.

Метаболiчнi механiзми адаптацiï чорноморських риб до гiпоксичних станiв (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5829
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут гідробiології

СОЛДАТОВ

Олександр Олександрович

УДК 597.2/.5:612.22:591.1:577.12

Метаболiчнi механiзми адаптацii чорноморських риб до гiпоксичних станiв

03.00.10 – iхтiологiя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора бiологiчних наук

Київ – 2007

Дисертацiя є рукописом

Робота виконана в Інститутi біології пiвденних морiв iм. О.О.
Ковалевского НАН України

Науковий консультант: доктор бiологiчних наук, член-кореспондент НАН
України, професор Шульман Георгiй Євгенович, Інститут біології пiвденних
морiв НАН України, завiдувач вiддiлом фiзiологiї тварин i бiохiмiї

Офiцiйнi опоненти:

заслужений дiяч науки i технiки України,

доктор бiологiчних наук,

Дворецький Анатолiй Iванович,

Днiпропетровський нацiональний унiверситет,

професор кафедри iхтiологiї, гiдробiологiї та экологiї

доктор бiологiчних наук, професор,

Курант Володимир Зiновiйович,

Тернопiльський нацiональний унiверситет,

декан хiмiко-бiологiчного факультету

доктор бiологiчних наук,

Кляшторин Леонiд Борисович,

ВНIРО (Москва, Росiя),

провiдний науковий спiвробiтник,

вiддiлу вiдтворення i марикультури

Захист вiдбудеться 24.01.2007 р. о 14_год. на засiданнi Спецiалiзованої
Вченої ради Д 26.213.01 Інституту гiдробіології НАН України за адресою:
04210, г. Київ-210, вул. Героїв Сталiнграда, 12

З дисертацiєю можно ознайомитися в бiблiотецi Iнституту гiдробiологiї
НАН України (04210, г. Київ-210, вул. Героїв Сталiнграда, 12)

Автореферат разiсланий 22.12.2007 р.

Вчений секретар спецiалiзованої

вченої ради Д 26.213.01,

кандидат бiологiчних наук Н. I. Гончаренко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Кисень є найважливішою складовою гідрохімічного
комплексу чинників морського середовища, яка обмежує розповсюдження
організмів і впливає на видове різноманіття їхніх угруповань (Романенко,
2004). Евтрофікація, пов’язана з антропогенним навантаженням на водойми,
а також обмеження водообміну, є основними причинами, що призводять до
виникнення зон стійкої гіпоксії (Joyce, 2000). Останнім часом це явище
все частіше охоплює високо продуктивні шельфові зони і відкриті
акваторії Світового океану, викликаючи якісну трансформацію існуючих
екосистем (McEnroe et al., 1998; Joyce, 2000; Duncombe-Rue et al., 2000;
Shulman et al., 2002). Зони стійкої придонної гіпоксії порівняно недавно
сформувались і на північно-західному шельфі Чорного моря (Фесюнов,
Назаренко,1991; Виноградов и др., 1992; Золотарев и др., 1996). Зараз ця
акваторія активно реколонізується організмами різних трофічних рівнів
(Зайцев, 1987; Фащук и др., 1991). У перспективі тут можна очікувати
виникнення унікальної для Чорного моря гіпоксичної екосистеми.

Виконуючи функцію акцептора електронів у дихальному ланцюзі мітохондрій,
кисень в остаточному підсумку зумовлює енергетичний статус тканин і
організму в цілому. В умовах водного середовища, де дифузія його
протікає в 10000 разів менш ефективно, в порівнянні з повітрям,
виникнення гіпоксичних станів у гідробіонтів стає більш імовірною
подією. Особливо це актуально для риб, у яких енергетичні витрати на
обмін істотно превалюють над конструктивними процесами (Шмидт-Ниельсен,
1982; Хочачка, Сомеро, 1988; Шульман, Урденко, 1989; Shulman, Love,
1999; Maіna, 2002). Стан гіпоксії може виникати не тільки в умовах
зовнішнього дефіциту кисню, а й при гіпер- і гіпотермії (Арсан, 1986
a,b; Романенко и др., 1991; Dong, Zhang, 1992; Xu et al., 1994; Guіweі
et al., 1998; Portner et al., 2004; Heіse et al., 2006). До них можна
віднести випадки переднерестової анемії (Raіzada, Sіngh, 1981; Маслова,
Тавровская, 1991), природні і токсичні варіанти метгемоглобинемії
(Koudela, Zіtkova, 1991; Schoore, 1995; Hofer, Gatumu, 1994). Причини,
що лежать в основі їхнього розвитку, не завжди ясні і зрозумілі.

Серед тканин гідробіонтів особлива роль належить скелетній мускулатурі.
Переорієнтація її метаболізму на посилення анаеробних процесів, може
привести до зміни рухової активності виду і вплинути на його майбутню
долю в екосистемі. Про нестійкість кисневого режиму скелетних м’язів
морських і прісноводних риб свідчить низька швидкість утилізації кисню,
яка сполучається з високою щільністю капілярів і мітохондрій у тканині,
порівняних з вищими хребетними (Mathіeu-Costello et al., 1996; Johnston,
Ball, 1997). Для м’язів багатьох риб характерний нескомпенсований тип
стехіометрії цитохромів мітохондрій (Савина, 1992; Zhou et al., 2000), а
також дуже ефективні метаболічні схеми анаеробної генерації енергії
(Bіdіnotto et al., 1997; Lutz, Nіlsson, 1997; Bіckler, Buck, 2007),
важливим елементом яких є білковий катаболізм (Shulman, Love, 1999;
Shulman et al., 2002; Chew et al., 2005). Таке співвідношення процесів
дозволяє припустити низьку ефективність масопереносу кисню у риб на
тканинному рівні.

Характеризуючи кисневі режими тканин, звертають увагу на дві групи
параметрів, які в стійкому стані повинні бути збалансовані: напруження
кисню (РО2) в артеріальній, венозній крові і тканинних структурах;
швидкості транспорту кисню кров’ю й утилізації його тканинами (Лауэр,
Колчинская, 1964). Перша група параметрів – відповідальна за швидкості
дифузії кисню на рівні гематопаренхіматозного бар’єра, друга – за
величини PO2 у крові і тканинах. Однак, ці аспекти фізіології риб
фактично не розроблені. На сьогоднішній день є велика інформація про
процеси мікроциркуляції (Soederstroem, Nіlsson, 2000; Schwerte et al.,
2003; Stenslokken et al., 2004; Florіndo et al., 2006 і ін.) і
газотранспортні властивості крові риб (Feuerleіn, Weber, 1996; Fago et
al., 1995; Pellegrіnі et al., 2003; Jensen, 2004 і ін.). Дані ж про
об’ємний тканинний кровотік, РО2 у тканинах і венозній крові, важливі
для розпізнавання первинних і вторинних форм гіпоксії, навпаки, надто
обмежені або відсутні (McKenzіe et al., 2004). Це означає, що питання
щодо вивчення процесів, які визначають кисневий гомеостаз тканин у
гідробіонтів і риб, зокрема, раніше не порушувались. Розробці цього
напряму екологічної і фізіологічної біоенергетики риб і присвячена дана
робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота тісно пов’язана з виконанням планових науково-дослідних робіт
Інституту біології південних морів НАН України, рядом державних
проектів, міжнародних грантів і госпдоговорних тем. Отримані результати
були використані під час підготовки звітів з держбюджетних тем:
“Еколого-фізіологічні і фізіолого-біохімічні основи існування популяцій
тварин в угрупованнях і екосистемах Чорного моря” (№ держ. реєстації
01.9.10 056168); “Метаболічні основи існування масових видів
безхребетних і риб в умовах мінливого режиму Чорного моря” (№
0196U022102); “Структурно-функціональні основи продукційних процесів у
гідробіонтів” (№ 0199U001389); “Біохімічні і метаболічні стратегії, які
забезпечують функціональне біорізноманіття гідробіонтів” (№
0103U001049). Частину досліджень було виконано у рамках проектів:
“Комплексний екологічний моніторинг прибережної зони Чорного й
Азовського морів”, № 01.02/02540 (Національне агентство морських
досліджень і технологій); “Фізіолого-біохімічна індикація забезпечення
харчуванням ракоподібних і риб пелагіалі Чорного моря”, № 5.4/211
(Державний комітет України у справах науки і технологій); “Оцінка
фізіологічного стану промислових гідробіонтів, що живуть в умовах дії
несприятливих антропогенних факторів”, № 0195U025265 ( Міністерство
рибного господарства України). При виконанні робіт були використані
кошти, отримані в рамках міжнародного гранта персональної підтримки з
програми “Іnternatіonal Scіence and Educatіon Program” (№ QSU 084189).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідження
кисневих режимів скелетних м’язів морських риб і механізмів їхньої
функціональної корекції при різних станах організму й умовах
навколишнього середовища.

Для цього виконувались наступні завдання.

Дослідити в умовах експерименту фізіологічні і поведінкові аспекти дії
уретанової анестезії на організми різних систематичних груп морських риб
і визначити на цій основі стадії наркозу й ефективні концентрації
наркотичного агента для різної температури, солоності і напруження кисню
в середовищі.

Порівняти величини РО2 у крові і м’язовій тканині, дифузійну здатність,
швидкості масопереносу й утилізації кисню в скелетних м’язах різних
екологічних груп морських риб.

Вивчити кисневі режими скелетних м’язів і механізми їхньої корекції у
морських риб в умовах експериментальної гіпоксії, гіпотермії, гіпоосмії
і гіподинамії.

Дослідити динаміку кисневого статусу м’язової тканини і процеси, які
його обумовлюють, у морських риб протягом річного циклу.

На основі отриманого експериментального матеріалу визначити основні
принципи регуляції кисневих режимів скелетних м’язів у морських риб, а
також механізми розвитку і компенсації гіпоксичних станів.

Об’єкти дослідження: представники донної і пелагічної іхтіофауни Чорного
й Азовського морів (всього 15 видів риб).

Предмет дослідження: механізми спрямованої корекції кисневого режиму
скелетних м’язів морських риб.

Методи дослідження: загальноприйняті методи аналізу іхтіологічного
матеріалу; фотоколориметричні і спектрофотометричні методи визначення
активності ферментів, концентрації мінеральних і органічних речовин у
біологічних пробах; потенціометричні методи контролю частоти дихання,
частоти серцевих скорочень, об’ємного тканинного кровотоку, напруження
кисню у воді, крові, гемолізатах і м’язах; вертикальний
диск-електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) зразків гемоглобіну;
авторадіографічні і гістологічні методи обробки проб м’язів, крові і
відбитків кровотворних органів; світлова мікроскопія при вивченні
гістологічних і цитологічних препаратів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше використаний комплекс
показників для характеристики кисневого режиму тканин нижчих хребетних
(морські риби). Виявлена надзвичайно низька дифузійна здатність
тканнинних структур скелетних м’язів риб відносно кисню. Показано, що це
– основна причина низьких значень тканинного РО2 і малої ефективності
утилізації кисню м’язами, незважаючи на високу щільність капілярної
мережі в них.

Описано три нових види гіпоксичних станів у морських риб: гіпоксія
гіподинамічного стану; гемічний вид гіпоксії, виявлений в умовах
гіпотермії і пов’язаний з високим тепловим ефектом реакції оксигенації
гемоглобіну; гіпоосмічна гіпоксія, яка визначається гідратацією
скелетних м’язів при адаптації до умов розпріснення середовища. Вперше
запропоновано класифікацію гіпоксичних станів для водяних організмів.

Визначено механізми термінової і довгострокової регуляції тканинного
РО2. Показано, що найбільший внесок у стабілізацію кисневого режиму
м’язової тканини робить процес корекції положення кривих оксигенації
гемоглобіну. Виявлено, що в основі його лежать кількісні зміни
гетерогенної структури пігменту і внутрішньоеритроцитарної концентрації
нуклеотидтрифосфатів (NTP). Відзначено низьку ефективність процесів
тканинної гіперемії, яка лише частково забезпечує необхідний
адаптаційної ефект.

Вперше показано, що кров риб, толерантних до гострої зовнішньої
гіпоксії, має одночасно високу спорідненість до кисню і підвищену
чутливість до рН (ефект Бора). Досліджено гетерогенну систему
гемоглобіну і виявлено компонент із зазначеними функціональними
характеристиками. Показано, що вміст його в крові спрямовано зростає в
умовах експериментальної гіпоксії.

Встановлені спрямовані перебудови в цитохромному ланцюзі мітохондрій
м’язів риб (нескомпенсований тип стехіометрії), які підвищують
ефективність функціонування дихального ланцюга в умовах низького
тканинного РО2.

Вперше виявлена участь і визначена значущість тканинного рівня ліпідів у
корекції дифузійної здатності скелетних м’язів риб відносно кисню.

Описано феномен метаболічного арешту на рівні циркулюючих еритроцитів у
риб, здатних існувати в умовах гострого дефіциту кисню. Визначені
співвідношення активностей гексокінази, Na+, K+-ATPази і балансу
одновалентних катіонів (Na+ і K+), що існують на мембрані клітин
червоної крові у досліджених видів риб.

Встановлена моноциклічність у функціонуванні кровотворної тканини у риб
протягом річного циклу. Показано, що активний еритропоез у них
відбувається лише в післянерестовий період і спостерігається протягом
2-3 місяців. В інший час у системі червоної крові переважають
деструктивні процеси, які супроводжуються розвитком анемії і
метгемоглобинемії і зумовлюють розвиток стану переднерестової гіпоксії у
риб.

Виявлено, що у теплолюбних риб в умовах гіпотермії (менше 5оС) судини
м’язів втрачають здатність активно реагувати на функціональні
навантаження, що пов’язано з підвищенням вмісту Ca2+ у м’язовій тканині.

Показано, що еритроцити евригалінних риб, у порівнянні зі
стеногалінними, мають підвищену стійкість до осмотичного шоку і більш
ефективні Na+, K+-ATPази. У цих видів визначені процеси осморегуляції,
які забезпечують ефективне функціонування їхніх клітинних систем в
умовах гіпотонії плазми крові.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонована в роботі
класифікація гіпоксичних станів орієнтована як на морські, так й на
прісноводні риби. Вона дозволяє планувати рибоводні заходи таким чином,
щоб уникнути виникнення на практиці подібних станів. Особливо варто
звернути увагу на низку екзогенних і ендогенних форм гіпоксії, а також
гіподинамічну гіпоксію.

Камбала-глоса, кефалі (сингіль, гостроніс і, особливо, піленгас) є
об’єктами сучасного рибництва на території України. Дані, отримані з
гематології й біохімії крові для цих видів, можуть бути використані при
уточненні або визначенні меж фізіологічних норм, їм властивих, а також
діагностиці їхнього стану.

Встановлено, що в умовах експериментальної гіподинамії у
кефалі-піленгаса розвивалась анемія, артеріальна гіпоксемія, зростала
кількість гіпоксичних і аноксичних зон у м’язовій тканині, які у
сукупності приводили до розвитку стану гіпоксії. Це дозволяє
рекомендувати даний вид для басейнового, а не сажового вирощування у
рибоводних господарствах.

Вперше показано, що розвиток метгемоглобинемії у риб може викликати не
тільки нітритна інтоксикація, яка найчастіше трапляється в
рибогосподарській практиці, а й ряд природних станів (нерест) і чинників
середовища (гіпотермія). Це необхідно враховувати під час контролю стану
посадкового матеріалу і планування рибоводних заходів.

Дослідження впливу уретанової анестезії на організм морських риб
дозволило визначити основні стадії наркозу й ефективні концентрації
наркотичного агента з урахуванням факторів середовища і стану організму.
Показано також, що цей вид анестезії справляє значно м’якший ефект, у
порівнянні з іншими, широко застосовуваними препаратами (MS-222,
хлорбутанол, хінальдин, менокаїн, пропоксат, метомидат і багато
інших). Це дозволяє рекомендувати використання зазначених розробок не
тільки в науковій галузі, а і в рибогосподарській практиці.

Теоретичні положення і практичні розробки дисертації використані
автором під час лекцій з фізіології гіпоксичних станів, фізіології і
біохімії адаптаційних процесів, екологічної фізіології та біохімії риб
студентам факультетів біологічного профілю.

Особистий внесок дисертанта. Автор самостійно обґрунтував тему, мету та
основні завдання дослідження, оволодів усіма використовуваними в роботі
лабораторними методами аналізу біологічного матеріалу і реєстрації
фізіологічних показників, а також застосовуваними розрахунками; виконав
основний комплекс експериментальних робіт, проаналізував і узагальнив
отримані результати, сформулював висновки.

У процесі підготовки і виконання роботи здобувачу надали консультативну
допомогу з окремих теоретичних і методологічних питань – д.м.н. М.М.
Середенко, Інститут фізіології НАН України (класифікація гіпоксичних
станів, розрахунки масопереносау й утилізації кисню в тканинах); д.б.н.
М.М. Маслова, к.б.н. Т.В. Тавровська, Інститут еволюційної фізіології і
біохімії РАН (сезонні аспекти еритропоезу у пойкілотермів;
авторадіографія і мікроскопічний аналіз препаратів крові і кровотворних
органів у риб); д.б.н. С.В. Коношенко, Таврійський національний
університет МОН України (методи фракціонування гемоглобінів і побудова
кривих оксигенації пігментів).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на X Всесоюзній конференції з еволюційної фізіології
(Ленінград, Росія, 1990); V Всесоюзній конференції з раннього онтогенезу
риб (Астрахань, 1991); VІІІ науковій конференції з екологічної
фізіології і біохімії риб (Петрозаводськ, 1992); І, ІІ, ІV з’їздах
Гідроекологічного товариства України (Київ, 1993; 1997; Феодосія, 2005);
31st, 33rd European Marіne Bіology Symposіum (St.-Petersburg, Russіa,
1996; Wіlhelmshaven, Germany, 1998); BMB 15 and ECSA 27 Sіmposіum
“Comparіson of Enclosed and Semіenclosed Marіne Systems” (Marіehamn,
Aland, Fіnland, 1997); Baltіc Sea Scіence Congress (Stockholm, Sweden,
2001); V Міжнародній конференції “Водні екосистеми й організми” (Москва,
Росія, 2003); Міжнародному науковому семінарі “Особливості механізмів
адаптації риб до факторів середовища” (Феодосія, 2003); Fіrst
(Іnaugural) Ukraіnіan Congress of Cell Bіology (Lvіv, 2004); XІ з’їзді
фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова (Єкатеринбург, Росія, 2004);
Міжнародній конференції “Сучасні проблеми фізіології і біохімії водяних
організмів” (Петрозаводськ, Росія, 2004); І з’їзді фізіологів СНД (Сочі,
Росія, 2005); Міжнародній науковій конференції “Водная экология на заре
XXІ века (Винберг-100)” (С.-Петербург, Росія, 2005); XІІІ Міжнародній
нараді з еволюційної фізіології (С.-Петербург, Росія, 2006); Міжнародній
науковій конференції “Проблеми біологічної океанографії XXІ століття”
(Севастополь, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукові праці, з них 32
статті, які входять до переліку, затвердженого ВАК України, 1 стаття і
19 тез доповідей у збірниках матеріалів конференцій.

Структура й обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, 12-ти
розділів, висновків, списку використаних джерел, який містить 987
найменувань (168 кирилицею, 819 латиницею). Робота ілюстрована 40
рисунками і 66 таблицями. Загальний обсяг рукопису становить 441
сторінка.

ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Кисневий режим морських вод і організми

Розділ є першою частиною огляду літератури з тематики дисертаційної
роботи. У ньому розглядаються основні фізико-хімічні принципи регуляції
кисневих режимів водойм. Показано, що зовнішня гіпоксія є поширеним
явищем у водах Світового океану. Вона актуальна і для північно-західного
шельфу Чорного моря. Розглянуті основні уявлення про формування
гіпоксичних акваторій у морському середовищі.

Дається загальна характеристика екосистем гіпоксичних зон Світового
океану і Чорного моря з акцентом на морські риби. Проведено порівняльну
оцінку стійкості представників чорноморської іхтіофауни до зовнішньої
гіпоксії за значеннями граничних і критичних концентрацій кисню у воді.

Розділ 2. Фізіологічні і молекулярні системи транспорту й утилізації
кисню у риб

Розділ є основною складовою огляду літератури. В ньому представлено
інформацію про стан систем кисневого забезпечення тканин у морських і
прісноводних риб. Розглянуто процеси мікроциркуляції: щільність,
геометрія, морфологія й ультраструктура судин капілярного русла,
артеріол і венул, судинорухові реакції, об’ємний тканинний кровотік і
методи його реєстрації. Велику увагу приділено кисневій ємності крові у
риб і шляхам її функціональної корекції (еритропоез, депо крові,
деструкція старих еритроїдних форм). Окремим блоком представлено
інформацію про гемоглобіни риб. Охарактеризовані особливості їхньої
структури, поліморфізм, функціональні властивості. Особливий акцент
зроблено на механізми спрямованої корекції положення і форми кривих
оксигенації гемоглобіну.

Вперше зроблено спробу узагальнити інформацію про кисневий гомеостаз
тканин риб. Наводяться дані про РО2 в артеріальній, венозній крові і
тканинних структурах. Оцінюються дифузійні характеристики тканин і
чинники, що впливають на них: тканинний рівень ліпідів і міоглобіну.
Розглянені молекулярні системи утилізації кисню (цитохроми) і реакції
клітинних систем риб на гіпоксію.

Відзначено, що інформація про об’ємний тканинний кровотік, РО2 у
тканинах і венозній крові, важлива для розпізнавання первинних і
вторинних форм гіпоксії, для риб надзвичайно обмежена. З цієї причини не
можна скласти повне уявлення про механізми спрямованої корекції
тканинного РО2 і основні шляхи розвитку тканинної гіпоксії в зазначеній
систематичній групі організмів.

Розглянуто історію й еволюцію уявлень про формування гіпоксичних станів
на організменному і тканинному рівнях. Представлені сучасні підходи до
їхньої класифікації і діагностики. Відмічено, що діюча класифікаційна
система гіпоксичних станів не може бути цілком екстрапольована на водяні
організми. Це обумовлено специфікою фізико-хімічних властивостей водного
середовища й особливостями функціональної організації гідробіонтів.
Підкреслюється, що проблема гіпоксичних станів для водяних організмів і
риб, зокрема, раніше не порушувалась, і питання їхньої діагностики
фактично не розроблені.

Розділ 3. Матеріал і методи дослідження

Результати досліджень, представлені в дисертаційній роботі, були
отримані протягом 1980-2003 років. Основна частина експериментів,
лабораторна обробка проб та їхній аналіз були виконані на базі ІнБПМ НАН
України.

Робота виконувалась на 15-ти видах азово-чорноморських риб:
кефаль-сингіль (Lіza aurata R.); кефаль-гостроніс (Mugіl salіens R.);
кефаль-піленгас (Liza hamatocheila T.); ставрида (Trachurus
medіterraneus S.); тюлька (Clupeonella cultriventris N.); камса
(Engraulіs encrasіcolus L.); бичок-кругляк (Neogobіus melanostomus P.);
бичок-мартовик (Gobіus batrachocephalus P.); бичок-трав’яник
(Zosterisessor ophіocephalus P.); бичок-кругляш (Gobіus cobіtіs P.);
бичок-ротан (Neogobіus ratan P.); бичок-нігер (Gobіus nіger L.);
бичок-рижик (Neogobіus eurycephalus K.); камбала-глоса (Platіchthys
flesus L.), скорпена (Scorpaena porcus L.). Рибу відловлювали в
Керченській протоці, на Експериментальній базі ПівденНІРО (с. Заповітне,
Крим), у районі Кара-Дага і Севастополя. Частину матеріалу для
проведення досліджень надав Експериментальний кефалевий завод ЧВОРП
“Антарктика” (с. Біленьке, Одеська область).

У роботі задіяний спеціально виготовлений експериментальний стенд, який
дозволяв підтримувати задану PО2 у воді і температуру протягом
необмеженого часу, а також регулярно робити заміну води для видалення
метаболітів.

Проби артеріальної і венозної крові здобували відповідно пункцією
дорсальної аорти (aorta dorsalіs) і хвостової вени (vena caudalіs). В
інших випадках кров брали пункцією венозного синуса (sіnus venosus) чи
передсердя серця (atrіum). Як антикоагулянт застосовували гепарин
(“Rіchter”, Угорщина). Зразки м’язової тканини для біохімічних і
гістологічних досліджень одержували з великого білого бічного (musculus
lateralіs magnus) і поверхневого червоного бічного (musculus lateralіs
superfіcіalіs) м’язів, розташованих за спинним плавцем. У донних риб
проби червоної м’язової тканини відбирали в районі хвостового стебла.

Методи вивчення кисневого режиму м’язів. Напруження кисню в м’язах
(PmО2) вимірювали потенціометрично. Використовували склований платиновий
мікроелектрод з діаметром кінчика 4-6 мкм. Електроди завчасно
постарювали і калібрували (Березовский, 1975). Дифузійний струмінь кисню
з потенціалом поляризації 0,55-0,65 V реєстрували за допомогою
підсилювача постійного струму ОР-925 (“Radelkіs”, Угорщина) і
потенціометра КСП-4. Як допоміжний електрод застосовували стандартний
каломельний електрод. Напруження кисню в пробах артеріальної (PaО2) і
венозної (PvО2) крові вимірювали на кислотно-лужному аналізаторі ОР-210
(“Radelkіs”, Угорщина) з використанням стандартного кисневого електрода
Е 5046 (“Radіometer”, Данія). Об’ємний кровотік (Q) у червоних і білих
м’язах вимірювали методом H2-кліренсу з електрохімічною генерацією
водню, адаптованого до застосування на водяних тваринах (Вязовой и др.,
1982) з використанням платинового мікроелектрода (діаметр 150 мкм,
довжина 3 мм).

Насичення артеріальної (SaО2) і венозної (SvО2) крові киснем визначали
шляхом фотометрування проб при 540, 560, 580 нм (Houston, 1990) з
наступним розрахунком концентрації оксигемоглобіну або встановлювали,
виходячи з величин PaО2 і PvО2, за кривою дисоціації оксигемоглобіну,
вводячи поправку на зсув рН.

На підставі отриманих величин розраховували швидкість споживання О2
м’язовою тканиною (VmО2) і її дифузійну здатність (DmО2), швидкість
масопереносу О2 артеріальною (VaО2) і венозною (VvО2) кров’ю,
гемодинамічний еквівалент (НЕ).

Методи вивчення капілярної мережі м’язів. При оцінці щільності
капілярної мережі застосовували ін’єкційний метод Огнева (Шошенко и др.,
1984) і безін’єкційний метод Слонимського (Киселева и др., 1983). На
поперечному зрізі тканин (товщина 25-30 мкм) підраховували кількість
капілярних і м’язових одиниць, а також визначали їхній діаметр,
використовуючи окуляр-мікрометр. На поздовжних зрізах вимірювали довжину
капілярних одиниць.

На підставі отриманих значень розраховували величину капілярного
резерву, радіус Крога (RK), площу капілярної стінки (S), обсяг
тканинного циліндра (V) і поверхневий показник (ПП).

Морфо-функціональні методи дослідження червоної крові. Вміст гемоглобіну
в крові визначали за допомогою гемиглобінціанідного методу,
використовуючи стандартний набір реактивів (НПО “Биолар”). Кількість
еритроцитів у крові підраховували в камері Горяєва (Стенко, 1975).
Гематокрит визначали шляхом центрифугування зразків крові в капілярах
(750 g; 30 хвилин). На підставі отриманих значень розраховували
еритроцитарні індекси: MCV, MCH і MCHC.

Криві кисневого насичення крові будували за методом Таккера в
модифікації Кляшторина і Саликзянова (1980). Вимірювання виконували при
PCO2 у газовому середовищі тонометра – 4,0 і 10,7 гПа і температурі
15оС, паралельно реєструючи рН розчину. На підставі отриманих значень
розраховували величини ефекту Бора і коефіцієнта Хілла. Величину рН у
пробах артеріальної і венозної крові визначали мікрометодом на
кислотно-лужному аналізаторі ОР-210 (“Radelkіs”, Угорщина). Вплив АТР на
кисневозв’язуючі характеристики розчинів гемоглобіну оцінювали за зміною
величини показника Р50 у відповідь на введення в інкубаційне середовище
тонометра АТР (кінцева концентрація 70 мкМ г-1 Hb).

Фракціонування очищених гемолізатів здійснювали за допомогою
вертикального диск-електрофореза в поліакриламідному гелі (Стародуб,
1979). Концентрація акриламіду – 7%. Офарблювали електрофореграми кумаси
брильянтовим блакитним (G-250) і бензидиновим реагентом на гемові групи
(Маурер, 1971). Денситометрування проводили на денситометрі “Carl Zeіss”
(Німеччина). У ряді випадків фракції гемоглобіну елюювали з гелевих
блоків (Стародуб, 1979) і вивчали їхні кисневозв’язуючі властивості.
Концентрували зразки за допомогою мембран фірми “Amіcon” (США).

Вміст NTP у клітинах червоної крові і розчинах визначали шляхом
гідролізу лабільного фосфату (Крикливый и др., 1979). Концентрацію Mg2+
і Cl- в еритроцитах оцінювали фотометрично, використовуючи набори
реактивів (“Lacheme”, Чехія). Концентрації Na+ і К+ у плазмі крові і
гемолізатах визначали на полуменевому фотометрі ПАЖ-3 у суміші
пропан-повітря (Комаров и др., 1976).

Активність Na+,К+-АТРази зразків еритроцитарних мембран визначали в
інкубаційному середовищі складу: 3 mМ Na2ATP, 100 mМ NaCl, 20 mМ KСl, 3
mМ MgCl2, 10 mМ гістидину (рН 7,4), 5 мкг білка клітинних мембран. Як
інгібітор застосовували уабаїн. Звільнений неорганічний фосфат у пробі
оцінювали методом Фіске, Суббароу (Кочетов, 1980). Білок у пробах
контролювали методом Бредфорда (Sedmak, Grossberg, 1977). При оцінці
активності гексокінази в еритроцитах використовували інкубаційне
середовище складу: 100 mМ трис-HCl буфера (pН 7,4), 2 mМ MgCl2, 0,2 mМ
NADP, 2 mМ Na2ATP, 20 mМ глюкози, 0,2U глюкозо-6-фосфатдегідрогенази,
0,1 мл гемолізату. Температура – 15оС.

Вміст води в крові оцінювали шляхом зважування на аналітичних вагах
WP-11 (Польща) свіжої і висушеної до постійної ваги при 105оС краплі
крові. Осмотичну резистентність еритроцитів визначали за допомогою
мікроскопічного методу Яновського. Кислотні еритрограми будували згідно
з методом Гітельзона, Терскова (Стенко, 1975).

Мазки крові і відбитки пронефросу фіксували в метанолі й офарблювали
методом Паппенгейма (Стенко, 1975). На препаратах підраховували число
незрілих еритроїдних форм. Для оцінки темпів їхньої проліферації
використовували метод авторадіографії (Киселева и др., 1983). Як
радіоактивний попередник синтезу DNA (S-період) застосовували
3Н-тимідин.

Біохімічні дослідження плазми крові і скелетних м’язів. Вміст глюкози в
плазмі визначали орто-толуїдиновим методом, використовуючи стандартний
набір реактивів (НПО “Биолар”). Одночасно вимірювали вміст лактату
ферментативним способом (Комаров и др., 1976).

Концентрацію АТР у м’язах визначали методом Лампрехта, Тротшольда
(Ещенко, 1982). Вміст лактату в м’язовій тканині в цих же гомогенатах
оцінювали ферментативним методом Хохорста (Ещенко, 1982). Сумарний вміст
ліпідів у червоних і білих м’язах визначали фотометрично за реакцією з
фосфованілиновим реагентом (Кучеренко, Васильев, 1985). Використовували
стандартний набір реактивів фірми “Lacheme” (Чехія). Рівень міоглобіну в
м’язах оцінювали фотометрично за методикою Рейнафарье (Reynafarіe,
1963). Кількісне визначення вмісту цитохромів (aa3, b, c, c1) проводили
за методом Чанса в модифікації Євдотієнко, Мохової (1967). Активність
аланінамінотрансферази (АлАТ) у м’язах оцінювали
динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля із застосуванням
набору реактивів (“Sіmco Ltd” Україна).

Вміст води в м’язах оцінювали шляхом зважування на аналітичних вагах
WP-11 (Польща) свіжих і висушених до постійної ваги при 105оС зразків
тканини. Органічну речовину після висушування проб розчиняли в
концентрованій HNO3. У розчинах визначали концентрації Na+, K+ і Ca2+.
Виміри здійснювали на полуменевому фотометрі ПАЖ-3 з використанням
суміші пропан-повітря (Na+, K+) і ацетилен-повітря (Ca2+).

Загальні фізіологічні методи. У ряді експериментів визначали
інтенсивність споживання кисню рибами, частоту дихання і серцевих
скорочень, критичні і граничні концентрації кисню. Споживання кисню
оцінювали респірометрично. Вміст кисню контролювали за допомогою
оксиметра АК-04 (НПО “Сигма”) і потенціометра КСП-4. Критичні і граничні
концентрації кисню визначали за методикою перерваного потоку [Кляшторин,
1977]. Пневмограму і пульсограму реєстрували з імплантованих у тіло риб
електродів. Запис робили за допомогою підсилювача ОР-925 (“Radelkіs”,
Угорщина) і потенціометра КСП-4.

Розділ 4. Фізіологічні аспекти дії уретанової анестезії на організм
морських риб. Визначення ефективних концентрацій уретану

Цей етап передував основній частині роботи. Його необхідність була
спричинена тим, що під час визначення низки показників здійснювалась
активна маніпуляція з тваринами, що приводило до виникнення стану
handlіng стресу. У дослідницькій і рибоводній практиці застосовуються
десятки анестетиків. Однак, багато з них справляють очевидний
асфіксичний ефект, а фізіологічні аспекти дії інших досліджені слабко. У
представленій роботі як анестезуючий препарат обрано уретан. Він м’яко
впливає на респіраторний і серцево-судинний центри. Ефект після дії
уретану не виражений, оскільки кінцевими продуктами є СО2, NH3, H2O
(Veenstra et al., 1987; Белокопытин, 1993). Однак, цих відомостей не
вистачає для практичного застосування зазначеного препарату, оскільки
відсутня інформація про стадії наркотичного стану та його вплив на
процеси тканинного дихання. Дослідження показали, що уретанова анестезія
викликає у риб розвиток 3-х послідовних станів: спокою, збудження і
глибокого наркозу.

Період спокою зберігався тривалий час (до 1,5 години) і спостерігався в
надто широкому діапазоні концентрацій уретану у воді, що знижувало
імовірність передозування наркотичного агента. В особин зникала реакція
переляку, а фізіологічний стан носив стійкий характер. Споживання кисню,
дихальна і серцева ритміка, число еритроцитів і концентрація гемоглобіну
в крові риб зберігалися на рівні контрольних величин. Посилення
анаеробних процесів не відзначали, про що свідчили постійні значення
PvО2, вміст глюкози і лактату в плазмі крові.

Період збудження збігався з втратою координації рухів, деякою
інтенсифікацією обмінних процесів і ростом варіабельності значень
контрольованих показників, зокрема, дихальної і серцевої ритміки.

При глибокому наркозі спостерігалися припинення рухової активності,
прогресуюче зниження частоти дихання і серцевих скорочень, розвиток
тканинної гіпоксії. Споживання кисню особинами зменшувалося більш, ніж у
3 рази, а PvО2 – у 2 рази (p

@

®

A

Ae

I

I

(

*

P

c

O

’??I?THaaeae?oooeth

$

*

.

0

2

4

8

:

P

h

j

|

~

?

?

?

?

1/4

3/4

O

oe

o

ue

th

––&–(–?–?™I›?›r?xcnYV?oe¬o¬oooooooooooooccccooocooooo

occcccccccccccccccccccoc

A

$

?

3/4

A

3/4

A

?

-язові клітини активує базальний тонус судин (Шуба, Кочемасова, 1988).
На цьому фоні повинна розвиватися неконтрольована вазоконстрикторна
реакція, що, очевидно, дійсно мало місце.

Еритроцити. Іншим негативним наслідком гіпотермії з’явився високий
тепловий ефект реакції оксигенації гемоглобіну, що спостерігався при
наближенні до температури 5оС. Теплота оксигенації, розрахована для
показника Р50 за рівнянням Вант-Гоффа, для інтервалу температур 5-10оС
склала -5,36 ккал моль-1 O2, тоді як для 10-15оС – лише -1,24 ккал
моль-1 O2. Це приводило до істотного підвищення спорідненості
гемоглобіну до О2 в області низьких температур і супроводжувалося
значним зсувом кривих оксигенації ліворуч. Кров, яка має високу
спорідненість до О2, утрудняє розрядку оксигемоглобіну на тканинному
рівні і приводить до зниження РО2 у тканині. Цю реакцію також можна
розглядати як одну з причин, що призводить до розвитку тканинної
гіпоксії в м’язах риб при гіпотермії.

Реакції компенсації. В організмі кефалей, утримуваних при 5оС, були
зареєстровані зміни, компенсуючі негативний вплив гіпотермії. У 1-і дні
досліду відзначали збільшення кисневої ємності крові, що було пов’язано
з підвищенням числа еритроцитів у крові. Це відбувалося на фоні
зменшення ваги селезінки. Селезінка у риб є основним, депонуючим кров,
органом (Wells, Weber, 1990). Це дозволяє дійти висновку, що збільшення
кількості еритроцитів у крові було обумовлено викидом клітинної маси, що
знаходиться в селезінці, в кровотік. Потім відбувалося зниження
спорідненості гемоглобіну до О2. Воно визначалося підвищенням рівня NTP
в еритроцитах. NTP є основним чинником еритроцитарної корекції
спорідненості гемоглобіну до О2 у риб (Wells et al., 1997; Val, 1999).

Гіпотермія спричинювала і ряд адаптивних зрушень у скелетних м’язах риб.
У кефалей спостерігали збільшення тканинної концентрації міоглобіну,
ліпідів і сумарних цитохромів, що повинно полегшувати дифузію О2.
Дихальний ланцюг мітохондрій при цьому набував нескомпенсований
характер. Відношення b/aa3 знижувалося. Це відбивало процес його
адаптації до низького РО2 у м’язах. Корекція положення кривої
оксигенації гемоглобіну і спрямована зміна тканинного рівня міоглобіну,
ліпідів і цитохромів сприяли частковому відновленню РО2 у м’язах кефалі
в умовах гіпотермії. При 1-2оС компенсаційні процеси не були виражені.
Загибель риб на 15-у добу експерименту становила 100 %.

Таким чином, в основі розвитку стану тканинної гіпоксії м’язів у риб в
умовах гіпотермії лежать два процеси: надмірна вазоконстрикція судин
мікроциркуляторного русла; надто високий тепловий ефект реакції
оксигенації гемоглобіну в області низьких температур.

Розділ 8. Кисневий режим м’язової тканини у стено- і евригалінних
морських риб в умовах експериментальної гіпоосмії

Робота виконана на стеногалінному морському виді бичку-кругляші і
евригалінному бичку-мартовику. Контрольні групи риб утримували при 12-14
о/оо. Досліджувані групи знаходилися протягом 44-45 діб при 4,8-5,6
о/оо. Оцінка стану особин, відбір проб крові і тканин здійснювали на
1-5, 14-16 і 44-45 добу експерименту. Температура води – 15+1оС.

Стеногалінний вид. При зниженні солоності води в скелетних м’язах
кругляша підсилювалися анаеробні процеси. Це знайшло відображення в
зниженні середньом’язового PmО2, росту числа гіпоксичних (менш 8 гПа) і
аноксичних зон на фоні збільшення концентрації лактату в крові і м’язах.
У венозній крові відзначали зменшення PvО2, рН і зростання
артеріо-венозної різниці за рН.

Зміни відбувалися на фоні гідратації плазми крові. Ця реакція мала два
важливих наслідки: гідратацію м’язової тканини і свелінг (набрякання)
еритроцитів. Інші показники, що могли б вплинути на кисневий режим
тканини, не зазнавали істотних змін.

Відомо, що дифузія кисню в гідратованій цитоплазмі клітин протікає в
декілька разів менш ефективно (Londravіlle, Sіdell, 1990). Через те цей
фактор повинний робити суттєвий внесок у розвиток тканинної гіпоксії.
Оцінка дифузійної здатності м’язів (DmО2) кругляша в умовах гіпоосмії
підтвердила таке положення. Значення (DmО2) знижувалися більш ніж на 30%
(p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2019