НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут гідробiології

СОЛДАТОВ

Олександр Олександрович

УДК 597.2/.5:612.22:591.1:577.12

Метаболiчнi механiзми адаптацii чорноморських риб до гiпоксичних станiв

03.00.10 – iхтiологiя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора бiологiчних наук

Київ – 2007

Дисертацiя є рукописом

Робота виконана в Інститутi біології пiвденних морiв iм. О.О.
Ковалевского НАН України

Науковий консультант: доктор бiологiчних наук, член-кореспондент НАН
України, професор Шульман Георгiй Євгенович, Інститут біології пiвденних
морiв НАН України, завiдувач вiддiлом фiзiологiї тварин i бiохiмiї

Офiцiйнi опоненти:

заслужений дiяч науки i технiки України,

доктор бiологiчних наук,

Дворецький Анатолiй Iванович,

Днiпропетровський нацiональний унiверситет,

професор кафедри iхтiологiї, гiдробiологiї та экологiї

доктор бiологiчних наук, професор,

Курант Володимир Зiновiйович,

Тернопiльський нацiональний унiверситет,

декан хiмiко-бiологiчного факультету

доктор бiологiчних наук,

Кляшторин Леонiд Борисович,

ВНIРО (Москва, Росiя),

провiдний науковий спiвробiтник,

вiддiлу вiдтворення i марикультури

Захист вiдбудеться 24.01.2007 р. о 14_год. на засiданнi Спецiалiзованої
Вченої ради Д 26.213.01 Інституту гiдробіології НАН України за адресою:
04210, г. Київ-210, вул. Героїв Сталiнграда, 12

З дисертацiєю можно ознайомитися в бiблiотецi Iнституту гiдробiологiї
НАН України (04210, г. Київ-210, вул. Героїв Сталiнграда, 12)

Автореферат разiсланий 22.12.2007 р.

Вчений секретар спецiалiзованої

вченої ради Д 26.213.01,

кандидат бiологiчних наук Н. I. Гончаренко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Кисень є найважливішою складовою гідрохімічного
комплексу чинників морського середовища, яка обмежує розповсюдження
організмів і впливає на видове різноманіття їхніх угруповань (Романенко,
2004). Евтрофікація, пов’язана з антропогенним навантаженням на водойми,
а також обмеження водообміну, є основними причинами, що призводять до
виникнення зон стійкої гіпоксії (Joyce, 2000). Останнім часом це явище
все частіше охоплює високо продуктивні шельфові зони і відкриті
акваторії Світового океану, викликаючи якісну трансформацію існуючих
екосистем (McEnroe et al., 1998; Joyce, 2000; Duncombe-Rue et al., 2000;
Shulman et al., 2002). Зони стійкої придонної гіпоксії порівняно недавно
сформувались і на північно-західному шельфі Чорного моря (Фесюнов,
Назаренко,1991; Виноградов и др., 1992; Золотарев и др., 1996). Зараз ця
акваторія активно реколонізується організмами різних трофічних рівнів
(Зайцев, 1987; Фащук и др., 1991). У перспективі тут можна очікувати
виникнення унікальної для Чорного моря гіпоксичної екосистеми.

Виконуючи функцію акцептора електронів у дихальному ланцюзі мітохондрій,
кисень в остаточному підсумку зумовлює енергетичний статус тканин і
організму в цілому. В умовах водного середовища, де дифузія його
протікає в 10000 разів менш ефективно, в порівнянні з повітрям,
виникнення гіпоксичних станів у гідробіонтів стає більш імовірною
подією. Особливо це актуально для риб, у яких енергетичні витрати на
обмін істотно превалюють над конструктивними процесами (Шмидт-Ниельсен,
1982; Хочачка, Сомеро, 1988; Шульман, Урденко, 1989; Shulman, Love,
1999; Maіna, 2002). Стан гіпоксії може виникати не тільки в умовах
зовнішнього дефіциту кисню, а й при гіпер- і гіпотермії (Арсан, 1986
a,b; Романенко и др., 1991; Dong, Zhang, 1992; Xu et al., 1994; Guіweі
et al., 1998; Portner et al., 2004; Heіse et al., 2006). До них можна
віднести випадки переднерестової анемії (Raіzada, Sіngh, 1981; Маслова,
Тавровская, 1991), природні і токсичні варіанти метгемоглобинемії
(Koudela, Zіtkova, 1991; Schoore, 1995; Hofer, Gatumu, 1994). Причини,
що лежать в основі їхнього розвитку, не завжди ясні і зрозумілі.

Серед тканин гідробіонтів особлива роль належить скелетній мускулатурі.
Переорієнтація її метаболізму на посилення анаеробних процесів, може
привести до зміни рухової активності виду і вплинути на його майбутню
долю в екосистемі. Про нестійкість кисневого режиму скелетних м’язів
морських і прісноводних риб свідчить низька швидкість утилізації кисню,
яка сполучається з високою щільністю капілярів і мітохондрій у тканині,
порівняних з вищими хребетними (Mathіeu-Costello et al., 1996; Johnston,
Ball, 1997). Для м’язів багатьох риб характерний нескомпенсований тип
стехіометрії цитохромів мітохондрій (Савина, 1992; Zhou et al., 2000), а
також дуже ефективні метаболічні схеми анаеробної генерації енергії
(Bіdіnotto et al., 1997; Lutz, Nіlsson, 1997; Bіckler, Buck, 2007),
важливим елементом яких є білковий катаболізм (Shulman, Love, 1999;
Shulman et al., 2002; Chew et al., 2005). Таке співвідношення процесів
дозволяє припустити низьку ефективність масопереносу кисню у риб на
тканинному рівні.

Характеризуючи кисневі режими тканин, звертають увагу на дві групи
параметрів, які в стійкому стані повинні бути збалансовані: напруження
кисню (РО2) в артеріальній, венозній крові і тканинних структурах;
швидкості транспорту кисню кров’ю й утилізації його тканинами (Лауэр,
Колчинская, 1964). Перша група параметрів — відповідальна за швидкості
дифузії кисню на рівні гематопаренхіматозного бар’єра, друга — за
величини PO2 у крові і тканинах. Однак, ці аспекти фізіології риб
фактично не розроблені. На сьогоднішній день є велика інформація про
процеси мікроциркуляції (Soederstroem, Nіlsson, 2000; Schwerte et al.,
2003; Stenslokken et al., 2004; Florіndo et al., 2006 і ін.) і
газотранспортні властивості крові риб (Feuerleіn, Weber, 1996; Fago et
al., 1995; Pellegrіnі et al., 2003; Jensen, 2004 і ін.). Дані ж про
об’ємний тканинний кровотік, РО2 у тканинах і венозній крові, важливі
для розпізнавання первинних і вторинних форм гіпоксії, навпаки, надто
обмежені або відсутні (McKenzіe et al., 2004). Це означає, що питання
щодо вивчення процесів, які визначають кисневий гомеостаз тканин у
гідробіонтів і риб, зокрема, раніше не порушувались. Розробці цього
напряму екологічної і фізіологічної біоенергетики риб і присвячена дана
робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота тісно пов’язана з виконанням планових науково-дослідних робіт
Інституту біології південних морів НАН України, рядом державних
проектів, міжнародних грантів і госпдоговорних тем. Отримані результати
були використані під час підготовки звітів з держбюджетних тем:
«Еколого-фізіологічні і фізіолого-біохімічні основи існування популяцій
тварин в угрупованнях і екосистемах Чорного моря» (№ держ. реєстації
01.9.10 056168); «Метаболічні основи існування масових видів
безхребетних і риб в умовах мінливого режиму Чорного моря» (№
0196U022102); «Структурно-функціональні основи продукційних процесів у
гідробіонтів» (№ 0199U001389); «Біохімічні і метаболічні стратегії, які
забезпечують функціональне біорізноманіття гідробіонтів» (№
0103U001049). Частину досліджень було виконано у рамках проектів:
«Комплексний екологічний моніторинг прибережної зони Чорного й
Азовського морів», № 01.02/02540 (Національне агентство морських
досліджень і технологій); «Фізіолого-біохімічна індикація забезпечення
харчуванням ракоподібних і риб пелагіалі Чорного моря», № 5.4/211
(Державний комітет України у справах науки і технологій); «Оцінка
фізіологічного стану промислових гідробіонтів, що живуть в умовах дії
несприятливих антропогенних факторів», № 0195U025265 ( Міністерство
рибного господарства України). При виконанні робіт були використані
кошти, отримані в рамках міжнародного гранта персональної підтримки з
програми «Іnternatіonal Scіence and Educatіon Program» (№ QSU 084189).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідження
кисневих режимів скелетних м’язів морських риб і механізмів їхньої
функціональної корекції при різних станах організму й умовах
навколишнього середовища.

Для цього виконувались наступні завдання.

Дослідити в умовах експерименту фізіологічні і поведінкові аспекти дії
уретанової анестезії на організми різних систематичних груп морських риб
і визначити на цій основі стадії наркозу й ефективні концентрації
наркотичного агента для різної температури, солоності і напруження кисню
в середовищі.

Порівняти величини РО2 у крові і м’язовій тканині, дифузійну здатність,
швидкості масопереносу й утилізації кисню в скелетних м’язах різних
екологічних груп морських риб.

Вивчити кисневі режими скелетних м’язів і механізми їхньої корекції у
морських риб в умовах експериментальної гіпоксії, гіпотермії, гіпоосмії
і гіподинамії.

Дослідити динаміку кисневого статусу м’язової тканини і процеси, які
його обумовлюють, у морських риб протягом річного циклу.

На основі отриманого експериментального матеріалу визначити основні
принципи регуляції кисневих режимів скелетних м’язів у морських риб, а
також механізми розвитку і компенсації гіпоксичних станів.

Об’єкти дослідження: представники донної і пелагічної іхтіофауни Чорного
й Азовського морів (всього 15 видів риб).

Предмет дослідження: механізми спрямованої корекції кисневого режиму
скелетних м’язів морських риб.

Методи дослідження: загальноприйняті методи аналізу іхтіологічного
матеріалу; фотоколориметричні і спектрофотометричні методи визначення
активності ферментів, концентрації мінеральних і органічних речовин у
біологічних пробах; потенціометричні методи контролю частоти дихання,
частоти серцевих скорочень, об’ємного тканинного кровотоку, напруження
кисню у воді, крові, гемолізатах і м’язах; вертикальний
диск-електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) зразків гемоглобіну;
авторадіографічні і гістологічні методи обробки проб м’язів, крові і
відбитків кровотворних органів; світлова мікроскопія при вивченні
гістологічних і цитологічних препаратів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше використаний комплекс
показників для характеристики кисневого режиму тканин нижчих хребетних
(морські риби). Виявлена надзвичайно низька дифузійна здатність
тканнинних структур скелетних м’язів риб відносно кисню. Показано, що це
— основна причина низьких значень тканинного РО2 і малої ефективності
утилізації кисню м’язами, незважаючи на високу щільність капілярної
мережі в них.

Описано три нових види гіпоксичних станів у морських риб: гіпоксія
гіподинамічного стану; гемічний вид гіпоксії, виявлений в умовах
гіпотермії і пов’язаний з високим тепловим ефектом реакції оксигенації
гемоглобіну; гіпоосмічна гіпоксія, яка визначається гідратацією
скелетних м’язів при адаптації до умов розпріснення середовища. Вперше
запропоновано класифікацію гіпоксичних станів для водяних організмів.

Визначено механізми термінової і довгострокової регуляції тканинного
РО2. Показано, що найбільший внесок у стабілізацію кисневого режиму
м’язової тканини робить процес корекції положення кривих оксигенації
гемоглобіну. Виявлено, що в основі його лежать кількісні зміни
гетерогенної структури пігменту і внутрішньоеритроцитарної концентрації
нуклеотидтрифосфатів (NTP). Відзначено низьку ефективність процесів
тканинної гіперемії, яка лише частково забезпечує необхідний
адаптаційної ефект.

Вперше показано, що кров риб, толерантних до гострої зовнішньої
гіпоксії, має одночасно високу спорідненість до кисню і підвищену
чутливість до рН (ефект Бора). Досліджено гетерогенну систему
гемоглобіну і виявлено компонент із зазначеними функціональними
характеристиками. Показано, що вміст його в крові спрямовано зростає в
умовах експериментальної гіпоксії.

Встановлені спрямовані перебудови в цитохромному ланцюзі мітохондрій
м’язів риб (нескомпенсований тип стехіометрії), які підвищують
ефективність функціонування дихального ланцюга в умовах низького
тканинного РО2.

Вперше виявлена участь і визначена значущість тканинного рівня ліпідів у
корекції дифузійної здатності скелетних м’язів риб відносно кисню.

Описано феномен метаболічного арешту на рівні циркулюючих еритроцитів у
риб, здатних існувати в умовах гострого дефіциту кисню. Визначені
співвідношення активностей гексокінази, Na+, K+-ATPази і балансу
одновалентних катіонів (Na+ і K+), що існують на мембрані клітин
червоної крові у досліджених видів риб.

Встановлена моноциклічність у функціонуванні кровотворної тканини у риб
протягом річного циклу. Показано, що активний еритропоез у них
відбувається лише в післянерестовий період і спостерігається протягом
2-3 місяців. В інший час у системі червоної крові переважають
деструктивні процеси, які супроводжуються розвитком анемії і
метгемоглобинемії і зумовлюють розвиток стану переднерестової гіпоксії у
риб.

Виявлено, що у теплолюбних риб в умовах гіпотермії (менше 5оС) судини
м’язів втрачають здатність активно реагувати на функціональні
навантаження, що пов’язано з підвищенням вмісту Ca2+ у м’язовій тканині.

Показано, що еритроцити евригалінних риб, у порівнянні зі
стеногалінними, мають підвищену стійкість до осмотичного шоку і більш
ефективні Na+, K+-ATPази. У цих видів визначені процеси осморегуляції,
які забезпечують ефективне функціонування їхніх клітинних систем в
умовах гіпотонії плазми крові.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонована в роботі
класифікація гіпоксичних станів орієнтована як на морські, так й на
прісноводні риби. Вона дозволяє планувати рибоводні заходи таким чином,
щоб уникнути виникнення на практиці подібних станів. Особливо варто
звернути увагу на низку екзогенних і ендогенних форм гіпоксії, а також
гіподинамічну гіпоксію.

Камбала-глоса, кефалі (сингіль, гостроніс і, особливо, піленгас) є
об’єктами сучасного рибництва на території України. Дані, отримані з
гематології й біохімії крові для цих видів, можуть бути використані при
уточненні або визначенні меж фізіологічних норм, їм властивих, а також
діагностиці їхнього стану.

Встановлено, що в умовах експериментальної гіподинамії у
кефалі-піленгаса розвивалась анемія, артеріальна гіпоксемія, зростала
кількість гіпоксичних і аноксичних зон у м’язовій тканині, які у
сукупності приводили до розвитку стану гіпоксії. Це дозволяє
рекомендувати даний вид для басейнового, а не сажового вирощування у
рибоводних господарствах.

Вперше показано, що розвиток метгемоглобинемії у риб може викликати не
тільки нітритна інтоксикація, яка найчастіше трапляється в
рибогосподарській практиці, а й ряд природних станів (нерест) і чинників
середовища (гіпотермія). Це необхідно враховувати під час контролю стану
посадкового матеріалу і планування рибоводних заходів.

Дослідження впливу уретанової анестезії на організм морських риб
дозволило визначити основні стадії наркозу й ефективні концентрації
наркотичного агента з урахуванням факторів середовища і стану організму.
Показано також, що цей вид анестезії справляє значно м’якший ефект, у
порівнянні з іншими, широко застосовуваними препаратами (MS-222,
хлорбутанол, хінальдин, менокаїн, пропоксат, метомидат і багато
інших). Це дозволяє рекомендувати використання зазначених розробок не
тільки в науковій галузі, а і в рибогосподарській практиці.

Теоретичні положення і практичні розробки дисертації використані
автором під час лекцій з фізіології гіпоксичних станів, фізіології і
біохімії адаптаційних процесів, екологічної фізіології та біохімії риб
студентам факультетів біологічного профілю.

Особистий внесок дисертанта. Автор самостійно обґрунтував тему, мету та
основні завдання дослідження, оволодів усіма використовуваними в роботі
лабораторними методами аналізу біологічного матеріалу і реєстрації
фізіологічних показників, а також застосовуваними розрахунками; виконав
основний комплекс експериментальних робіт, проаналізував і узагальнив
отримані результати, сформулював висновки.

У процесі підготовки і виконання роботи здобувачу надали консультативну
допомогу з окремих теоретичних і методологічних питань – д.м.н. М.М.
Середенко, Інститут фізіології НАН України (класифікація гіпоксичних
станів, розрахунки масопереносау й утилізації кисню в тканинах); д.б.н.
М.М. Маслова, к.б.н. Т.В. Тавровська, Інститут еволюційної фізіології і
біохімії РАН (сезонні аспекти еритропоезу у пойкілотермів;
авторадіографія і мікроскопічний аналіз препаратів крові і кровотворних
органів у риб); д.б.н. С.В. Коношенко, Таврійський національний
університет МОН України (методи фракціонування гемоглобінів і побудова
кривих оксигенації пігментів).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на X Всесоюзній конференції з еволюційної фізіології
(Ленінград, Росія, 1990); V Всесоюзній конференції з раннього онтогенезу
риб (Астрахань, 1991); VІІІ науковій конференції з екологічної
фізіології і біохімії риб (Петрозаводськ, 1992); І, ІІ, ІV з’їздах
Гідроекологічного товариства України (Київ, 1993; 1997; Феодосія, 2005);
31st, 33rd European Marіne Bіology Symposіum (St.-Petersburg, Russіa,
1996; Wіlhelmshaven, Germany, 1998); BMB 15 and ECSA 27 Sіmposіum
«Comparіson of Enclosed and Semіenclosed Marіne Systems» (Marіehamn,
Aland, Fіnland, 1997); Baltіc Sea Scіence Congress (Stockholm, Sweden,
2001); V Міжнародній конференції «Водні екосистеми й організми» (Москва,
Росія, 2003); Міжнародному науковому семінарі «Особливості механізмів
адаптації риб до факторів середовища» (Феодосія, 2003); Fіrst
(Іnaugural) Ukraіnіan Congress of Cell Bіology (Lvіv, 2004); XІ з’їзді
фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова (Єкатеринбург, Росія, 2004);
Міжнародній конференції «Сучасні проблеми фізіології і біохімії водяних
організмів» (Петрозаводськ, Росія, 2004); І з’їзді фізіологів СНД (Сочі,
Росія, 2005); Міжнародній науковій конференції «Водная экология на заре
XXІ века (Винберг-100)» (С.-Петербург, Росія, 2005); XІІІ Міжнародній
нараді з еволюційної фізіології (С.-Петербург, Росія, 2006); Міжнародній
науковій конференції «Проблеми біологічної океанографії XXІ століття»
(Севастополь, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукові праці, з них 32
статті, які входять до переліку, затвердженого ВАК України, 1 стаття і
19 тез доповідей у збірниках матеріалів конференцій.

Структура й обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, 12-ти
розділів, висновків, списку використаних джерел, який містить 987
найменувань (168 кирилицею, 819 латиницею). Робота ілюстрована 40
рисунками і 66 таблицями. Загальний обсяг рукопису становить 441
сторінка.

ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Кисневий режим морських вод і організми

Розділ є першою частиною огляду літератури з тематики дисертаційної
роботи. У ньому розглядаються основні фізико-хімічні принципи регуляції
кисневих режимів водойм. Показано, що зовнішня гіпоксія є поширеним
явищем у водах Світового океану. Вона актуальна і для північно-західного
шельфу Чорного моря. Розглянуті основні уявлення про формування
гіпоксичних акваторій у морському середовищі.

Дається загальна характеристика екосистем гіпоксичних зон Світового
океану і Чорного моря з акцентом на морські риби. Проведено порівняльну
оцінку стійкості представників чорноморської іхтіофауни до зовнішньої
гіпоксії за значеннями граничних і критичних концентрацій кисню у воді.

Розділ 2. Фізіологічні і молекулярні системи транспорту й утилізації
кисню у риб

Розділ є основною складовою огляду літератури. В ньому представлено
інформацію про стан систем кисневого забезпечення тканин у морських і
прісноводних риб. Розглянуто процеси мікроциркуляції: щільність,
геометрія, морфологія й ультраструктура судин капілярного русла,
артеріол і венул, судинорухові реакції, об’ємний тканинний кровотік і
методи його реєстрації. Велику увагу приділено кисневій ємності крові у
риб і шляхам її функціональної корекції (еритропоез, депо крові,
деструкція старих еритроїдних форм). Окремим блоком представлено
інформацію про гемоглобіни риб. Охарактеризовані особливості їхньої
структури, поліморфізм, функціональні властивості. Особливий акцент
зроблено на механізми спрямованої корекції положення і форми кривих
оксигенації гемоглобіну.

Вперше зроблено спробу узагальнити інформацію про кисневий гомеостаз
тканин риб. Наводяться дані про РО2 в артеріальній, венозній крові і
тканинних структурах. Оцінюються дифузійні характеристики тканин і
чинники, що впливають на них: тканинний рівень ліпідів і міоглобіну.
Розглянені молекулярні системи утилізації кисню (цитохроми) і реакції
клітинних систем риб на гіпоксію.

Відзначено, що інформація про об’ємний тканинний кровотік, РО2 у
тканинах і венозній крові, важлива для розпізнавання первинних і
вторинних форм гіпоксії, для риб надзвичайно обмежена. З цієї причини не
можна скласти повне уявлення про механізми спрямованої корекції
тканинного РО2 і основні шляхи розвитку тканинної гіпоксії в зазначеній
систематичній групі організмів.

Розглянуто історію й еволюцію уявлень про формування гіпоксичних станів
на організменному і тканинному рівнях. Представлені сучасні підходи до
їхньої класифікації і діагностики. Відмічено, що діюча класифікаційна
система гіпоксичних станів не може бути цілком екстрапольована на водяні
організми. Це обумовлено специфікою фізико-хімічних властивостей водного
середовища й особливостями функціональної організації гідробіонтів.
Підкреслюється, що проблема гіпоксичних станів для водяних організмів і
риб, зокрема, раніше не порушувалась, і питання їхньої діагностики
фактично не розроблені.

Розділ 3. Матеріал і методи дослідження

Результати досліджень, представлені в дисертаційній роботі, були
отримані протягом 1980-2003 років. Основна частина експериментів,
лабораторна обробка проб та їхній аналіз були виконані на базі ІнБПМ НАН
України.

Робота виконувалась на 15-ти видах азово-чорноморських риб:
кефаль-сингіль (Lіza aurata R.); кефаль-гостроніс (Mugіl salіens R.);
кефаль-піленгас (Liza hamatocheila T.); ставрида (Trachurus
medіterraneus S.); тюлька (Clupeonella cultriventris N.); камса
(Engraulіs encrasіcolus L.); бичок-кругляк (Neogobіus melanostomus P.);
бичок-мартовик (Gobіus batrachocephalus P.); бичок-трав’яник
(Zosterisessor ophіocephalus P.); бичок-кругляш (Gobіus cobіtіs P.);
бичок-ротан (Neogobіus ratan P.); бичок-нігер (Gobіus nіger L.);
бичок-рижик (Neogobіus eurycephalus K.); камбала-глоса (Platіchthys
flesus L.), скорпена (Scorpaena porcus L.). Рибу відловлювали в
Керченській протоці, на Експериментальній базі ПівденНІРО (с. Заповітне,
Крим), у районі Кара-Дага і Севастополя. Частину матеріалу для
проведення досліджень надав Експериментальний кефалевий завод ЧВОРП
«Антарктика» (с. Біленьке, Одеська область).

У роботі задіяний спеціально виготовлений експериментальний стенд, який
дозволяв підтримувати задану PО2 у воді і температуру протягом
необмеженого часу, а також регулярно робити заміну води для видалення
метаболітів.

Проби артеріальної і венозної крові здобували відповідно пункцією
дорсальної аорти (aorta dorsalіs) і хвостової вени (vena caudalіs). В
інших випадках кров брали пункцією венозного синуса (sіnus venosus) чи
передсердя серця (atrіum). Як антикоагулянт застосовували гепарин
(«Rіchter», Угорщина). Зразки м’язової тканини для біохімічних і
гістологічних досліджень одержували з великого білого бічного (musculus
lateralіs magnus) і поверхневого червоного бічного (musculus lateralіs
superfіcіalіs) м’язів, розташованих за спинним плавцем. У донних риб
проби червоної м’язової тканини відбирали в районі хвостового стебла.

Методи вивчення кисневого режиму м’язів. Напруження кисню в м’язах
(PmО2) вимірювали потенціометрично. Використовували склований платиновий
мікроелектрод з діаметром кінчика 4-6 мкм. Електроди завчасно
постарювали і калібрували (Березовский, 1975). Дифузійний струмінь кисню
з потенціалом поляризації 0,55-0,65 V реєстрували за допомогою
підсилювача постійного струму ОР-925 («Radelkіs», Угорщина) і
потенціометра КСП-4. Як допоміжний електрод застосовували стандартний
каломельний електрод. Напруження кисню в пробах артеріальної (PaО2) і
венозної (PvО2) крові вимірювали на кислотно-лужному аналізаторі ОР-210
(«Radelkіs», Угорщина) з використанням стандартного кисневого електрода
Е 5046 («Radіometer», Данія). Об’ємний кровотік (Q) у червоних і білих
м’язах вимірювали методом H2-кліренсу з електрохімічною генерацією
водню, адаптованого до застосування на водяних тваринах (Вязовой и др.,
1982) з використанням платинового мікроелектрода (діаметр 150 мкм,
довжина 3 мм).

Насичення артеріальної (SaО2) і венозної (SvО2) крові киснем визначали
шляхом фотометрування проб при 540, 560, 580 нм (Houston, 1990) з
наступним розрахунком концентрації оксигемоглобіну або встановлювали,
виходячи з величин PaО2 і PvО2, за кривою дисоціації оксигемоглобіну,
вводячи поправку на зсув рН.

На підставі отриманих величин розраховували швидкість споживання О2
м’язовою тканиною (VmО2) і її дифузійну здатність (DmО2), швидкість
масопереносу О2 артеріальною (VaО2) і венозною (VvО2) кров’ю,
гемодинамічний еквівалент (НЕ).

Методи вивчення капілярної мережі м’язів. При оцінці щільності
капілярної мережі застосовували ін’єкційний метод Огнева (Шошенко и др.,
1984) і безін’єкційний метод Слонимського (Киселева и др., 1983). На
поперечному зрізі тканин (товщина 25-30 мкм) підраховували кількість
капілярних і м’язових одиниць, а також визначали їхній діаметр,
використовуючи окуляр-мікрометр. На поздовжних зрізах вимірювали довжину
капілярних одиниць.

На підставі отриманих значень розраховували величину капілярного
резерву, радіус Крога (RK), площу капілярної стінки (S), обсяг
тканинного циліндра (V) і поверхневий показник (ПП).

Морфо-функціональні методи дослідження червоної крові. Вміст гемоглобіну
в крові визначали за допомогою гемиглобінціанідного методу,
використовуючи стандартний набір реактивів (НПО «Биолар»). Кількість
еритроцитів у крові підраховували в камері Горяєва (Стенко, 1975).
Гематокрит визначали шляхом центрифугування зразків крові в капілярах
(750 g; 30 хвилин). На підставі отриманих значень розраховували
еритроцитарні індекси: MCV, MCH і MCHC.

Криві кисневого насичення крові будували за методом Таккера в
модифікації Кляшторина і Саликзянова (1980). Вимірювання виконували при
PCO2 у газовому середовищі тонометра — 4,0 і 10,7 гПа і температурі
15оС, паралельно реєструючи рН розчину. На підставі отриманих значень
розраховували величини ефекту Бора і коефіцієнта Хілла. Величину рН у
пробах артеріальної і венозної крові визначали мікрометодом на
кислотно-лужному аналізаторі ОР-210 («Radelkіs», Угорщина). Вплив АТР на
кисневозв’язуючі характеристики розчинів гемоглобіну оцінювали за зміною
величини показника Р50 у відповідь на введення в інкубаційне середовище
тонометра АТР (кінцева концентрація 70 мкМ г-1 Hb).

Фракціонування очищених гемолізатів здійснювали за допомогою
вертикального диск-електрофореза в поліакриламідному гелі (Стародуб,
1979). Концентрація акриламіду – 7%. Офарблювали електрофореграми кумаси
брильянтовим блакитним (G-250) і бензидиновим реагентом на гемові групи
(Маурер, 1971). Денситометрування проводили на денситометрі «Carl Zeіss»
(Німеччина). У ряді випадків фракції гемоглобіну елюювали з гелевих
блоків (Стародуб, 1979) і вивчали їхні кисневозв’язуючі властивості.
Концентрували зразки за допомогою мембран фірми «Amіcon» (США).

Вміст NTP у клітинах червоної крові і розчинах визначали шляхом
гідролізу лабільного фосфату (Крикливый и др., 1979). Концентрацію Mg2+
і Cl- в еритроцитах оцінювали фотометрично, використовуючи набори
реактивів («Lacheme», Чехія). Концентрації Na+ і К+ у плазмі крові і
гемолізатах визначали на полуменевому фотометрі ПАЖ-3 у суміші
пропан-повітря (Комаров и др., 1976).

Активність Na+,К+-АТРази зразків еритроцитарних мембран визначали в
інкубаційному середовищі складу: 3 mМ Na2ATP, 100 mМ NaCl, 20 mМ KСl, 3
mМ MgCl2, 10 mМ гістидину (рН 7,4), 5 мкг білка клітинних мембран. Як
інгібітор застосовували уабаїн. Звільнений неорганічний фосфат у пробі
оцінювали методом Фіске, Суббароу (Кочетов, 1980). Білок у пробах
контролювали методом Бредфорда (Sedmak, Grossberg, 1977). При оцінці
активності гексокінази в еритроцитах використовували інкубаційне
середовище складу: 100 mМ трис-HCl буфера (pН 7,4), 2 mМ MgCl2, 0,2 mМ
NADP, 2 mМ Na2ATP, 20 mМ глюкози, 0,2U глюкозо-6-фосфатдегідрогенази,
0,1 мл гемолізату. Температура – 15оС.

Вміст води в крові оцінювали шляхом зважування на аналітичних вагах
WP-11 (Польща) свіжої і висушеної до постійної ваги при 105оС краплі
крові. Осмотичну резистентність еритроцитів визначали за допомогою
мікроскопічного методу Яновського. Кислотні еритрограми будували згідно
з методом Гітельзона, Терскова (Стенко, 1975).

Мазки крові і відбитки пронефросу фіксували в метанолі й офарблювали
методом Паппенгейма (Стенко, 1975). На препаратах підраховували число
незрілих еритроїдних форм. Для оцінки темпів їхньої проліферації
використовували метод авторадіографії (Киселева и др., 1983). Як
радіоактивний попередник синтезу DNA (S-період) застосовували
3Н-тимідин.

Біохімічні дослідження плазми крові і скелетних м’язів. Вміст глюкози в
плазмі визначали орто-толуїдиновим методом, використовуючи стандартний
набір реактивів (НПО «Биолар»). Одночасно вимірювали вміст лактату
ферментативним способом (Комаров и др., 1976).

Концентрацію АТР у м’язах визначали методом Лампрехта, Тротшольда
(Ещенко, 1982). Вміст лактату в м’язовій тканині в цих же гомогенатах
оцінювали ферментативним методом Хохорста (Ещенко, 1982). Сумарний вміст
ліпідів у червоних і білих м’язах визначали фотометрично за реакцією з
фосфованілиновим реагентом (Кучеренко, Васильев, 1985). Використовували
стандартний набір реактивів фірми «Lacheme» (Чехія). Рівень міоглобіну в
м’язах оцінювали фотометрично за методикою Рейнафарье (Reynafarіe,
1963). Кількісне визначення вмісту цитохромів (aa3, b, c, c1) проводили
за методом Чанса в модифікації Євдотієнко, Мохової (1967). Активність
аланінамінотрансферази (АлАТ) у м’язах оцінювали
динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля із застосуванням
набору реактивів («Sіmco Ltd» Україна).

Вміст води в м’язах оцінювали шляхом зважування на аналітичних вагах
WP-11 (Польща) свіжих і висушених до постійної ваги при 105оС зразків
тканини. Органічну речовину після висушування проб розчиняли в
концентрованій HNO3. У розчинах визначали концентрації Na+, K+ і Ca2+.
Виміри здійснювали на полуменевому фотометрі ПАЖ-3 з використанням
суміші пропан-повітря (Na+, K+) і ацетилен-повітря (Ca2+).

Загальні фізіологічні методи. У ряді експериментів визначали
інтенсивність споживання кисню рибами, частоту дихання і серцевих
скорочень, критичні і граничні концентрації кисню. Споживання кисню
оцінювали респірометрично. Вміст кисню контролювали за допомогою
оксиметра АК-04 (НПО «Сигма») і потенціометра КСП-4. Критичні і граничні
концентрації кисню визначали за методикою перерваного потоку [Кляшторин,
1977]. Пневмограму і пульсограму реєстрували з імплантованих у тіло риб
електродів. Запис робили за допомогою підсилювача ОР-925 («Radelkіs»,
Угорщина) і потенціометра КСП-4.

Розділ 4. Фізіологічні аспекти дії уретанової анестезії на організм
морських риб. Визначення ефективних концентрацій уретану

Цей етап передував основній частині роботи. Його необхідність була
спричинена тим, що під час визначення низки показників здійснювалась
активна маніпуляція з тваринами, що приводило до виникнення стану
handlіng стресу. У дослідницькій і рибоводній практиці застосовуються
десятки анестетиків. Однак, багато з них справляють очевидний
асфіксичний ефект, а фізіологічні аспекти дії інших досліджені слабко. У
представленій роботі як анестезуючий препарат обрано уретан. Він м’яко
впливає на респіраторний і серцево-судинний центри. Ефект після дії
уретану не виражений, оскільки кінцевими продуктами є СО2, NH3, H2O
(Veenstra et al., 1987; Белокопытин, 1993). Однак, цих відомостей не
вистачає для практичного застосування зазначеного препарату, оскільки
відсутня інформація про стадії наркотичного стану та його вплив на
процеси тканинного дихання. Дослідження показали, що уретанова анестезія
викликає у риб розвиток 3-х послідовних станів: спокою, збудження і
глибокого наркозу.

Період спокою зберігався тривалий час (до 1,5 години) і спостерігався в
надто широкому діапазоні концентрацій уретану у воді, що знижувало
імовірність передозування наркотичного агента. В особин зникала реакція
переляку, а фізіологічний стан носив стійкий характер. Споживання кисню,
дихальна і серцева ритміка, число еритроцитів і концентрація гемоглобіну
в крові риб зберігалися на рівні контрольних величин. Посилення
анаеробних процесів не відзначали, про що свідчили постійні значення
PvО2, вміст глюкози і лактату в плазмі крові.

Період збудження збігався з втратою координації рухів, деякою
інтенсифікацією обмінних процесів і ростом варіабельності значень
контрольованих показників, зокрема, дихальної і серцевої ритміки.

При глибокому наркозі спостерігалися припинення рухової активності,
прогресуюче зниження частоти дихання і серцевих скорочень, розвиток
тканинної гіпоксії. Споживання кисню особинами зменшувалося більш, ніж у
3 рази, а PvО2 – у 2 рази (p<0,001). Одночасно відбувалося зростання концентрації лактату і глюкози в плазмі крові на 60-65 % (p<0,001). Початкова стадія уретанової анестезії (період спокою) була обрана надалі як оптимальна для роботи. На цій підставі були визначені ефективні концентрації анестетика для 6-ти пелагічних і 6-ти донних видів морських риб, а також вивчена їх залежність від температури, солоності і концентрації кисню в морській воді. Ці розробки були використані при виконанні основної частини дисертаційної роботи. Розділ 5. Порівняльне вивчення кисневих режимів м'язової тканини морських риб різної природної рухливості Порівняльні дослідження виконані на 10-ти видах морських риб, які відрізняються толерантністю до температури, солоності, вмісту О2 у воді, а також природною рухливістю. В схожих умовах вмісту: щільність посадки - 50-80 л на особину, фотоперіод - 12 год день : 12 год ніч, температура води – 15+1оС, добовий харчовий раціон - 6-7% від маси тіла, найбільш радикальні відмінності були виявлені між пелагічними і донними видами. Кисневий режим скелетних м'язів. Напруження кисню в артеріальній і венозній крові пелагічних риб було на 78,3-212,5 % (p<0,001) вищим, ніж у донних (табл. 1). Артеріо-венозна різниця за PО2 майже в 2 рази (p<0,001) перевищувала аналогічні значення, зареєстровані для малорухливих риб. Вищі значення PО2 були відзначені і для обох типів скелетних м'язів (PrО2 і PwО2). Таблиця 1 Напруження кисню в крові і м'язах риб різної рухливості ) Кров М'язи P(c-m)O2 n PaO2 PvO2 PcO2 n PrO2 PwO2 PmO2 Сингіль 16 110,8+3,3 47,5+2,0 68,6+1,2 5 29,2+0,2 7,49+0,30 10,3+0,26 56,4+1,9 Гостроніс 10 115,2+5,0 40,4+2,2 65,3+2,4 5 26,7+0,6 6,63+0,29 9,04+0,29 52,9+3,3 Піленгас 12 98,4+5,4 34,4+1,8 55,7+2,2 5 28,3+0,5 8,44+0,17 11,1+0,19 46,5+3,8 Ставрида 16 126,3+3,6 37,7+1,1 67,3+1,6 5 33,4+0,9 8,38+0,08 12,3+0,17 55,8+3,9 Кругляк 14 49,9+2,4 18,6+0,6 29,0+0,8 5 16,6+0,5 5,02+0,32 5,65+0,30 25,3+1,1 Мартовик 14 55,2+1,9 17,2+0,7 29,9+0,9 5 13,0+0,1 4,68+0,12 5,09+0,11 26,2+1,6 Глоса 16 82,4+1,9 32,1+1,1 49,9+0,8 5 22,6+0,5 6,54+0,14 7,91+0,13 42,1+0,6 Скорпена 11 50,2+3,0 15,2+0,8 26,9+1,1 5 11,3+0,2 4,91+0,22 5,09+0,21 22,8+1,8 Розрахунок середньокапілярного (PcО2) і середньом'язового (PmО2) напруження кисню дозволив визначити існуючий градієнт PО2 між кров'ю і скелетними м'язами (Pm-сО2). Значення цього показника у активних видів у 1,8-2,5 рази перевищували (p<0,001) аналогічні величини у донних риб (табл. 1). Це означає, що дифузія кисню в їх м'язовій тканині відбувалася з більшою швидкістю. складала 11-25 %. Діапазон зміни PO2 у білих м'язах збігався у всіх досліджуваних риб – 0-20 гПа. Однак, у порівнянні з донними видами, максимуми на гістограмах розподілу у пелагічних риб знаходився на 2-4 гПа праворуч. У 39,0-67,0 % білих м'язів пелагічних риб PO2 не перевищувало 8 гПа. У донних видів ця величина була значно вища і досягала 81,0-84,0 %. Масоперенос кисню в м'язовій тканині пелагічних риб був у 4,1-12,4 рази вищий (p<0,001) аналогічних значень, зареєстрованих для донних риб, і становив відповідно 0,3-0,7 і 0,5-1,0 мл О2 хв-1 100-1 г для венозної й артеріальної крові. Розходження були обумовлені більш високими значеннями об'ємної швидкості тканинного кровотоку – 14-20 і 3-6 мл хв-1 100-1 г для червоних і білих м'язів, відповідно, і підвищеною кисневою ємністю крові – 14-20 мл л-1 (артеріальна кров), у рухливих видів. Розрахунок дифузійної здатності м'язової тканини (DmО2) показав, що у активних видів вона була на 89,7-338,5 % вища (p<0,001), ніж у донних риб і складала 33-55 мл O2 хв-1100 г-1 гПа-1 (10-4). Це обумовлювалося високою часткою червоної мускулатури в скелетних м'язах пелагічних риб, підвищеною щільністю капілярної мережі, високим вмістом ліпідів і міоглобіну в м'язовій тканині, а також низьким рівнем її гідратації. Сполучення цих властивостей забезпечувало активним видам риб зростання площі дифузійної поверхні, зниження товщини дифузійного шару і полегшення дифузії кисню в м'язовій тканині. Молекулярні системи утилізації кисню. Утилізація кисню м'язовою тканиною у пелагічних риб у стані спокою склала 26,0-28,4 %, що відповідає 0,146-0,271 мл О2 хв-1 100 г-1. У донних риб % утилізації кисню м'язовою тканиною був вищий – 34,7-42,8 %, але абсолютні значення швидкості споживання кисню не перевищували 0,050 мл О2 хв-1 100 г-1, що відбиває нижчу інтенсивність енергетичного обміну. Ефективність утилізації кисню у активних видів була вища. Це відбивають більш низькі значення гемодинамічного еквівалента (HE). Розходження за даним показником досягали 45 % (p<0,001). М'язи пелагічних риб відрізнялися підвищеним рівнем цитохромів у порівнянні з донними видами. Розходження досягали 2,6-9,2 разів (p<0,001). Максимум відзначали у високорухливої ставриди – 96,6+7,0 і 7,1+0,7 нмоль г-1, відповідно для червоних і білих м'язів, а мінімум у донного мартовика – 10,5+1,4 і 1,2+0,2 нмоль г-1. Принципові відмінності між цими групами риб відзначали в організації цитохромних систем. У донних видів вміст цитохрому aa3 у м'язах обох типів на 23,9-58,7 % (p<0,05) перевищував рівень цитохромів b, c, c1. Відношення b/aa3, c1/aa3 і c/aa3 були менше одиниці, тобто для м'язової тканини донних видів була характерна нескомпенсована стехіометрія цитохромів. У активних риб, навпаки, стехіометрія цитохромів була близька до стехіометрії цитохромів наземних тварин. Рівень цитохрому aa3 у червоних і білих м'язах був мінімальний. Найбільш показові розходження між донними і пелагічними видами по відношенню b/aa3 – у 2,4-3,1 рази (p<0,001). Концентрація АТФ у білих м'язах пелагічних риб була на 22-140 % (p<0,05-0,001) вища, ніж у донних видів. Для червоних м'язів таких розходжень не встановлено. Близькі результати отримані й у відношенні концентрації лактату в тканині. Величина рН артеріальної і венозної крові у малоактивних видів була нижча, ніж у пелагічних риб. Слід особливу увагу звернути на артеріо-венозну різницю (рНa-v). У донних риб вона була в 2,3-4,2 рази вища (p<0,001). Це, очевидно, відбиває більш високий відсотковий вміст білих м'язів у тілі донних риб, рівень анаеробних процесів у яких вищий. Молекулярні системи транспорту кисню. Киснева ємність крові (СmaxО2) у рухливих видів на 38,3-98,9 % (p<0,001) перевищувала значення, відзначені для донних риб. Це обумовлювалось розходженнями в концентрації гемоглобіну і числі еритроцитів в циркулюючій крові. MCH мав обернену залежність. У малорухливих видів він був на 30-45 % вищий (p<0,01-0,001). Максимальну спорідненість крові до кисню відзначали у малоактивних риб. Величина P50 при PCO2 – 4 гПа і температурі 15oС дорівнювала 15,7-19,4 гПа. У пелагічних видів вона була на 25,8-113,6 % (p<0,001) вища: 24,4-33,5 гПа. Коефіцієнт Хілла (n), що відбиває характер взаємодії субодиниць у молекулі гемоглобіну при її оксигенації, у пелагічних риб на 16,1-56,8 % (p<0,001) перевищував значення, зареєстровані для донних видів. Зміни PСО2 інкубаційного середовища в діапазоні 4,0-10,7 гПа (15oС) викликало у рухливих риб значне збільшення P50 (ефект Бора – r). Максимальний зсув кривих оксигенації відзначали у активної ставриди (-0,53+0,02). У донних видів він був менш виражений. Слід зазначити, що гемоглобіни донних риб функціонували в середовищі з більш низькими значеннями pН. Це, очевидно, і визначало їхню низьку чутливість до зазначеного чинника. Відомо, що ATP і GTP у риб є основними регуляторами спорідненості гемоглобіну до кисню (Wells et al., 1997; Val, 1999). У даній роботі показано, що концентрації нуклеотидтрифосфатів (NTP) в еритроцитах донних і пелагічних риб були близькими. Однак, концентрація Mg2+ в клітинах червоної крові донних видів на 38-125 % (p<0,01-0,001) перевищувала значення, відзначені для активних риб. Mg2+ є конкурентом гемоглобіну за ATP (Houston, Koss, 1984). Відношення Mg2+/NTP в еритроцитах у малорухливих видів було в 2,5-4,8 рази вище (р<0,001). Це означає, що участь NTP у корекції спорідненості крові до кисню у пелагічних риб було більш виражене. Експеримент із гіподинамією. Для уточнення впливу гіподинамії на кисневий режим скелетних м'язів був виконаний експеримент на піленгасі. Досліджувану групу риб утримували протягом 5-ти місяців у сажалках розміром 1 м3 по 5-6 особин на кожну. Умови утримування виключали активне переміщення особин. Контрольна група риб знаходилася в бетонних басейнах, розміром 80х4 м. Її фонову рухову активність не було обмежено. Експозиція – 5-ть місяців. Гіподинамія викликала зниження значень PmО2 на 28,6 % (p<0,001). У досліджуваної групи вони становили 20,0+0,7 гПа. В розподілі PmО2 відзначали зсув максимуму ліворуч на 7-8 гПа (рис. 2). Частка гіпоксичних зон (менше 8 гПа) у м'язовій тканині зростала в 2 рази і досягала 10 %. Подібні зміни відбувалися в білих м'язах. Щільність капілярних одиниць у м'язах піленгаса протягом експерименту зменшувалася на 20-28 % (p<0,001). Обмеження рухової активності приводило до зниження рівня гемоглобіну в крові з 88,3+1,3 до 77,1+2,0 г л-1 (p<0,001). Показник P50 зменшувався на 22,0 % (p<0,01), що відбивало збільшення спорідненості крові до кисню. Концентрація NTP в еритроцитах залишалася на рівні контрольних значень. Чутливість гемоглобіну піленгаса до pН (ефект Бора) знижувалася на 25,6 % (p<0,01). Сумарний вміст цитохромів у м'язовій тканині піленгаса в ході експерименту зменшувався на 42,0-58,7 % (p<0,001) (рис. 3). Зміни торкалися червоних і білих м'язів. Найбільшого зниження зазнавав цитохром b, тобто дихальний ланцюг мітохондрій за характером організації наближався до нескомпенсованого типу. Таким чином, результати порівняльного аналізу й експериментальних досліджень показали, що зменшення рухової активності риб призводить до зниження тканинного PO2, збільшення числа гіпоксичних зон у тканині і зниження рН внутрішнього середовища організму. Це супроводжується функціональними і структурними перебудовами молекулярних систем транспорту й утилізації О2, які обмежують їхню потужність, знижують їх чутливість до pН і забезпечують адаптацію до умов низького PO2 у тканині. Розділ 6. Експериментальна гіпоксія і кисневі режими м'язової тканини морських риб Для виявлення функціональних механізмів корекції кисневого режиму скелетних м'язів морських риб поміщали в умови експериментальної гіпоксії. Використовували окремих представників пелагічної і донної іхтіофауни. Пелагічний вид. Експерименти виконані на сингілі. Контрольна група риб утримувалась при PO2 у воді 158-162 гПа (8,0-8,5 мг л-1). Досліджувані групи – при 85 гПа, 55 гПа і 35 гПа. Експозиція – 15 діб. Відбір проб здійснювали на 1-2-у, 10-у і 15-у добу дослідження. Температура води – 15+1оС. Зниження PO2 у воді викликало зменшення PaО2 на 22,4 %, 47,1 % і 63,8 % (p<0,001) відповідно при 85, 55 і 35 гПа. У м'язах помітне зниження PmО2 відзначали, лише починаючи з 55 гПа. У білих м'язах воно склало 15,1 % (p< 0,01), а в червоних – 28,5 % (p<0,001). При 35 гПа зміни були ще більш виражені. Утримування особин при 55 гПа протягом 15-ти діб супроводжувалося майже повною компенсацією відзначених вище змін. При 35 гПа цього не відмічали. Загибель риби при 35 гПа на 3-ю добу дослідження становила 100 %. Аналіз стану кефалей, утримуваних при 55 гПа, дозволив виявити дві групи процесів, які забезпечують спрямовану корекцію тканинного PO2. На початку (1-2 доба) відзначалося збільшення щільності функціонуючої капілярної мережі (Nc), підвищення швидкості тканинного кровотоку (Q) і випорожнення кров'яних депо (вага селезінки зменшувалась на 34,1 %, p<0,001). Це підвищувало кисневу ємність крові (CaО2) і в остаточному підсумку величину масопереносу кисню артеріальною кров'ю (VaО2) (термінова адаптація). Потім (10-15 доба) відбувалися кількісні перебудови на рівні гемоглобінової системи, що приводять до збільшення спорідненості крові до O2 і зниження її чутливості до рН, а також адаптація дихального ланцюга мітохондрій м'язів до умов низького PO2 (довгострокова адаптація). У гемоглобіновій системі кефалей було виявлено 5 компонентів: 3 основних і 2 мінорних. В умовах гіпоксії вміст 3-го компонента (Rf – 0,198+0,005) підвищувався на 40,3% (p<0,001). При цьому частка 4-го знижувалася на 21,8 % (p<0,001). Третій компонент мав більш високу спорідненість до O2 і менш виражений ефект Бора (P50: 13 ,7 гПа; r: -0,27), ніж 4-ий (P50: 19 ,5 гПа; r: -0,48). Перебудова повинна була підвищувати спорідненість крові до O2 і знижувати її чутливість до рН, що дійсно мало місце. Рівень NTP в еритроцитах при цьому не зазнавав статистично значущих змін. Загальний рівень цитохромів при адаптації до 55 гПа в червоних м'язах підвищувався на 10,1 % (p<0,01), а в білих – на 15,6 % (p<0,01). При цьому відзначали зміну стехіометрії цитохромів. Індекс b/aa3 наближався до одиниці: 1,74+0,05 (контроль), 1,06+0,06 (55 гПа: 15 доба), тобто дихальний ланцюг за характером організації наближалася до гіпоксичного типу. Донний вид. Експерименти виконані на кругляку. Контрольна група риб утримувалася при PO2 у воді 158-162 гПа (8,0-8,5 мг л-1). Досліджувані групи - при 45 гПа, 25 гПа і 15 гПа. Експозиція – 15 діб. Відбір проб здійснювали на 1-2-у, 10-у і 15-у добу експерименту. Температура води – 15+1оС. Зниження PO2 у воді акваріума, насамперед, торкалося артеріальної крові. Величина PaО2 рівномірно зменшувалася, досягаючи мінімального рівня при 15 гПа. Зміну PvО2 спостерігали, тільки починаючи з 25 гПа. У червоних м'язах (PrО2) вірогідне зменшення значень відзначали при PO2 у середовищі – 25 гПа, а в білих м'язах (PwО2) лише при 15 гПа. Слід зазначити, що при посиленні зовнішньої гіпоксії відбувалося зниження градієнта PO2 між кров'ю і м'язовою тканиною (Pc-mО2). При 15 гПа дифузія кисню в м'язи, очевидно, припинялася зовсім, оскільки Pc-mО2 становив тільки 3,7-4,0 гПа. На відміну від кефалі, в організмі кругляка компенсаційні процеси, спрямовані на утримання вихідної швидкості окисного метаболізму в м'язах, не були виражені. Величини масопереносу О2 артеріальною кров'ю (VaО2), об'ємний тканинний кровотік (Q), споживання О2 м'язами (VmО2) рівномірно знижувались. Єдина реакція була виявлена у бичка на рівні гемоглобінової системи. Гемоглобін був розділений за допомогою електорофорезу в ПААГ на 4 компоненти: два основних (F1 і F2) і два мінорних (M1 і M2). Вміст особин кругляка при 25 гПа супроводжувався спаданням F1 на 26,8 % і зростанням F2 на 41,8 % (p<0,001) (рис. 4). F2 мав більш високу спорідненість до O2 і значні ефекти Бора і Рута (табл. 2). Дані зміни носять явно адаптивний характер і мають два важливі наслідки: зростання спорідненості гемоглобіну до кисню полегшує його насичення в умовах низького РО2 у середовищі; підвищення ж чутливості до рН сприяє розрядці гемоглобіну на тканинному рівні в умовах тканинного ацидозу. Показники n Фракції гемоглобіну F1 F2 P50, гПа (рН 8.3) 5 21.5+1.9 7.74+0.98 n (рН 8.3) 5 2.60+0.09 1.65+0.08 Ефект Бора (рН 8.3?7.5) 5 -0.17+0.03 -0.81+0.09 Ефект Рута, % Необхідно відзначити, що збільшення концентрації лактату в м'язовій тканині бичка спостерігали лише при PO2 у середовищі – 15 гПа. У крові він не виявлявся. Це відбувалося на фоні збільшення активності аланінамінотрансферази на 94,6 % (p<0,01). Зазначений фермент сполучає метаболізм глюкози і глутамату і виключає тим самим нагромадження токсичного лактату (Mommsen et al., 1980; Савина, 1992). Експерименти, виконані іn vіtro на еритроцитах скорпени, показали, що в умовах гіпоксії для клітинних систем донних риб характерно сполучене пригнічення мембранних і метаболічних функцій. Вони зберігали градієнти концентрацій Na+ і K+ на мембрані, а також стабільний рівень АТР у клітині на фоні зниження активностей Na+,K+-АТРази і гексокінази. Еритроцити кефалі цієї властивості не мали. Таким чином, стратегії виживання в умовах зовнішньої гіпоксії у пелагічних і донних риб різні. У перших в організмі розвиваються компенсаційні реакції, спрямовані на підтримку вихідних швидкостей окисного метаболізму в тканинах. Другі мають у своєму розпорядженні молекулярні комплекси, які ефективно функціонують в умовах анаеробіозу, і допускають значне зниження PO2 у тканинах. Розділ 7. Кисневий режим м'язової тканини у морських риб в умовах експериментальної гіпотермії Утримування теплолюбних видів риб при температурах води нижче 5-7оС часто супроводжується розвитком асфіксії. Такий стан нерідко виникає у риб на рибоводних господарствах і є причиною їхньої масової загибелі (Куликова и др., 1986 а,b). Ця реакція в деякій мірі парадоксальна, через те, що спостерігається в умовах, коли кисневі потреби організму знижені, а розчинність його у воді і тканинних середовищах підвищується. Як модельний об'єкт було обрано кефаль-сингіль, у якої розвиток стану асфіксії спостерігається при температурах води нижче 5оС. Контрольна група риб утримувалась при 15+1оС. Досліджувані групи - при 10, 5 і 1-2 оС. Експозиція – 41-46 діб. Відбір проб здійснювали на 1-5-у, 14-16-у і 41-46-у добу експерименту. Аналіз кисневого режиму скелетних м'язів кефалі при температурах нижче 5оС дозволив виявити ряд змін, які у сукупності можна розглядати як стан тканинної гіпоксії. У м'язах відбувалося зменшення PmО2 і спостерігалось збільшення кількості гіпоксичних (менше 8,0 гПа) і аноксичних зон, підвищувалася концентрація лактату. У крові відзначали зниження венозного PvО2 і рН, збільшення артеріо-венозної різниці за рН і збільшення концентрації лактату. Причини, що лежать в основі розвитку цього стану, визначалися процесами, що відбуваються на рівні кровоносних судин і циркулюючих еритроцитів. Особливості мікроциркуляції. При температурах 5 і 1-2оС відбувалося значне зниження щільності функціонуючих капілярів у м'язовій тканині. Це як наслідок збільшувало товщину дифузійного шару (RK) і зменшувало площу дифузійної поверхні (S). У білих м'язах зміни були більш виражені, ніж у червоних. Дифузійна здатність м'язів (DmО2) при цьому знижувалася майже в 2 рази (p<0,001). Порівняльні експерименти, виконані на камсі і тюльці, показали, що капілярна мережа м'язів теплолюбної камси при температурі води 5оС втрачала здатність активно реагувати на функціональні навантаження (гіпоксія). При цьому в м'язовій тканині підвищувався рівень Ca2+ у 2,1-2,2 рази (p<0,001). У холодолюбної тюльки зростання Ca2+ було незначне, а судинна мережа реагувала на зміну РО2 у середовищі. " 8 : >

@

®

A

Ae

I

I

(

*

P

c

O

’ ? ? I ? TH a ae ae ? o o oe th

»

$

*

.

0

2

4

8

:

P

h

j

|

~

?

?

?

?

1/4

3/4

O

oe

o

ue

th

– –&–(–?–?™I›?›r?xcnYV?oe¬o¬oooooooooooooccccooocooooo

occcccccccccccccccccccoc

A

»

$

?

3/4

A

3/4

A

?

-язові клітини активує базальний тонус судин (Шуба, Кочемасова, 1988).
На цьому фоні повинна розвиватися неконтрольована вазоконстрикторна
реакція, що, очевидно, дійсно мало місце.

Еритроцити. Іншим негативним наслідком гіпотермії з’явився високий
тепловий ефект реакції оксигенації гемоглобіну, що спостерігався при
наближенні до температури 5оС. Теплота оксигенації, розрахована для
показника Р50 за рівнянням Вант-Гоффа, для інтервалу температур 5-10оС
склала -5,36 ккал моль-1 O2, тоді як для 10-15оС – лише -1,24 ккал
моль-1 O2. Це приводило до істотного підвищення спорідненості
гемоглобіну до О2 в області низьких температур і супроводжувалося
значним зсувом кривих оксигенації ліворуч. Кров, яка має високу
спорідненість до О2, утрудняє розрядку оксигемоглобіну на тканинному
рівні і приводить до зниження РО2 у тканині. Цю реакцію також можна
розглядати як одну з причин, що призводить до розвитку тканинної
гіпоксії в м’язах риб при гіпотермії.

Реакції компенсації. В організмі кефалей, утримуваних при 5оС, були
зареєстровані зміни, компенсуючі негативний вплив гіпотермії. У 1-і дні
досліду відзначали збільшення кисневої ємності крові, що було пов’язано
з підвищенням числа еритроцитів у крові. Це відбувалося на фоні
зменшення ваги селезінки. Селезінка у риб є основним, депонуючим кров,
органом (Wells, Weber, 1990). Це дозволяє дійти висновку, що збільшення
кількості еритроцитів у крові було обумовлено викидом клітинної маси, що
знаходиться в селезінці, в кровотік. Потім відбувалося зниження
спорідненості гемоглобіну до О2. Воно визначалося підвищенням рівня NTP
в еритроцитах. NTP є основним чинником еритроцитарної корекції
спорідненості гемоглобіну до О2 у риб (Wells et al., 1997; Val, 1999).

Гіпотермія спричинювала і ряд адаптивних зрушень у скелетних м’язах риб.
У кефалей спостерігали збільшення тканинної концентрації міоглобіну,
ліпідів і сумарних цитохромів, що повинно полегшувати дифузію О2.
Дихальний ланцюг мітохондрій при цьому набував нескомпенсований
характер. Відношення b/aa3 знижувалося. Це відбивало процес його
адаптації до низького РО2 у м’язах. Корекція положення кривої
оксигенації гемоглобіну і спрямована зміна тканинного рівня міоглобіну,
ліпідів і цитохромів сприяли частковому відновленню РО2 у м’язах кефалі
в умовах гіпотермії. При 1-2оС компенсаційні процеси не були виражені.
Загибель риб на 15-у добу експерименту становила 100 %.

Таким чином, в основі розвитку стану тканинної гіпоксії м’язів у риб в
умовах гіпотермії лежать два процеси: надмірна вазоконстрикція судин
мікроциркуляторного русла; надто високий тепловий ефект реакції
оксигенації гемоглобіну в області низьких температур.

Розділ 8. Кисневий режим м’язової тканини у стено- і евригалінних
морських риб в умовах експериментальної гіпоосмії

Робота виконана на стеногалінному морському виді бичку-кругляші і
евригалінному бичку-мартовику. Контрольні групи риб утримували при 12-14
о/оо. Досліджувані групи знаходилися протягом 44-45 діб при 4,8-5,6
о/оо. Оцінка стану особин, відбір проб крові і тканин здійснювали на
1-5, 14-16 і 44-45 добу експерименту. Температура води – 15+1оС.

Стеногалінний вид. При зниженні солоності води в скелетних м’язах
кругляша підсилювалися анаеробні процеси. Це знайшло відображення в
зниженні середньом’язового PmО2, росту числа гіпоксичних (менш 8 гПа) і
аноксичних зон на фоні збільшення концентрації лактату в крові і м’язах.
У венозній крові відзначали зменшення PvО2, рН і зростання
артеріо-венозної різниці за рН.

Зміни відбувалися на фоні гідратації плазми крові. Ця реакція мала два
важливих наслідки: гідратацію м’язової тканини і свелінг (набрякання)
еритроцитів. Інші показники, що могли б вплинути на кисневий режим
тканини, не зазнавали істотних змін.

Відомо, що дифузія кисню в гідратованій цитоплазмі клітин протікає в
декілька разів менш ефективно (Londravіlle, Sіdell, 1990). Через те цей
фактор повинний робити суттєвий внесок у розвиток тканинної гіпоксії.
Оцінка дифузійної здатності м’язів (DmО2) кругляша в умовах гіпоосмії
підтвердила таке положення. Значення (DmО2) знижувалися більш ніж на 30%
(p<0,001). Площа дифузійної поверхні, товщина дифузійного шару, концентрації міоглобіну і ліпідів у м'язах при цьому не змінювалися. Гідратація периферічного русла крові викликала у кругляша не тільки свелінг, а й лізис частини еритроцитів. Про це свідчили два факти: поява вільного гемоглобіну в плазмі і зниження числа циркулюючих клітин червоної крові. На мембранах еритроцитів у цей період відзначалася диссипація іонних градієнтів і стійке зниження активності Na+, K+-АТФази, що свідчить про відсутність активних процесів осморегуляції в клітинах. Лізис еритроцитів приводив в остаточному підсумку до зниження CaО2 і при збереженні величини Q обмежував його доставку до скелетних м'язів. MCH при цьому не зазнавало істотних змін. Евригалінний вид. У порівнянні з кругляшом, зниження солоності середовища в умовах аналогічного експерименту помітно не впливало на кисневий режим м'язів евригалінного мартовика. Усі контрольовані показники (РmО2, CaО2, Q,, VaО2,, VmО2) залишалися на рівні контрольних значень. У м'язах зберігався також вихідний рівень окисних процесів. У перші 5 діб досліду відзначали короткочасну гідратацію м'язів риб. Вміст води підвищувався на 6-7 % (p<0,05), але на 14-16-у добу ці зміни цілком компенсувалися. Рівень же води в крові мартовика збільшувався на 8,8-11,3 % (p<0,001) і зберігався протягом усього періоду спостережень. Концентрація Na+ у плазмі знижувалася на 18,4-21,4 % (p<0,001). Однак, це помітно не впливало на еритроцитарну масу. Гематокрит, MCV і MCHC протягом досліду не змінювалися. Це досягалося частковою втратою клітинами K+. Концентрація K+ в еритроцитах знижувалася на 16,3-19,6 % (p<0,001), а концентрація Na+ залишалася на рівні контрольних величин, що свідчило про активну осморегуляцію. Ознак внутрішньосудинного лізису еритроцитів у цього виду не спостерігали. Еритроцити мартовика відрізнялися також підвищеною стійкістю до гіпотонічного шоку і високоефективною Na+, K+-ATPазою. У порівнянні з кругляшом розходження в активності ферменту склали 18,8 % (p<0,001). Отже, гіпоосмія викликає у стеногалінних риб зменшення РО2 і збільшення кількості гіпоксичних зон у м'язах на фоні посилення анаеробних процесів. Це пов'язано з гідратацією м'язової тканини і, як наслідок, погіршенням її дифузійних характеристик. Евригалінні види здатні підтримувати ізоосмотичність клітинних середовищ при плазменній гіпоосмії. Їхні клітини мають підвищену осмотичну стійкість і більш ефективні Na+, K+-ATPази. Стеногалінні види не здатні до активної осморегуляції на клітинному рівні. Розділ 9. Кисневий режим скелетних м'язів морських риб протягом річного циклу Сезонна динаміка кисневого гомеостазу скелетних м'язів вивчена у 3-х видів морських риб: кефалі-сингіля, камбали-глоси і бичка-кругляка. Рибу відловлювали протягом року в районах Севастопольської, Козачої бухт (м. Севастополь) і Керченської протоки. В акваріумах, де після вилову знаходилася риба, зберігалися природна протока води і фотоперіод. У всіх досліджених видів риб протягом року величина масопереносу О2 кров'ю (VaО2), об'ємний тканинний кровотік (Q), споживання О2 м'язами (VmО2) і їхні дифузійні характеристики (DmО2) позитивно корелювали з температурою води. Це обумовлювалось зміною щільності капілярної мережі м'язів (Nc). Динаміка ж вмісту води, ліпідів і цитохромів у м'язах мала виражену видову специфіку. Протягом року в скелетних м'язах досліджуваних видів риб періодично підсилювалися анаеробні процеси. Вони розвивалися в переднерестовий період і спостерігалися у сингіля і кругляка влітку, а у глоси взимку. Це доводить наступна група фактів: зниження PmО2; збільшення кількості гіпоксичних (менш 8 гПа) і аноксичних зон у м'язовій тканині; зниження PvО2; збільшення артеріо-венозної різниці за рН; підвищення рівня лактату в білих і червоних м'язах. Причини розвитку цього стану були пов'язані з процесами, що відбуваються в переднерестовий період у циркулюючій крові риб: зменшення концентрації гемоглобіну і числа еритроцитів, зростання вмісту метгемоглобіну. Яких-небудь інших негативних реакцій на рівні м'язової тканини, судин мікроциркуляторного русла відзначено не було. Ці зміни в остаточному підсумку знижували концентрацію О2 в артеріальній крові (СаО2) і при збереженні значень об'ємного тканинного кровотоку обмежували величину його масопереносу до м'язів. Ці зміни в організмі риб можуть бути повязані з перерозподілом пластичних ресурсів (насамперед, білкових) на користь генеративних тканин, характерних для переднерестових станів. Вони відбиваються на багатьох системах органів і циркулюючій крові, зокрема. Білкова недостатність завжди сполучається з більш-менш вираженою анемією у риб (Сорвачев, 1982; Svobodova et al., 1998). Зниження концентрації гемоглобіну і числа еритроцитів у крові в переднерестовий період було відзначено в роботах багатьох авторів (Raіzada, Sіngh, 1981; Маслова, Тавровская, 1991; Ranzanі-Paіva, 1995). Штучна стимуляція нересту (ін'єкції витяжок гіпофіза, гонадотропіну, естрогену, релізинг-факторів) також викликала подібні зміни (Ochіaі et al., 1975; Hіlge, Klіnger, 1978). нізмів. Декілька пізніше він був виявлений у представників прісноводної іхтіофауни й амфібій (Маслова, Тавровская, 1991; Ranzanі-Paіva, 1995). Нерегулярність еритропоезу і приуроченість його до післянерестового періоду, очевидно, є основним чинником розвитку стану переднерестової гіпоксії. Таким чином, активний еритропоез у риб відбувається лише протягом 2-3 місяців на рік і відноситься до післянерестового періоду. Решту часу в системі крові переважають деструктивні процеси. Вони викликають розвиток анемії і метгемоглобинемії під час переднерестового періоду і обмежують доставку О2 до тканин. Розділ 10. Кисневий режим скелетних м'язів морських риб і принципи його функціональної корекції Розділ є одним із завершальних етапів роботи. Тут наводиться порівняльна оцінка кисневих режимів скелетних м'язів у вищих і нижчих (риби) хребетних. Аналізуються механізми, які лежать в основі розвитку тканинної гіпоксії, а також процеси, що компенсують розвиток цього стану. Порівняльно-фізіологічні аспекти. При характеристиці кисневих режимів тканин звертають увагу на дві групи параметрів: напруження кисню в артеріальній (PaО2), венозній крові (PvО2) і тканинних структурах (PmО2); швидкості транспорту кисню кров'ю (VaО2, VvО2) і утилізації його тканинами (VmО2). Перша група параметрів – відповідальна за швидкості дифузії кисню в тканинних структурах, друга – за величини PO2 у крові і тканинах. Порівняльна оцінка показала, що величини PaО2 і PvО2 у ссавців і пелагічних риб виявилися близькими (табл. 4). Незважаючи на збіг PaО2 і PvО2, РO2 у м'язах (PmО2) риб було більш, ніж у 3 рази нижчим. У донних видів, порівняно зі ссавцями, розходження досягали 5-6 разів. Аналогічні дані отримані і при зіставленні PmО2 риб з рептиліями, амфібіями і птахами. Низьке PmО2 у риб може бути зумовлено: високою швидкістю утилізації кисню м'язами (VmО2) або низькою дифузійною здатністю гемато-паренхиматозного бар'єра (DmО2). Величини масопереносу й утилізації О2 (VaО2,, VmО2) у м'язах риб були порівнянні, або нижчі, ніж у ссавців (табл. 4). Тому 1-а причина, яка обумовлює зниження тканинного PO2, повинна бути виключена з розгляду. Таблиця 4 Напруга, масоперенос і утилізація кисню у кістякових м'язах різних груп хребетний тварин (стан спокою) Види організмів PaO2, гПа PvO2, гПа PmO2, гПа VaO2, мл О2 хв-1 100-1 г VmO2, мл О2 хв -1 100-1 г DmO2, мл О2 хв -1 100-1 г гПа-1 Ссавці Людина 120 53 36.2+1.9 0.8-1.0 0.257 0.010 Собака 122.3 53.5 36.4+1.6 - - - Кролик 115.7+2.7 47.9+1.6 38.3+6.9 7.0-7.4 2.30+0.31 0.070+0.008 Кішка 121.3-143.4 52.1 40.3-47.6 0.5-1.0 0.3-0.8 0.013-0.020 Пацюка - - 38.8+1.5 - - - Афаліна 95.5-113.0 43.9-49.2 53.2+6.9 1.7-2.4 0.72-0.90 0.057-0.071 Костисті риби (пелагічни) Форель 90-100 45-47 - - - - Тунці 90-115 - - - - - Сингіль 110.8+3.3 47.5+2.0 10.3+0.26 0.556+0.013 0.146+0.012 0.00349+0.00012 Гостроніс 115.2+5.0 40.4+2.2 9.04+0.29 0.502+0.016 0.146+0.011 0.00333+0.00020 Піленгас 98.4+5.4 34.4+1.8 11.1+0.19 0.656+0.022 0.187+0.016 0.00444+0.00055 Ставрида 126.3+3.6 37.7+1.1 12.3+0.17 0.989+0.020 0.271+0.012 0.00545+0.00087 Низькі дифузійні характеристики гемато-паренхіматозного бар'єра є більш ймовірним з'ясуванням виявленого феномена. Це відбиває ряд фактів, отриманих у представленій роботі. Градієнт PO2 між кров'ю і м'язами у риб був на 55-70 % вищий, ніж у ссавців, що показує напружений характер дифузії газу в їхніх тканинах. Дифузійна здатність м'язів риб (DmО2) була в 2-21 разів нижча (табл. 4). Величина гемодинамічного еквівалента (HE) у риб, навпаки, виявилася в 2-8 разів вища. Це означає, що на витяг адекватного об'єму О2 рибам був потрібний більший об'єм крові. Механізми розвитку тканинної гіпоксії. Низька дифузійна здатність м'язової тканини риб є основною причиною зниження значень тканинного РО2, нестійкості і малої ефективності утилізації О2. Це робить її чутливою до багатьох факторів середовища і станів організму. Аналіз кисневого режиму м'язів риб дозволив визначити групу процесів, відповідальних за зниження тканинного РО2. Артеріальна гіпоксемія була відзначена у риб не тільки в умовах зовнішньої гіпоксії, а й гіподинамії. Обмеження рухливості погіршує газообмін у зябровій порожнині, особливо у активних видів, які часто використовують таранний тип вентиляції. Низька рухливість припускає тривале перебування організму в тому ж самому об’ємі води. Відомо, що дифузія О2 у воді обмежена. При відсутності активного перемішування рівень його швидко знижується. Існування в таких умовах фактично відповідає хронічним формам респіраторної гіпоксії і призводить до зниження РaО2. Випадки анемії були описані у риб у переднерестовий період і в умовах гіпоосмії. В обох випадках вони визначалися зниженням числа еритроцитів у крові. Переднерестова анемія була обумовлена старінням еритроцитарної маси внаслідок нерегулярності еритропоетичних процесів у кровотворній тканині. Вона доповнювалася розвитком метгемоглобинемії. В умовах гіпоосмії спостерігали свелінг і наступний лізис частини циркулюючих еритроцитів. Гіпоосмія морського середовища супроводжувалася гідратацією м'язової тканини риб, особливо у стеногалінних видів. Це явище періодично спостерігалось й протягом річного циклу. Воно знижувало дифузійну здатність м'язів відносно О2 і приводила до зменшення тканинного РО2. Тепловий ефект реакції оксигенації гемоглобіну у теплолюбних риб в умовах гіпотермії підвищувався. Це зумовлювалось зміною характеру взаємодії білка з внутрішньоклітинним мікрооточенням і приводило до надмірного росту спорідненості крові до О2. Останнє ускладнювало розрядку оксигемоглобіну і супроводжувалося зниженням тканинного РО2. В умовах гіпотермії судини м'язів теплолюбних риб втрачали здатність активно реагувати на функціональні навантаження, що було пов'язано з підвищенням вмісту Ca2+ у м'язовій тканині. Це приводило до неконтрольованої вазоконстрикції, зниження щільності капілярної мережі, росту дифузійних просторів і зменшення тканинного РО2. Механізми компенсації тканинної гіпоксії. Аналіз гіпоксичних станів організму риб дозволив виявити групу процесів спрямованої корекції кисневого режиму м'язової тканини. Деякі з них розвивалися у відносно короткий проміжок часу (термінова компенсація), інші спостерігалися через тривалий час (тривала компенсація) (табл. 5). Термінові механізми компенсації: гіперемія, випорожнення кров'яних депо були виявлені, головним чином, у представників пелагічної іхтіофауни. Раніше показано, що резерви депо крові в них майже в 5 разів вищі, ніж у донних видів (Солдатов, 1992). Гіперемію у риб було виявлено в умовах зовнішньої гіпоксії. Однак, вона спостерігалася на фоні збільшення рухової активності особин, які намагались компенсувати дефіцит О2 напірною вентиляцією зябрової порожнини. Відомо, що рух є основним чинником гіперемії скелетної мускулатури у риб (Шошенко и др., 1984; Eggіnton, 1997). Через те зазначену реакцію не слід розглядати як компенсаційну. Таблиця 5 Механізми компенсації гіпоксичних станів скелетних м'язів риб N Процес Функціональне призначення Тип компенсації Умови реалізації 1 Спорожнювання кров'яних депо Ріст кисневої ємності крові Терміновий Гіпоксія, гіпотермія 2 Гіперемія (на тлі росту рухливості) Скорочення дифузійних відстаней. Ріст об'ємного кровотоку Терміновий Гіпоксія 3 Трансформація гетерогенної структури гемоглобіну Підвищення спорідненості крові до кисню. Зміна її чутливості до рН Тривалий Гіподинамія, гіпоксія 4 Змінення рівня NTP у еритроцитах Зміна спорідненості крові до кисню Тривалий Гіпотермія 5 Підвищення рівня термінальної групи цитохромів (аа3) Зв'язування остатніх кількостей О2 у м'язовій тканині Тривалий Гіподинамія, гіпоксія, гіпотермія, сезон 6 Ріст вмісту міоглобіну у червоних м'язах Підвищення дифузійної здатності м'язової тканини Тривалий Гіпотермія 7 Ріст тканинного рівня ліпідів. Зниження рівня гідратації м'язів Підвищення дифузійної здатності м'язової тканини Тривалий Гіпотермія, сезон Процеси, що визначають тривалу компенсацію, розвивалися на рівні циркулюючих еритроцитів і м'язової тканини. В еритроцитах відбувалася спрямована корекція спорідненості гемоглобіну до О2 і чутливості його до рН. Це досягалося шляхом перебудови гетерогенної структури білка або на основі зміни внутрішньоклітинної концентрації NTP. В остаточному підсумку спорідненість до О2 підвищувалась. Зміна чутливості до рН була не однозначна. У донних видів вона зростала, а в пелагічних знижувалась. Перша стратегія полегшувала розрядку оксигемоглобіну на тканинному рівні, а друга зменшувала залежність процесу оксигенації і деоксигенації білка від рН. Вибір стратегії, очевидно, визначався рівнем плазменного ацидозу. У пелагічних риб він був вищий. У м'язах усі зміни були спрямовані на збільшення дифузійної здатності тканини відносно О2: зростання вмісту міоглобіну, ліпідів і зниження рівня її гідратації. Одночасно підвищувався рівень цитохромів, а дихальний ланцюг набував гіпоксичний тип організації, що дозволяло утилізувати слідові кількості О2. Розділ 11. Класифікація гіпоксичних станів у гідробіонтів Необхідність написання цього розділу виникла в зв'язку з неможливістю використовувати діючу систему класифікації гіпоксичних станів (Дудко, Соколов, 2000) для водяних організмів у повному обсязі. Це обумовлено тим, що повітряне і водне середовища принципово відрізняються фізико-хімічними властивостями, що вимагає перегляд екзогенних форм гіпоксії. Гідробіонти використовують інші респіраторні поверхні (зябра) і типи їхньої вентиляції (насосний, таранний). Їх функціональні і молекулярні системи транспорту й утилізації кисню залежать від температури, що не властиво гомойотермним організмам. У ряді водяних організмів відсутні окремі функціональні і молекулярні системи (циркуляторні, респіраторні пігменти), що позначилось на механізмах регулювання кисневих режимів. Інформація, отримана під час виконання роботи, дозволила визначити нові, властиві лише гідробіонтам, види гіпоксичних станів. Це, а також розглянуті вище особливості водного середовища і функціональної організації гідробіонтів дозволили переглянути діючу систему класифікації гіпоксичних станів щодо водяних організмів (рис. 6). Рис. 6. Загальна класифікаційна схема гіпоксичних станів у гідробіонтів В основу пропонованої класифікації покладені уявлення про первинну і вторинну гіпоксію (Колчинская, 1981). Первинні форми гіпоксії (гістотоксичний тип) пов'язуються з нездатністю молекулярних систем тканин утилізувати О2 у кількості, достатньої для повноцінного ресинтеза АТР. Їх 4 основних типи: дефіцит субстратів окиснення, недостатність окиснення, порушення окиснення, роз'єднання окиснення і фосфорилювання є загальними для водяних і наземних організмів. До вторинної гіпоксії віднесені стани, що розвиваються на основі невідповідності доставки О2 величинам його споживання тканнинними структурами. Серед них виділені екзогенні, ендогенні і локомоторні форми. Екзогенна гіпоксія розвивається внаслідок зовнішнього дефіциту О2 при збереженні функціональної повноцінності фізіологічних і молекулярних систем транспорту й утилізації О2. Механізми виникнення екзогенних форм гіпоксії у водному середовищі принципово інші. Швидкість дифузії О2 у воді в 10000 разів менш ефективна, ніж у повітрі. Через те будь-які фактори, які негативно впливають на водообмін чи розчинність О2, можуть призводити до виникнення зовнішньої гіпоксії. На цьому засновано виділення 4-х основних її видів (рис.6). Ендогенні форми вторинної гіпоксії спостерігаються в умовах як зовнішньої нормоксії, так і гіпоксії, і пов'язані зі зміною стану систем кисневого забезпечення організму. Вони супроводжуються зниженням РаО2 або обмеженням масопереносу О2 до тканин і включають респіраторний, циркуляторний і гемічний компоненти. В роботі уперше виділяється і дифузійна гіпоксія. Це обумовлено тим, що хімічний склад (ліпіди, вода, міоглобін) і пов'язана з цим дифузійна здатність тканин гідробіонтів можуть зазнавати радикальних змін. До класифікаційної системи вперше включені також нові види гемічної і циркуляційної (ішемічної) гіпоксії. Локомоторні форми гіпоксії виникають на основі неузгодженості процесів доставки і споживання кисню тканинами, насамперед, скелетними м'язами. Внаслідок виникає кисневий борг, зростає число гіпоксичних і аноксичних зон у тканинах, відбувається переорієнтація тканинного метаболізму вбік посилення анаеробних процесів. Для гідробіонтів, поряд з виділенням гіпоксії навантаження, вперше пропонується розглянути і гіподинамічну гіпоксію, яка розвивається на основі обмеження фонової рухової активності тварин. Даний вид гіпоксії характерний для риб, використовуючих в тій чи іншій мірі таранний (напірний) тип вентиляції респіраторних поверхонь (Bushnell, Jones, 1994). Будь-яке обмеження їх рухливості через функціональну недостатність зябрового насоса буде супроводжуватися розвитком артеріальної гіпоксемії і, як наслідок, гіпоксичного стану. Розділ 12. Еколого-фізіологічні аспекти дослідження У розділі розглядаються функціональні основи існування морських риб у зонах екстремальної гіпоксії. Відзначається, що гіпоксичні акваторії комплексно впливають на організм гідробіонтів, що виявляється в сполученні наступних факторів: екстремальної гіпоксії, гіпотермії, гіпербарії і гіподинамії. Провідним серед них є гострий дефіцит О2, який обмежує енергетичний обмін організму. Результати дослідження дозволяють констатувати, що фізіологічні і молекулярні системи донних видів риб споконвічно орієнтовані на функціонування в умовах зовнішньої гіпоксії, гіпотермії і знижених швидкостей енергетичного обміну. Це дозволяє розглядати цю групу організмів як перспективну в освоєнні зон екстремальної гіпоксії. Організм пелагічних риб функціонально орієнтований на високий рівень метаболічних процесів, але при цьому має у своєму розпорядженні системи, які дозволяють йому адаптуватися до дефіциту О2, низьких температур і обмеженої рухливості. При відповідній спрямованості природного добору можна очікувати, що окремі види високорухливих риб зможуть існувати в умовах гострой гіпоксії. ВИСНОВКИ 1. Для риб, у порівнянні з вищими хребетними, характерна низька дифузійна здатність гемато-паренхіматозного бар'єра при порівнянних швидкостях маспереносу кисню в скелетних м'язах. Це є основною причиною низьких значень тканинного РО2 і малої ефективності утилізації кисню м'язовою тканиною у цієї систематичної групи організмів. 2. Скелетні м'язи риб не мають ефективних механізмів термінової корекції кисневого режиму, що свідчить про його нестійкість. Гіперемія і випорожнення кров'яних депо лише частково забезпечують необхідний адаптаційний ефект. Реакція судинної мережі м'язів спостерігається лише при зростанні рухової активності особин. В інших випадках вона не виражена і не перешкоджає розвитку тканинної гіпоксії. 3. Найбільший внесок у стабілізацію кисневого режиму м'язової тканини робить процес корекції положення кривих оксигенації гемоглобіну. В основі його лежать кількісні зміни гетерогенної структури пігменту і внутрішньоеритроцитарної концентрації NTP. Це доповнюється адаптивними перебудовами цитохромного ланцюга мітохондрій і зміною тканинного вмісту ліпідів. 4. Виявлено ряд нових механізмів, що лежать в основі розвитку стану тканинної гіпоксії у морських риб: гіпоксія гіподинамічного стану; гемічний вид гіпоксії, виявлений в умовах гіпотермії і пов'язаний з високим тепловим ефектом реакції оксигенації гемоглобіну; тканинна гіпоксія, яка виникає в умовах гіпоосмії середовища, що зумовлюється гідратацією скелетних м'язів. Зазначені стани специфічні для морського середовища і визначаються характером дифузії кисню у воді, а також особливостями функціональної організації організму гідробіонтів. Вперше запропоновано класифікацію гіпоксичних станів для водяних організмів. 5. Дифузійна здатність кисню в скелетних м'язах пелагічних риб у 1,9-3,4 рази вища, ніж у представників донної іхтіофауни. Розходження обумовлені високою щільністю капілярної мережі, особливостями м'язової композиції (висока частка червоних м'язів) і хімічного складу м'язової тканини (підвищений вміст міоглобіну, ліпідів, низький рівень гідратації). 6. Гемодинамічний еквівалент у пелагічних риб на 35-45 % перевищує значення, розраховані для донних видів. Це обумовлюється полегшеним характером дифузії кисню в м'язовій тканині і більш ефективною розрядкою артеріальної крові на тканинному рівні (висока концентрація гемоглобіну, низька спорідненість до кисню, підвищена чутливість до рН). 7. Обмеження рухової активності риб приводить до зниження середньотканинного PO2, збільшення кількості гіпоксичних зон у тканині і закисленню внутрішнього середовища організму. Це супроводжується функціональними і структурними перебудовами молекулярних систем транспорту й утилізації кисню, які обмежують їхню потужність, а також спрямовані на зниження чутливості їх до pН і адаптацію до умов низького PO2 у тканині: зниження вмісту цитохромів у скелетних м'язах, нескомпенсований тип організації дихального ланцюга; зменшення концентрації гемоглобіну в крові, зростання показника Р50, низькі значення ефекту Бора. 8. У пелагічних риб в умовах зовнішньої гіпоксії спостерігається розвиток комплексу компенсаційних реакцій, спрямованих на підтримку вихідної швидкості окисного метаболізму в клітинах тканин. Адаптаційний ефект реалізується в області PO2 , близьких до критичних. Спочатку (1-2 доба) відзначається збільшення щільності функціонуючої капілярної мережі, підвищення швидкості тканинного кровотоку і випорожнення кров'яних депо, що підвищує кисневу ємність крові (термінова адаптація). Потім (10-15 доба) відбуваються кількісні перебудови на рівні гемоглобінової і цитохромної систем, які приводять до збільшення спорідненості крові до кисню і зниження її чутливості до рН, а також адаптації дихального ланцюга мітохондрій скелетних м'язів до умов низького PO2 (довгострокова адаптація). 9. В умовах зовнішньої гіпоксії в еритроцитах малорухливої скорпени відбувається збалансоване пригнічення метаболічних і мембранних функцій (зниження активностей Na+,K+-АТРази і гексокінази). Основні показники життєздатності клітин: градієнти за Na+ і K+ на мембрані, внутрішньоклітинна концентрація АТР не зазнають істотних змін. Реакція еритроцитів кефалі-сингіля прямо протилежна. При збереженні високих активностей Na+,K+-АТРази і гексокінази спостерігається зниження рівня АТР у клітині і значне зниження концентраційних градієнтів за Na+ і K+ між внутрішньоеритроцитарним середовищем і плазмою крові. 10. Донні види риб відрізняються підвищеною стійкістю до дефіциту кисню. В умовах зовнішньої гіпоксії в їхньому організмі не розвиваються компенсаційні реакції, спрямовані на підтримку кисневого гомеостазу тканини. Напруження кисню в крові і м'язах рівномірно знижується. Збереження життєздатності в умовах низьких РО2 зумовлюється: здатністю їхніх молекулярних систем транспорту й утилізації кисню функціонувати в умовах гострої гіпоксії: гемоглобінова система має компоненти, які сполучають високу спорідненість до О2 з підвищеною чутливістю до рН, а дихальний ланцюг мітохондрій має нескомпенсований тип стехіометрії цитохромів; стійкістю клітин тканин, які зберігають в умовах гіпоксії основні параметри життєздатності (рівень АТР, трансмембранні градієнти за Na+ і K+) на основі сполученого пригнічення мембранних і метаболічних функцій; наявністю фізіологічних і біохімічних процесів, які виключають нагромадження токсичних сполук (лактат) у тканинах і циркулюючій крові. 11. Гіпотермія (5оС і нижче) спричинює у теплолюбних видів риб розвиток тканинної гіпоксії. Вона носить вторинний характер і пов'язана зі зміною функціонального стану кровоносних судин і циркулюючих еритроцитів. При гіпотермії: щільність капілярної мережі в м'язах зменшується; судини втрачають здатність активно реагувати на функціональні навантаження, що пов'язано з підвищенням вмісту Ca2+ у м'язовій тканині; тепловий ефект реакції оксигенації гемоглобіну різко підвищується; це зумовлюється зміною характеру взаємодії пігменту з внутрішньоеритроцитарним мікрооточенням і приводить до надмірного зростання спорідненості цільної крові до кисню. 12. Гіпоосмія викликає у стеногалінних риб зменшення напруження кисню, збільшення кількості гіпоксичних і аноксичних зон у м'язовій тканині на фоні посилення анаеробних процесів. Це пов'язано з гідратацією скелетної мускулатури і, як наслідок, погіршенням її дифузійних характеристик відносно кисню. 13. Евригалінні види здатні підтримувати ізоосмотичність клітинних середовищ в умовах гіпоосмії внутрішнього середовища. Їхні клітини мають підвищену осмотичну стійкість і більш ефективні Na+, K+-ATPази. Стеногалінні види не здатні до активної осморегуляції на клітинному рівні. 14. Швидкість утилізації і характер дифузії кисню в м'язовій тканині у риб протягом річного циклу залежить від зміни щільності функціонуючої капілярної мережі, а також вмісту в ній ліпідів і води. Вирішальне значення має рівень капіляризації скелетних м'язів, який позитивно корелює зі зміною температури навколишнього середовища. Рівень ліпідів і ступінь гідратації м'язової тканини обумовлюється, головним чином, функціональним станом організму риб (нагул, нерест, міграції, зимівля). Вміст зазначених сполук може підсилювати чи послабляти температурну залежність дифузійних властивостей скелетних м'язів у цілому. 15. Протягом річного циклу в скелетних м'язах риб періодично підсилювались анаеробні процеси, що було наслідком розвитку тканинної гіпоксії. Цей стан пов’язаний з переднерестовим періодом і обумовлюється зниженням концентрації гемоглобіну і збільшенням частки окисленого пігменту (метгемоглобіну) у крові. Анемія і метгемоглобинемія переднерестового стану риб пов'язана з моноциклічністю функціонування кровотворної тканини. Активний еритропоез відбувається лише в післянерестовий період протягом 2-3 місяців. В інший час у системі червоної крові переважають деструктивні процеси, які відбиваються як на кількості циркулюючих еритроцитів, так і на рівні окисних процесів у них. 16. Донна іхтіофауна Чорного й Азовського морів включає групу видів, яка має функціональні і молекулярні системи, що дозволяють існувати в умовах гострого дефіциту кисню. При відповідній спрямованості природного добору вони здатні освоїти проблемні для чорноморського регіону акваторії північно-західного шельфу. СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Маслова М.Н., Солдатов А.А., Тавровская Т.В. Сезонная динамика состояния системы красной крови некоторых черноморских рыб // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1988. – Т. 24, N 4. – С. 516-521. Солдатов А.А. Кислородосвязующая функция крови бычка-кругляка при адаптации к температурным условиям среды // Гидробиол. журн. – 1989. – Т. 25, N 2. – С. 58-62. Солдатов А.А., Маслова М.Н. Концентрация метгемоглобина в крови рыб в течение годового цикла // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1989. – Т. 25, N 4. – С. 454-459. Солдатов А.А., Сташков А.М. Эритропоэтическая активность сыворотки крови рыб различной естественной подвижности // Экология моря. – 1989. – Вып. 32. – С. 78-80. Солдатов А.А. Активность НАДН2-зависимой метгемоглобинредуктазы в эритроцитах бычка-кругляка при адаптации к низким температурам // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1989. – Т. 25, N 6. – С. 772-774. Солдатов А.А. Кислородосвязующая функция крови бычка-мартовика и факторы ее регуляции при адаптации к температурным условиям среды // Экология моря. – 1991. – Вып. 38. – С. 80-84. Солдатов А.А. Онтогенетические изменения активноти Na+, К+ -АТФазы и баланса одновалентных катионов в эритроцитах кефали-сингиля Liza aurata R. // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1991. – Т. 27, N 4. – С. 530-533. Солдатов А.А. Формирование резервов депо крови в онтогенезе морских рыб // Экология моря. – 1992. – Вып. 42. – С. 46-55. Солдатов А.А. Сравнительное изучение кислородосвязующей функции крови черноморских бычков (род Gobius) // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1993. – Т. 29, N 3. – С. 327-330. Солдатов А.А. Кислородно-диссоциационные свойства крови черноморских и дальневосточных кефалей // Биология моря. – 1993. – N. 3. – С. 118-120. Солдатов А.А. Формирование кислородной емкости крови в онтогенезе морских рыб. I. Пелагические виды // Экология моря. – 1993. – Вып. 43. – С. 26-31. Солдатов А.А. Экспериментальное изучение распределения напряжения кислорода в мышечной ткани морских рыб // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1993. – Т. 26, N 5,6. – С. 656-659. Солдатов А.А. Локализация и пролиферативная активность очагов эритропоэза в онтогенезе кефали-сингиля Liza aurata // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1994. – Т. 30, N 4. – С. 567-573. Солдатов А.А., Русинова О.С., Трусевич В.В., Звездина Т.Ф. Влияние гипоксии на биохимические показатели эритроцитов скорпены // Укр. биох. журн. – 1994. – Т. 66, N 5. – С. 115-118. Soldatov A.A. The effect of hypoxia on red blood cells of flounder: a morphologic and autoradiographic study // J. Fish Biol. – 1996. – Vol. 48, N 3. – P. 321-328. Солдатов А.А. Цитохромная система и напряжение кислорода в мышечной ткани морских рыб различной естественной активности // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1996. – Т. 32 , N 2. – С. 142-146. Солдатов А.А. Кислородно-диссоциационные свойства крови и состав внутриэритроцитарной среды у морских рыб с различной двигательной активностью // Журн. эволюц. биох. физиол. – 1997. – Т. 33, N 6. – C. 607-614. Солдатов А.А. Регуляция состава красной крови бычка-мартовика (Gobius batrachocephalus P.) при адаптации к высоким температурам // Гидробиол. журн. – 1998. – Т. 34, N 1. – C. 62-67. Солдатов А.А. Особенности организации цитохромных систем и кислородный режим скелетных мышц морских рыб // Укр. биох. журн. – 1998. – Т. 70, N 4. – С. 46-51. Солдатов А.А. Особенности осморегуляции циркулирующих эритроцитов у стено- и эвригалинных видов морских рыб в условиях гипоосмотической среды // Журн. эволюц. биох. физиол. – 2000. – Т. 36, N 1. – С. 40-44. Солдатов А.А., Парфенова И.А. Влияние температуры на устойчивость гемоглобинов морских рыб к окислению // Экология моря. – 2000. –Вып. 53. – С. 49-53. Солдатов А.А., Парфенова И.А. Уровень метгемоглобина в крови и устойчивость циркулирующих эритроцитов скорпены Scorpaena porcus P. к осмотическому шоку в условиях экспериментальной гипоксии // Журн. эволюц. биох. физиол. – 2001. – Т. 37, N 6. – С. 477-479. Солдатов А.А. Особенности структуры, полиморфизм и устойчивость к окислению гемоглобинов рыб (обзор) // Журн. эволюц. биох. физиол. – 2002. – Т. 38, N 4. – С. 305-310. Шульман Г.Е., Столбов А.Я., Солдатов А.А., Минюк Г.С., Ивлева Е.В., Трусевич В.В., Дробецкая И.В. Метаболические реакции черноморских рыб на долговременную экспериментальную гипоксию // Гидробиол. журн. – 2003. – Т. 39, N 1. – С. 21-30. Солдатов А.А. Физиологические аспекты действия уретанового наркоза на организм морских рыб // Гидробиол. журн. – 2003. – Т. 39, N 1. – С. 51-63. Солдатов А.А. Влияние температуры, рН и органических фосфатов на гемоглобины рыб // Журн. эволюц. биох. физиол. – 2003. – Т. 39, N 2. – С. 121-127. Солдатов А.А., Парфенова И.А. Коношенко С.В. Гемоглобиновая система черноморского бычка-кругляка в условиях экспериментальной гипоксии // Укр. биох. журн. – 2004. – Т. 76, N 3. – С. 85-90. Солдатов А.А. Особенности организации и функционирования системы красной крови рыб // Журн. эволюц. биох. физиол. – 2005. – Т. 41, N 3. – С.217-223. Парфенова И.А., Солдатов А.А. Эритрограмма циркулирующей крови скорпены в условиях экспериментальной гипоксии // Морск. экол. журн. – 2005. – Т. IV, N 2. – С. 59-67. Парфенова И.А., Солдатов А.А., Коношенко С.В. Кислородосвязующие свойства гемоглобинов рыб устойчивых к внешней гипоксии // Доп. НАН України. – 2005. – N 5. – С. 160-164. Солдатов А.А. Кислородные режимы скелетных мышц стеногалинного бычка (Gobius cobitis P.) в условиях экспериментальной гипоосмии // Наук. зап. Терноп. нац. пед. ун-та. Серія: біологія. – 2005. – Т. 4, N 27. – С. 227-229. Солдатов А.А. Органный кровоток и сосуды микроциркуляторного русла у рыб (обзор) // Ж. эволюц. биох. физиол. – 2006. – Т. 42, N 3. – С. 193-200. Солдатов А.А. Эритропоэз и концентрация метгемоглобина в крови кефали-сингиля (Liza aurata Risso) на протяжении годового цикла // Совр. пробл. физиол. биохим. водных организмов. – Петрозаводск: Изд-во Ин-та биол. КарНЦ РАН, 2005. – С. 182-187. Солдатов А.А. АТФ-азная активность фрагментов эритроцитарных мембран в онтогенезе кефали-сингиля // X Всесоюз. конф. по эволюц. физиологии: Тез.докл. – Л.: Наука, 1990. – С. 379. Солдатов А.А. Особенности физиологии эритропоэза в раннем онтогенезе кефали-сингиля Liza aurata R. // V Всесоюз. конф. по раннему онтогенезу рыб: Тез. докл. (Астрахань, 1-3 окт. 1991 г.). – М.: Наука, 1991. – С.102-103. Солдатов А.А. Изменение морфологического состава эритроидных элементов крови и кроветворной ткани в онтогенезе кефали // VIII Науч. конф. по экол. физиол. биох. рыб: Тез. докл. – Петрозаводск, 1992. – Т. 2. – С. 108-109. Солдатов А.А. Напряжение кислорода в мышечной ткани кефали-сингиля // VIII Науч. конф. по экол. физиол. биох. рыб: Тез. докл. – Петрозаводск, 1992. – Т. 2. – С.109. Солдатов А.А. Цитохромная система скелетных мышц рыб различной активности // I з'(зд гiдроекол. тов-ва Укра(ни. Ки(в,16-19 лист. 1993.: Тез. доп. – Ки(в, 1994. – С. 271. Soldatov A.A. The tissue hypoxia in sea fishes with adaptation to low temperature: mechanism of development // 31st European Marine Biology Symp.: Progr. Abstr. (St.-Petersburg, 9-13 Sept.1996). – St.-Petersburg, 1996. – P. 77. Soldatov A.A. Comparison of adaptive strategy of marine fishes from normo- and hypoxic regions of Black Sea: biochemical aspects // BMB 15 and ECSA 27 Simp. 1997. Comparison of Enclosed and Semienclosed Marine Systems. Mariehamn, Aland, Finland, 9-13 June 1997.: Abstr. – Mariehamn, 1997. – P.23. Солдатов А.А. Кислородно-диссоциационные свойства крови у рыб различной естественной подвижности // II з'(зд гiдроекол. тов-ва Укра(ни. Ки(в, 27-31 жовт. 1994: Тез. доп. – Ки(в, 1997. – Т.2. – С. 95-96. Солдатов А.А., Столбов А.Я. Трусевич В.В. Минюк Г.С. Комплексная оценка физиологического состояния рыб различной экологической специализации в условиях экспериментальной гипоксии // II з'(зд гiдроекол. тов-ва Укра(ни. Ки(в, 27-31 жовт. 1994: Тез. доп. – Ки(в, 1997. – Т. 2. – С. 98-99. Shulman G.E., Stolbov A.Y., Soldatov A.A., Ivleva I.V., Minyuk G.S., Trusevich V.V. The features of metabolism in Black Sea fishes under extreme conditions // 33rd Eur. Mar. Biol. Symp. Wilhelmshaven (Germany), 7-11 Sept. 1998: Progr. and Abstr. – Wilhelmshaven, 1998. – P. 93. Soldatov A.A. The reasons of high resistance of Neogobius melanostomus P. to external hypoxia: comparative investigations // Baltic Sea Sci. Cong. Stockholm (Sweden), Nov. 25-29, 2001: Abstr. – Stockholm: Mar. Res. Center, 2001. – P. 304. Солдатов А.А., Коношенко С.В., Парфенова И.А. Сравнительная оценка устойчивости к гипоксии черноморских рыб // Ecological Studies, Hazards, Solutions. – 2004. – V. 7. – P. 91. Soldatov A.A., Parfyonova I.A., Konoshenko S.V. Nuclear erythrocytes of marine fishes under experimental hypoxia conditions: morphological and biochemical investigations // First (Inaugural) Ukr. Congr. Cell Biol. Lviv, April 25-28, 2004: Abstr. – Lviv, 2004. – P. 229. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Цитохромная и гемоглобиновая системы бычка-кругляка Neogobius melanostomus (P.) в условиях внешней гипоксии // Совр. пробл. физиол. и биох. водных организмов. Мат. Межд. конф. 06-09 сент. 2004. – Петрозаводск, 2004. – С. 131-132. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные системы транспорта и утилизации кислорода у морских рыб в условиях экстремальной гипоксии // XIX Съезд физиол. об-ва им. И.П. Павлова (Мат-лы съезда). 19-24.09.04. Екатеринбург (Россия). – Екатеринбург, 2004. – С. 204-205. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные основы устойчивости организма некоторых морских рыб к условиям экстремальной гипоксии // Научн. тр. I Съезда физиологов СНГ. Сочи. Дагомыс (Россия), 19-23 сент. 2005. Т. 1. – М.: Медицина-Здоровье, 2005. – С. 168. Soldatov A.A. Oxygen status of skeletal muscles in marine fishes during an annual cycle // Aquat. Ecol. Dawn XXI Century. Prof. G.G. Winberg 100th Anniversary. 03-07. Oct. 2005, Zool. Inst. St.-Petersburg (Russia). – St.-Petersburg, 2005. – P. 90. Солдатов А.А. Кислородный режим и цитохромные системы скелетных мышц морских рыб в норме и условиях экспериментальных нагрузок // XIII Межд. совещ. по эволюц. физиол., 23-25 янв. 2006, С.-Петербург (Россия). Тез. докл. – С.-Петербург, 2006. – С. 204. Солдатов А.А., Головина И.В., Гостюхина О.Л., Андреенко Т.И., Столбов А.Я., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные и функциональные основы адаптации черноморских гидробиотов к гипоксии, аноксии и различным видам окислительных нагрузок // Межд. научн. конф. “Пробл. биол. океанографии XXI века”, Севастополь, 19-21 сент. 2006: – Севастополь, 2006. – С. 166. АНОТАЦІЇ Солдатов О.О. Метаболічні механізми адаптації чорноморських риб до гіпоксичних станів. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за фахом 03.00.10 – іхтіологія. Інститут гідробіології НАН України, Київ, 2007. Досліджено кисневий режим скелетних м'язів морських риб і механізми його функціональної корекції при різних станах організму й умовах навколишнього середовища. Виявлено низьку дифузійну здатність м'язової тканини риб у відношенні О2 у порівнянні з іншими хребетними. Показано, що це є основною причиною низьких значень тканинного РО2 і малої ефективності утилізації О2. Описані нові види гемічної і циркуляційної гіпоксії. Вперше виділяється дифузійна тканинна гіпоксія і гіпоксія гіподинамічного стану. Запропоновано класифікацію гіпоксичних станів для водяних організмів. Визначено механізми термінової і довгострокової корекції тканинного РО2 у риб. Показано, що кров риб, толерантних до гострої зовнішньої гіпоксії, має одночасно високу спорідненість до О2 і підвищену чутливість до рН. Досліджено гетерогенну систему гемоглобіну і виявлено компонент, з даними функціональними характеристиками. Встановлено спрямовані перебудови в цитохромному ланцюзі мітохондрій м'язів риб, що підвищують ефективність функціонування дихального ланцюга в умовах низького тканинного РО2. Вперше виявлено участь і визначено значущість тканинного рівня ліпідів у корекції дифузійної здатності скелетных м'язів риб. Описано феномен метаболічного арешту на рівні циркулюючих еритроцитів у риб, здатних існувати в умовах гострого дефіциту О2. Встановлено моноциклічність у функціонуванні кровотворної тканини у риб протягом річного циклу, що обумлвлює розвиток переднерестової анемії і метгемоглобинемії. Виявлено, що у теплолюбних риб в умовах гіпотермії судини м'язів втрачають здатність активно реагувати на функціональні навантаження, що пов'язано з підвищенням вмісту Ca2+ у м'язовій тканині. Показано, що еритроцити евригалінних риб, у порівнянні зі стеногалінними, мають підвищену стійкість до осмотичного шоку і більш ефективні Na+,K+-ATPази. У зазначених видів визначені процеси осморегуляції, які забезпечують ефективне функціонування їхніх клітинних систем в умовах гіпотонії плазми крові. Ключові слова: морські риби, скелетні м'язи, тканинний об'ємний кровоток, тканинне РО2, гази крові, гемоглобін, еритроцити, цитохроми. Солдатов А.А. Метаболические механизмы адаптации черноморских рыб к гипоксическим состояниям. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.10 – ихтиология. Институт гидробиологии НАН Украины, Киев, 2007. Исследован кислородный режим скелетных мышц морских рыб и механизмы его функциональной коррекции при различных состояниях организма и условиях окружающей среды. Обнаружена низкая диффузионная способность мышечной ткани рыб в отношении О2 в сравнении с другими позвоночными. Показано, что это является основной причиной низких значений тканевого РО2 и малой эффективности утилизации О2. Описаны новые виды гемической и циркуляционной гипоксии. Впервые выделяется диффузионная тканевая гипоксия и гипоксия гиподинамического состояния. Предложена классификация гипоксических состояний для водных организмов. Определены механизмы срочной и долговременной коррекции тканевого РО2 у рыб. Показано, что кровь рыб, толерантных к острой внешней гипоксии, обладает одновременно высоким сродством к О2 и повышенной чувствительностью к рН. Исследована гетерогенная система гемоглобина и выявлен компонент, обладающий данными функциональными характеристиками. Установлены направленные перестройки в цитохромной цепи митохондрий мышц рыб, повышающие эффективность функционирования дыхательной цепи в условиях низкого тканевого РО2. Впервые выявлено участие и определена значимость тканевого уровня липидов в коррекции диффузионной способности скелетных мышц рыб. Описан феномен метаболического ареста на уровне циркулирующих эритроцитов у рыб, способных существовать в условиях острого дефицита О2. Установлена моноцикличность в функционировании кроветворной ткани у рыб на протяжении годового цикла, которая определяет развитие преднерестовой анемии и метгемоглобинемии. Обнаружено, что у теплолюбивых рыб в условиях гипотермии сосуды мышц утрачивают способность активно реагировать на функциональные нагрузки, что связано с повышением содержания Ca2+ в мышечной ткани. Показано, что эритроциты эвригалинных рыб, в сравнении со стеногалинными, обладают повышенной устойчивостью к осмотическому шоку и более эффективными Na+, K+-ATPазами. У данных видов определены процессы осморегуляции, обеспечивающие эффективное функционирование их клеточных систем в условиях гипотонии плазмы крови. Ключевые слова: морские рыбы, скелетные мышцы, тканевой объемный кровоток, тканевое РО2, газы крови, гемоглобин, эритроциты, цитохромы. Soldatov А.А. Metabolic mechanisms of Black Sea fishes adaptation to hypoxia states. – Manuscripts. Thesis for Doctor’s degree by specialty 03.00.10 – Ichthyology. – Institute of Hydrobiology of National Academy of Science of Ukraine, Kiev, 2007. Oxygen regime of skeletal muscles in marine fishes and mechanisms of its functional correction at different state of organism and environmental conditions were investigated. Low oxygen diffusion in fish muscle tissue in comparison with other vertebrates was observed. This phenomenon was shown to be the main cause of low level of tissue РО2 and small efficiency of О2 utilization. New kinds of hemic and circulating hypoxia were distinguished. Diffusion and hypodynamic hypoxia states were studied for the first time. The classification of hypoxia states for hydrobionts was proposed. The mechanisms of fast and long-term correction of tissue РО2 in fish were investigated. It was shown that the blood of tolerant to acute external hypoxia fishes has high oxygen affinity and higher sensitivity to pH simultaneously. The component (fraction) of heterogenous hemoglobin system responsible for these functional characteristics was found. The orientated transformation in cytochrome chain of fish muscles increasing of efficiency of respiration chain functioning under low tissue РО2 conditions were determined. For the first time the role of tissue lipid level in correction of diffusion ability of fish skeletal muscles was revealed. The phenomenon of metabolic arrest was described for erythrocytes of fishes being able to exist under acute hypoxia conditions. It was shown that monocycling of blood forming tissue functioning during annual cycle determines development of prespawning anemia and methemoglobinemia in fishes. The vessels of heat-loving fishes were found to lose the ability to response to functional tests under hypothermia conditions due to increase of Ca2+content in muscles. The erythrocytes of euryhaline fishes have elevated resistance to osmotic shock and more effective Na+, K+-ATPases compared with stenohaline species. Osmoregulation processes providing effective functioning of cell system in these fishes under hypotonia of blood plasma were analyzed. Key words: marine fishes, skeletal muscles, tissue volume blood flow, tissue РО2, blood gases, hemoglobin, erythrocyte, cytochromes. Рис. 1. Розподіл РО2 у червоних м'язах риб різної природної рухливості (1 – сингіль; 2 – гостроніс; 3 – піленгас; 4 – ставрида; 5 – кругляк; 6 – мартовик; 7 – глоса; 8 – скорпена) Рис. 2. Розподіл РО2 у м'язах піленгасу в умовах гіподинамії (А – червоні м'язи, Б – білі м'язи, 1 – контроль, 2 – експеримент) Рис. 3. Вплив гіподинамії на вміст цитохромів у м'язах піленгасу (А – контроль, Б – експеримент, 1 – білі м'язи, 2 – червоні м'язи) Рис. 4. Денситограми гемоглобінової системи бичка-кругляка в нормі й в умовах експериментальної гіпоксії Таблиця 2 Кисневозв’язуючі характеристики окремих компонентів гемоглобіну кругляка Рис. 5. Эритрограма пронефроса сингіля і глоси протягом річного циклу (PrN – пронормобласти, BN – базофільні нормобласти, PN – поліхроматофільни нормобласти, А – зима, Б – весна, В – лiто, Г – осiнь) Таблиця 3 Проліферативна активність пронефросу у сингіля протягом річного циклу Сезон Уключення 3Н-тимідину, % PrN (нирки) BN (нирки) BN (кров) Зима 0,98+0,40 (6) 18,3+1,6 (6) 1,28+0,61 (6) Весна - 3,20+0,68 (6) - Літо 2,16+0,66 (7) 12,6+3,7 (7) 2,19+0,78 (7) Осінь 5,79+0,39 (7) 41,8+3,3 (7) 6,21+0,40 (7) Примітка: BN – базофільні нормобласти; PrN – пронормобласти; у дужках вказано число особин ПЕРВИННА ГІПОКСІЯ ВТОРИННА ГІПОКСІЯ Дефіцит субстратів окислювання Недостатність окислювання Порушення окислювання Роз'єднання окислювання і фосфорилювання Екзогенна гiпоксiя Ендогенна гiпоксiя Локомоторна гiпоксiя Гіпоксія обмеження водообміну Гіпоксія евтрофікації Гіпоксія гіпертермії Гіпоксія гіпоосмії Дифузійна гіпоксія Гемічна гіпоксія (анемія, часткова інактивація гемоглобіну, зниження дифузійних характеристик мембран еритроцитів) Циркуляторна гіпоксія (ішемічна, застійна) Респіраторна гіпоксія (вентиляційна, паренхіматозна) Гіпоксія гіподинамії Гіпоксія навантажень

Похожие записи