НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

КАМІНСЬКИЙ ВІТАЛІЙ ОЛЕКСІЙОВИЧ

УДК 577.1:547.943:611.018.15

Механізми індукції апоптозу у лімфомних клітинах під впливом алкалоїдів
чистотілу

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського національного
університету імені Івана Франка МОН України та у відділі регуляції
проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України,

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин,

професор кафедри біохімії Львівського національного університету імені
Івана Франка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович

Директор Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення
продуктивності тварин Львівської національної академії ветеринарної
медицини ім. С.З. Гжицького, професор кафедри органічної та неорганічної
хімії.

доктор біологічних наук, доцент

Дробот Людмила Борисівна

Інститут біології клітини НАН України,

в.о. завідувача відділу сигнальних механізмів клітини

Провідна установа – Інститут молекулярної біології та генетики НАН
України, м. Київ

Захист відбудеться «18» жовтня 2006 р. о 14.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН
України за адресою:

вул. Драгоманова, 14/16, м. Львів, 79005.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини
за адресою: вул. Драгоманова, 14/16, м. Львів, 79005.

Автореферат розісланий «13» вересня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сполуки природного, зокрема рослинного походження
займають важливе місце у сучасній хіміотерапії пухлин. Зростання
інтересу до цих сполук пов’язане із відкриттям і детальним вивченням
низки цитостатиків рослинного походження та успішним впровадженням у
практику таких антибластичних препаратів як колхамін, вінбластин,
вінкристин, подофілін та ін. Серед сполук рослинного походження слід
виділити алкалоїди – групу біологічно-активних речовин, що мають у своїх
гетероциклах атом нітрогену. Екстракт чистотілу (Chelidonium majus L.)
містить у своєму складі близько 36 диізохінолінових алкалоїдів
(Потопальський, 1992, Taborska et al, 1994) з протопіновою,
протобербериновою та бензофенантридиновою структурою. Серед алкалоїдів
чистотілу за вмістом переважають хелідонін, сангвінарин, хелеритрин,
берберин та коптизин.

В останні роки було з’ясовано деякі механізми біологічної дії окремих
алкалоїдів чистотілу на клітини-мішені. Зокрема, встановлено, що
алкалоїд хелідонін взаємодіє з цитоскелетним білком тубуліном і зумовлює
зупинку клітин у фазі мітозу (Panzer et al, 2001). Хелеритрин,
сангвінарин, берберин та коптизин впливають на процеси дихання в
мітохондріях (Barreto et al, 2003). Сангвінарин та хелеритрин, завдяки
наявності імінних груп, здатні інгібувати активність ензимів та інших
білків, які мають в активному центрі нуклеофільні групи (Фаддеева и др.,
1997). Деякі алкалоїди чистотілу діють як інгібітори протеїнкіназ,
блокують активність транскрипційного фактора NF-kB, який є компонентом
сигнальних шляхів, залучених до індукції проліферації клітин або їх
загибелі (Chaturvedi et al, 1997). У низці робіт (Bhadra et al, 2005,
Das et al, 2003, Mazzini et al, 2003, Schmeller  et al, 1997, Sen et al,
1994) автори звернули увагу на здатність окремих алкалоїдів чистотілу
взаємодіяти з ДНК шляхом проникнення їх планарних молекулярних структур
у ланцюги ДНК.

На лімфопроліферативні захворювання припадає вагома частка злоякісних
новоутворень, вона становить близько 7,5 %, причому смертність від цих
захворювань становить близько 7 % загальної смертності хворих на
злоякісні пухлини (Greenlee R.T. et al, 2000). Пошук і створення
хіміопрепаратів на основі алкалоїдів чистотілу, що проявляють
протипухлинну властивість in vitro та in vivo (Cordes et al, 2002,
Hohenwarter et al, 1992, Kurochkin et al 2000, Nowicky et al, 1996,
Roublevskaia et al, 2000, Ernst et al, 2005, Grinevich et al, 2005)
залишається актуальною проблемою. Здатність алкалоїдів пригнічувати ріст
новоутворень лімфоїдної тканини вивчена недостатньо, зокрема
маловивченими залишаються механізми дії алкалоїдів чистотілу, залучені
до індукції загибелі пухлинних клітин. Нез’ясованими є
внутрішньоклітинні шляхи реалізації апоптозу клітин під впливом окремих
алкалоїдів, потребує уточнення питання, які з алкалоїдів чистотілу є
найбільш ефективними індукторами апоптозу і чи існують інші типи
загибелі клітини, які можуть індукуватися під впливом алкалоїдів
чистотілу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у рамках держбюджетної теми Бх-116Б кафедри біохімії
Львівського національного університету ім. І. Франка “Ензиматичні
системи організму при дії іонізуючого випромінювання та інших
патологічних чинників” № держреєстрації 0103V001918 (2003-2004 pp.).
Окремі дослідження були проведені у межах теми відділу регуляції
проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України “Дослідження
процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого
антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії” № держреєстрації
0106U002599 (2005-2007 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити на
клітинному і молекулярному рівнях механізми індукції апоптозу лімфомних
клітин основними алкалоїдами чистотілу – хелідоніном, сангвінарином,
хелеритрином та коптизином.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

вивчити цитотоксичну дію алкалоїдів чистотілу щодо ліній клітин
перещеплюваної мишачої лімфоми NK/Ly, культур лімфомних клітин людини
ліній МТ-4, CCRF-CEM і Jurkat;

дослідити вплив окремих алкалоїдів чистотілу на розподіл лімфомних
клітин за фазами клітинного циклу та їх вплив на прояв апоптозу;

вивчити вплив алкалоїдів чистотілу на рівень та активність білків, що
регулюють апоптоз лімфомних клітин;

з’ясувати вплив алкалоїдів чистотілу на інтенсивність процесів окисного
фосфорилювання та кальцієву ємність ізольованих мітохондрій,
трансмембранний потенціал мітохондрій лімфомних клітин та синтез ATP;

дослідити здатність алкалоїдів чистотілу інтеркалювати в структуру ДНК
лімфомних клітин;

вивчити деструктивні стадії загибелі лімфомних клітин під впливом
алкалоїдів чистотілу.

Об’єкт дослідження: механізми загибелі лімфомних клітин.

Предмет дослідження: вплив окремих алкалоїдів чистотілу на апоптоз
лімфомних клітин.

Методи дослідження: виділення ДНК, виділення мітохондрій,
спектрофотометрія, культивування клітин in vitro, світлова,
флуоресцентна та електронна мікроскопія, електрофорез ДНК та білків у
гелі, Вестерн-блот-аналіз білків, проточна цитофлуориметрія.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено основні шляхи
індукції апоптозу лімфомних клітин під впливом чотирьох основних
алкалоїдів чистотілу. Показано, що хелідонін та сангвінарин є найбільш
ефективними індукторами апоптозу лімфомних клітин людини in vitro.
Вперше показано, що індукція апоптозу сангвінарином, хелеритрином та
коптизином реалізується на мітохондріальному рівні, про що свідчить
вивільнення цитохрому с із мітохондрій та активація ініціюючої
каспази-9. Індукція апоптозу лімфомних клітин під впливом досліджених
алкалоїдів може реалізуватись також із залученням каспази-8, яка приймає
участь у здійсненні рецептор-опосередкованого шляху апоптозу.

Виявлено, що у механізмах дії сангвінарину, хелеритрину та коптизину на
лімфомні клітини залучені пошкоджуючий вплив на мітохондрії та
інтеркаляція у структуру ДНК лімфомних клітин. Сангвінарин і хелеритрин
є сильними інтеркаляторами ДНК лімфомних клітин, спричиняють одно- та
двониткові розриви в ланцюгах ДНК, впливають на трансмембранний
потенціал мітохондрій лімфомних клітин, а також на синтез ATP вже на
ранніх етапах дії. Хелідонін зупиняє клітинний цикл клітин лінії МТ-4
лімфоми людини у G2/M фазі, викликає активацію проапоптичного білка Bad,
однак не інтеркалює у структуру ДНК лімфомних клітин,.

Практичне значення одержаних результатів. З’ясовано механізми індукції
апоптозу лімфомних клітин in vitro за умов дії основних алкалоїдів
чистотілу. Встановлено, які саме з алкалоїдів чистотілу є найсильнішими
індукторами апоптозу, що дозволяє розробити рекомендації щодо їх
випробовування на протипухлинну активність in vivo.

Одержані результати, що стосуються механізмів індукції процесів апоптозу
використовуються при викладанні матеріалу спецкурсу «Молекулярні
механізми регуляції проліферації і диференціації клітин» для магістрів
на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного
університету імені Івана Франка та спецкурсу “Біологія індивідуального
розвитку” для магістрів на кафедрі біології природничо-географічного
факультету Вінницького державного педагогічного університету імені
Михайла Коцюбинського.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за
темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину і
статистичну обробку отриманих результатів. Аналіз і обговорення
отриманих даних проведено спільно з науковим керівником,
членом-кореспондентом НАН України Стойкою Р.С. Окремі розділи роботи
детально обговорено з доктором біологічних наук Луциком М.Д. К.б.н.
Фільченков О.О. надав допомогу у проведенні експериментів на проточному
цитофлуориметрі. Електронну мікроскопію здійснено за допомоги к.б.н.
Кулачковського О.Р. Виділення мітохондрій та вивчення деяких їхніх
властивостей проведено за участю Крив’як Н.В.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертації були
представлені на міжнародній конференції “Ionic Soft matter: Novel trends
in theory and applications” (Lviv, Ukraine, April 14-17, 2004),
конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної
біохімії” (Тернопіль, 11-12 листопада 2004 р.), наукових сесіях
Наукового Товариства ім. Шевченка (Львів, 2005 та 2006 рр), на 5-ій
Міжнародній Парнасівській конференції (Київ, 2005), конференції молодих
науковців «Сучасні проблеми біохімії та біотехнології» (Київ, 2005),
Міжнародному науково-практичному форумі “Основи молекулярно-генетичного
оздоровлення людини і довкілля” на базі Інституту молекулярної біології
та генетики НАН України (Київ, 31 травня-1 червня 2005 р.), щорічних
звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного
університету ім. І. Франка (Львів, 2005-2006), VII Міжнародній
конференції молодих онкологів «Сучасні проблеми експериментальної і
клінічної онкології» (Київ, 2006), конференції «Отечественные
противоопухолевые препараты» (Москва, 2006), звітній конференції молодих
вчених Інституту біології клітини НАН України (Львів, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з
них 4 статті у фахових виданнях і 7 тез у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ,
огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень,
аналіз та обговорення результатів досліджень, висновки та список
цитованої літератури. Дисертацію викладено на 150 сторінках і
проілюстровано 47 рисунками та 3 таблицями. Список цитованої літератури
складає 207 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано дані про механізми
загибелі клітин шляхом апоптозу. Детально висвітлено дані щодо
механізмів біологічної дії алкалоїдів на клітини-мішені, в першу чергу,
злоякісні клітини.

Матеріали та методи досліджень. Сангвінарин, хелеритирн, хелідонін та
коптизин очищені з чистотілу (Chelidonium majus L.) д. б. н. Луциком
М.Д. та інженером Осипом Ю.Л і люб’язно надані для роботи. Дослідження
проводили на клітинах лімфоми людини лінії МТ-4, CCRF-CEM та Jurkat, а
також на клітинах мишачої лімфоми лінії NK/Ly, отриманих із банку
клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології та
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ). Клітини
вирощували у середовищі RPMI 1640 (“Sigma”, США) за присутності 10%
сироватки ембріонів великої рогатої худоби (FCS, “Sigma”, США) і 50
мкг/мл гентаміцину (“Sigma”, США).

Вплив алкалоїдів на ріст і виживання клітин визначали за допомогою
фарбування клітин 0,1% розчином трипанового синього та підрахунком
зафарбованих (мертві) і незафарбованих (живі) клітин.

Вміст білків вивчали за допомогою методу Вестерн-блот-аналізу із
використанням моноклональних антитіл до фрагменту білка PARP
(«Santa-Cruz», США), каспази-8 та каспази-9 («Beckman Coulter, Inc.»,
США), каспази-3 («Chemicon», США), цитохрому с (“BD Biosciences
Pharmingen”, США) або поліклональних анти-Bcl-2 (“Santa Cruz”, США) та
анти-Bad («Beckman Coulter, Inc.», США) антитіл. Отримані дані щодо
рівня білків були проаналізовані та оцифровані за допомогою програми Gel
Pro Analyzer 3.1.

Апоптоз клітин визначали на проточному цитофлуориметрі шляхом фарбування
ядер клітин пропідіййодидом.

Виділення мітохондрій та визначення їх функціонального стану здійснювали
згідно до описаної методики (Дубицький та ін., 1996).

Вміст ATP у клітинах визначали ензиматичним методом, в основі якого
лежить здатність гексокінази за присутності глюкози фосфорилювати
глюкозу. Глюкозо-6-фосфат, що при цьому утворюється, служить субстратом
для глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної реакції. Кількість ATP, яка
прореагувала, еквімолярна кількості NADPН, що утворився у
глюкозо-6-фосфатдегідро-геназній реакції. Кількість NADPН визначали
спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм.

Вплив алкалоїдів на трансмембранний потенціал мітохондрій визначали за
здатністю цих органел накопичувати флуоресцентний барвник родамін-123
(Johnson L. et al, 1981).

ДНК-інтеркаляторну здатність алкалоїдів вивчали за допомогою методів
термоденатурації ДНК та витіснення барвника метилового зеленого з
комплексу з ДНК згідно описаних методик (Schmeller T. et al, 1997). За
графіками визначали концентрацію лігандів, яка витісняє половину
метилового зеленого з його комплексу з ДНК, та температуру плавлення
ДНК.

Виділення апоптичної ДНК проводили, як описано Гонгом (Gong J. et al,
1994). Розділення фрагментів ДНК здійснювали електрофоретично у гелі 1,5
% агарози.

Морфологічні зміни ядер досліджували шляхом зафарбовування ядер клітин
барвником Hoechst 33342 (кінцева концентрація 1,5 мкМ). Клітини
інкубували з барвником при 37 °С протягом 15 хв та концентрували
центрифугуванням до 3 млн/мл. Зразки аналізували на флуоресцентному
мікроскопі при збільшенні х400.

Для електронної мікроскопії зразки готували шляхом фіксування клітин
1,5 % розчином глутарового альдегіду (Sigma Chem. Co, США) із додатковою
фіксацією 2 % розчином OsO4. Препарати зневоднювали у зростаючих
концентраціях етилового спирту і поміщали в епоксидну смолу епон-812
(Fluka, Німеччина) (Уикли, 1975). Зрізи готували на ультрамікротомі
УМТП-6, контрастували 2%-ним розчином уранілацетату протягом 15 хв і
додатково цитратом свинцю та переглядали за допомогою електронного
трансмісійного мікроскопа ПЕМ-100.

Мікроелектрофорез ДНК індивідуальних клітин у гелі агарози за лужних та
слаболужних умов проводили згідно до методик (Gulston et al, 2002, Olive
et al, 2001).

Усі досліди повторювали тричі з трьома паралельними експериментами у
кожному варіанті. Статистичну обробку даних та побудову графіків
виконували за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Office Excel
2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Вплив алкалоїдів чистотілу на апоптоз клітин та їх розподіл за фазами
клітинного циклу. Вплив сангвінарину, хелеритрину та коптизину на ріст
та виживання клітин лімфоми людини лінії МТ-4 представлено на рис. 1.
Подібний характер кривих отримано із використанням лімфомних клітин
людини ліній CCRF-CEM та Jurkat. Початкова концентрація клітин становила
1 млн/мл. На 24 год приріст клітин у культурі становив 40 %. На 24 год
дії сангвінарину чи хелеритрину у концентрації 8 мкг/мл спостерігали
практично повну загибель клітин у культурі. Сангвінарин виявився
найбільш цитотоксичним, при концентрації алкалоїду 2 мкг/мл кількість
живих клітин відносно контролю становила лише 10 %. Хелеритрин виявляв
подібний ефект у концентрації 4 мкг/мл. Коптизин володів помірною
цитотоксичністю, адже при використанні алкалоїду у концентрації 8 мкг/мл
кількість живих клітин відносно контролю становила 40 %. Хелідонін у
концентрації 0,5 мкг/мл повністю пригнічував ріст клітин у культурі.
Максимальний цитотоксичний ефект дії хелідоніну був виражений вже при
використанні алкалоїду у концентрації 2 мкг/мл, кількість живих клітин
відносно контролю становила 40 %.

За даними проточної цитофлуориметрії, хелідонін у концентрації
2,5 мкг/мл призводить до суттєвого збільшення частки клітин лінії МТ-4 у
фазах G2/M (54 % у порівнянні з 19 % у контролі) за рахунок значного
зменшення частки клітин у фазах G0/G1 (12 % у порівнянні з 44 % у
контролі). Сангвінарин та хелеритрин у концентраціях 1 та 2 мкг/мл
відповідно спричиняли зменшення частки клітин у G2/M фазах (9 та 14 %,
відповідно, у порівнянні з 19 % у контролі) із відповідним збільшенням,
в основному, частки клітин у G0/G1 та S фазах клітинного циклу.

Рис. 1. Вплив алкалоїдів чистотілу на виживання клітин лінії МТ-4
лімфоми людини: 1 – сангвінарин; 2 – хелеритрин; 3 – коптизин; 4 –
хелідонін

Збільшення частки клітин у фазі S під впливом коптизину відбувалось за
рахунок зменшення частки клітин у фазах G0/G1.

За результатами проточної цитофлуориметрії найвищий апоптичний індекс
(відсоток гіподиплоїдних клітин) у культурі клітин МТ-4 виявлено при дії
хелідоніну та сангвінарину у концентраціях близьких до індексу
цитотоксичності (ІС50), він становить у середньому 33 та 24 %,
відповідно. При збільшенні концентрації сангвінарину до 2 мкг/мл
спостерігали зниження кількості апоптичних клітин у культурі. На відміну
від сангвінарину, при дії хелідоніну у концентраціях, значно вищих за
ІС50, апоптичний індекс був близьким до 30 %. Значно слабший ефект на
вміст гіподиплоїдних клітин у культурі виявлено при дії хелеритрину та
коптизину. Подібно до дії сангвінарину при використанні хелеритрину у
концентраціях вищих за ІС50 спостерігали зменшення частки гіподиплоїдних
клітин у культурі.

Вплив алкалоїдів чистотілу на рівень білків, задіяних у регуляції
апоптозу. На рис. 2 представлено результати впливу алкалоїдів чистотілу
на вміст цитохрому с у мітохондріальній та цитоплазматичній фракції
клітин лінії МТ-4. З рисунку видно, що під впливом сангвінарину,
хелідоніну та хелеритрину значно зменшується вміст цитохрому с у
мембранній фракції, дещо слабший ефект виявлено під впливом коптизину.

Найбільший вміст цитохрому с у цитоплазмі спостерігали під впливом
сангвінарину. За результатами аналізу, цей алкалоїд у концентрації 0,8
мкг/мл зумовлює зростання вмісту цитохрому с у цитоплазмі приблизно у 8
разів порівняно з контролем.

Під впливом хелідоніну (5 мкг/мл) та хелеритрину (2 мкг/мл) вміст
цитохрому с у цитоплазмі зростав приблизно у 5 та 3 рази порівняно з
контролем. Коптизин у концентрації 10 мкг/мл призводив до зростання
вмісту цитохрому с у цитоплазмі приблизно у 2,3 рази порівняно з
контролем.

На рис. 3 представлено результати Вестерн-блот-аналізу білкових лізатів
клітин лінії МТ-4 з використанням антитіл до проапоптичного білка Bad,
антиапоптичного білка Bcl-2, активної та неактивної форми каспази-9,
неактивної форми каспази-3, а також в-актину.

Рис. 2. Вплив алкалоїдів чистотілу (дія протягом 24 год) на вміст
цитохрому с у мітохондріальній (А) та цитоплазматичній (Б) фракції
клітин лінії МТ-4: 1 – контроль; 2 – сангвінарин 0,8 мкг/мл; 3 –
хелідонін 5 мкг/мл; 4 – хелеритрин 2 мкг/мл; 5 – коптизин 20 мкг/мл.
(Тут і надалі вибрані концентрації речовин близькі до ІС50).

Під впливом сангвінарину та хелеритрину спостерігається зниження рівня
білка Bcl-2 (у межах 15 % відносно контролю). Після 6 год дії хелідоніну
на клітини лінії МТ-4 спостерігали зменшення кількості білка Bcl-2 з
молекулярною масою 25 кДа, що відбувалось за рахунок появи додаткової
смуги, яка була чітко виражена на 24 год інкубації клітин з хелідоніном
і, за даними літератури, є результатом фосфорилювання цього білка.

Під впливом хелідоніну протягом 24 год на клітини МТ-4 спостерігали
зростання рівня білка Bad приблизно у 2,5 рази, порівняно з контролем
(рис. 3). Під впливом сангвінарину через 6 год інкубації рівень білка
Bad зростав приблизно у 1,7 рази, проте знижувався на 24 год (порівняно
з дією на 6 год). Хелеритрин у концентрації 2 мкг/мл призводив до
зростання рівня білка Bad приблизно у 1,3 рази. На 24 год інкубації
клітин з коптизином у концентрації 10 мкг/мл спостерігали зростання
рівня білка Bad приблизно в 1,7 рази порівняно з контролем.

Всі досліджувані алкалоїди зумовлювали активацію ініціюючої каспази-9
(рис. 3). Вже через 6 год дії сангвінарин та хелеритрин зумовлювали
зменшення попередника активної форми каспази-9 на 90 та 80 % порівняно з
контролем, відповідно. Хелідонін на 6 год дії на клітини спричиняв
зниження вмісту попередника активної форми каспази-9 приблизно на 15 %,
а на 24 год дії алкалоїду вміст неактивної форми становив 70 % відносно
контрольного рівня. Як видно з рис. 3, на 24 год дії коптизину у
концентрації 10 мкг/мл приблизно на 30 % знижується рівень попередника
активної форми каспази-9. Найбільший рівень активної форми каспази-9
спостерігали на 6 год дії сангвінарину та на 24 год дії хелідоніну. На
24 год інкубації клітин лінії МТ-4 з сангвінарином вміст активної форми
каспази-9 зменшувався порівняно з дією цього алкалоїду протягом 6 год.
Як видно з рис. 3, під впливом хелеритрину у концентрації 2 мкг/мл також
спостерігається зростання вмісту активної форми каспази-9.

Під впливом сангвінарину протягом 6 год спостерігали зменшення вмісту
попередника активної форми каспази-3 приблизно на 65 %, а на 24 год дії
вміст прокаспази-3 зменшувався на 90 % порівняно з контролем. На 6 та 24
год дії хелеритрину вміст прокаспази-3 зменшувався приблизно на 60 %
порівняно з контролем. При використанні хелідоніну в концентрації 5
мкг/мл рівень прокаспази-3 у клітинах лінії МТ-4 знижувався на 20-25 %
порівняно з контролем.

Рис. 3. Вплив алкалоїдів чистотілу на вміст білків-регуляторів апоптозу
у клітинах лінії МТ-4: 1 – контроль; 2 – сангвінарин, 0,8 мкг/мл (6
год); 3 – сангвінарин, 0,8 мкг/мл (24 год); 4 – хелідонін, 5 мкг/мл (6
год); 5 – хелідонін, 5 мкг/мл (24 год); 6 – хелеритрин, 2 мкг/мл (6
год); 7 – хелеритрин, 2 мкг/мл (24 год); 8 – коптизин, 10 мкг/мл (24
год).

У результаті роботи встановлено, що у клітинах лінії CCRF-CEM під
впливом хелідоніну, крім активації ініціюючої каспази-9, відбувається
також значна активація каспази-8. Відомо, що каспаза-8 відповідальна за
рецептор-опосередкований шлях апоптозу та ініціюється шляхом зв’язування
лігандів із рецепторами TNFR1, CD95, TRAIL тощо (Lavrik I. et al, 2005).

На рис. 4 представлено результати вивчення впливу алкалоїдів чистотілу
на фрагментацію білка PARP-1 у клітинах лінії CCRF-CEM із використанням
антитіл до його фрагменту з молекулярною масою 85 кДа, який утворюється
у процесі апоптозу після його специфічного розщеплення каспазою-3.
Найбільший ефект на фрагментацію цього білка виявляв хелідонін.

Рис. 4. Вплив алкалоїдів чистотілу на фрагментацію білка PARP-1 у
клітинах лінії CCRF-CEM (час інкубації з алкалоїдами 24 год): 1 –
контроль; 2 – сангвінарин 0,5 мкг/мл; 3 – хелеритрин 0,5 мкг/мл; 4 –
хелідонін 2 мкг/мл; 5 – хелідонін 10 мкг/мл; 6 – коптизин 10 мкг/мл.

Після 24 год інкубації клітин із хелідоніном у концентраціях 2 та 10
мкг/мл у 8 разів зростала кількість фрагментованої форми білка PARP-1
порівняно з контрольним рівнем. Сангвінарин та хелеритрин (0,5 мкг/мл)
проявляли слабший ефект (порівняно з хелідоніном) на фрагментацію
PARP-1, адже кількість фрагментованої форми цього білка була тільки у 4
рази вищою порівняно з контрольним рівнем (рис. 4).

Дія алкалоїдів чистотілу на мітохондріальному рівні. Морфологічні зміни
у мітохондріях клітин лінії CCRF-СЕМ під впливом алкалоїдів досліджували
на 6 та 24 год їхньої дії. На рис. 5 представлено електронні
мікрофотографії клітин лінії CCRF-CEM після їх інкубації з алкалоїдами.
Як видно з рис. 5, сангвінарин та хелеритрин викликають значні
морфологічні зміни структури мітохондрій. Вже на 6 год дії цих
алкалоїдів має місце порушення структури внутрішньої мітохондріальної
мембрани, на що вказує зменшення кількості крист та їх „зморщування”.
Інший алкалоїд хелідонін на 6 год дії не викликав помітних змін у
морфології мітохондрій.

Рис. 5. Вплив алкалоїдів чистотілу на морфологію мітохондрій клітин
лінії CCRF-СЕМ лімфоми людини (6 год, х 15000). 1 – контроль; 2 –
хелеритрин, 1 мкг/мл; 3 – сангвінарин, 0,6 мкг/мл; 4 – хелідонін, 5
мкг/мл.

? 1/4 3/4 B

|

B

|

E

„@

^„@

d?th^„`„?

oaaaooooUoooIIooooooooo

,редньому на 83 % у порівняно з контролем. Коптизин мав слабший вплив на
кальцієву ємність мітохондрій, ніж сангвінарин та хелеритрин, оскільки
знижував накопичення кальцію мітохондріями в середньому на 72 %
порівняно з контролем. Хелідонін практично не впливав на кальцієву
ємність мітохондрій і зменшення цього показника відносно контролю
становило біля 10 %.

Подібну закономірність впливу досліджуваних алкалоїдів (кінцеві
концентрації 40 мкг/мл) було виявлено на швидкість окисного
фосфорилювання. У контролі його швидкість складала 57,5 нмоль ADP/хв на
мг білка. Сангвінарин та хелеритрин повністю пригнічували окисне
фосфорилювання у мітохондріях, а коптизин знижував його швидкість в
середньому на 61 %. За присутності колхаміну та хелідоніну швидкість
окисного фосфорилювання у мітохондріях становила в середньому 89 та 97 %
відносно контролю.

Встановлено, що на 3 год дії сангвінарину та хелеритрину (1 мкг/мл)
зростає кількість клітин, які втратили здатність накопичувати барвник
родамін-123 у мітохондріях на 55 % та 40 %, відповідно, у той же час на
24 год кількість таких клітин становить 95 та 75 %, відповідно. При
використанні цих алкалоїдів у концентрації 2 мкг/мл, вже на 3 год їх дії
спостерігали зменшення накопичення барвника у мітохондріях у більш ніж
90% клітин культури. Після 3 год інкубації з хелідоніном змін у
накопиченні родаміну-123 мітохондріями не спостерігалось. На 24 год дії
хелідоніну кількість клітин зі зниженим трансмембранним потенціалом
мітохондрій становила близько 35 %, причому на 48 год цей показник
зростав до 86 %.

Вже на 3 год дії сангвінарину та хелеритрину (2 мкг/мл) спостерігали
зниження вмісту ATP у клітинах CCRF-CEM до 4 нмоль/млн клітин порівняно
з 15 нмоль/млн клітин у контролі. При використанні хелідоніну у
концентрації 5 мкг/мл на 3 та 9 год дії виявлено достовірне зростання
вмісту ATP на 25-30 % порівняно з контролем. При дії коптизину протягом
3 та 9 год у концентраціях 5 та 20 мкг/мл достовірних змін вмісту ATP у
клітинах відносно контролю виявлено не було, проте при використанні
алкалоїду в концентрації 20 мкг/мл вміст ATP на 24 год у клітинах
знижувався до 8 нмоль/млн клітин, що становить 55 % відносно контролю.

Вплив алкалоїдів чистотілу на конформаційну стабільність та структурну
цілісність ДНК та хроматину. Виявлено, що сангвінарин і хелеритрини є
сильними інтеркаляторами у структуру ДНК клітин лімфоми NK/Ly і в
концентрації 20 мкМ викликають підвищення температури плавлення ДНК на
17,5 (С та 18,5 (С, відповідно (температура плавлення інтактної ДНК
становила 63,5 (С). У тій же концентрації коптизин підвищував
температуру плавлення на 3,5 (С. Хелідонін практично не впливав на
температуру термоденатурації ДНК.

Сангвінарин, хелеритрин та коптизин виявили здатність витісняти
метиловий зелений із його комплексу з ДНК, причому сангвінарин та
хелеритрин були значно ефективнішими, ніж коптизин. Це вказує на те, що
коптизин володіє меншою спорідненістю до ДНК лімфомних клітин NK/Ly
порівняно із сангвінарином та хелеритрином. Хелідонін не володів
здатністю до витіснення метилового зеленого з його комплексу з ДНК, що
вказує на відсутність у цього алкалоїду ДНК-інтеркаляторних
властивостей. Порівняння півмаксимальних ефектів витіснення різними
алкалоїдами метилового зеленого із його комплексу з ДНК показало, що
сангвінарин має у 1,6 рази вищу спорідненість до ДНК лімфомних клітин
NK/Ly, ніж хелеритрин. За показником витіснення метилового зеленого
останній є приблизно в 1,7 рази сильнішим інтеркалятором у структуру
ДНК, ніж дауноміцин, тоді як коптизин володіє приблизно у 13 разів
меншою спорідненістю до ДНК, ніж хелеритрин, і подібний за цим
показником до актиноміцину D.

За результатами електронної та флуоресцентної мікроскопії сангвінарин та
хелеритрин (дія протягом 6 год) зумовлюють агрегацію та конденсацію
хроматину клітини вздовж внутрішньої поверхні ядерної мембрани лімфомних
клітин лінії CCRF-CEM та МТ-4. Після 6 год інкубації клітин CCRF-CEM із
хелідоніном або коптизином у концентраціях, які відповідають ІС50,
помітних змін у структурі ядра виявлено не було. Такі ознаки апоптозу,
як високий ступінь конденсації хроматину у вигляді „чорної дірки” та
розпад ядра на окремі фрагменти, мали місце на 24 год дії хелідоніну.

Рис. 6. Електрофорез ДНК клітин лінії CCRF-СЕМ після 24 год їх інкубації
з алкалоїдами:1 – контроль; 2 – сангвінарин, 0,5 мкг/мл; 3 –
сангвінарин, 1 мкг/мл; 4 – хелеритрин, 0,5 мкг/мл; 5 – хелеритрин, 1,5
мкг/мл; 6 – коптизин, 1 мкг/мл; 7 – коптизин, 10 мкг/мл; 8 – хелідонін,
0,5 мкг/мл; 9 – хелідонін, 5 мкг/мл.

За результатами електрофорезу ДНК у гелі агарози (рис. 6), найбільш
вираженою здатністю викликати олігонуклеосомну фрагментацію ДНК клітин
CCRF-CEM володіли сангвінарин, хелеритрин та хелідонін.

Сангвінарин та хелеритрин виявляли найбільш виражений ефект на
формування ДНК-комет із високим ступенем фрагментації ДНК (3 та 4 клас
комет). Після 6 та 24 год інкубації клітин МТ-4 з сангвінарином або
хелеритрином у концентраціях 0,5 та 1 мкг/мл, відповідно, близько 7 %
клітин формували ДНК-комети (рис. 7). Після підвищення концентрації
сангвінарину до 1 мкг/мл, вже на 6 год 70 % клітин мали високий ступінь
пошкодження ДНК. Подібний ефект на формування ДНК-комет виявляв
хелеритрин у концентрації 4 мкг/мл, оскільки на 6 год кількість
ДНК-комет із високим ступенем пошкодження ДНК перевищувала 75%. Після 6
год інкубації клітин МТ-4 із коптизином чи хелідоніном відсоток
ДНК-комет був близьким до контролю (рис. 7). При дії коптизину на 24 год
кількість ДНК-комет із високим рівнем пошкодження ДНК становила близько
13%. Хелідонін на 6 год дії у концентрації 8 мкг/мл не впливав на
формування ДНК-комет клітинами МТ-4, проте цей показник зростав у
порівнянні з контролем на 24 год і становив близько 34 %.

Встановлено, що здатність алкалоїдів інтеркалювати у структуру ДНК
клітин лімфоми NK/Ly корелює з їх цитотоксичною активністю щодо цих
клітин (коефіцієнт кореляції становить 0,98) (Kaminskyy et al, 2006).
Аналіз отриманих даних також свідчить про подібну залежність між
здатністю алкалоїдів інтеркалювати в структуру ДНК і рівнем порушення
ними процесів поглинання катіонів кальцію і окисного фосфорилювання у
мітохондріях. Така подібність у характері впливу сангвінарину,
хелеритрину чи коптизину дозволяє висловити припущення, що вплив цих
алкалоїдів на дисипацію трансмембранного потенціалу мітохондрій може
бути пов’язаний з їхнім впливом на функції внутрішньої мітохондріальної
мембрани через посередництво мітохондріальної ДНК. Відомо, що ДНК цієї
органели контактує із внутрішньою мембраною мітохондрій у ділянці центру
ori (Albring M. et al, 1977, Borst P. et al, 1972).

Рис. 7. Вплив алкалоїдів чистотілу на пошкодження ДНК клітин лінії МТ-4
після 6 та 24 год інкубації за результатами мікроелектрофорезу ДНК
окремих клітин при слаболужному рН: 1 – контроль; 2 – сангвінарин, 0,5
мкг/мл; 3 – сангвінарин, 1 мкг/мл; 4 – хелеритрин, 1 мкг/мл; 5 –
хелеритрин, 2 мкг/мл; 6 – хелеритрин, 4 мкг/мл; 7 – коптизин, 10 мкг/мл.
8 – хелідонін, 8 мкг/мл

* – p < 0,05, ** – p < 0,01 Дані електронної мікроскопії свідчать про те, що під впливом сангвінарину, хелеритрину та хелідоніну клітини гинуть шляхом апоптозу. На це вказує конденсація ядра із утворенням агрегатів, які розміщені вздовж ядерної мембрани а також утворення аоптичних тілець (Лушников Е.Ф. и др. 2001, Cohen J. et al, 1993). Швидке зниження трансмембранного потенціалу мітохондрій під впливом сангвінарину чи хелеритрину у концентрації 2 мкг/мл призводить до втрати здатності синтезувати ATP, про що свідчить виявлене нами зниження рівня внутрішньоклітинного ATP на 60-80 %. Швидка втрата клітинами здатності синтезувати ATP може бути однією з причин загибелі клітин шляхом некрозу (Syntichaki et al, 2002). Відомо, що трансмембранний потенціал мітохондрій і продукція ними ATP залишаються непорушеними навіть після виходу цитохрому с із мітохондрій та ініціації активації каспаз (Waterhouse et al, 2001, Bossy-Wetzel et al, 1998). За результатами наших експериментів при використанні сангвінарину та хелеритрину у концентраціях нижчих за півмаксимальні летальні дози, вони, переважно, індукують апоптоз у лімфомних клітинах. Про загибель лімфомних клітин під впливом хелідоніну, сангвінарину, хелеритрину та коптизину шляхом апоптозу свідчать такі дані, як поява цитохрому с у цитоплазмі, активація каспазної системи, фрагментація репараційного ензиму PARP-1, підвищення рівня білка Bad. Хелідонін, на відміну від трьох інших досліджуваних алкалоїдів, не володів здатністю інтеркалювати у структуру ДНК та безпосередньо впливати на функції мітохондрій. За даними літератури механізмом його дії є деполімеризація мікротрубочок цитоскелету (Wolff et al., 1993). Відомо, що мітотична катастрофа супроводжується порушенням проникності мітохондріальної мембрани та активацією каспазної системи (Castedo et al, 2004). Отримані нами результати свідчать про те, що під впливом хелідоніну з’являється імунореактивна смуга білка Bcl-2 із зниженою електрофоретичною рухливістю. Можливо, що така модифікація білка відбувається шляхом його фосфорилювання, що є характерним для дії антитубулінових агентів (Haldar et al, 1995, Wang et al, 1999). Фосфорильована форма білка Bcl-2 зумовлює втрату ним здатності утворювати гетеродимер із проапоптичним білком Bax (Haldar et al, 1996). Зростання у клітинах рівня білка Bad під впливом хелідоніну також може призводити до інактивації антиапоптичних білків, які перешкоджають утворенню гетеродимерів Bax/Bcl-2 (Wang et al, 1999, Zha et al, 1996). Саме ця умова необхідна для виходу проапоптичних факторів із мітохондріальної мембрани у цитозоль (Jiang et al, 2000). Аналіз даних щодо фрагментації ДНК індивідуальних клітин показав, що сангвінарин та хелеритрин, які добре інтеркалюють у структуру ДНК, індукують фрагментацію ДНК вже на першу год своєї дії, причому значна фрагментація ДНК більшої частки лімфомних клітин спостерігається на третю год впливу цих алкалоїдів. Слід зазначити, що високий ступінь фрагментації ДНК індивідуальних клітин був наявним і при використанні алкалоїдів у високих концентраціях, які зумовлюють загибель клітин шляхом некрозу. Некротична загибель клітин під впливом високих концентрацій сангвінарину та хелеритрину, очевидно, пов’язана із порушенням цілісності мітохондріальної мембрани та втратою здатності мітохондрій синтезувати ATP. Можливо, у даному випадку, фрагментація ДНК зумовлена як проапоптичними чинниками, так і лізосомними ензимами (Broker et al, 2005). Отримані нами дані свідчать про те, що за механізмами біологічної дії на лімфомні клітини алкалоїди чистотілу можна поділити на два основні типи: алкалоїди, які викликають пошкодження ДНК та порушення функції мітохондрій (сангвінарин, хелеритрин та коптизин), та алкалоїд хелідонін, основним механізмом індукції апоптозу якого може бути вплив на функції білків родини Bcl-2 та білка цитоскелету тубуліну. ВИСНОВКИ У дисертаційній роботі проведено порівняльне дослідження механізмів індукції апоптозу лімфомних клітин під впливом чотирьох алкалоїдів чистотілу (сангвінарин, хелеритрин, коптизин, хелідонін). Виявлено найбільш ефективні індуктори апоптозу у культурі лімфомних клітин. Сангвінарин та хелеритрин проявляють найвищу цитотоксичну дію щодо лімфомних клітин людини ліній CCRF-СЕМ, Jurkat, МТ-4 та лімфоми миші NK/Ly in vitro. Пів-максимальний цитотоксичний ефект цих алкалоїдів знаходиться у межах 0,5-1,5 мкг/мл. Хелідонін та коптизин характеризуються помірною цитотоксичністю, а пів-максимальний цитотоксичний ефект хелідоніну близький до 3 мкг/мл і коптизину – 10 мкг/мл. Найбільш ефективними індукторами апоптозу у культурі лімфомних клітин є хелідонін, сангвінарин та хелеритрин. Індукція апоптозу сангвінарином, хелеритрином та коптизином реалізується за участю мітохондрій і супроводжується вивільненням цитохрому с із мітохондрій, активацією ініціюючої каспази-9 та ефекторної каспази-3. Апоптоз лімфомних клітин під впливом хелідоніну реалізується шляхом підвищення рівня проапоптичного білка Bad, вивільненням цитохрому с з мітохондрій, активації ініціюючої каспази-9 та ефекторної каспази-3. Реалізація апоптозу під впливом досліджуваних алкалоїдів відбувається також із залученням ініціюючої каспази-8. При дії на клітини лінії МТ-4 лімфоми людини хелідонін (2,5 мкг/мл) зумовлює достовірне зростання частки клітин у G2/M фазах (55 % порівняно з 19 % у контролі). У механізмах індукції апоптозу лімфомних клітин сангвінарином, хелеритрином та коптизином задіяні процеси інтеркалювання цих алкалоїдів у структуру ДНК, тоді як у хелідоніну властивості інтеркалятора відсутні він не взаємодіє з ДНК. Сангвінарин та хелеритрин індукують як апоптичну, так і некротичну загибель. Однією з причин некротичної загибелі клітини під впливом сангвінарину та хелеритрину є колапс трансмембранного потенціалу мітохондрій, який зумовлює блокування процесів окисного фосфорилювання та спряженого з ним синтезу ATP у мітохондріях. Сангвінарин та хелеритрин у концентрації 2 мкг/мл через 3 год дії призводять до зниження рівня ATP у клітинах лінії CCRF-CEM на 65-80 % порівняно з контролем. Хелідонін (5 мкг/мл) підвищує рівень внутрішньоклітинного ATP у клітинах лінії CCRF-CEM на 25-30 %, тоді як коптизин (5 мкг/мл) достовірно не впливає на вміст внутрішньоклітинного ATP. Сангвінарин та хелеритрин індукують ранні стадії апоптозу, про що свідчить активація ними компонентів каспазної системи та структурні зміни ядра вже на 6-ту год дії цих речовин. Апоптичні зміни ядра під впливом хелідоніну та коптизину виявляються на 24-ту год дії цих алкалоїдів на лімфомні клітини. СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Осип Ю.Л., Камінский В.О., Луцик М.Д., Стойка Р.С. Вплив складу розчинника та інтеркалюючих лігандів на конформаційну стабільність молекули ДНК // Медична хімія. – 2004. – Т. 6, № 3. – С. 30-33. (Дисертанту належить визначення впливу різних чинників на ДНК, виділення ДНК, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті). В.О. Камінський, М.Д. Луцик, Р.С. Стойка. Аналіз фрагментації ДНК індивідуальних клітин методом гель-мікроелектрофорезу: модифікація фарбування солями срібла для отримання постійних препаратів // Український біохімічний журнал 2005. – Т.77, № 6. – с. 89-92. (Дисертанту належить підготовка зразків для дослідів, розробка методу фарбування ДНК-комет, пошук та аналіз даних літератури, участь у написанні статті). Kaminskyy V.O., Lootsik M.D., Stoika R.S. Cytotoxic activity of various greater celandine alkaloids correlates with their DNA intercalating properties and ability to induce breaks in DNA of NK/Ly murine lymphoma cells // Central European Journal of Biology 2005. - Vol. 1, № 1. – P. 2-15. (Дисертанту належить визначення цитотоксичного ефектів алкалоїдів на досліджувані клітини, виділення ДНК, дослідження інтеркаляторної здатності алкалоїдів, проведення та аналіз ДНК-комет, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті). В.О. Камінський, Н.В. Крив’як, М.Д. Луцик, Р.С. Стойка. Вплив алкалоїдів чистотілу на кальцієву ємність та окисне фосфорилювання мітохондрій у залежності від здатності інтеркалювати в структуру ДНК // Український біохімічний журнал 2006. – Т.78, № 2. – с. 28–33 (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду, участь у експериментах, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті). Lutsik M. D., Kaminsky V. O., Stoika R. S. Determination of tumor cells response to chemotherapeutic drugs by different methods of quantitative evaluation of apoptosis // 5 Parnas Сonference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. – Kyiv. – April 29, 2005. – p. 125. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, оформленні тез). Завелевич М.П., Фільченков О.О., Храновська Н.М., Осип Ю.Л., Камінський В.О., Луцик М.Д., Стойка Р.С. Вплив хелідоніну, хелеритрину та сангвінарину на клітинний цикл лінії лімфобластної лейкемії людини МТ-4: порівняльний аналіз із їх ДНК-зв’язувальною здатністю // Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля. – Київ. – 31 травня-1 червня, 2005. – с. 67-69. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез). В. О. Камінський. Визначення чутливості пухлинних клітин до алкалоїдів із застосуванням тестів на пошкодження структури ДНК та хроматину // Сучасні проблеми біохімії та біотехнології. Київ. – червень, 2005. – с. 16 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез). Камінський В.О. Порівняльний аналіз проапоптичної активності індивідуальних алкалоїдів чистотілу. – Київ. – 2-3 лютого, 2006. – с. 37 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез). Фильченков А.А., Каминский В.А., Завелевич М.П., Стойка Р.С. Активация каспазной системы в клетках лимфобластного лейкоза человека при индукции апоптоза алкалоидами хелидонином и сангвинарином // Отечественные противоопухолевые препараты. – Москва. – 21-24 марта, 2006. – с. 6. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез). Каминский В.А., Фильченков А.А., Завелевич М.П., Храновская Н.М., Стойка Р.С. Сравнительный анализ апоптозиндуцирующего действия алкалоидов чистотела на клетки лимфобластного лейкоза человека // Отечественные противоопухолевые препараты. – Москва. – 21-24 марта, 2006. – с. 14. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез). Камінський В.О., Стойка Р.С. Проапоптична дія алкалоїдів чистотілу у культурі лімфомних клітин. // Конференція молодих вчених Інституту біології клітини НАНУ. –Львів. – 30 травня, 2006. – с. 6. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез). АНОТАЦІЯ Камінський В.О. Механізми індукції апоптозу у лімфомних клітинах під впливом алкалоїдів чистотілу. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11-цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2006. Дисертація присвячена вивченню механізмів індукції апоптозу під впливом чотирьох основних алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.) хелідоніну, сангвінарину хелеритрину та коптизину. Встановлено, що хелідонін, сангвінарин, хелеритрин та коптизин індукують апоптоз, який реалізується на мітохондріальному рівні, про що свідчить вивільнення цитохрому с з мітохондрій, активація каспази-9 та каспази-3. Індукція апоптозу лімфомних клітин під впливом цих алкалоїдів може реалізуватись також із залученням каспази-8, яка приймає участь у здійсненні рецептор-опосередкованого шляху апоптозу. У механізмах індукції апоптозу сангвінарином, хелеритрином та коптизином залучені їх пошкоджуючий вплив на мітохондрії та інтеркаляція у структуру ДНК лімфомних клітин. Сангвінарин і хелеритрин є сильними інтеркаляторами в структуру ДНК лімфомних клітин, спричиняють одно- та двониткові розриви в ланцюгах ДНК, знижують трансмембранний потенціал мітохондрій а також вміст ATP на ранніх етапах своєї дії. Хелідонін не інтеркалює у структуру ДНК лімфомних клітин, зупиняє клітинний цикл у G2/M фазі та активує проапоптичну дію білка Bad. Ключові слова: хелідонін, сангвінарин, хелеритрин, коптизин, апоптоз, проліферація, інтеркаляція, мітохондрії, ДНК-кометний аналіз, CCRF-CEM, NK/Ly, MT-4, ATP АННОТАЦИЯ Каминский В.А. Механизмы индукции апоптоза в лимфомных клетках под действием алкалоидов чистотела. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11-цитология, клеточная биология, гистология. – Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2006. Диссертация посвящена изучению механизмов индукции апоптоза под действием основных алкалоидов чистотела (Chelidonium majus L.) хелидонина, сангвинарина, хелеритрина и коптизина. Установлено, что сангвинарин, хелеритрин и коптизин индуцируют апоптоз, который реализуется на уровне митохондрий, следствием чего есть выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму, активация каспазы-9 и каспазы-3. Индукция апоптоза лимфомных клеток под действием этих алкалоидов может реализоваться также с привлечением инициаторной каспазы-8, которая принимает участие в рецептор-опосредованном пути апоптоза. В механизмах индукции апоптоза сангвинарином, хелеритрином и коптизином задействованы их интеркаляция в структуру ДНК, а также их влияние на функции митохондрий лимфомных клеток. Сангвинарин и хелеритрин являются сильными интеркаляторами ДНК лимфомных клеток, вызывают одно- и двунитевые разрывы в ДНК, понижают трансмембранный потенциал митохондрий и содержание ATP на ранних этапах своего действия. Хелидонин не интеркалирует в структуру ДНК лимфомных клеток, останавливает клеточный цикл в фазах G2/M и активирует проапоптическое действие белка Bad. Ключевые слова: чистотел, алкалоиды, хелидонин, сангвинарин, хелеритрин, коптизин, апоптоз, пролиферация, интеркаляция, ДНК-кометный анализ, CCRF-CEM, NK/Ly, MT-4, ATP. SUMMARY Kaminskyy V.O. Mechanisms of apoptosis induction in lymphoma cells by greater celandine alkaloids. Thesis for Ph.D. scientific degree on cytology, cell biology, histology 03.00.11, Institute of Cell Biology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2006. Dissertation is devoted to а study of the mechanisms of apoptosis induction by the main celandine (Chelidonium majus L.) alkaloids – chelidonine, sanguinarine, chelerythrine and coptisine. According to the ability to induce apoptosis in lymphoma cells the studied alkalopids can be placed in decreasing order: chelidonine, sanguinarine and chelerythrine. Coptisine possesses a weak apoptotic activity even used at high concentrations. Sanguinarine and chelerythrine induced apoptotic and necrotic type of cell death. In concentrations less than 2 мg/ml, these alkaloids predominantly induced apoptosis. They affected plasma membrane integrity in higher concentrations, induced rapid decreasing of the mitochondrial trans-membrane potential and decreased the intracellular level of ATP in the lymphoma cells which can be a reason of necrotic type of cell death. Sanguinarine and chelerythrine in concentration 2 мg/ml induced a decrease in the intracellular level of ATP in CCRF-CEM cells on 65-80 % comparing with the control. At the same time, the level of cells with low trans-membrane potential of mitochondria was 80-100 %. Sanguinarine, chelerythrine and coptisine induced a mitochondrial type of apoptosis. These alkaloids induced cytochrome c release from the mitochondrial membrane into the cytoplasm, where it activated initiator caspase-9 and effector caspase-3. Chelidonine also induced apoptosis of lymphoma cells at the mitochondrial level by activating the cytochrome c release from mitochondria and activating the caspase-9 and caspase-3. Another type of apoptosis was realized by alkaloids via an activation of receptor-dependent initiator caspase-8 in the lymphoma cells. The main mechanisms of cell death induction by sanguinarine, chelerythrine and coptisine are their intercalation into the structure of DNA and their effect on the function of mitochondria in lymphoma cells. Sanguinarine and chelerythrine possessed a strong DNA intercalating ability, induced single- and double-strand DNA breaks, decreased mitochondrial trans-membrane potential and ATP level at the early stages of their action. These alkaloids were the most cytotoxic towards all investigated lymphoma cell lines in vitro. The half-maximal dose of inhibition of proliferation towards different lymphoma cell lines for these alkaloids are 0.5-1.5 мg/ml. Sanguinarine and chelerythrine arrested cells in G1/S phases of the cell cycle. Coptisine had less ability to intercalate into DNA than sanguinarine and chelerythrine. Cytotoxic activity of alkaloids correlated with their DNA intercalating properties and ability to induce breaks in the DNA of murine NK/Ly lymphoma cells. Chelidonine had a moderate cytotoxic effect towards all investigated cell lines. This alkaloid had no ability to intercalate into the structure of DNA of lymphoma cells. In concentration 2.5 мg/ml it caused an increasing to 55 % of the quantity of cells in G2/M phases of cell cycle comparing with 19 % in control. This alkaloid induced predominantly cell death via apoptosis opposite to sanguinarine and chelerythrine which caused both apoptotic and necrotic types of cell death. The apoptotic action of chelidonine was realized via an increasing in the level of Bad protein. Apoptotic morphology of cell nucleus and formation of DNA comets have been revealed after 24 hours of alkaloid action. Key words: Chelidonium majus, alkaloids, chelidonine, sanguinarine, chelerythrine, coptisine, apoptosis, proliferation, intercalation, comet assay, ATP, CCRF-CEM, NK/Ly and MT-4. PAGE 1 PAGE 19

Похожие записи