній
конференції по застосуванню магнітного резонансу в науках про їжу,
Париж, вересень, 2002, Франція; 3-му з’їзді українського біофізичного
товариства, Львів, жовтень, 2002, Україна; 16-й Міжнародній
школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”, Севастополь,
травень, 2003, Україна; 1-й об’єднаній міжнародній конференції по ЯМР
спектроскопії EENC/AMPERE, Лілль, вересень, 2004, Франція; 1-й
всеукраїнській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної
фізики”, Харків, вересень, 2004, Україна; 3-й міжнародній конференції з
нових технологій і застосуванню сучасних фізико-хімічних методів,
Ростов-на-Дону, березень, 2005, Росія; 3-й Міжнародній конференції
“Фізика рідких середовищ: сучасні проблеми”, Київ, травень, 2005,
Україна; 17-й Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і
кристалів”, Берегове, вересень, 2005, Україна; 5-й Харківській
конференції молодих учених “Радіофізика і СВЧ електроніка” (секц.
біофізики), Харків, грудень, 2005, Україна; 3-й міжнародній конференції
по водневим зв’язкам і молекулярним взаємодіям, Київ, травень, 2006,
Україна; об’єднаній конференції “Euromar”, Йорк, липень, 2006,
Великобританія.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 53 роботи, у тому
числі 33 статті в наукових журналах і 20 тез доповідей на національних і
міжнародних конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, семи розділів і
висновків. Повний обсяг дисертації складається з 341 с., список
використаних літературних джерел – 490 найменувань – 29 с. Дисертація
містить 97 рис. і 45 табл., у тому числі на 34 окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, зв’язок дисертації з науковими
програмами і темами, сформульовані мета і задачі дослідження, показані
новизна і практична значимість отриманих результатів, зазначений
особистий внесок здобувача в опубліковані зі співавторами роботи.

Розділ 1 присвячений аналізу сучасної інтерпретації спостерігаємих in
vitro і in vivo синергетичних біологічних ефектів при спільному
використанні різних ароматичних БАС. Дано сучасне уявлення про
міжмолекулярні взаємодії ароматичних молекул у водному розчині і можливі
механізми зміни біологічної активності різних ароматичних препаратів, що
надходять у систему в біологічно значимих комбінаціях:
Антибіотик-Антибіотик, БАС-Метилксантин, БАС-Вітамін. Аналіз показав, що
для системи БАС-Метилксантин домінує уява про два найбільш значимі
молекулярні механізми зміни активності препарату в присутності кофеїну і
родинних метилксантинів – це конкуренція за сайти зв’язування на ДНК і
гетероасоціація – за умови, що основна біологічна дія препарату
виявляється через комплексоутворення з ДНК. Огляд літератури дозволив
зробити висновок, що обидва процеси, очевидно, є наслідком ароматичної
будови взаємодіючих молекул і в зв’язку з цим можуть виявлятися не
тільки в системі БАС-Метилксантин, але також і в інших комбінаціях
ароматичних молекул. Зокрема, існують свідчення про синергетичний
біологічний ефект в комбінаціях Антибіотик-Антибіотик і БАС-Вітамін,
який не має зараз адекватного пояснення. Таким чином, був зроблений
висновок про те, що задача з’ясування молекулярних механізмів зміни
медико-біологічної активності ароматичних препаратів у комбінації
зводиться до узагальненої проблеми аналізу трикомпонентної суміші
БАС1-БАС2-ДНК (або БАС1-БАС2-БАС3), яка включає в себе усі види
нековалентних взаємодій між розчиненими компонентами: самоасоціацію,
гетероасоціацію, комплексоутворення з ДНК, а також можливі специфічні
ефекти, характерні тільки для трикомпонентної суміші. Показано, що для
всебічного розв’язання подібної задачі (проведення структурного і
термодинамічного аналізу) найбільш придатним є метод ЯМР спектроскопії.

У розділі 2 розглянуті основи методу ядерного магнітного резонансу,
деякі практичні аспекти техніки реалізації одно- і двомірних ЯМР
експериментів, використаних у цій роботі, і теоретичні моделі, які
застосовувалися для аналізу асоціації ароматичних молекул і їх
комплексоутворення з фрагментами ДНК, розроблені в минулій кандидатській
дисертації здобувача. Зроблено висновок про те, що існуючі зараз моделі
нековалентних взаємодій ароматичних сполук обмежуються схемою реакцій,
яка формує динамічну рівновагу в розчині, при цьому будь-яке розширення
базової схеми істотно ускладнює аналітичний запис кінцевих виразів, що
особливо яскраво виявляється в моделях двокомпонентної гетероасоціації.
Як наслідок, перехід до аналізу багатокомпонентних розчинів БАС стає
неможливим у рамках існуючих аналітичних підходів. Зроблено висновок про
те, що опублікована здобувачем у кандидатській дисертації узагальнена
модель гетероасоціації є природною межею застосовності
функціонально-аналітичного підходу для опису протонного хімічного зсуву
в реакціях асоціації ароматичних молекул.

У розділі 3 запропонований новий підхід, заснований на алгоритмічному
моделюванні двокомпонентної рівноваги в розчині, дозволяючий принципово
розширити можливості аналізу гетероасоціації ароматичних сполук у
водному розчині – стохастична модель гетероасоціації.

Стохастична модель гетероасоціації. Формальний математичний опис
стохастичної моделі засновано на узагальненій реакції гетероасоціації,
що враховує утворення комплексів молекул X і Y з будь-яким чергуванням
гетеро- і гомостиків

, (1)

де ai, bi, ci – кількість однотипних молекул (довжина) відповідного
агрегату X або Y;

m, n, k – кількість агрегатів у кожнім комплексі;

KX, KY, Kh – рівноважні константи самоасоціації молекул X і Y і їх
гетероасоціації відповідно.

Введемо індекс I, що може приймати два значення X або Y: I((X,Y).
Розділимо всі можливі типи комплексів у розчині на три групи: 1)
комплекс типу X-Y, фланкирований з одного кінця молекулою X, а з іншого
кінця молекулою Y; 2) комплекс типу X-X, фланкирований з обох кінців
молекулами X; 3) комплекс типу Y-Y, фланкирований з обох кінців
молекулами Y. Тоді індекс T, що позначає тип комплексу, прийме значення
T((X-Y, X-X, Y-Y). Розглянемо довільний комплекс, що складається з L
молекул X і Y. Нехай кількість гетеростиків між молекулами X і Y у цьому
комплексі дорівнює h (h ( L – 1). Тоді довжини агрегатів однотипних
молекул, з яких складається комплекс, дорівнюють li, де i((1…h+1)–номер
агрегату.

З урахуванням уведених позначень і припущень щодо характеру процесу
молекулярної асоціації в розчині, аналітичні вирази для обчислення
сумарної концентрації CI і хімічного зсуву (I молекул типу I у ЯМР
експерименті можуть бути представлені у вигляді:

, (2)

– концентрація і хімічний зсув від самоасоціатів;

I0, I1 – загальна і мономерна концентрація молекул I у розчині
відповідно;

(m,(d –хімічний зсув протонів молекули I у мономері й у димері
відповідно;

f(h) – одинична функція, що розділяє парні і непарні h.

молекул I у комплексах типу T, що фігурують у виразі (2), визначаються
відповідно до закону збереження маси і, виходячи з адитивності хімічного
зсуву в умовах швидкого обміну в масштабі часу ЯМР, як

, (3)

– кількість молекул I у комплексі T з розподілом довжин агрегатів
l1…lh+1;

– концентрація комплексу T з розподілом довжин агрегатів l1…lh+1, яка
може бути визначена в загальному виді з закону діючих мас.

в (3) дає хімічній зсув від молекул типу I у комплексі T з розподілом
довжин агрегатів l1…lh+1 і визначається як різниця сумарного хімічного
зсуву молекул I в ізольованих агрегатах і в результаті додаткового
екранування в гетеростиках:

, (4)

де (h – хімічній зсув молекули I у гетерокомплексі;

– кількість агрегатів молекул виду I у комплексі типу T.

В описаній вище теоретичній моделі гетероасоціації немає обмежень на
розміри агрегатів і комплексів – у рівняннях (2) у загальному випадку
враховуються усі фізично можливі реакції з утворенням гетерокомплексів з
будь-якими ймовірними комбінаціями агрегатів взаємодіючих ароматичних
молекул у розчині. На відміну від запропонованих раніше моделей
молекулярної гетероасоціації модель (2) не вводить будь-яких додаткових
граничних умов у схему динамічної рівноваги (1). Рівняння (2)-(4)
складають основу некооперативної стохастичної моделі молекулярної
гетероасоціації STOCH-NC.

описує параметр кооперативності молекул I-типу в розчині.

Обчислювальний алгоритм стохастичної моделі будується на представленні
довільного гетерокомплекса, утвореного випадковим набором молекул X і Y,
у виді подвійного числа, у якому кожен біт ‘0’ чи ‘1’ відповідає
речовині X чи Y. Отже, цикл по всім подвійним числам від 0 до
максимально можливого при даній довжині гетерокомплекса означає
генерування всіх статистично можливих комплексів молекул у розчині.

Порівняльний аналіз результатів розрахунку по різним моделям дозволяє
зробити висновок про те, що величина розкиду параметрів гетероасоціації
аналітичних і алгоритмічних моделей істотно залежить від величин
рівноважних констант асоціації молекул. Базова модель найкраще
застосовна до систем з невеликим внеском реакцій гетероасоціації в
сумарну динамічну рівновагу в розчині. Разом з тим, для всіх досліджених
молекулярних систем узагальнена аналітична модель дає результати, що
збігаються з точністю до (30% з алгоритмічною моделлю, яка є найбільш
точною серед існуючих на сьогоднішній день теоретичних підходів. Аналіз
впливу параметра кооперативності на розрахункові параметри
гетероасоціації свідчить про відсутність вираженої кореляції між
константою гетероасоціації і похибкою розрахунку. Разом з тим у системах
з подібним характером кооперативності самоасоціації взаємодіючих речовин
похибка неврахування кооперативності може досягати 30%.

Двосайтова модель гетероасоціації. Розглянуті вище моделі молекулярної
гетероасоціації, засновані на припущенні структурної подоби взаємодіючих
компонентів X і Y, при якому з однієї сторони хромофора молекули X може
комплексоутворюватись лише одна молекула Y. Разом з тим, клас
ароматичних сполук містить у собі молекули, істотно різні за розмірами і
будівлею хромофору. Прикладом тому може служити вітамін нікотинамід з
одним ароматичним кільцем у хромофорі і молекули антрациклінових
антибіотиків з чотирма кільцями в хромофорі. У зв’язку з цим можна
припустити, що в змішаному розчині відразу дві молекули нікотинаміду
можуть сісти на одну сторону хромофора антрацикліна. Для обліку такого
типу взаємодій розроблена двосайтова модель гетероасоціації структурно
різних речовин X і Y. Отримано аналітичні вирази для опису хімічного
зсуву протонів взаємодіючих молекул (рівняння не наведені в зв’язку з їх
громіздкістю).

Модель багатокомпонентної гетероасоціації (N-STOCH). Базова ідея
розглянутої вище стохастичної моделі двокомпонентних взаємодій (2-STOCH)
полягала в розгляді довільного гетерокомплексу як подвійного числа, у
якому кожен біт може приймати значення 0 чи 1, відповідно типу речовини
X чи Y. Перехід до багатокомпонентної системи, що містить N взаємодіючих
ароматичних сполук, означає, що в такій системі довільний
гетерокомплекс еквівалентний числу в системі числення з основою N. У
спрощеному формулюванні це рівносильно тому, що для реалізації алгоритму
N-STOCH моделі досить базовий алгоритм 2-STOCH моделі перевести в
загальному випадку в систему числення з основою N.

. Будь-яка складова Ii вектора H може приймати значення I((0…N-1) і
позначає тип i-ї компоненти комплексу.

Введемо в розгляд квадратну матрицю Дд розмірності NxN, що містить
індуковані хімічні зсуви протонів молекул за номером рядка, що
знаходяться в комплексі з молекулами за номером стовпця. Значення
індукованих хімічних зсувів, що лежать на головній діагоналі,
відповідають екрануванню в гомостику, інші – екрануванню в гетеростику.
Аналогічним чином, уведемо матрицю K виду NxN, що містить рівноважні
константи асоціації між молекулами за номером рядку і молекулами за
номером стовпця. На головній діагоналі лежать константи самоасоціації
молекул; недіагональні елементи матриці відповідають константам
гетероасоціації.

, що містять мономерні і загальні концентрації всіх типів молекул у
розчині відповідно. З урахуванням цього закон збереження маси для
молекул типу I може бути записаний у вигляді:

, (5)

є функцією включення, що дозволяє проводити вибірку молекул тільки
заданого типу I;

fH – службова функція, необхідна для виключення з результату
підсумування фізично нерозрізнимих складових, відповідних т.зв.
“відзеркаленим” гетерокомплексам;

CH — концентрація поточного комплексу H у розчині, яка може бути
визначена відповідно до закону діючих мас:

. (6)

молекул типу I у комплексі H, може бути визначений шляхом послідовного
віднімання з мономерного хімічного зсуву дm величини індукованого
хімічного зсуву, створюваного молекулою “праворуч” і “ліворуч” від
даної:

. (7)

З урахуванням (7) результуючий хімічний зсув молекул типу I у розчині в
умовах швидкого обміну в масштабі часу ЯМР записується у виді

. (8)

Рівняння (5) і (8) складають основу Стохастичної моделі N-STOCH
багатокомпонентної рівноваги взаємодіючих ароматичних речовин. Зручність
запропонованого формалізованого опису полягає в можливості
безпосереднього програмування зазначених рівнянь з метою створення
комп’ютерного алгоритму обробки даних ЯМР за аналогією з алгоритмом
2-STOCH моделі. У якості вхідних даних використовуються матриці хімічних
зсувів Дд і констант K, вектор сумарних концентрацій Ct і концентраційна
(температурна) залежність протонного хімічного зсуву.

. При такому розгляді є можливим скорегувати константи
реакцій комплексоутворення лігандів X і Y з олігомером ДНК. Аналіз
свідчить про суттєвий вплив кооперативності на параметри спільного
зв’язування лігандів із фрагментом ДНК.

У розділі 4 проведений аналіз самоасоціації різних ароматичних БАС:
дауноміцина, доксорубіцина, норфлоксацина й ароматичних
біс-інтеркаляторів гомодимерів етидія й акридина методом 1М- і 2М-1H ЯМР
спектроскопії. Загальний алгоритм проведення обчислювального
експерименту полягає в пошуку оптимальних параметрів самоасоціації: (m
(граничний хімічний зсув в мономері), (d (хімічний зсув в димері), K
(рівноважна константа самоасоціації) чи (H (ентальпія), (S (ентропія),
при яких сума квадратів відхилень теоретичної кривої, розрахованої по
моделі самоасоціації, від експериментальної концентраційної ((x0) чи
температурної ((T) залежності протонного хімічного зсуву мінімальна.
Розрахунок залежності ((T) базується на використанні співвідношення
Вант-Гоффа для апроксимації залежності константи асоціації від
температури.

Самоасоціація ароматичних моноінтеркаляторів. З огляду на залежність
розчинності різних ароматичних БАС від типу використовуваного буфера,
був проведений експеримент по самоасоціації дауноміцина в різних
буферних розчинниках, з метою установлення впливу типу буфера на
параметри асоціації. Як розчинник були обрані буферні системи, широко
розповсюджені в біофізичних дослідженнях: водно-сольовий розчин (D2O +
0.1М NaCl), 0.1М фосфатний-, TRIS- і HEPES буфери. У табл.1 наведені
параметри самоасоціації DAU, розраховані за нескінченномірної
некооперативної моделі самоасоціації:

Таблиця 1

Параметри самоасоціації дауноміцина в різних буферних розчинниках (pD
7.3, T=303K)

Буфер D2O+NaCl Фосфатний буфер HEPES TRIS

K, л/моль 1160 ( 210 1020 ( 250 1400 ( 320 1130 ( 170

((H(, кДж/моль 32 ( 2 29 ( 2 30 ( 3 34 ( 3

((S(, Дж/моль(K 47 ( 7 38 ( 10 39 ( 10 55 ( 10

У цілому отримані результати свідчать про незначний вплив типу буферного
розчину на параметри самоасоціації ароматичних сполук у водному
середовищі.

Аналіз 2М-NOESY/ROESY спектрів показав, що в розчинах антибіотика
спостерігаються крос-піки, які варто віднести до міжмолекулярних
взаємодій близько розташованих у просторі протонів молекул DAU. Отримані
експериментальні результати дозволяють зробити висновок про існування
двох просторових структур самоасоціатів DAU у розчині – з паралельною й
антипаралельною орієнтацією хромофорів молекул у димерному комплексі з
можливістю утворення міжмолекулярного водневого зв’язку (рис.1).

Рис.1. Просторові структури димеру молекул дауноміцину в розчині: (а)
паралельна і (б) антипаралельна. Водневий зв’язок між O12 атомом
ароматичного кільця C хромофора однієї молекули і NH3-групою
аминоцукрового кільця іншої молекули показаний пунктиром.

Розрахунок структур димерних комплексів DAU був виконаний методами
молекулярної механіки з використанням програми X-PLOR і силового поля
Charmm22. Водяне оточення моделювалося молекулами води у виді TIP3P,
розміщеними в прямокутному боксі (1100 молекул). Топологія молекули DAU
і параметризація валентних взаємодій отримані за допомогою програми
XPLO2D з використанням кристалічних структур з PDB банку даних.
Параметри невалентних взаємодій між атомами відповідали силовому полю
ММ3. Початкова структура димеру задавалася на підставі аналізу значень
індукованих хімічних зсувів (?д=дm-дd) протонів DAU і відомих з NOESY
експерименту міжмолекулярних крос-піків. Описана методика також
використовувалася для побудови структур 1:1 гетерокомплексів усіх
систем, наведених у наступних розділах.

За методикою, використаної вище для аналізу самоасоціації DAU, був також
проведений структурний і термодинамічний аналіз агрегації антибіотиків
доксорубіцина (TRIS буфер) і норфлоксацина (фосфатний буфер). Отримано
рівноважні параметри самоасоціації (табл.2) і просторові структури
димерних комплексів. Структурні параметри агрегації DOX у цілому подібні
таким для розглянутого вище DAU, однак в енергетику самоасоціації
просліджується помітний внесок гідрофобних взаємодій, обумовлений,
очевидно, різною гідрофільністю молекул DAU і DOX, що
відрізняються групами –H і –OH у положенні 9O антрациклінового
хромофора, відповідно. Самоасоціація NOR (див.табл.2) також багато в
чому визначається гідрофобним внеском від водного оточення, що
виявляється в порівняно високому значенні рівноважної константи
самоасоціації, не характерному для двокільцевих ароматичних молекул.

Таблиця 2

Параметри самоасоціації доксорубіцину (DOX) и норфлоксацину (NOR)

Молекула DOX (T=303K) NOR (T=298K)

( 1.3 ( 0.2 0.97 ± 0.06

K, л/моль 1500 ( 400 130 ± 14

((H(, кДж/моль 26.0 ( 3.0 18.0 ± 3.6

((S(, Дж/моль(K 25 ( 8 20 ± 5

Самоасоціація ароматичних біс-інтеркаляторів. Аналіз експериментальних
даних дозволив запропонувати фізичну модель динамічної рівноваги
біс-інтеркалятора, що включає утворення відкритої (U), закритої (F) форм
молекули, взаємно інтеркальованого димера (F2) і тримера (F3) (рис.2).
На підставі запропонованої моделі виведене рівняння для опису
експериментального протонного хімічного зсуву:

, (9)

де h1 і h0 – мономерна і загальна молярні концентрації;

(U і (F – хімічні зсуви в U- і F-формі біс-інтеркалятора відповідно;

Kh – рівноважна константа реакції U?F (див.рис.2а);

K2, (2 і K3, (3 – рівноважні константи і хімічній зсув в димері й у
тримері, відповідно.

На підставі концентраційних і температурних залежностей протонних
хімічних зсувів EBH і AcrH у розчині і моделі (9) отримані параметри
самоасоціації біс-інтеркаляторів (табл.3). Порівняльний аналіз
індукованих хімічних зсувів і рівноважних констант комплексоутворення
дозволяє зробити висновок про існування конкуренції димерів і тримерів у
розчині, причому значний внесок у хід експериментальних кривих дає
наявність подвійного заряду лінкеру EBH і нейтральність лінкеру AcrH.

Рис.2. Схематичне зображення реакцій самоасоціації біс-інтеркалятора.

На підставі проведеного аналізу самоасоціації ароматичних БАС, а також
аналізу параметрів самоасоціації ароматичних БАС, відомих з літературних
даних, можуть бути зроблені наступні загальні висновки:

Таблиця 3

Рівноважні константи (л/моль), ентальпії (кДж/моль) і ентропії
(Дж/моль(К) реакцій само- і гетероасоціації AcrH і EBH

Реакція K298 -(H( -(S(

Самоасоціація

U ( F AcrH 42 ( 10 11 ( 3 6 ( 3

EBH 25 ( 5 9 ( 3 4 ( 2

F + F ( F2 AcrH 540 ( 130 32 ( 5 50 ( 10

EBH 730 ( 100 23 ( 3 22 ( 5

F + F2 ( F3 AcrH 4200 ( 1000 28 ( 5 25 ( 5

EBH 1400 ( 200 26 ( 3 27 ( 5

Гетероасоціація

EB + F ( FEB AcrH —

PI + F ( FPI EBH 30 ( 10 11 ( 2 9 ( 4

EB + F2 ( F2EB AcrH 6500 ( 800 36 ( 4 50 ( 10

PI + F2 ( F2PI EBH 160 ( 40 17 ( 3 15 ( 5

1. Для всіх вивчених ароматичних систем у більшості випадків
спостерігається екранування всіх ароматичних протонів обох сполук у
гетерокомплексі, що виявляється в зміщенні концентраційних кривих
хімічного зсуву при підвищенні концентрації в область сильного поля й у
виконанні умови ?m>дd.

2. Для усіх вивчених ароматичних систем без винятку й у незалежності від
типу бічних груп характерний екзотермічний характер реакції
самоасоціації (?H<0) і негативна зміна ентропії (?S<0). 3. Рівноважна константа самоасоціації й абсолютне значення зміни ентропії корелюють з типом бічних груп хромофора і кількістю ароматичних кілець досліджуваної сполуки. 4. Аналіз пунктів 1,2 дозволяє зробити висновок про стопочну орієнтацію хромофорів, які утворюють агрегати ароматичних молекул у водно-сольовому розчині (стекинг). Висновок про стопочну асоціацію підтверджується результатами рентгеноструктурного аналізу, а також аналізом міжмолекулярних протон-протонних NOE крос-піків у комплексах деяких ароматичних сполук. 5. Аналіз пунктів 1-4 дозволяє зробити висновок про домінування дисперсійних взаємодій у реакції агрегації ароматичних молекул, характеризуємих умовами ?H<0 і ?S<0. Значний внесок у стабілізацію комплексів дають гідрофобні взаємодії і водневі зв'язки, які залежать від типу бічних груп, а також структура ароматичного хромофору, що визначає інтенсивність дисперсійних взаємодій. Отримані в даному розділі параметри самоасоціації використовуються далі як вхідні дані при дослідженні гетероасоціації і спільного зв'язування ароматичних лігандів із ДНК. У розділі 5 проведений систематичний аналіз гетероасоціації біологічно активних ароматичних сполук X і Y, що належать різним структурним (моно- і біс-інтеркаляторы ДНК) і фармакологічним (антибіотики, вітаміни, мутагени) групам: Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик і Біс-інтеркалятор-БАС. Гетероасоціація моноінтеркаляторів. Для аналізу експериментальних концентраційних і температурних залежностей хімічних зсувів протонів взаємодіючих молекул використовувалася базова аналітична модель молекулярної гетероасоціації і співвідношення Вант-Гоффа для апроксимації температурної залежності константи гетероасоціації. При дослідженні гетероасоціації антибіотиків антрациклінового ряду DAU і NOV з нікотинамідом, що істотно розрізняються за геометричними розмірами, використовувалася розроблена в розділі 3 двосайтова модель гетероасоціації. Однак проведені розрахунки показали неадекватність цієї моделі для аналізу гетероасоціації DAU/NOV-NMD, що свідчить про “стандартні” взаємодії цих молекул у розчині, при яких тільки одна молекула NMD може сісти з однієї сторони антрациклінового хромофора. Як приклад на рис.3 представлені розрахункові структури 1:1 гетерокомплексів NOV-DAU і NOV-FMN. Розрахункові параметри гетероасоціації для всіх досліджених груп молекул представлені в табл.4. Рис.3. Структури 1:1 гетерокомплексів FMN-NOV (а) і NOV-DAU (б). Міжмолекулярні водневі зв'язки показані пунктиром. Міжмолекулярні ROE-контакти показані суцільними стрілками. На підставі проведеного аналізу гетероасоціації ароматичних БАС, а також аналізу параметрів гетероасоціації комбінацій ароматичних БАС, відомих з літературних даних, були зроблені наступні загальні висновки: 1. Для усіх вивчених ароматичних систем, у більшості випадків, спостерігається екранування ароматичних протонів обох сполук у гетерокомплексі, що виявляється в зміщенні кривих хімічного зсуву при підвищенні концентрації в область сильного поля й у виконанні умови ?m>дh; деекранування окремих протонів спостерігається тільки у випадку
значного розходження розмірів хромофорів взаємодіючих молекул.

2. Для усіх вивчених ароматичних систем без винятку й у незалежності від
типу бічних груп характерний екзотермічний характер реакції
самоасоціації (?H<0) і негативна зміна ентропії (?S<0, за винятком системи NOV-CAF). 3. Гетероасоціація ароматичних молекул у водно-сольовому розчині носить характер стекингу хромофорів, стабілізованого переважно дисперсійними і гідрофобними взаємодіями, а також, в окремих випадках, міжмолекулярними водневими зв'язками. Підтвердження стопочної асоціації випливає з аналізу експериментальних залежностей хімічного зсуву від концентрації і температури (пункт 1), екзотермічного характеру реакції гетероасоціації (пункт 2), аналізу міжмолекулярних NOE крос-піків і результатів молекулярного моделювання. 4. Рівноважна константа гетероасоціації, абсолютне значення зміни ентальпії й ентропії займають проміжне положення між аналогічними параметрами самоасоціації взаємодіючих речовин. Перевищення параметрів гетероасоціації над параметрами самоасоціації спостерігається тільки для систем, додатково стабілізованих у розчині міжмолекулярними водневими зв'язками (за винятком системи NOV-CAF з підвищеним гідрофобним внеском). Таблиця 4 ? e O O Oe O U F ’ ae 4 6 8 ^ & j - a$ ”y¦  ”y¦  ”y¦  ”y¦  ”y¦  ”y¦  ?o?\??????? X Z E E E ?????Розрахункові параметри гетероасоціації БАС1-БАС2 у 0.1М Na-фосфатному буфері, pD 7.1 система Т, K Kh, M-1 -(Hh, кДж/моль -(Sh, Дж/моль(K Кофеїн-БАС CAF-NOV 318 256(31 9 ( 1 - (15 ( 4) CAF-DOX 303 180±30 22 ( 1 30 ( 5 CAF-NOG 303 180±40 23 ( 3 33 ( 8 CAF-NOR 298 30(10 20 ( 4 40 ( 10 CAF-FMN 298 161(26 24 ( 3 40 ( 16 CAF-NMD 298 7.12(0.04 19 ( 2 49 ( 6 Вітамін-БАС FMN-PF 298 920(80 41 ( 3 80 ( 10 FMN-EB 298 640±75 33 ( 2 57 ( 7 FMN-NOV 303 34000±8000 55 ( 6 87 ( 11 FMN-DAU 298 453(28 36 ( 5 70 ( 9 FMN-NOG 303 790(50 30 ( 1 44 ( 4 FMN-AMD 298 890(330 34 ( 6 50 ( 10 FMN-NOR 298 180(80 26 ( 2 42 ( 10 NMD-DAU 298 64(5 26 ( 4 53 ( 14 NMD-NOV 312 35(5 23 ( 3 44 ( 12 Антибіотик-Антибіотик NOV-DAU 318 3330(350 60 ( 6 95 ( 10 NOV-AMD 312 1500(600 28 ( 7 31 ( 8 DAU-AMD 298 2800(1100 39 ( 4 53 ( 12 NOG-DAU 303 2700(1200 33 ( 4 40 ( 8 NOG-NOV 318 5200(2500 34 ( 4 36 ( 7 NOG-AMD 303 3600(600 35 ( 6 47 ( 15 5. Існування міжмолекулярної взаємодії між ароматичними БАС підтверджує припущення про те, що одним з можливих механізмів зміни біологічної активності цих препаратів у суміші є гетероасоціація. Отримані в даному розділі параметри гетероасоціації використовуються далі як вхідні дані при дослідженні спільного зв'язування ароматичних лігандів із ДНК. Гетероасоціація біс-інтеркаляторів. Гетероасоціація за участю ароматичних біс-інтеркаляторов EBH і AcrH була вивчена на прикладі взаємодії EBH-PI і AcrH-EB у водно-сольовому і HEPES буфері, відповідно. Найкращу відповідність експериментальним даним виявлено при використанні моделі динамічної рівноваги в розчині, зображеної на рис.4. Для такої схеми вирази для хімічних зсувів протонів біс-інтеркалятора (h) і барвника (P) записуються у виді: (10) Рис. 4. Схематичне зображення реакцій гетероасоціації EBH-PI и AcrH-EB. Розрахункові параметри гетероасоціації представлені в табл.3. Аналіз значень у табл.3 дозволяє виділити основний фактор, що визначає розходження параметрів гетероасоціації EBH-PI і AcrH-EB – це довжина лінкеру досліджених біс-інтеркаляторів. Лінкер у AcrH на 4 зв'язки довше, ніж у EBH, що обумовило дуже низьке значення константи KC1 у системі AcrH-EB і енергетично більш вигідне зв'язування EB у F2-форму AcrH. У цілому проведений термодинамічний аналіз гетероасоціації за участю ароматичних біс-інтеркаляторів показав, що молекули, утворені сполученням двох ароматичних хромофорів, є ефективними перехоплювачами молекул ароматичних моноінтеркаляторів. Факт інтенсивної міжмолекулярної взаємодії моно- і біс-інтеркаляторів раніше не розглядався взагалі й у зв'язку з цим вимагає обов'язкового врахування в будь-яких біофізичних дослідженнях з одночасною присутністю в розчині сполук цього класу. Розділ 6 присвячений дослідженню комплексоутворення ароматичних БАС – новатрона, норфлоксацина і флавин-мононуклеотида – із фрагментом ДНК дезокситетрануклеотидом 5’-d(TGCA) у водно-сольовому розчині. Аналіз експериментальних концентраційних і температурних залежностей хімічних зсувів протонів ліганду проводився по аналогічній розглянутій у розділі 5 методиці гетероасоціації. При цьому в схемі динамічної рівноваги в розчині враховувалися реакції утворення 1:1, 2:1 і 2:1, 2:2 комплексів ліганда (D) з однонитковою і дуплексною формами тетрануклеотида (N), відповідно, за виразом (11) Розрахункові значення рівноважних констант комплексоутворення наведені в табл.5. Таблиця 5 Розрахункові значення рівноважних констант (л/моль) комплексоутворення лігандів з дезокситетрануклеотидом 5’-d(TGCA) Ліганд K11, 103 M-1 K12, 103 M-1 K21, 103 M-1 K22, 103 M-1 NOV 67(15 850(170 34(15 545(103 NOR 0.3 ( 0.05 2 ( 0.5 - - FMN 0.1 ( 0.04 8 ( 2 - - У цілому для всіх розглянутих ароматичних БАС характерне екранування ароматичних протонів ліганда в складі 1:2 комплексу, досить великі негативні значення ентальпії й ентропії реакції комплексоутворення, що свідчить про інтеркаляційне чи частково інтеркаляційне зв'язування з дуплексом ДНК. Для антибіотика NOR експериментальні дані також свідчать про можливість утворення зовнішньозв’язаного комплексу з однонитковою формою тетрамеру. Комплексоутворення NOV з d(TGCA) у цілому некооперативне і характеризується значним електростатичним внеском в енергетику комплексоутворення з боку заряджених бічних аміноалкильних ланцюгів антибіотика; для антибіотика NOR інформація про утворення комплексів більш складних типів (2:1,2:2) з наявних експериментальних даних не може бути отримана; зв'язування ж FMN з тетрамером виявляє виражений антикооперативний характер, обумовлений стеричними й електростатичними перешкодами для вбудовування в дуплекс ДНК із боку бічних ланцюгів вітаміну. Отримані значення рівноважних констант комплексоутворення ароматичних БАС з тетрамером (див.табл.5) надалі використовувалися для розрахунку спільного зв'язування ароматичних молекул із ДНК. У розділі 7 проведений аналіз багатокомпонентної рівноваги ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК, Антибіотик-Антибіотик-ДНК і БАС1-БАС2-БАС3. Рівновага в системі БАС1-БАС2-ДНК. Як модель ДНК використовувалася дуплексна форма дезокситетрануклеотиду 5'-d(TGCA). Вибір такої олігонуклеотидної послідовності обумовлений наступним. По-перше, ДНК у клітині існує не у вільній полімерній формі, а в комплексі з ядерними білками–гистонами, – при цьому зв'язування типових ароматичних інтеркаляторів відбувається у вільні від гистонів ділянки ядерної ДНК. По-друге, у першому наближенні доцільно розглядати конкуренцію лігандів у локальному сусідстві тільки одного сайта зв'язування, отже, для такої мети тетрамерна послідовність є цілком придатною. По-третє, досліджуваний тетрануклеотид містить усі чотири природних нуклеотиди, що дозволяє зменшити внесок у проведений аналіз різної специфічності конкуруючих речовин при зв'язуванні з ДНК. Аналіз спільного зв'язування лігандів X і Y з олігонуклеотидом N повинний виконуватись при одночасному обліку усіх видів нековалентних взаємодій у водному розчині, докладно розглянутих у розділах 3-6: самоасоціація, гетероасоціація і комплексоутворення з ДНК. Відповідна система рівнянь закону збереження маси і спостерігаємого протонного хімічного зсуву лігандів X і Y записується у виді: (12) (13) Для того, щоб одержати хімічній зсув речовини Y, необхідно у виразі (13) всі індекси х замінити на індекси y і навпаки. Усі параметри, що фігурують у рівняннях (13)-(14), відомі з проведених раніше досліджень одно- (самоасоціація) і двокомпонентних (гетероасоціація і комплексоутворення з ДНК) взаємодій (розділи 4-6). Для перевірки адекватності моделі (12)-(13) були поміряні концентраційні залежності в системах DAU-CAF-TGCA і DAU-FMN-TGCA. Наступне перерахування хімічних зсувів DAU/CAF і DAU/FMN по рівняннях (12)-(13) дав збіг з експериментом у середньому не гірше 0.02 млн-1 на кожну експериментальну точку, що підтверджує можливість використання параметрів одно- і двокомпонентних взаємодій, для аналізу трикомпонентної рівноваги. Для аналізу спільного зв'язування ароматичних лігандів із ДНК використовувалося уявлення про існування двох основних молекулярних процесів, які впливають на зменшення зв'язування ароматичної сполуки X із ДНК у присутності іншої ароматичної сполуки Y – гетероасоціація X–Y і комплексоутворення Y із ДНК. Гетероасоціація зменшує кількість мономерів X у розчині, здатних зв'язуватися з ДНК, – цей процес назвемо "інтерцепторною" дією Y стосовно X. Комплексоутворення Y із ДНК частково витісняє молекули X, зв'язані з ДНК, зменшуючи тим самим частку комплексів X–ДНК – цей процес назвемо "протекторною" дією Y стосовно ДНК. У будь-якому випадку частка комплексів X–ДНК знижується в присутності Y і, отже, змінюється біологічна активність речовини X. : , (14) - мольна частка комплексів ліганд-d(TGCA)2 при "відключених" гетероасоціації і комплексоутворенні (Kh=0, K2Y=0). Область Rd>1 відповідає перевазі процесу комплексоутворення Y-ДНК над
процесом гетероасоціації X-Y (протекторна дія Y), а в області Rd<1 головний внесок у зменшення частки комплексів ліганд-ДНК вносить процес гетероасоціації (інтерцепторна дія Y). Для оцінки відсотку витиснутого з ДНК ліганда X при додаванні перехоплювача Y пропонується наступний критерій: , (15) - мольна частка комплексів X-d(TGCA)2 при "включеній" гетероасоціації і "включеному" комплексоутворенні Y з d(TGCA)2 (Kh(0, K2Y(0). У зв'язку з тим, що біологічна активність ароматичних лігандів, досліджуваних у цій роботі, переважно обумовлена зв'язуванням з молекулою ДНК, можна припустити, що відсоток витиснутого ліганда з ДНК (Ad) пропорційний зменшенню токсичності досліджуваного препарату при додаванні Y. Отже, фактор Ad є критерієм оцінки біологічного ефекту в трикомпонентній суміші X-Y-ДНК. Як приклад на рис.5 приведені залежності Rd і Ad для систем Кофеїн-БАС-ДНК. Аналіз графіків Rd і Ad як функції концентрації ліганда, речовини-перехоплювача і ДНК показав, що для усіх вивчених систем Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК, Антибіотик-Антибіотик-ДНК у фізіологічній області концентрацій ліганду (x0=0.01мМ), перехоплювача (y0<0.1мМ) і ДНК (N0(0.01мМ) фактори Rd і Ad добре описуються емпіричними співвідношеннями , (16) де C – деяка характерна для кожної групи речовин константа. Отримані вирази можуть бути використані для визначення домінуючого молекулярного процесу, який дає основний внесок у зміну спостерігаємої біологічної активності речовини X при додаванні речовини Y, а також для грубої оцінки детоксифіцируючого впливу речовини Y на клітинну систему, що містить ароматичний цитотоксичний ліганд X, по відомих константах гетероасоціації і комплексоутворення Ліганд-ДНК, і за умови, що інтерцепторний і протекторний механізми домінують у системі. Крім цього, характер зміни фактора Ad при додаванні Y (див.рис.5), а також взаємозв'язок величини Ad і фізико-хімічних параметрів (див.(16)), означає можливість спрямованого регулювання активності речовини X у присутності речовини Y. Рис.5. Фактори Rd і Ad як функція концентрації кофеїну для різних ароматичних лігандів. Рівновага в системі БАС1-БАС2-БАС3. Як приклад трикомпонентної рівноваги ароматичних сполук у представленій роботі на підставі багатокомпонентної стохастичної моделі N-STOCH (див.розділ 3) були проаналізовані динамічні рівноваги в системах CAF-NOV-DAU і FMN-CAF-NMD. В обох системах спеціально поставлений ЯМР експеримент підтвердив адекватність моделі N-STOCH для опису трикомпонентної рівноваги ароматичних БАС. Біологічна значимість системи CAF-NOV-DAU полягає в тому, що комбінація антибіотиків NOV-DAU широко використовується в клінічній практиці для лікування раку груди, однак при тривалому витримуванні розчину ці антибіотики виявляються несумісними і випадають в осад. У наявній роботі розрахунковим способом показано, що додавання кофеїну в суміш NOV-DAU приводить до дисоціації комплексу антибіотиків NOV-DAU за рахунок утворення гетерокомплексів CAF-NOV і CAF-DAU, що може служити потенційним засобом підвищення ефективності режиму хіміотерапії рака на базі комбінації антибіотиків NOV-DAU. Інтерес до системи FMN-CAF-NMD полягає в тім, що кофеїн і нікотинамід є ефективними гідротропними агентами, у присутності яких розчинність вітаміну B2 (аналоги FMN) підвищується. Проведений на підставі N-STOCH моделі аналіз дозволив завбачити два важливих ефекти, раніше не описаних у літературі: зниження ефективності гідротропної дії при надмірному збільшенні концентрації гідротропа і дещо більшу ефективність суміші CAF-NMD у якості солюбілізатора стосовно CAF і NMD по-окремості в однакових загальних концентраціях. ВИСНОВКИ У дисертаційній роботі уперше дано вирішення важливої проблеми молекулярної біофізики - з'ясування фундаментальних механізмів регуляції медико-біологічної активності при спільному використанні різних комбінацій ароматичних біологічно активних сполук (БАС) і представлена завершена методика структурного і термодинамічного дослідження міжмолекулярних взаємодій різних груп БАС у багатокомпонентному розчині в присутності ДНК. Результати і висновки роботи поглиблюють представлення про взаємодії ароматичних БАС і формують основу для розуміння молекулярних механізмів синергетичних біологічних ефектів при спільному використанні ароматичних БАС. Отримані результати можуть бути використані в області біотехнології, молекулярної біології та фармакології. Основні результати роботи можуть бути сформульовані наступним чином: Вперше проведене систематичне дослідження методами 1М- і 2М-1H ЯМР спектроскопії (500 МГц) нековалентних взаємодій різних груп ароматичних БАС (Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик, Біс-інтеркалятор-БАС), які виявляють синергизм біологічної дії при спільному використанні. Отримано структурні (індуковані хімічні зсуви в складі комплексів, просторові структури димерів і 1:1 гетерокомплексів) і термодинамічні (рівноважні константи, ентальпія, ентропія, вільна енергія Гиббса) параметри асоціації молекул і їх комплексоутворення з фрагментом ДНК. Установлено, що асоціація ароматичних БАС у водно-сольовому розчині носить характер стекингу хромофорів, переважно стабілізованого дисперсійними і гідрофобними взаємодіями. Параметри асоціації молекул не залежать від виду буферного розчинника, однак корелюють з типом бічних груп хромофора і кількістю ароматичних кілець взаємодіючих ароматичних сполук. Уперше установлений факт додаткової стабілізації гетерокомплексів молекул у групах Вітамін-БАС і Антибіотик-Антибіотик міжмолекулярними водневими зв'язками. Сформульовано загальні закономірності водневого зв'язування при дослідженні асоціації ароматичних БАС методом ЯМР. Аналіз асоціації ароматичних біс-інтеркаляторів дозволив уперше зробити висновок про існування значно більш складної динамічної рівноваги таких молекул у розчині, чим передбачалося раніше. Показано, що біс-інтеркалятори утворюють у розчині різні за структурою агрегати, які включають відкриту і закриту форми, частково інтеркальовані димери і тримери, а також є ефективними перехоплювачами молекул простих моноінтеркаляторів. Запропоновано новий підхід до аналізу багатокомпонентних взаємодій ароматичних молекул у розчині, заснований на алгоритмічному моделюванні процесів асоціації молекул. Розроблена стохастична модель двох- і багатокомпонентної гетероасоціації. Уперше вивчені трикомпонентні змішані розчини ароматичних БАС з обліком усіх можливих міжмолекулярних взаємодій компонентів суміші. Передбачено ефект дисоціації комплексу антрациклінових антибіотиків у присутності кофеїну, ефект зниження розчинності БАС при підвищених концентраціях гідротропного агента й ефект підвищення розчинності БАС у суміші гідротропних агентів. Запропоновано фізичну модель спільного зв'язування різних ароматичних БАС з ядерною ДНК, в основі якої лежить уявлення про переважне зв'язування лігандів з вільними від білків ділянками ядерної ДНК. Проведено аналіз спільного зв'язування різних комбінацій ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК. Уперше введене поняття інтерцепторного і протекторного механізмів дії в системах Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК. Знайдено емпіричні співвідношення, які дозволяють оцінити частку ліганду, витиснутого з ДНК при додаванні ліганда-перехоплювача, як функцію рівноважних констант гетероасоціації і комплексоутворення ліганду з ДНК, і критерій, що дозволяє вказати домінуючий процес, відповідальний за це. Для трьох досліджених груп ароматичних БАС: Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик продемонстрована потенційна можливість регулювання біологічної активності в комбінації ароматичних сполук і можливість кількісної оцінки очікуваного біологічного ефекту за умови домінування в системі протекторного і інтерцепторного механізмів. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Веселков А.Н., Высоцкий С.А., Евстигнеев М.П., Веселков Д.А., Дымант Л.Н., Болотин П.А., Дэвис Д.Б. Анализ взаимодействия антибиотика митоксантрона с ДНК в присутствии кофеина в водном растворе по данным 1H ЯМР спектроскопии // Биополимеры и клетка. - 2002. - Т.18, №4. - С.287-296. Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Высоцкий С.А., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Термодинамический анализ взаимодействия антибиотика митоксантрона с дезокситетрануклеотидом 5’-d(TpGpCpA) в водном растворе по данным 1H-ЯМР спектроскопии // Биофизика. - 2002. - Т.47, №3. - С.459-466. Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А., Рогова О.В., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Исследование равновесных ассоциированных форм гомодимера этидия в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии // Физ.химия. - 2003. - Т.77, №11. - С.2060-2067. Евстигнеев М.П., Веселков А.Н. Вероятностная модель для исследования гетероассоциации ароматических красителей и кофеина методом ЯМР спектроскопии // Доповiдi НАН України (біофізика). - 2003. - №8. - С.715-719. Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Рогова О.В., Чубаров А.С., Дэвис Д.Б. Стохастическая модель для ЯМР анализа гетероассоциации биологически активных ароматических молекул // Биофизика. - 2004. - Т.49, Вып.4. - С.587-594. Евстигнеев М.П., Чубаров А.С., Эрнандес Сантьяго А.А. Учет кооперативности при анализе конкурентного связывания ароматических лигандов с дезокситетрануклеотидами // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2004. - Т.59. - С.48-53. Evstigneev M.P., Hernandez Santiago A., Rogova O.V., Veselkov A.N. Comparative analysis of the self-association of ethidium mono- and bis-intercalators in aqueous solution using 1H NMR spectroscopy // Proc. of SPIE. - 2004. - Vol.5507. - P.173-177. Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Hernandez Santiago A.A., Davies D.B. 1H NMR investigation of the self-association of ethidium homodimer and its complexation with propidium iodide in aqueous solution // J.Mol.Struct. - 2004. – Vol.690. - P.17-24. Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Hernandez Santiago A.A., Zubchenok O.V., Djimant L.N., Davies D.B. 1H NMR structural and thermodynamical analysis of the hetero-association of daunomycin and novatrone in aqueous solution // J.Mol.Struct. - 2004. – Vol.701. - P.31-37. Розвадовская А.О., Евстигнеев М.П., Мухина Ю.В., Кисуркин Д.В., Веселков А.Н. Анализ гетероассоциации гидротропных агентов кофеина и никотинамида в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2004. - Т.59. - С.30-38. Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Кисуркин Д.В., Эрнандес Сантьяго А.А., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Анализ гетероассоциации антиопухолевых антибиотиков новатрона и актиномицина D в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии // Доповiдi НАН України (біофізика). - 2004. - №12. - С.168-174. Эрнандес Сантьяго А.А., Хомич В.В., Евстигнеев М.П. Анализ смеси трех ароматических компонент: диссоциация комплекса антрациклиновых антибиотиков в присутствии кофеина // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2005. - Т.70. - С.23-30. Мухина Ю.В., Евстигнеев М.П. Связывание ароматических лигандов с ДНК в присутствии витамина // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2005. - Т.70. - С.62-73. Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Чубаров А.С., Эрнандес Сантьяго А.А., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Структурный и термодинамический анализ гетероассоциации молекул дауномицина и флавин-мононуклеотида в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии // Журн.структур.химии. - 2005. - Т.46, №1. - С.70-76. Евстигнеев М.П., Хомич В.В., Дэвис Д.Б. 1H ЯМР анализ само- и гетероассоциации антибиотика доксорубицина и кофеина в водном растворе // Физика живого. - 2005. - Т.13, №2. - С.71-82. Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Эрнандес Сантьяго А.А., Мухина Ю.В., Веселков К.А., Рогова О.В., Дэвис Д.Б. Веселков А.Н. Анализ ассоциации кофеина с флавинмононуклеотидом по данным ПМР-спектров в водном растворе // Физ.химия. - 2005. - Т.79, №4. - С.673-679. Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Мухина Ю.В., Дэвис Д.Б. Структурный и термодинамический анализ гетероассоциации молекул новатрона и флавинмононуклеотида в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии // Биоорг.химия. - 2005.-Т.31,№5.-С.503-510. Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Мухина Ю.В., Рыбакова К.А., Дэвис Д.Б. Анализ комплексообразования ароматических молекул антибиотика и витамина в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии: гетероассоциация актиномицина D и флавин-мононуклеотида // Биофизика. - 2005. - Т.50, Вып.1. - С.20-27. Davies D.B., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Veselkov A.N. Hetero-association of anti-cancer antibiotics in aqueous solution: NMR and molecular mechanics analysis // Biophys.Chem. - 2005. - Vol.117. - P.111-118. Evstigneev M.P., Mykhina Yu.V., Davies D.B. Complexation of daunomycin with a DNA oligomer in the presence of an aromatic vitamin (B2) determined by NMR spectroscopy // Biophys.Chem. - 2005. - Vol.118. - P.118-127. Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Дэвис Д.Б. 1H ЯМР исследование гетероассоциации ногаламицина с ароматическими антиопухолевыми антибиотиками // Вісн.Харк.нац.ун-та №665, Біофіз.вісн. - 2005. - Вип.1(15). - С.43-48. Evstigneev M.P., Davies D.B., Veselkov A.N. Stochastic models (cooperative and non-cooperative) for NMR analysis of the hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution // Chem. Phys. - 2006. - V.321. - P.25-33. Розвадовская А.О., Евстигнеев В.П., Дэвис Д.Б., Евстигнеев М.П. Взаимодействие ароматических антибиотиков и витаминов: 1H ЯМР анализ гетероассоциации никотинамида с антрациклиновыми антиопухолевыми антибиотиками // Биофизика. - 2006. - Т.51, №2. - С.214-224. Евстигнеев М.П., Хомич В.В., Дэвис Д.Б. Исследование самоассоциации антибиотика дауномицина в различных буферных растворителях // Физ.химия. - 2006. - Т.80, №5. - С.854-859. Evstigneev M.P., Rybakova K.A., Davies D.B. Complexation of norfloxacin with DNA in the presence of caffeine // Biophys.Chem. - 2006. - Vol.121. - P.84-95. Evstigneev M.P., Evstigneev V.P., Davies D.B. 1H NMR determination of the self-association of an acridine homodimer and its complexation with ethidium bromide in aqueous solution // J.Mol.Str. - 2006. - Vol.784. - P.162-168. Evstigneev M.P., Mukhina Yu.V., Davies D.B. 1H NMR study of the hetero-association of flavin-mononucleotide with mutagenic dyes: ethidium bromide and proflavine // Molecular Phys. - 2006. - V.104, N4. - P.647-654. Evstigneev M.P., Evstigneev V.P., Hernandez Santiago A.A., Davies D.B. Effect of a mixture of caffeine and nicotinamide on the solubility of vitamin (B2) in aqueous solution // Eur. J. Pharm. Sci. - 2006. - Vol.28. - P.59-66. Евстигнеев М.П., Барановский С.Ф., Рыбакова К.А., Дэвис Д.Б. Исследование комплексообразования хинолонового антибиотика норфлоксацина с ДНК методом 1H ЯМР спектроскопии // Молекулярная биология. – 2006. – Т.40, №5. - С.894-899. Евстигнеев М.П., Евстигнеев В.П., Шокуров М.В. Стохастическая модель для ЯМР анализа многокомпонентных растворов биологически активных ароматических молекул // Вісн.Харк.нац.ун-та №716, Біофіз.вісн. - 2005. – Вип.2(16). – С.10-14. Евстигнеев М.П., Рыбакова К.А., Дэвис Д.Б. Гетероассоциация антибиотика норфлоксацина с ароматическими витаминами в водном растворе // Биофизика. - 2006. – Т.51, №4. – С.734-743. Евстигнеев М.П. Совместное связывание биологически активных ароматических молекул и кофеина с ДНК в водном растворе // Физика живого. - 2006. – Т.14, №1. – С.29-40. Bolotin P.A., Baranovsky S.F., Evstigneev M.P. Spectrophotometric investigation of the hetero-association of caffeine and thiazine dye in aqueous solution // Spectrochimica Acta: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. - 2006. - V.64A. - P.693-697. Evstigneev M.P., Rogova O.V., Hernandez Santiago A., Chubarov A.S., Veselkov A.N. Parameters of self- and hetero-association of aromatic ligands using NMR spectroscopy and different theoretical approaches // Book of Abstracts of XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals, 25 may-01 jun, 2003, Sevastopol, Ukraine P.264. Evstigneev V.P., Baranovsky S.F., Davies D.B., Evstigneev M.P. Theoretical analysis of two-component equilibrium of aromatic molecules in solution based on NMR data // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.35. Розвадовская А.О., Евстигнеев М.П., Ширяева О.С., Веселков А.Н. 1H ЯМР анализ самоассоциации антиопухолевого антибиотика дауномицина в различных буферных растворах // I Українська наукова конференція “Проблеми Біологічної і Медичної Фізики” ПМБФ-2004, 20-22 вересня 2004р., Харків, С.81. Khomich V.V., Evstigneev M.P. Self-association of antibiotic Doxorubicin and its hetero-association with Caffeine in aqueous solution // Book of abstracts of 3rd International Conference ‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’, 27-31 May 2005, Kyiv, Ukraine. P.37. Rybakova K.A., Evstigneev M.P. 1H NMR investigation of the self-association of antibiotic Norfloxacin and its hetero-association with Caffeine in aqueous solution // Book of abstracts of 3rd International Conference ‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’, 27-31 May 2005, Kyiv, Ukraine. P.36. Evstigneev M.P., Veselkov A.N. NMR analysis of a dynamic equilibrium of molecular complexes of a bis-intercalator, ethidium homodimer, in aqueous solution // III з’їзд українського біофізичного товариства, 8-11 жов. 2002, Львів, Україна. С.50. Rogova O.V., Hernandez Santiago A., Evstigneev M.P., Veselkov A.N. Thermodynamical analysis of self-association of ethidium homodimer and its complexation with phenanthridine dye in aqueous solution // Book of Abstracts of XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals, 25 may-01 jun, 2003, Sevastopol, Ukraine P.233. Evstigneev M.P., Hernandez Santiago A.A., Evstigneev V.P. Equilibrium interaction of acridine homodimer with itself and ethidium bromide in aque-ous solution // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, 15-21 May, 2006, Kyiv, Ukraine, P.106. Veselkov A.N., Vysotsky S.A., Sigaev V.A., Evstigneev M.P., Zavyalova O.S., Veselkov D.A., Davies D.B. Molecular mechanism of caffeine action on complexation of biologically active aromatic molecules with DNA // 6-th International Conference on Applications of Magnetic Resonance in Food Science, 4-6 sept. 2002, Paris, France, P.229. Evstigneev M.P., Khomich V.V., Davies D.B. 1H NMR study of the hetero-association of caffeine with anthracycline antibiotics // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.266. Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Hernandez Santiago A., Veselkov A.N., Davies D.B. Analysis of the hetero-association of aromatic drug molecules in aqueous solution by 1H NMR spectroscopy and molecular mechanics calculations // The first EENC/AMPERE joint meeting, 6-11 Sept. 2004, Lille, France, ID329. Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Эрнандес Сантьяго А., Веселков А.Н. Гетероассоциация ароматических молекул антиопухолевых антибиотиков и витаминов: анализ методами 1H ЯМР спектроскопии и молекулярной механики // I Українська наукова конференція “Проблеми Біологічної і Медичної Фізики” ПМБФ-2004, 20-22 вересня 2004р., Харків, С.82. Davies D.B., Mykhina Yu.V., Djimant L.N., Evstigneev M.P. Non-covalent interactions of flavine-mononucleotide with aromatic drug molecules studied by NMR // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.267-268. Davies D.B., Mukhina Yu.V., Evstigneev M.P. 1H NMR study of the hetero-association of mutagenic dyes, ethidium bromide and proflavine, with flavine-mononucleotide // Материалы III международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов, 21-25 марта 2005, Ростов-на-Дону, Россия, С.161. Hernandez Santiago A.A., Rozvadovska A.O., Evstigneev M.P. Hetero-association of antibiotic Nogalamycin with aromatic antitumour antibiotics // Book of abstracts of 3rd International Conference ‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’, 27-31 May 2005, Kyiv, Ukraine. P.35. Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Davies D.B. 1H NMR of hetero-complexes of aromatic drug molecules: possible stabilisation by intermolecular hydrogen-bonds // Book of abstracts of the Joint Conference of British NMR-DG, AMPERE and EENC “Euromar”, 16-21 July 2006, York, England. P.65. Evstigneev M.P., Khomich V.V. Competitive binding of anthracycline antibiotics with a model DNA in the presence of caffeine // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, 15-21 May, 2006, Kyiv, Ukraine, P.110. Evstigneev M.P., Rybakova K.A., Rozvadovska A.O. Binding of antibacterial antibiotic norfloxacin with DNA oligomer in presence of caffeine studied by NMR // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.270. Evstigneev M.P. Influence of flavine-mononucleotide on DNA binding properties of aromatic drug molecules // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, 15-21 May, 2006, Kyiv, Ukraine, P.101. Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А.А., Мосунов А.А., Симонова С.Н., Розвадовская А.О. Влияние гетероассоциации на параметры связывания антиопухолевых антибиотиков с олигомером ДНК // V Харьковская конференция молодых ученых “Радиофизика и СВЧ электроника” (секц.биофизики), 14-16 дек. 2005, Харьков, С.57. АНОТАЦІЯ Євстигнєєв М.П. Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і ДНК у водному розчині. – Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім.В.Н.Каразіна, м. Харків, 2006. Методом 1H ЯМР спектроскопії проведене систематичне дослідження нековалентних взаємодій різноманітних груп ароматичних біологічно активних сполук (БАС) (Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик, Біс-інтеркалятор-БАС), виявляючих синергізм біологічної дії при спільному використуванні: самоасоціація, гетероасоціація, комплексоутворення з ДНК. Отримані структурні та термодинамічни параметри асоціації молекул та їх комплексоутворення з ДНК. Виявлено внесок різноманітних фізичних взаємодій в стабілізацію комплексів. Запропоновано новий підхід для аналізу багатокомпонентних розчинів ароматичних БАС з урахуванням всіх можливих міжмолекулярних взаємодій компонентів суміші. Запропонована фізична модель спільного зв'язування різноманітних ароматичних БАС з ядерною ДНК, на підставі якої проведено аналіз спільного зв'язування різноманітних комбінацій ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК. Для досліджуваних груп продемонстрована потенційна можливість регулювання біологічної активності в комбінації ароматичних сполук і можливість кількісної оцінки очікуваного біологічного ефекту. Ключові слова: ароматичні молекули, ДНК, асоціація, комплексоутворення, багатокомпонентний розчин, ЯМР спектроскопія, регулювання біологичної активності АННОТАЦИЯ Евстигнеев М.П. Межмолекулярные взаимодействия биологически активных ароматических веществ и ДНК в водном растворе. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет им.В.Н.Каразина, г.Харьков, 2006. Методом 1H ЯМР спектроскопии проведено систематическое исследование нековалентных взаимодействий различных групп ароматических биологически активных соединений (БАС) (Кофеин-БАС, Витамин-БАС, Антибиотик-Антибиотик, бис-интеркалятор-БАС), проявляющих синергизм биологического действия при совместном использовании: самоассоциация, гетероассоциация, комплексообразование с ДНК. Получены структурные и термодинамические параметры ассоциации молекул и их комплексообразования с ДНК. Выявлен вклад различных физических взаимодействий в стабилизацию комплексов. Предложен новый подход для анализа многокомпонентных растворов ароматических БАС с учетом всех возможных межмолекулярных взаимодействий компонент смеси. Предложена физическая модель совместного связывания различных ароматических БАС с ядерной ДНК, на основании которой проведен анализ совместного связывания различных комбинаций ароматических БАС в группах Кофеин-БАС-ДНК, Витамин-БАС-ДНК и Антибиотик-Антибиотик-ДНК. Для исследованных групп продемонстрирована потенциальная возможность регулирования биологической активности в комбинации ароматических соединений и возможность количественной оценки ожидаемого биологического эффекта. Ключевые слова: ароматические молекулы, ДНК, ассоциация, комплексообразование, многокомпонентный раствор, ЯМР спектроскопия, регуляция биологической активности SUMMARY Evstigneev M.P. Intermolecular interactions of biologically active aromatic compounds and DNA in aqueous solution – Manuscript. Thesis for a Doctor’s degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics - Speciality 03.00.02, Kharkov National University, Kharkov, 2006. A systematic investigation of non-covalent interactions in different groups of aromatic biologically active molecules (BAC) (Caffeine-BAC, Vitamin-BAC, Antibiotic-Antibiotic, bis-intercalator-BAC) which exert a medico-biological synergism when used together have been made by 1D- and 2D-1H NMR spectroscopy (500MHz) methods. Structural (structures of 1:1 complexes) and thermodynamical (equilibrium constants, enthalpy and entropy) parameters of the association of the drugs and their complexation with DNA were obtained. It was found that the association of aromatic BAC in aqueous solution occurs via vertical stacking of their chromophores, mainly stabilized by dispersive and hydrophobic interactions. For the first time an additional stabilization by intermolecular H-bonds of the hetero-complexes of aromatic molecules was observed in the groups: Vitamin-BAC and Antibiotic-Antibiotic. Analysis of the association of aromatic bis-intercalators enabled to draw a conclusion that there is a more complex dynamic equilibrium of such molecules in solution as it had been known before. It was shown that aromatic bis-intercalators form different in their structures molecular aggregates, such as unfolded and folded forms, partially intercalated dimers and trimers, and also demonstrate an ability to intercept very effectively the molecules of simple monointercalators. A novel approach for analysis of multicomponent interactions of aromatic molecules in solution, based on algorithmic modelling of the association process, was suggested. A stochastic model was developed in order to analyse two- and multicomponent hetero-association, which had made it possible to investigate three-component solutions of aromatic drugs for the first time taking into consideration all possible intermolecular interactions between the components of the mixtures. This has allowed to forsee the effect of dissociation of the complex of anthracycline antibiotics in the presence of Caffeine, the effect of lowering of the solubilizing action on BAC under elevated concentrations of hydrotropic agents and the effect of raising of the solubility of BAC in a mixture of hydrotropic agents. A physical model for the simultaneous binding of different aromatic BAC with nuclear DNA was suggested. On the basis of this model an analysis of simultaneous binding of different combinations of aromatic BAC was carried out within the groups: Caffeine-BAC-DNA, Vitamin-BAC-DNA and Antibiotic-Antibiotic-DNA. The view of interceptor and protector mechanisms of action was introduced for the systems Vitamin-BAC-DNA and Antibiotic-Antibiotic-DNA. An empirical relations allowing to estimate the fraction of the ligand removed from DNA upon addition of a ligand-interceptor as a function of equilibrium constants of the hetero-association and Ligand-DNA complexation, and a criterion allowing to determine a dominating process responsible for that, were found. For the groups of aromatic BAC studied: Caffeine-BAC, Vitamin-BAC, Antibiotic-Antibiotic, a potential possibility of regulation of biological activity in combinations of aromatic drugs and the possibility of quantitative estimation of the expected biological effect under condition of action of protector and interceptor mechanisms, were demonstrated. Key words: aromatic molecules, DNA, association, complexation, multicomponent solution, NMR spectroscopy, regulation of biological activity Наукове видання ЄВСТИГНЄЄВ Максим Павлович “Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і ДНК у водному розчині” Підписано до друку 08.11.2006 р. Формат 60x90 1/16 Друк офсетний. Умовн.-др.арк. 2.5. Тираж 100 прим. Замовлення №46 Видавництво “СевНТУ”, Севастополь, 53, Стрілецька бухта, Студмістечко, НМЦ PAGE 1

Похожие записи