НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

ВОЙТЕНКО НАНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.822:611.813.14

Кальцієва сигналізація в спінальних нейронах соматосенсорної системи в
умовах наявності ноціцептивних синдромів

03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,
Міжнародному Центрі молекулярної фізіології НАН України та Державному
університеті штата Айова (США)

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Ліманський Юрій Петрович,

зав. відділом фізіології стовбуру мозку Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів
Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук, професор

Макарчук Микола Юхимович,

зав. кафедрою фізіології людини і тварин Київського Національного
університету ім. Тараса Шевченка.

Провідна установа: Київський Національний Медичний університет ім.
О.О.Богомольця, кафедра фізіології.

Захист дисертації відбудеться 21.12.2004 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 19.11.2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Ідентифікація причин і розробка способів запобігання розвитку больових
синдромів при різних захворюваннях є принципово важливими задачами
сучасної фізіології. Незважаючи на величезну кількість
експериментального і клінічного матеріалу, який накопичено з цих проблем
за останні десятиліття (Лиманський 1986, Milan 1999), питання про те, як
формується біль, залишається значною мірою відкритим. Дослідження
механізмів, процесів і явищ у тих системах мозку, що сприймають і
обробляють інформацію про вплив больових факторів на організм, мають
забезпечити істотний прогрес у рішенні цієї задачі.

Механізми розвитку больових синдромів, таких як гіпералгезія та
алодінія, або, навпаки, втрати больової чутливості до теперішнього часу
вивчені недостатньо. Так, дані про зміни внутрішньоклітинного
метаболізму і, зокрема, кальцієвого гомеостазу, які відбуваються у
нейронах входу ноцицептивної системи при больових впливах, поки що
практично відсутні, хоча очевидно, що ці механізми мають відігравати
найважливішу роль у змінах передачі ноцицептивних сигналів, що
спостерігаються при нейропатіях та запаленнях різного генезу.

Також невідомо, порушення яких саме механізмів, котрі задіяні у
регулюванні концентрації вільного цитозольного кальцію ([Ca2+]i) у
клітині, мають первинне значення. Показано, що розлади клітинного
метаболізму Ca2+ відіграють істотну роль у розвитку порушень в секреції
інсуліну та його дії на організм при діабеті. Порушення кальцієвого
гомеостазу, вірогідно відіграють істотну роль у судинних ускладненнях,
що супроводжують діабет, таких як артеріальна гіпертензія, атеросклероз
та ангіопатії. Є підстави вважати, що пов’язані з діабетом зміни в
нервових тканинах можуть базуватися на модифікаціях кальційакумулюючої
функції мітохондрій та параметрів деполяризаційних кальцієвих сигналів і
призводити до анормального проведення больових імпульсів в первинних
сенсорних нейронах.

Таким чином, запалення і сенсорна діабетична нейропатія являють собою
такі патологічні стани організму, яки призводять до значних метаболічних
перебудов у різних клітинах організму, у тому числі й у нервових.
Розуміння принципів регуляції кальцію та їх змін при запаленні і діабеті
необхідно як для розширення нашого уявлення про виникнення сенсорних
нейропатій і больових синдромів, так і для знаходження шляхів їх
лікування. Тому логіка виконаної роботи полягала в поетапному вивченні
та порівнянні змін кальцієвої сигналізації у спінальних нейронах
соматосенсорної системи гризунів в умовах нейропатії та запалення, а
саме: (і) встановленні наявності порушень проведення больових сигналів
на рівні цілого організму; (іі) дослідженні функціонування молекулярних
механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу в ізольованих
соматосенсорніх нейронах та нейронах у зрізах спинного мозку тварин з
больовими синдромами; (ііі) порівнянні змін кальцієвого гомеостазу при
запаленні та нейропатії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології
нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України:
“Дослідження впливу різних нейромедіаторів на гомеостаз кальцію в
ізольованих нейронах мозку щурів”, «Зміни дії нейромедіаторів та
модуляторів гомеостазу кальцію в сенсорних нейронах щурів на різних
стадіях розвитку діабетичної нейропатії”, “Вивчення ролі потенціал- та
лігандкерованих кальцієвих каналів ізольованих сенсорних нейронів
дорсальнокорінцевих ганглиїв та нейронів дорсального рогу під час
розвітку больової нейропатії у щурів”, а також наукових тем Міжнародного
Центру молекулярної фізіології НАН України: «Дослідження молекулярних
механізмів гомеостазу кальцію в нервових клітинах під час ішемії та
діабету”, «Дослідження кальційової провідності глутаматних рецепторів
трансгенних мишей з нокаутованими генами цих рецепторів” та “Зміни
ефективності синаптичної передачі на різних рівнях нервової системи за
експериментально викликаних патологічних станів”.

Мета роботи.

Мета виконаної роботи полягала у виявленні і порівняльному аналізі змін
кальцієвої сигналізації та їх механізмів у первинних та вторинних
нейронах соматосенсорної системи (клітини дорсальнокорінцевих гангліїв
(ДКГ), та нейрони дорсального рогу (ДР) спинного мозку, відповідно)
тварин (гризунів) в умовах наявності експериментально викликаних
больових синдромів.

Задачі дослідження.

Визначити адекватність використання стрептозотоцинової моделі цукрового
діабету як моделі нейропатичного болю шляхом вимірів больової чутливості
щурів у нормі і при експериментально викликаному діабеті.

Провести порівняльний аналіз основних параметрів кальцієвих транзієнтів
у первинних і вторинному (ноцицептивних та неноцицептивних) сенсорних
нейронах здорових щурів і щурів із синдромами діабетичної нейропатії.

Визначити залежність змін кальцієвого гомеостазу у соматосенсорних
нейронах від терміну розвитку діабетичної нейропатії.

Провести порівняльний аналіз основних параметрів кальцієвих транзієнтів,
викликаних деполяризацією цитоплазматичної мембрани, у первинних
соматосенсорних нейронах здорових тварин і тварин з карагенініндукованим
периферичним запаленням.

Виявити зміни кальцієвих сигналів, які викликані вивільненням іонів
кальцію з внутрішньоклітинних органел сенсорних нейронів мишей і щурів
на тлі карагеніниндукованого запалення.

Вивчити функціонування іонотропних та метаботропних глутаматних
рецепторів в умовах викликаного карагеніном запалення.

Провести зіставлення змін кальцієвої сигналізації в соматосенсорних
нейронах при наявності больових синдромів запального і нейропатичного
походження.

Наукова новизна отриманих результатів.

У роботі вперше проведено порівняння модифікацій механізмів
внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації, котрі можуть лежати в
основі розвитку больових синдромів при запаленні і діабетичній
нейропатії. Виявлено зміни кальцієвого гомеостазу в первинних (нейрони
ДКГ) і вторинних (нейрони ДР) соматосенсорних нейронах, характерні для
станів як ноцицептивного, так і нейропатичного болю у гризунів.
Показано, що ці зміни відбуваються у функціях кальцієвих каналів і
внутрішньоклітинних кальцієвих депо досліджених нейронів мишей та щурів.
Вперше продемонстровано, що при больових синдромах амплітуди кальцієвих
транзієнтів, які індуковані кофеїном, АТФ та іономіцином, зменшуються, а
вхід іонів кальцію в цитозоль через іонотропні глутаматні рецептори
посилюється. Часовий перебіг цих змін чітко корелює з динамікою розвитку
алодінії та гіпералгезії після ініціації захворювання. Отримані дані
свідчать про можливість того, що зменшення кальційакумулюючої активності
эндоплазматического ретикулуму і мітохондрій може бути основним
фактором, відповідальним за процеси центральної сенситизації. Уперше
показані специфічні риси кальцієвої сигналізації у первинних і вторинних
соматосенсорних нейронах щурів з периферичним запаленням і цукровим
діабетом.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Результати, які отримані в роботі, мають як фундаментальне, так і
практичне значення. Порівняння роботи внутрішньоклітинних
кальційрегулюючих структур в умовах діабетичної нейропатії та запалення
істотно допомагають розумінню механізмів виникнення больових синдромів і
збагачують знання, що стосуються цих патологій.

Практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що вони
дозволяють зрозуміти, які саме механізми внутрішньоклітинного
кальцієвого гомеостазу у первинних і вторинних сенсорних нейронах
ушкоджуються при розвитку різних патологій, пов’язаних з виникненням
больових синдромів. Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть
стати основою для розробки високоселективних фармакологічних підходів до
лікування вищеназваних патологій. Є підстави вважати, що речовини, які
впливають на роботу кальцієвих каналів плазмалемми, кальцієвих насосів
ендоплазматичного ретикулуму і плазмалемми, а також можливі модулятори
кальцієвого уніпортеру мітохондрій можуть бути використані для лікування
сенсорних нейропатій у людей, які хворіють діабетом, а також для
зменшення страждань хворого на гостре і, можливо, хронічне запалення тих
чи інших тканин та органів.

Особистий внесок здобувача.

Автор поставила задачу досліджень і самостійно розробила методики
приготування тонких зрізів спинного мозку та ізоляції функціонально
повноцінних вторинних сенсорних нейронів, внесла ряд удосконалень у
методику проведення поведінкових тестів, а також самостійно виконувала
основну частину експериментів, здійснювала аналіз, статистичну обробку й
узагальнення результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами
опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г.Костюком, доктором медичних
наук О.П.Костюк, кандидатами біологічних наук Б.С.Сушко, О.В.Грищенко,
І.Кругликовим, В.Шишкіним, а також аспірантами Е.Потапенко и Л.Шутовим.
Біохімічні експерименти були виконані сумісно з доцентом кафедри
фізіології людини та тварин Львівського державного університету ім.
І.Франка к.б.н. Н.В.Федірко. У роботі використовували деяке унікальне
устаткування, яке було створено провідним інженером Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця С.І.Кабанченко.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації докладено на семінарах Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України, а також на міжнародних симпозіумах і
з’їздах: щорічних конференціях Американського Товариства Нейронаук, США
(Новий Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Маямі, 1999; Сан Діего, 2001;
Орландо, 2002; Новий Орлеан, 2003, Сан Дієго 2004); щорічних
конференціях Американського Біофізичного Товариства, США (Новий Орлеан,
1997; Новий Орлеан, 2000; Сан Антоніо 2003); спільному Богомолец-Ненскі
симпозіумі (Сулеєв, Польша, 2001); 33-м і 34-м міжнародних Конгресах
фізіологичних наук (Санкт-Петербург, Росія 1997; Крайстчерч, Нова
Зеландія, 2001); міжнародному семінарі по нейронаукам (Прага, Чехия,
2001); 37-м щорічнім засіданні Європейської Наукової Діабетичної
Асоціації (Глазго, Велика Британія, 2001); XIV міжнародному біофізичному
Конгресі (Буэнос-Айрес, Аргентина, 2002); 62-й Научній Сесії
Американської Діабетичної Асоциації (Сан-Францисько, США, 2002);
Ювілейній школі IBRO (Ялта, Україна, 2004), а також на засіданнях
сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України, 2000, 2001, 2002, 2003 и 2004 років.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 31 стаття у провідних вітчизняних і
закордонних журналах і 45 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів
досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих
результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 501
найменування. Робота викладена на 326 сторінках, містить 5 таблиць та
проілюстрована 60 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкти дослідження. В експериментах використовували модель
ноцицептивного болю, який викликано карагеніновим запаленням, та модель
невропатичного болю, що викликаний стрептозотоциновим (СТЗ) діабетом.
Для одержання моделі експериментального запалення ми використовували
самців щурів лінії Вистар віком 21 день (маса 30-35 г) або дорослих
мишей віком 2 місяця (маса 25-30 г). Запалення викликалося
внутрім’язовою ін’єкцією 100 мкл розчину карагеніна (Carrageenan Lambda,
Type ІV, Sіgma-Aldrich, США) у задню кінцівку (2 мг на 100 мкл 0.9 %
розчину NaCl для ін’єкцій, Галичфарм, Україна). Експозиція для розвитку
запалення становила 3 години. Контрольним тваринам того ж віку
ін’єкували аналогічний об’єм чистого 0.9% розчину NaCl. Для одержання
моделі експериментального діабету використовували самців щурів лінії
Вистар віком 21 день (маса 30-35 г). Діабет викликався одноразовою
внутрішньочеревинною ін’єкцією 80 мг/кг СТЗ, що був розчинений в
ізотонічному розчині NaCl. Ін’єковані СТЗ і контрольні тварини такого ж
віку утримувалися на однаковій дієті протягом усього періоду розвитку
захворювання; тварин брали в експеримент через 3-4 або 6-7 тижнів після
ін’єкції СТЗ. Концентрацію глюкози в плазмі крові, вимірювали за
допомогою оптичного сенсора глюкози (Roche Dіagnostіcs, Німеччина).
Концентрація глюкози в плазмі крові знаходилася в межах 5 — 9 мМ у
контрольних тварин і 14 — 28 мМ у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом.
Експерименти з тваринами були затверджені і проводилися відповідно до
вимог Клініки піддослідних тварин Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України.

Після експозиції, достатньої для розвитку запалення або діабету,
проводили стандартну процедуру ферментативного виділення сенсорних
нейронів ДКГ або ДР люмбального відділу (L4-L6) спинного мозку (Voitenko
et al. 2004). У разі індукції запалення нейрони ДКГ і ДР виділялися з
тієї сторони, у яку виконували ін’єкцію. Тонкі зрізи спинного мозку
готували за методикою Рандич і співавторів (Randіc et al. 1993). Для
цього під глибокою ефірною анестезією проводили ламінектомію та
препарували люмбосакральну ділянку спинного мозку (сегменти L4 -S1).
Відразу ж після цього фрагмент спинного мозку занурювали в охолодженій
до 4°С інкубаційний розчин, постійно насичуваний сумішшю 95% + O25% CO2,
у якому виконували подальші операції. Після очищення від твердої
мозкової оболонки, препарат прикріплювали до столика вібротома (Campden
Іnstruments, Велика Британія), за допомогою якого готували тонкі
фронтальні зрізи (300 мкм) сегментів L4-L6. Після приготування зрізи
витримували протягом принаймні 1 години в оксигенованому базовому
розчині при температурі 32°С.

Для дослідження змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію в
ізольованих нейронах ДКГ і ДР були використанні кальцієві барвники
іndo-1 та fura-2. В експериментах на недіалізованих клітинах
використовували мембранопроникні форми барвників (іndo-1/АМ та
fura-2/АМ). Для завантаження кальцієвих барвників були застосовані наші
оригінальні методики (Voitenko et al. 2000; Kostyuk et al. 2001;
Voitenko et al. 2004).

Встановлення наявності діабетичних нейропатій. Для встановлення
наявності відхилень в роботі нервової системи тварин з діабетом
використовували методи «формалінового тесту» та «гарячої поверхні».
Перший метод використовували для дослідження поведінкових реакцій тварин
при гострому болі, другий метод дозволяв досліджувати больові реакції
щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової
температурної чутливості.

Одночасна реєстрація трансмембранних струмів і внутрішньоклітинних
кальцієвих сигналів. Нейрони візуально ідентифікували, використовуючи
довгофокусний об’єктив NA 0.9, х60 (Olympus, Японія) і відеокамеру
Hamamatsu C2400, (Hamamatsu Corp., Японія) у режимі інфрачервоного
диференційно-інтерференційного контрасту. Іонні струми («пэтч-клэмп» у
конфігурації «ціла клітина») реєстрували з використанням неоплавлених
тонкостінних піпеток з боросілікатного скла (8-10MО; VWR Scіentіfіc,
США), підсилювача Lіst EPC7 (HEKA Electronics, Німеччина). Клітини,
котрі мали гладку поверхню мембрани і низький контраст, демонстрували
найкращі ознаки життєздатності нейронів, такі як потенціал спокою,
потенціал дії (рис. 1), вхідний опір і постійну часу мембрани. Після
одержання гігаомного контакту нейрони утримували при потенціалі -60 мВ.
Стимуляцію і реєстрацію електричних сигналів проводили з використанням
програмного забезпечення pClamp – 8.0 (Axon Іnstruments, США). Зміни
внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію визначали згідно зі
змінами флуоресценції барвника fura-2, яку вимірювали з використанням
охолоджуваної CCD камери (PXL; EEV-37-GІ, Photometrіcs, США) на довжині
хвилі 510 нм зі збуджуючим випромінюванням на довжині хвиль 360 та 380
нм. В разі використання барвника іndo-1 зміни внутрішньоклітинної
концентрації кальцію визначали як зміни флуоресценції на довжинах хвиль
400 та 500 нм за допомогою двох фотопомножувачів зі збудженням на
довжині хвилі 360 нм. Для виміру змін флуоресценції використовували
програмне забезпечення ІPLAB (Scanalytіcs, США) або Tida ( HEKA
Electronics, Німеччина).

Відносну зміну інтенсивності флуоресценції (R) на зазначених довжинах
хвиль застосовували для розрахування [Ca2+]i у цитозолі за формулою
Грінкевіча (Grynkiewicz G. et al. 1985):

[Ca2+]i = Kd · B · (R — Rmin) / (Rmax — R).

Значення констант, що входять у формулу (Kd, B, Rmin, Rmax), одержували
за допомогою калібрування відповідного експериментального устаткування.

Вимірювання активності Ca2+, Mg2+-АТФаз ДКГ і ДР. Мікросомальну фракцію
одержували шляхом диференціального центрифугування. Величину
АТФ-гідралазної активності визначали по кількості відщепленого
неорганічного фосфату Рi, вміст якого визначали за допомогою
модифікованого методу Фиске-Субарроу.

Розчини і реактиви. Інкубаційний фізіологічний розчин, що застосовували
у перебігу препарування спинного мозку, містив (мМ): NaCl — 125; KCl —
5; CaCl2 — 2.5; MgSO4 — 1.5; NaHCO3 — 25; KH2PO4 — 1.6; глюкоза – 10; рН
7.4. Температуру розчину підтримували на рівні 4°С протягом усього
процесу виділення і приготування зрізів. Базовий фізіологічний розчин,
що застосовували під час експериментальних процедур і завантаження
зрізів флуоресцентними кальцій чуттєвими зондами містив (мМ): NaCl —
128; KCl — 2; CaCl2 — 2.5; MgSO4 — 1.5; NaHCO3 — 25; KH2PO4 — 1.6;
глюкоза – 10; рН 7.4, в умовах постійного насичення сумішшю 95 % O2 + 5%
CO2; температуру розчину підтримували на рівні 32°С.
Внутрішньопіпетковий розчин, що використовували в електрофізіологічних
експериментах, містив (мМ): глюконат калію – 133; NaCl – 5; MgCl2 — 0.5;
HEPES-Na – 10; MgATP – 2; GTP — 0.1; fura-2 калієву сіль — 0.2-0.3; pН
7.3 доводили за допомогою KOH. Базовим позаклітинним розчином, який
використовували для ізольованих нервових клітин, перфузії
експериментальної камери і приготування інших позаклітинних розчинів,
був модифікований розчин Тироде наступного складу (мМ): NaCl – 140; KCl
– 2; MgCl2 – 2; CaCl2 – 2; HEPES – 10; глюкоза – 10; рН 7.4 доводили за
допомогою NaOH. Для одержання гіперкалієвого розчину 50 мМ Na+ у розчині
Тироде ізоосмотично заміщували 50 мМ K+. Безкальцієвий фізіологічний
розчин одержували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl2 у
базовому розчині на MgCl2, а також додаванням 1 мМ хелатора кальцію
EGTA. З метою запобігання можливого впливу потенціалів дії на генерацію
кальцієвих транзієнтів у всіх експериментах з тонкими зрізами спинного
мозку до базового розчину додавали 1 мкМ блокатора потенціалзалежних Na+
каналів тетродотоксину (ТТХ).

Аналіз даних. У процесі експерименту дані оцифровували аналого-цифровими
перетворювачами (Axon Іnstruments, США та HEKA Electronics, Німеччина) і
зберігали на твердому диску комп’ютера з використанням програмних
пакетів pClamp – 8.0, Axolab 3.0 (Axon Іnstruments, США), ІPLAB
(Scanalytіcs, США) та Tida ( HEKA Electronics, Німеччина). Аналіз даних
виконували з використанням аналітичних програмних продуктів (Clampex –
8.0, Axon Іnstruments; Tida HEKA Electronics; Origin 3.54, Microcal
Software; Excel 2000, Microsoft). У подальшому результати представлені
як середні значення ± середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n.
Вірогідність розходжень між значеннями визначали за критерієм
t-Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Больова чутливість щурів в нормі та зі СТЗ-індукованим діабетом У даних експериментах ми оцінювали зміни поведінкових реакцій щурів зі СТЗ-індукованим діабетом у відповідь на біль, викликаний підшкірною ін’єкцією формаліна (формаліновий тест). Досліди проводили на самцях щурів лінії Wistar двох груп: контрольної (10 тварин) й зі СТЗ - індукованим діабетом (7 тварин). При введенні формаліну (20 мкл 5% розчину), як у хворих, так і у здорових щурів розвивалися реакції неконтрольованого посмикування та активного лизання кінцівки, у яку був уведений формалін. При цьому характер розвитку даніх реакцій був достовірно різним у контрольних щурів й у щурів зі СТЗ-індукованим діабетом. У діабетичних щурів відповідь носила яскраво виражений двофазний характер; вона складалася з першої “гострої” фази, що тривала близько 10 хв, і другої “тонічної” фази, що була тривалою (85-90 хв), без яскраво виражених максимумів. У контрольних тварин значно менш виражена перша фаза; друга фаза, навпаки, проявлялася більш інтенсивно і мала яскраво виражений максимум на 40-45 хв. Реакції припинялися через 70-75 хв, тобто набагато раніше, ніж у діабетичних тварин. При застосуванні тесту “гаряча поверхня” ноцицептивну стимуляцію виконували, розміщуючи експериментальну тварину на поверхні, розігрітій до температури, здатної викликати больову реакцію. Як больові реакції ми розглядали посмикування кінцівок, що контактують з нагрітою поверхнею, і їх лизання. У перебігу експериментів було встановлено, що поріг больової чутливості у контрольних щурів і щурів зі СТЗ-індукованим діабетом статистично не відрізнявся; він складав 420 С. При підвищенні температури поверхні з 43 до 470 С, не спостерігалося достовірних розходжень у латентності больової реакції, проте при 480 С ці розходження ставали достовірними, (експерименти з подальшим збільшенням температури не проводилися з гуманних міркувань). Так, у щурів, розміщених на гарячій поверхні з температурою 480 С, час настання больової реакції склав 10 ± 0.8 с (n = 5) для контрольних тварин й 22 ± 1.5 с (n = 5), для діабетичних щурів (р < 0.001). Таким чином, ми спостерігали достовірне збільшення латентного періоду больової реакції у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом, що говорить про наявність у них термічної гіпоалгезії. Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ при діабетичної нейропатії Для експериментів по вивченню змін, що відбуваються на клітинному рівні, було взято 65 контрольних тварин й 73 тварин зі СТЗ-індукованим діабетом. Тварини з діабетом бралися в експеримент через 6-7 тижнів після введення СТЗ. Концентрація глюкози в плазмі крові склала у середньому 7.4 ± 1.2 мМ (n = 65) у контрольних тварин й 26.6 ± 1.8 мМ (n = 73) у щурів зі СТЗ-індукованим діабетом. Однією з найважливіших характеристик внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу є кінетика кальцієвих транзієнтів, які пов’язані з деполяризацією клітинної мембрани. Пікові значення кальцієвих транзієнтів характеризують вхід кальцію в клітину через потенціалзалежні кальцієві канали, а крива спаду таких транзієнтів описує динаміку виведення Ca2+ із цитозоля. Відкривання потенціалзалежних кальцієвих каналів є функцією зменшення мембранного потенціалу. Порівняння кальцієвих сигналів, які викликалися у тварин з діабетом і контрольних щурів короткочасною (3 с) деполяризацією нейронів ДКГ малого діаметра, показало що їхні основні характеристики, а саме базальний рівень [Ca2+]i, тривалість напівспаду (t0,5), а також рівень залишкового кальцію в цитозолі через 60 с після закінчення деполяризації (R60) достовірно відмінні. У середньому базальний рівень [Ca2+]i у малих нейронах ДКГ складав 76 ± 6 нМ (n=26) у контрольних тварин й 134 ± 11 нМ (n=29) у нейронах діабетичних щурів (p < 0.001). При порівнянні кінетики відновлення транзієнтного підвищення [Ca2+]i у відповідь на деполяризацію виявилося достовірне підвищення рівня залишкового кальцію на спаді такого транзієнту, але тільки в нейронах ДКГ малого діаметра (табл. 1). Величина R60 у нейронах щурів з діабетом склала 15 ± 3 % (n=17), тоді як у нейронах контрольних тварин аналогічне значення було 10 ± 1 % (n=19, p < 0.05). У великих нейронах ДКГ відповідні значення не розрізнялися одне від одного, навіть за збільшеної тривалості деполяризації. Для подальшої інтерпретації механізмів функціонування структур, що беруть участь у регуляції кальцієвого гомеостазу, ми досліджували вплив блокаторів різних кальцієвих каналів на кальцієві транзієнти, які викликано деполяризацією. Аплікація 50 мкМ блокатора кальцієвих каналів L-типу ніфедипипіну на нейрони ДКГ призводила до істотного зменшення амплітуди кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією. Як видно з табл. 1, ця депресія була значно сильнішою у діабетичних щурів у порівнянні з контрольними тваринами. У малих за розміром нейронах ДКГ нормовані амплітуди кальцієвих транзієнтів, які викликалися деполяризацією на тлі аплікації ніфедипіна, складали 64 ± 5 % (n = 11) у нейронах контрольних тварин і 46 ± 5 % (n=9) у нейронах діабетичних щурів, у порівнянні з величинами транзієнтів за відсутності згаданого агента. Розходження між значеннями у контрольних та діабетичних тварин були статистично достовірними (p < 0.05). У великих нейронах такі амплітуди знижувалися до 57 ± 6 % (n=16) і 34 ± 6 % (n=8), у контрольних і діабетичних тварин відповідно (p < 0.05). Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДКГ при діабетичної нейропатії Функціонування мітохондрій Для вивчення можливих змін у кальцієвої регуляції в нейронах ДКГ, яка реалізується мітохондріями, ми провели серію експериментів з використанням роз’єднувача протонного градієнта на мембрані мітохондрій карбоніл-цианід-m-хлорофеніл гідразона (СССР). Як було показано раніше, гіперкалієва деполяризація, яка реалізується на тлі дії СССР, істотно збільшує амплітуду [Ca2+]i транзієнтів: від 702 ± 62 нМ (n=19) у нормальних умовах до 1065 ± 105 нМ (n=14) у присутності СССР (p < 0.05). При порівнянні кальцієвих відповідей на деполяризацію в нормальних умовах і на тлі дії 10 мкМ СССР нами було виявлено, що в малих (ноцицептивних) нейронах ДКГ достовірна відмінність амплітуд [Ca2+]i транзієнтів при діабеті зникає (табл. 1). Відповідні амплітуди дорівнювали 799 ± 100 нМ (n=17) у нормальних умовах та 938 ± 142 нМ (n=22) під час дії СССР (p < 0.05). У великих нейронах ДКГ дані амплітуди істотно відрізнялися як у контролі, так і при діабеті (p < 0.05). У випадку, коли СССР аплікувався під час спаду кальцієвого транзієнту, то як при діабеті, так і у нормі, відбувався додатковий викид кальцію, який запасається мітохондріями під час підвищення [Ca2+]i, викликаного деполяризацією. І у великих, і у малих нейронах ДКГ діабетичних щурів ми виявили значне пригнічення даного викиду (табл. 1). Так, у великих нейронах ДКГ нормована амплітуда СССР - індукованого викиду зменшилася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 20% (n=10, p < 0.005). У малих нейронах ДКГ значення таких амплітуд становили в нормі 134 ± 22% (n=8), а при діабеті лише 68 ± 12% (n=6, p < 0.05). Дані результати свідчать, що при діабеті робота Na+/Ca2+-обмінника мітохондрій значно послаблюється. До того ж у малих нейронах це пригнічення ймовірно супроводжується ще й послабленням захоплення Ca2+ кальцієвим уніпортером. Функціонування ріанодинового депо ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) Досліджуючи роботу ріанодинового депо ЕР у нейронах ДКГ ми використали такий активатор ріанодинових рецепторів, як кофеїн у концентрації 20 мМ. Для виключення розбіжностей, які пов'язані з рівнем завантаженості кальцієвого депо ЕР, ми попередньо деполяризовали досліджувані клітини. Аплікація 20 мМ кофеїну до інтактних нейронів ДКГ (без попередньої деполяризації) призводила до транзієнтного збільшення [Ca2+]i у нейронах контрольних і діабетичних тварин (рис. 2А). ref SHAPE \* MERGEFORMAT Ми не виявили достовірної різниці між амплітудами кофеїніндукованих [Ca2+]i транзієнтів у нейронах здорових і діабетичних щурів до дії деполяризації (табл.1). У середньому амплітуди кофеїніндукованих [Ca2+]i транзієнтів складали 334 ± 48 нМ (n=21) у нейронах контрольних тварин і 354 ± 39 нМ (n=27) у нейронах діабетичних щурів (p > 0.1). Це свідчить
про те, що початковий обсяг кальцію в ЕР майже однаковий у нормі та при
діабеті. До цього, ефективність виведення кальцію через ріанодинові
рецептори, очевидно, не змінюється.

Як це показано на рис. 2А, амплітуди кальцієвих відповідей на кофеїн
після перезаповнення кальцієвих депо ЕР за допомогою деполяризації були
достовірно меншими при діабеті: 1083 ± 93 нМ (n=14) у порівнянні з 757 ±
72 нМ у контролі (n=16, p < 0.01). Можна припустити, що зниження амплітуд кофеїніндукованих відповідей після перезаповнення депо пов'язане з уповільненням роботи Са2+-АТФаз ЕР в умовах діабетичій нейропатії. Функціонування інозитолтрифосфат чутливого депо ЕР Для вивчення викликаних діабетом змін у вивільненні Ca2+ із іншого депо, яке існує у ЕР - інозитол-1,4,5-трифосфат(InsP3)-чутливого депо, ми використовували агоністи метаботропних пуринових і глутаматних рецепторів. Відомо, що активація деяких типів метаботропних (P2Y) пуринорецепторів призводить до збільшення рівня InsP3 у цитозолі, що призводить до збільшення [Ca2+]i за рахунок вивільнення Ca2+ з InsP3-чутливого кальцієвого депо. Як і у експериментах з вивільненням Ca2+ з ріанодин чутливих депо, ми дослідили ступінь завантаженості кальцієвих депо ЕР в стані спокою. Аплікація 200 мкМ АТФ на нейрони ДКГ, що перебували в спокої, у безкальцієвому позаклітинному розчині, призводила до підвищення [Ca2+]i у нейронах як діабетичних, так і контрольних тварин. Амплітуди транзієнтів, індукованих додаванням АТФ, у нейронах діабетичних тварин у порівнянні з контрольними не демонстрували істотних відмінностей. У середньому амплітуди цих транзієнтів становили 114 ± 18 нМ (n=11) для нейронів контрольних й 98 ± 19 нМ (n=12, p > 0.1)
для нейронів діабетичних щурів (табл.1). Отже, у нейронах ДКГ, які
знаходилися в спокої, InsP3-чутливі депо заповнені кальцієм приблизно до
однакового рівня і у діабетичних, і у контрольних щурів.

ref SHAPE \* MERGEFORMAT Наступним етапом наших досліджень був
аналіз амплітуд кальцієвих транзієнтів в умовах вивільнення Ca2+ з
InsP3-чутливих кальцієвих депо після їхнього перезаповнення,
індукованого гіперкалієвою деполяризацією. Аплікація 200 мкМ АТФ у
безкальцієвому позаклітинному розчині на малі (ноцицептивні) нейрони ДКГ
викликала кальцієвий транзієнт із середньою амплітудою 232 ± 47 нМ
(n=10) у контролі й 88 ± 12 нМ (n=13) у діабетичних тварин (рис. 3).
Таким чином, зниження амплітуди АТФ-індукованого вивільнення Ca2+ з
InsP3-чутливого кальцієвих депо склало 62 ± 5 % (p < 0.01). Іономіциніндукований викид кальцію з ЕР Для дослідження ємності кальцієвих депо ЕР ми використали антибіотик іономіцин. Відомо, що іономіцин є широко вживаним клітинним іонофором, котрий індукує високоспецифічну проникність іонів двовалентних металів й особливо кальцію (Liu and Hermann, 1978). У концентраціях менших або рівних 1 мкМ іономіцин зумовлює викид кальцію з обох типів депо ЕР згідно з ріанодин- та InsP3-незалежними механізмами (Morgan and Jacob, 1994). Додавання 1 мкМ іономіцину до безкальцієвого розчина призводило до транзієнтного збільшення рівня вільного внутрішньоклітинного Ca2+ у нейронах ДКГ як контрольних тварин, так і щурів з СТЗ-індукованим діабетом (рис. 4А). Щоб уникнути артефактів, які можуть бути пов'язані зі ступенем завантаженості кальцієвих депо ЕР, всі досліди з додаванням іономіцину проводилися після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення таких депо. Щоб уникнути артефактів, які можуть бути пов'язані зі ступенем завантаженості кальцієвих депо ЕР, всі досліди з додаванням іономіцину проводилися після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення таких депо. Так само, як і при дії інших активаторів викиду кальцію з депо, амплітуда [Ca2+]i транзієнтів під дією 1 мкМ іономіцину була значно меншою в нейронах діабетичних тварин; вона склала 236 ± 20 нМ (n=20) у контрольних нейронах й 116 ± 25 нМ (n=16) у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом. Різниця амплітуд була статистично достовірною (р < 0.001). Таким чином, середня амплітуда иономицин-індукованого [Ca2+]i транзієнту зменшувалася у нейронах тварин з експериментальним цукровим діабетом на 51 ± 5% у порівнянні з контрольними значеннями (табл.1). Таблиця 1. Параметри, визначені для нейронів ДКГ контрольних щурів та тварин із діабетичною нейропатією. Дані представлені в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р – параметр вірогідності. Параметр Контроль Діабет p Концентрація глюкози в плазмі крові, мM 7.4 ( 1.2 (n=65) 26.6 ( 1.8 (n=73) < 0.001 Рівень [Ca2+]i у спокої, нM 76 ( 6 (n=26) 134 ( 11 (n = 29) < 0.001 Амплітуда KCl-індукованого підвищення [Ca2+]i, нМ 702 ( 62 (n = 19) 799 ( 100 (n = 17) >0.09

Рівень залишкового [Ca2+]i на 60 с після закінчення деполяризації, % 10
± 1 (n = 19) 15 ± 3 (n = 17) < 0.05 Дія ніфедипіну на KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i в малих нейронах ДКГ, % 64 ± 5 (n = 11) 46 ± 5 (n = 9) < 0.05 Дія ніфедипіну на KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i у великих нейронах ДКГ, % 57 ± 6 (n = 16) 34 ± 6 (n = 8) < 0.05 KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i під час дії СССР в малих нейронах ДКГ, нM 1065 ± 105 (n=14) 938 ± 142 (n=22) < 0.05 СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i під час відновлення [Ca2+]i транзієнту в малих нейронах ДКГ, % від пікової амплітуди 134 ± 22 (n=8) 68 ± 12 (n=6) <0.05 СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i під час відновлення [Ca2+]i транзієнту у великих нейронах ДКГ, % від пікової амплітуди 235 ± 42 (n=12) 62 ± 20 (n=10) <0.005 Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i до деполяризації, нM 334 ± 48 (n = 21) 354 ± 39 (n = 27) >0.1

Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM
1083 ± 93 (n = 14) 757 ± 72 (n = 16) < 0.01 Амплітуда АТФ-індукованого підвищення [Ca2+]i до деполяризації, нM 114 ± 18 (n = 11) 98 ± 19 (n = 12) > 0.1

Амплітуда АТФ-індукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM
232 ± 47 (n = 10) 88 ± 12 (n = 13) < 0.01 Амплітуда іономіциніндукованого підвищення [Ca2+]i, нM 236 ± 20 (n = 20) 116 ± 25 (n = 16) < 0.001 Загальна активність Ca2+, Mg2+ -ATФаз, мкмоль год-1 мг-1 263 ( 43 (n=7) 113 ( 5 (n=6) < 0.01 Активність PMCA, мкмоль год-1 мг-1 216 ( 32 (n=7) 89 ( 4 (n=6) < 0.01 Активність SERCA, мкмоль год-1 мг-1 47 ( 14 (n=7) 24 ( 4 (n=6) < 0.01 Зміни кальцієвої сигналізації у нейронах ДР при діабетичній нейропатії У нейронах желатинозної субстанції ДР рівень базального [Ca2+]i склав в середньому 90 ± 4 нМ (n = 31) у контрольних тварин й 102 ± 6 нМ (n = 47) у тварин з діабетичною нейропатією. Деполяризація клітини викликалася додаванням гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К+ близько 50 мМ. Ми не виявили істотної міжгрупової різниці в значеннях пікових амплітуд або часу наростання кальцієвих транзієнтів, що викликані деполяризацією у контрольних і діабетичних тварин. Так, постійна часу наростання таких транзієнтів становила 3.5 ± 0.8 с (n = 28) і 3.9 ± 0.6 с (n = 38) у контрольній групи та у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом відповідно (p > 0.1) й описувалася
моноекспоненційною функцією.

Різниця між піковими значеннями кальцієвих транзієнтів, що викликані
деполяризацією, також не була достовірною. Відповідні значення склали
636 ± 36 нМ (n = 28) і 564 ± 51 нМ (n = 38, p > 0.1), у контрольних
тварин і тварин із діабетичною нейропатією відповідно (табл. 2). Основна
різниця характеристик [Ca2+]i транзієнтів у нейронах ДР була виявлена
нами щодо кінетики спаду таких транзієнтів, що відображає характер
вилучення Са2+ із цитозолю. Найбільш істотну різницю було виявлено в
значеннях рівню залишкового [Ca2+]i, який вимірювали на 90-й секунді
після початку деполяризації. Рівень залишкового кальцію був достовірно
вищім у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом і становив (у відсотках
пікового значення) 2.8 ± 0.5 % (n = 25) і 14.1 ± 1.2 % (n = 25) у
контрольних тварин і щурів з діабетичною нейропатією відповідно
(р<0.001; табл. 2). Отже, отримані результати дозволяють дійти висновку про наявність порушень кальційрегуляторної функції у вторинних нейронах соматосенсорної системи. Один з найбільш істотних шляхів підвищення цитозольного [Ca2+]i - це вхід Ca2+ через потенціал залежні Ca2+ канали клітинної мембрани. Для відкривання таких каналів ми використали дію позаклітинного розчину із підвищеною концентрацією (50 мМ) іонів K+, що призводить до деполяризації мембрани у нейронах даного типу до рівня -10 - 0 мВ. Для визначення внеску різних типів потенціалкерованих кальцієвих каналів у загальний деполяризаціцний [Ca2+]i транзієнт ми використали блокування різних підтипів каналів їхніми специфічними інгібіторами такими як ніфедипін й ?-конотоксин. Ефект ніфедипіну Аплікація 50 мкМ блокатора високопорогових кальцієвих каналів L-типу ніфедипіну, значно зменшувала амплітуду деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту у нейронах ДР. Амплітуда деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту під дією ніфедипіна склала 490 ± 36 нМ (n = 18) у нейронах контрольних тварин і 248 ± 21 нМ (n = 13) у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом (p < 0.001). Характерні деполяризаційні [Ca2+]i транзієнти під дією ніфедипіна наведені на рис. 5. Таким чином, амплітуда деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту під дією ніфедипіну зменшувалася у нейронах контрольних тварин на 31 ± 5 %, у той час як у нейронах тварин з експериментальним цукровим діабетом ефект ніфедипіну був виражений значно сильніше, і складав 65 ± 3 %. Дані результати свідчать про істотне збільшення блокуючого ефекту ніфедипіну на деполяризаційний [Ca2+]i транзієнт в умовах СТЗ-індукованого діабету (табл. 2). Ефект ?-конотоксину Для того щоб визначити подальші можливі зміни внеску потенціалкерованих кальцієвих каналів у генерацію деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту, ми використали специфічний блокатор високопорогових Ca2+ каналів N-типу ?-конотоксин GVIA. Амплітуда деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту у нейронах ДР на тлі дії 1 мкМ??-конотоксина склала 546 ± 29 нМ (n = 8) у контрольних умовах й 426 ± 25 нМ (n = 11) при діабеті (p < 0.01). Таким чином, дія ?-конотоксина призводила до зменшення амплітуди [Ca2+]i транзієнту, викликаного деполяризацією клітини, на 23 ± 4% у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів з експериментальним діабетом дане зменшення склало, як й у випадку з ніфедипіном, значно більше значення - 40 ± 3%. Дані результати свідчать про достовірне збільшення блокування кальцієвих каналів N-типу при генерації деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту в умовах СТЗ-індукованого діабету (табл. 2). Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДР при діабетичної нейропатії Функціонування мітохондрій Для дослідження впливу мітохондрій на кальцієву сигналізацію нейронів ДР ми застосовували блокування захоплення мітохондріями цитозольного Са2+ за допомогою СССР. Аплікація 10 мкМ СССР сама по собі не викликала достовірного підвищення [Ca2+]i у нейронах ДР у тонких зрізах спинного мозку. Якщо ж ми деполяризували клітину на тлі додавання СССР, то амплітуда викликаного збільшення [Ca2+]i була набагато вище ніж амплітуда кальцієвого транзієнту у відповідь на деполяризацію у нормальному розчині. Даний ефект пов'язаний з тим, що уніпортер мітохондрій заблокований і, отже, мітохондрії не беруть участь у захопленні іонів кальцію із цитоплазми, у той час як вхід через потенціалкеровані кальцієві канали зберігається незмінним. Так, амплітуда деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту у нейронах ДР на тлі дії 10 мкМ СССР склала 1249 ± 69 нМ (n = 22) у контрольних умовах і 827 ± 45 нМ (n = 22) при експериментально викликаному діабеті (p < 0.001). Таким чином, дія СССР призводила до збільшення амплітуди деполяризаційного [Ca2+]i транзієнту на 78 ± 15 % у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом це збільшення склало значно менше значення - 27 ± 8 % (табл. 2). Функціонування ріанодинового депо ЕР Додавання 30 мМ кофеїну до нейронів ДР призводило до транзієнтного збільшення вільного внутрішньоклітинного кальцію у нейронах як контрольних тварин, так й у нейронах тварин з діабетичною нейропатією. Як й у випадку нейронів ДКГ, всі дані по додаванню кофеїну до нейронів ДР отримували після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, що спричиняло перезаповнення депо. Інкубація зрізів спинного мозку протягом 5 хвилин у розчині, що не містить кальцію, не впливала на амплітуду кофеїн - індукованого кальцієвого транзієнту, що свідчить про винятково внутрішньоклітинну природу даного явища (n = 5 й 8 для нейронів контрольних і діабетичних тварин, відповідно). Однак, у середньому амплітуда [Ca2+]i транзієнтів, які викликалися аплікацією 30 мМ кофеїну, була значно меншою в нейронах діабетичних тварин і склала 268 ± 18 нМ (n = 17) у контрольних нейронах й 41 ± 8 нМ (n = 13) у нейронах щурів зі СТЗ-індукованим діабетом (p< 0.001). У декількох нейронах діабетичних тварин взагалі не було виявлено відповідей на додавання кофеїну (n = 6), у той час як у контрольний групі ми спостерігали відповіді в 100% досліджуваних нейронів. Таким чином, амплітуда кофеїніндукованого [Ca2+]i транзієнту зменшувалася на 85 ± 7 % у нейронах тварин з експериментальним цукровим діабетом відносно контрольних. Характерні [Ca2+]i транзієнти під дією кофеїну наведені на рис. 2Б. Таким чином, можна зробити висновок про драматичне зменшення викиду кальцію з ріанодинчутливого депо ЕР нейронів ДР при діабетичній нейропатії. Функціонування InsP3 - чутливого депо ЕР Дослідження функції кальційрегулюючих внутрішньоклітинних механізмів здійснювали за допомогою аплікацій АТФ і глутамата як у нормальному позаклітинному середовищі, так і під час відсутності в ньому іонів кальцію. Це дозволило виділити функцію метаботропних рецепторів у генерації відповідних кальцієвих транзієнтів. Як відомо, активація метаботропного рецептора призводить до виникнення клітинної відповіді по двох можливих шляхах: у першому вторинним посередником виступає цАМФ, у другому – InsP3. Нас цікавив саме другий шлях активації клітинної відповіді, тому що саме він призводить до викиду кальцію з депо за допомогою активації InsP3 рецептора ЕР. Амплітуда [Ca2+]i транзієнту під дією 200 мкМ АТФ у нормальному фізіологічному розчині склала 237 ± 24 нМ (n = 30) у нейронах ДР контрольних тварин і 226 ± 23 нМ (n = 17) у нейронах щурів з діабетичною нейропатією, причім різниця між амплітудами не була статистично достовірною (p > 0.1). Таким чином, амплітуда АТФ-індукованого [Ca2+]i
транзієнту не змінювалася у нейронах тварин з нейропатією у порівнянні з
нейронами контрольних щурів (табл.2). При додаванні 200 мкМ АТФ у
безкальцієвому розчині, навпаки, спостерігалося істотне зменшення
амплітуди кальцієвого транзієнту. Так, амплітуда [Ca2+]i транзієнту при
додаванні 200 мкМ АТФ до нейронів ДР в безкальцієвому розчині склала 156
± 14 нМ (n = 45) у контрольних умовах та 104 ± 6 нМ (n = 21) при
діабетичній нейропатії (p < 0.01). Зменшення амплітуди [Ca2+]i транзієнту при переході у безкальцієвий розчин склало 43 ± 6 % у нейронах контрольних тварин і 54 ± 5 % у нейронах щурів з діабетичною нейропатією. Амплітуда відповіді на додавання АТФ до нейронів ДР в безкальцієвому розчині у нейронах щурів з діабетичною нейропатією у порівнянні з нейронами контрольних тварин зменшилася на 34 ± 6 %. Характерні [Ca2+]i транзієнти, які були викликані дією АТФ у нейронах ДР у нормальному й безкальцієвому розчинах для контрольних і діабетичних тварин наведені на рис. 6А. Підсумовуючи отримані результати, можна стверджувати, що в нейронах ДР експресовані як іоноторопні (Р2Х), так і метаботропні (Р2Y) пуринорецептори. При розвитку діабетичній нейропатії відбувається перерозподіл їхнього внеску в генерацію [Ca2+]i транзієнта у бік збільшення внеску іонотропних рецепторів з 43 до 54%. Також відзначено суттєве зменшення викиду кальцію з InsP3 - чутливого депо ЕР у нейронах діабетичних тварин в порівнянні з контрольними щурами (табл.2). Аналогічні експерименти були проведені і для вивчення дії глутамата як на іонотропні, так і на метаботропні рецептори у нейронах контрольних і діабетичних тварин. Амплітуда [Ca2+]i транзієнтів під дією 100 мкМ глутамата в нормальному фізіологічному розчині склала 216 ± 19 нМ (n = 14) у нейронах ДР контрольних щурів й 145 ± 20 нМ (n = 7) у нейронах щурів з діабетичною нейропатією. Таким чином, амплітуди глутаматіндукованого [Ca2+]i транзієнту зменшувалися при розвитку нейропатії у тварин на 33 ± 5 %, і різниця в амплітудах була статистично достовірною (p < 0.01). При додаванні глутамата у безкальцієвому розчині ми також спостерігали достовірне зменшення амплітуди кальцієвого транзієнту. Так амплітуда [Ca2+]i транзієнтів при додаванні 100 мкМ глутамата до нейронів ДР в безкальцієвому розчині склала 176 ± 21 нМ (n = 13) у контрольних умовах й 80 ± 15 нМ (n=9) при діабетичній нейропатії (p < 0.01). Амплітуда кальцієвих відповідей на додавання глутамата до нейронів ДР в безкальцієвому розчині зменшилася на 54 ± 6 % у нейронах діабетичних тварин в порівнянні з контрольними. Характерні [Ca2+]i транзієнти наведені на рис. 6Б. Таким чином, при діабетичній нейропатії спостерігається зменшення кальціймобілізюучої функції як іонотропних, так і метаботропних глутаматних рецепторів у відповідь на збудження нейромедіатором. Також, як і у випадку з АТФ, спостерігається зменшення викиду кальцію з InsP3 - чутливого депо ЕР (табл.2). Іономіцин - індукований викид кальцію з ЕР Для вивчення ємності кальцієвого депо ЕР, ми використали антибіотик іономіцин. Додавання 1 мкМ іономіцина до нейронів ДР в безкальцієвому розчині, викликало транзієнтне збільшення вільного внутрішньоклітинного кальцію у нейронах як контрольних щурів, так і тварин з діабетичною нейропатією. Щоб уникнути артефактів, які можуть бути пов'язані з рівнем завантаження депо ЕР, всі досліди з додаванням іономіцину проводили після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення таких депо. Так само як і при дії інших активаторів викиду кальцію з депо ЕР, амплітуда [Ca2+]i транзієнтів під впливом 1 мкМ іономіцину була значно меншою в нейронах діабетичних тварин. Вона склала 188 ± 25 нМ, (n = 8) у нейронах контрольних щурів й 85 ± 13 нМ (n = 6) у нейронах тварин з діабетичною нейропатією. Різниця в амплітудах була статистично достовірною (р < 0.01). Амплітуда іономіциніндукованого [Ca2+]i транзієнту у нейронах тварин з діабетичною нейропатією зменшувалася на 55 ± 8 % порівняно з контрольними значеннями. Характерні [Ca2+]i транзієнти під дією іономіцина наведені на рис. 4Б. Всі вищенаведені результати досліджень свідчать про те, що викид кальцію з депо ЕР значно зменшується при активації кожного з перерахованих вище шляхів як за допомогою кофеїну, АТФ і глутамата, так і під дією іономіцина,. Можна припустити, що це явище пов'язане з уповільненням роботи Са2+, Mg2+-АТФаз ЕР. Діабет-індукована зміна активностей Ca2+, Mg2+-АТФаз ДКГ і ДР. У наступних експериментах нами були прямо виміряні питомі активності Ca2+, Mg2+-АТФаз плазматичної (PMCA) й ретикулярної (SERCA) мембран у мікросомальних фракціях ДКГ і ДР. Для цього відповідні тканини, узяті у 28 контрольних і 24 діабетичних щурів, розділили, відповідно, на 7 й 6 порцій. Реакція гідролізу АТФ ініціювалася додаванням 5 мМ АТФ у середовище, що містить мікросомальні фракції ДКГ і ДР. Для інгібування залишкової активності мітохондріального Са2+ уніпортера й Na+,K+-АТФази до всіх інкубаційних середовищ додавали 1 мМ азиду натрію і 1 мМ оуабаіну. Питому Са2+-АТФазную активність розраховували по різниці між кількістю неорганічного фосфору (Рi), звільненого в кальційутримуючому й безкальциевому (з додаванням 1 мМ ЭГTA) середовищах. Загальну Са2+-АТФазную активність розділяли на складові активності PMCA і SERCA шляхом додавання до інкубаційних середовищ 100 нМ селективного інгібітору SERCA тапсигаргіну. Таблиця 2. Параметри, визначені для нейронів ДР контрольних щурів та тварин із діабетичною нейропатією. Дані представлені в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р – параметр вірогідності. Параметр Контроль Діабет p Концентрація глюкози в плазмі крові, мM 7.4 ( 1.2 (n=65) 26.6 ( 1.8 (n=73) < 0.001 Рівень [Ca2+]i, у спокої, нM 90 ( 4 (n=31) 102 ( 6 (n = 47) >0.06

KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i, нM 636 ( 36 (n = 28) 564 ( 51 (n =
38) >0.09

Рівень залишкового [Ca2+]i на 90 с після початку деполяризації, % 2.8 ±
0.5 (n = 25) 14.1 ± 1.2 (n = 25) < 0.001 KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i під час дії ніфедипіну, нM 490 ± 36 (n = 18) 248 ± 21 (n = 13) < 0.001 KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i під час дії (-конотоксину, нM 546 ± 29 (n = 8) 426 ± 25 (n = 11) < 0.01 KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i під час дії СССР, нM 1249 ± 69 (n=22) 827 ± 45 (n=22) < 0.001 Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i, нM 268 ± 18 (n = 17) 41 ± 8 (n = 13) < 0.001 Амплітуда АТФ-індукованого підвищення [Ca2+]i, нM 237 ± 24 (n = 30) 226 ± 23 (n = 17) > 0.1

Амплітуда АТФ-індукованого (0Са) підвищення [Ca2+]i, нM 156 ± 14 (n =
45) 104 ± 6 (n = 21) < 0.01 Амплітуда глутаматіндукованого підвищення [Ca2+]i, нM 216 ± 19 (n = 14) 145 ± 20 (n = 7) < 0.01 Амплітуда глутаматіндукованого (0Са) підвищення [Ca2+]i, нM 176 ± 21 (n = 13) 80 ± 15 (n = 9) < 0.01 Амплітуда іономіциніндукованого підвищення [Ca2+]i, нM 188 ± 25 (n = 8) 85 ± 13 (n = 6) < 0.01 Загальна активність Ca2+, Mg2+ -ATФаз, мкмоль год-1 мг-1 55 ( 6 (n=7) 22 ( 6 (n=6) < 0.01 Активність PMCA, мкмоль год-1 мг-1 39 ( 4 (n=7) 15 ( 2 (n=6) < 0.01 Було виявлено, що концентрація Рі, яку виміряли на 300 секунді після ініціації реакції, суттєво зменшувалася при діабеті в тканинах як ДКГ, так і ДР (табл. 1, 2). У ДКГ загальна Ca2+, Mg2+-АТФазна активність становила 263 ± 43 мкМ ч-1 мг-1 у контролі й 113 ± 5 мкМ ч-1 мг-1 при діабеті. Питома активність РМСА становила 216 ± 32 мкМ ч-1 мг-1 й 89 ± 4мкМ ч-1 мг-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Питома активність SERCA становила 47 ± 14 мкМ ч-1 мг-1 й 24 ± 4мкМ ч-1 мг-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Таким чином, зменшення питомих активностей РМСА й SERCA при діабеті становило 63 ± 6 % й 50 ± 8 % відповідно (p < 0.01). Дуже схожа картина спостерігалася і у тканинах ДР: загальна Ca2+, Mg2+ АТФазна активність становила 55 ± 6 мкМ ч-1 мг-1 у контролі й 22 ± 6 мкМ ч-1 мг-1 при діабеті. Питома активність РМСА становила 39 ± 4 мкМ ч-1 мг-1 й 15 ± 2 мкМ ч-1 мг-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Питома активність SERCA становила 16 ± 3 мкМ ч-1 мг-1 й 11 ± 4мкМ ч-1 мг-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Таким чином, зменшення питомих активностей РМСА й SERCA при діабеті становило 60 ± 9 % й 48 ± 12 % відповідно (p < 0.01). Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах соматосенсорної системи на різних термінах розвитку діабетичної нейропатії. Для визначення залежності змін кальцієвого гомеостазу сенсорних нейронів від терміну розвитку діабетичної нейропатії ми провели серію експериментів, у яких порівнювали основні параметри кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ і ДР щурів з різними термінами розвитку діабету. У досліди були взяті 7 щурів через 4 тижні і 9 щурів через 7 тижнів після ін'єкції СТЗ. З розвитком діабету помітно погіршувалося самопочуття тварин. Вони втрачали вагу, у багатьох щурів розвивалася ретинопатія, підвищене сечовипускання. Тварини з великим терміном діабету більше часу витрачали на їжу і пиття. Рівень глюкози достовірно (р<0.05) зростав з 17.2 ± 2.9 мМ (4 тижні) до 26.6 ± 1.8 мМ (7 тижнів). Для визначення змін нейропатичних синдромів з розвитком діабету ми використовували тест "гаряча поверхня". При 48 градусах Цельсія латентність больової реакції була достовірно більшою у щурів з терміном розвитку діабету 7 тижнів у порівнянні з щурами, в яких діабет розвивався 4 тижні. Так, латентність больової реакції при 48° С склала 23 ( 2 с (n = 7) для щурів з 4-тижневим і 35 ( 7 с (n = 9) для щурів з 7-тижневим діабетом. (p < 0.05). Таким чином, ми спостерігали достовірне збільшення латентності больової реакції у тварин з більш пізнім терміном розвитку діабету, що говорить про посилення в них термічної гіпоалгезії (табл. 3). Основні показники внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу також змінювалися з розвитком захворювання. Так, базальний рівень [Ca2+]i в малих нейронах ДКГ і в нейронах ДР достовірно збільшувався на сьомому тижні розвитку захворювання, у порівнянні з 4-им. У середньому базальний рівень [Ca2+]i в малих нейронах ДКГ був 101 нM ( 4 нM (n=39) у тварин на 4 тижні розвитку діабету і 134 нM ( 11 нM (n=19) у щурів через 7 тижнів після ін'єкції СТЗ (p < 0.001). У нейронах ДР базальний рівень [Ca2+]i був у середньому 82 нM ( 17 нM (n=39) у тварин на 4 тижні розвитку діабету і 102 нM ( 6 нM (n=47) у щурів через 7 тижнів після ін'єкції СТЗ (p < 0.05). (табл. 3). Таблиця 3. Основні параметри змін при розвитку діабетичної нейропатії, визначені для нейронів ДКГ та ДР. Дані представлено в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р – параметр вірогідності Параметр Діабет 4 тижні Діабет 7 тижнів р Рівень глюкози в плазмі крові 17.2 ± 2.9 (n=7) 26.6 ± 1.8 (n=9) <0.05 Рівень [Ca2+]i у спокої, нМ в нейронах ДКГ 101 ±4 (n=39) 134±11 (n=19) < 0.001 в нейронах ДР 82±17 (n=39) 102±6 (n=47) < 0.05 Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i, нM в нейронах ДКГ 756±72 (n=16) 463±51 (n=26) < 0.001 в нейронах ДР 126±11 (n=15) 108±14 (n=17) < 0.05 Амплітуда іономіцин-індукованого підвищення [Ca2+]i, нM в нейронах ДКГ 98±23 (n=11) 116±26 (n=16) >0.6

в нейронах ДР 89±7 (n=19) 68±6 (n=17) <0.05 Латентний період больової реакції при температурі 48?С, с 23±2 (n=7) 35±7 (n=9) <0.05 Амплітуди кальцієвих відповідей на 20 мМ кофеїну у нейронах ДКГ, викликаних після перезаповнення кальцієвих депо ЕР за допомогою деполяризації, достовірно зменшувалися з 756 нM ± 72 нM (n=16) на 4 тижні розвитку діабету, до 463 нM ± 51 нM (n=26) на 7-му тижні (р < 0.001). Аналогічно, амплітуда [Ca2+]i транзієнтів, викликаних аплікацією 30 мМ кофеїну, у нейронах ДР достовірно зменшувалась з 126 нМ ( 11 нM (n = 15) на 4 тижні розвитку діабету до 108 нМ ( 14 нМ (n = 17) на 7-му тижні (р < 0.05, табл. 3). Прикладання 1 мкМ іономіцину до нейронів ДКГ і ДР у безкальцієвому розчині, призводило до транзієнтного збільшення [Ca2+]i в обох вікових групах тварин. Амплітуда [Ca2+]i транзієнтів під дією 1 мкМ іономіцина була меншою в нейронах тварин на більш пізніх термінах розвитку діабету, але тільки в нейронах ДР, і склала 89 нM ( 7 нM, (n = 19) на 4 тижні і 68 нM ( 6 нM (n = 17) на 7 тижні (р<0.05, табл. 3). У нейронах ДКГ різниця амплітуд іономіцин-індукованих транзієнтів була статистично недостовірною 98 нМ ( 23 нM, (n = 11) на 4 тижні і 116 нM ( 26 нM (n = 16) на 7 тижні (р > 0.6). Основні параметри зміни стану тварин і
кальцієвої сигналізації в нейронах соматосенсорної системи на різних
термінах розвитку діабетичної нейропатії представлені в таблиці 3. З цих
даних можна зробити висновок, що часовий хід розвитку діабетичної
нейропатії корелює з розвитком та посиленням абнормальностей
внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу як в первинних, так і у
вторинних соматосенсорних нейронах.

Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ, які викликані
карагеніновим запаленням

Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією нейронів ДКГ
великого й малого діаметрів у нормі та при запаленні, показало
відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик:
базального рівня [Ca2+]i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвих
транзієнтів, часу напівспаду (t0,5), а також рівня залишкового кальцію в
цитозолі на 60 с спаду деполяризаціонного транзіента (R60). Слід
зазначити, що достовірних змін амплітуди кальцієвих транзієнтів у
відповідь на деполяризацію цитоплазматичної мембрани не було виявлено як
у великих, так й у малих сенсорних нейронах. Для більш глибокого
дослідження можливих змін кальційрегулюючої ролі внутрішньоклітинних
кальцієвих депо нейронів ДКГ при запаленні ми застосували відповідні
експериментальні процедури, що дозволяють активувати викид і захоплення
Ca2+ ЕР і мітохондріями.

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДКГ при запаленні

Функціонування мітохондрій

Для визначення того, як змінюється ефективність функціонування
мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди деполяризаційних
[Ca2+]i транзієнтів у контрольних умовах і на тлі дії 10 мкМ СССР. При
цьому для всіх типів клітин не спостерігалося змін у співвідношенні
амплітуд даних Ca2+ відповідей у присутності та відсутності СССР при
запаленні в порівнянні з нормою. Однак аплікація 10 мкМ СССР на спаді
кальцієвого транзієнту викликала викид Ca2+ набагато меншої амплітуди
при запаленні, ніж у контрольних експериментах (табл. 4). Для великих
нейронів ДКГ амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду при
запаленні склала 38 ± 9 % (n=21) у порівнянні з 71 ± 10 % (n=25) у
контролі (p < 0.05); для малих нейронів ДКГ, відповідно, 49 ± 6 % (n=35) при запаленні та 84±15% (n=22) у контролі (p < 0.05). Отже, при запаленні ми спостерігаємо зменшення виведення кальцію мітохондріями в обох типах нейронів ДКГ, тоді як ефективність мітохондріального кальцієвого захоплення, очевидно, не змінюється. Функціонування ріанодинового депо ЕР ? ? & \ l n O , . † ? & \ O U d?]„1`„ ??????? ?x?x??&?? ??? \ ` b d ????????? ]„ay”kda ?????????? ?x?x????? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? q! „ ¤x ¤x]„ q! ???r???????? q! ? ???r???????? q! ? ???r???????? q! ?????x?x????? ?x?x?????? 86 нМ (n=8) у контролі до 123 ± 27 нМ (n=10, p < 0.05) при запаленні (табл. 4). У нейронах ДКГ контрольних тварин середня амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного кофеїном, була значно більшою після попередньої деполяризації цитоплазматичної мембрани за допомогою аплікації гіперкалієвого розчину. Це явище свідчить про перезаповнення кальцієвого депо за участю Ca2+-ATФази ЕР. Таблиця 4. Параметри, визначені для нейронів ДКГ контрольних тварин та тварин із периферичним запаленням. Дані представлено в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р – параметр вірогідності. Параметр Контроль Запалення p СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i під час відновлення [Ca2+]i транзієнту в малих нейронах ДКГ, % від пікової амплітуди 84 ± 15 (n=22) 49 ± 6 (n=35) <0.05 СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i під час відновлення [Ca2+]i транзієнту в великих нейронах ДКГ, % від пікової амплітуди 71 ± 22 (n=25) 38 ± 12 (n=21) <0.05 Амплітуда кофеїн-індукованого підвищення [Ca2+]i до деполяризації, нM 345 ± 86 (n = 8) 123 ± 27 (n = 10) < 0.05 Амплітуда кофеїн-індукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM 658 ± 139 (n = 8) 251 ± 32 (n = 14) < 0.001 Амплітуда АТФ-індукованого підвищення [Ca2+]i до деполяризації, нM 99 ± 15 (n = 12) 35 ± 3 (n = 9) < 0.005 Амплітуда АТФ-індукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM 158 ± 15 (n = 12) 60 ± 7 (n = 9) < 0.001 Після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою деполяризації, амплітуди [Ca2+]i транзієнтів, викликаних кофеїном, також достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних мишей. У середньому амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією кофеїну після деполяризації цитоплазматичної мембрани, становила 658 ± 139 нМ (n=8) у контролі і 251 ± 32 нМ (n=14, p < 0.001) при запаленні (табл. 4). Можна припустити, що зниження кофеїн-індукованих відповідей пов'язано або зі зниженням ефективності роботи ріанодинових рецепторів, або зі зменшенням кальційакумулюючої ємності самого ЕР. Вищенаведені результати ймовірно не пов'язані з уповільненням роботи Са2+-АТФази ЕР, оскільки відносні зміни кофеїніндукованих відповідей до та після перезаповнення депо достовірно не змінювалися. Так, збільшення відповідей на 20 мМ кофеїну за рахунок перезаповнення депо ЕР в нормі склало 48 ± 9 %, а при запаленні 41 ± 6 % (p>0.5).

Функцианування ІnsР3 депо ЕР

Для того, щоб викликати продукування ІnsР3 з наступним вивільненням
кальцію з ЕР через ІnsР3-рецептори ми проводили аплікацію 100 мкМ АТФ у
безкальцієвому розчині. У цьому випадку ситуація була цілком аналогічною
[Ca2+]i сигналам, викликанім кофеїном. Амплітуда АТФ-індукованого
кальцієвого транзієнту зменшилася з 98 ± 15 нМ (n=12) у контролі до 35 ±
3 нМ (n=9, p < 0.005) при запаленні (табл. 4). Після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою деполяризації амплітуди АТФ-індукованих [Ca2+]i транзієнтів також достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних тварин. У середньому амплітуда кальцієвих транзієнтів, викликаних аплікацією АТФ після деполяризації цитоплазматичної мембрани, становила 158 ± 15 нМ (n=12) у контролі та 60 ± 7 нМ (n=9, p < 0.001) при запаленні (табл. 4). Таким чином, можна зробити висновок, що при периферичному запаленні погіршується функція InsP3-чутливого депо ЕР нейронів ДКГ. Зміни кальцієвої сигналізації у нейронах ДР, які викликані карагеніновим запаленням Ця серія експериментів проводилася на гостро-ізольованих нейронах желатинозної субстанції ДР щурів. Рівень базального [Ca2+]i склав 75 ± 15 нМ (n = 90) і 82 ± 17 нМ (n = 85) для нейронів контрольних тварин і тварин з карагеніновим запаленням відповідно. Різниця в рівні базального [Ca2+]i статистично не відрізнялась в нейронах контрольних тварин та щурів з карагеніновим запаленням (p > 0.1). Для деполяризації клітин
використовували додавання гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів
К+ близько 50 мМ. Ми не виявили істотної різниці в значеннях пікових
амплітуд або часу наростання кальцієвих транзієнтів, викликаних
деполяризацією, у контрольних тварин і тварин з карагеніновим
запаленням. Так, постійна часу наростання [Ca2+]i транзієнтів становила
4.5 ± 0.7 c (n = 39) і 4.9 ± 0.6 c (n = 60) для контрольної групи і для
тварин з карагеніновим запаленням, відповідно, і описувалася
моноекспоненційною функцією. Різниця в пікових значеннях кальцієвих
транзієнтів, викликаних деполяризацією, також не була статистично
достовірною. Деяка різниця в характеристиці [Ca2+]i транзієнтів нейронів
ДР була виявлена нами під час описання кінетики спаду транзієнтів, яка
характеризує характер виведення Са2+ із цитозоля клітини. Найбільш
істотна різниця була встановлена у рівні залишкового [Ca2+]i, виміряного
на 15 та 30 секунді після закінчення деполяризації. Ця різниця зникала
на 60 секунді після закінчення деполяризації (табл. 5). Так, на 15
секунді після закінчення деполяризації рівень залишкового кальцію склав
у контрольних умовах 12.7 ± 1.5 % (n=39) від максимальної амплітуди
транзієнту, а в клітинах в умовах запалення 18.8 ± 2.1 % (n=60,
р<0.001). На 30 секунді рівень залишкового кальцію склав 6.5 ± 0.6 % й 9.3 ± 0.7 % відповідно (р<0.01), а на 60 секунді - 4.3 ± 1 % й 4.8 ± 1.2 % відповідно (р>0.1).

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДР при запаленні.

Функціонування мітохондрій

Для того, щоб проаналізувати можливий внесок мітохондрій у зміни
кальцієвої сигналізації сенсорних нейронів мишей при інфламаторному
болі, проводилася аплікація СССР, що припиняв накопичення іонів кальцію
мітохондріями. У контрольних клітинах аплікація 10 мкM CCCP перед
деполяризацією викликала збільшення амплітуди зростання [Ca2+]i,
індукованого деполяризацією, що свідчить про участь мітохондрій у
процесі швидкого захоплення іонів кальцію під час досягнення піка
транзієнту. Для визначення того, як змінюється ефективність
функціонування мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди
деполяризаційних [Ca2+]i транзієнтів у контрольних умовах і на тлі дії
СССР. При цьому для нейронів ДР не спостерігалося змін у співвідношенні
амплітуд таких Са2+ відповідей при запаленні в порівнянні з контролем.

Аплікація CCCP після досягнення піка транзієнта викликала додаткове
зростання [Ca2+]i, що свідчить про значний викид кальцію, що був
попередньо запасений мітохондріями. Однак у нейронах ДР тварин з
карагеніновим запаленням таке зростання було надзвичайно зниженим. У
середньому у нейронах ДР амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного
аплікацією CCCP після деполяризації, склала 36 ± 6 % (n=34) у контролі і
16 ± 4 % (n=9, р<0.05) при запаленні (табл. 5). Отримані дані свідчать про те, що запалення пов'язане з істотним зниженням мітохондріального захоплення нейронами ДР й наступним викидом кальцію в цитозоль. Функционування ріанодинового депо ЕР Додавання 30 мМ кофеїну до нейронів ДР призводило до транзієнтного збільшення вільного внутрішньоклітинного кальцію як у нейронах контрольних, так й у нейронах тварин з карагеніновим запаленням. Досліди по додаванню кофеїну проводилися як до, так і після короткочасної аплікації гіперкалієвого розчину, яка призводила до перезаповнення депо. Амплітуда [Ca2+]i транзієнту під дією 30 мМ кофеїну в стані спокою практично не відрізнялася в нейронах тварин з карагеніновым запаленням і складала 69 ± 13 нМ (n = 15) у нейронах контрольних тварин й 55 ± 11 нМ (n = 15, p > 0.1) у нейронах щурів з карагеніновым запаленням (табл. 5).
Однак, після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою
деполяризації, амплітуди кофеїн-індукованих [Ca2+]i транзієнтів
достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у
порівнянні з нейронами контрольних тварин. У середньому амплітуда
кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією кофеїну після
деполяризації цитоплазматичної

Таблиця 5. Параметри, визначені для нейронів ДР контрольних тварин та
тварин із периферичним запаленням. Дані представлено в вигляді: середнє
значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р –
параметр вірогідності.

Параметр Контроль Запалення p

Відновлення [Ca2+]i після закінчення деполяризації на 15 сек., % 12.7 ±
1.5 (n = 39) 18.8 ± 2.1 (n = 60) < 0.001 Відновлення [Ca2+]i після закінчення деполяризації на 30 сек., % 6.5 ± 0.6 (n = 39) 9.3 ± 0.7 (n = 60) < 0.001 Відновлення [Ca2+]i після закінчення деполяризації на 60 сек., % 4.3 ± 1.0 (n = 39) 4.8 ± 1.2 (n = 60) > 0.1

СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i під час відновлення [Ca2+]i
транзієнту в нейронах ДР, % від пікової амплітуди 36 ± 6 (n=34) 16 ± 4
(n=9) <0.05 Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i до деполяризації, нM 69 ± 13 (n = 15) 55 ± 11 (n = 15) > 0.05

Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM
302 ± 23 (n=15) 238 ± 41 (n=15) < 0.05 Кількість клітин, що відповіли на 1мкM DHPG, (%) 13 (n=16) 44 (n=17) Кількість клітин, що відповіли на 5 мкM DHPG, (%) 33 (n=16) 50 (n=17) Кількість клітин, що відповіли на 10 мкM DHPG, (%) 42 (n=14) 64 (n=18) Амплітуда NMDA-індукованого підвищення [Ca2+]i в дендритах, (F/F, % 50.1 ± 5.3 (n = 20) 63.7 ± 4.2 (n = 14) < 0.05 Амплітуда АМРА-індукованого струму, пA 198 ± 38 (n = 10) 498 ± 51 (n = 12) < 0.001 Амплітуда АМРА-індукованого підвищення [Ca2+]i в сомі, (F/F, % 25.6 ± 7.7 (n = 10) 54.9 ± 7.1 (n = 12) < 0.01 Амплітуда АМРА-індукованого підвищення [Ca2+]i в дендритах, (F/F, % 27.6 ± 6.5 (n = 9) 59.2 ± 7.1 (n = 12) < 0.001 Амплітуда КА-індукованого підвищення [Ca2+]i в сомі, (F/F, % 4.9 ± 1.7 (n = 9) 16.6 ± 4.1 (n = 10) < 0.05 Амплітуда КА-індукованого підвищення [Ca2+]i в дендритах, (F/F, % 7.6 ± 4.3 (n = 9) 22.2 ± 3.9 (n = 10) < 0.05 Амплітуда DA-індукованого підвищення [Ca2+]i в сомі, (F/F, % 3.1 ± 1.4 (n = 7) 19.8 ± 5.1 (n = 9) < 0.05 Амплітуда DА-індукованого підвищення [Ca2+]i в дендритах, (F/F, % 8.6 ± 2.5 (n = 7) 24.2 ± 3.7 (n = 8) < 0.05 мембрани, становила 302 ± 23 нМ (n = 15) у контролі та 238 ± 41 нМ (n = 15, p < 0.05) при запаленні. Таким чином, ми спостерігаємо драматичне зменшення викиду кальцію з ЕР нейронів ДР тварин з периферичним запаленням у порівнянні з нейронами контрольних щурів (табл. 5). Зміни функціонування глутаматних рецепторів нейронів желатинозної субстанції при карагеніновому запаленні. У даній серії експериментів ми використали метод одночасної реєстрації трансмембранних струмів і внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів у нейронах желатинозної субстанції в зрізах спинного мозку. У конфігурації “ціла клітина”, використовуючи піпетку, що містить флуоресцентний індикатор кальцію Fura-2, ми одночасно реєстрували агоністіндуковані струми в сомі нейронів ДР та зміни концентрації вільного кальцію як в області соми, так й в області проксимальних дендритів нейронів желатинозної субстанції. Експерименти проводили на тонких зрізах відділів L4 - L6 спинного мозку контрольних щурів (без запалення) і щурів, взятих в експеримент через 3 години після того, як ін’єкували карагенін у задню кінцівку тварини. У перфузійний розчин додавали 0.5 мкМ тетродотоксину (ТТХ) для блокування потенціал-залежних натрієвих каналів і спонтанного збудження. Ми не виявили достовірної різниці в основних електрофізіологічних характеристиках нейронів ДР у зрізах спинного мозку між контрольними щурами і тваринами з карагеніновим запаленням. Потенціал спокою нейронів складав -60.8 ± 0.8 мВ (n=55) у нейронах контрольних щурів й -61.3 ± 0.7 мВ (n=59) у нейронах щурів з карагеніновим запаленням (р > 0.5).
Амплітуда потенціалів дії становила 77.0±2.8мВ (n=35) у нейронах
контрольних щурів й 75.8±2.1 мВ (n=46) у нейронах щурів з карагеніновим
запаленням (р > 0.5). Вхідний опір нейрона був 451.7 ± 39.5 МОм (n=35) у
нейронах контрольних щурів й 491.3 ± 46.9 МОм (n=46) у нейронах щурів з
карагеніновим запаленням (р > 0.5).

Активація метаботропних глутаматних рецепторів (mGluR) у нейронах ДР.

Інформація про механізми кальцієвої сигналізації і їхній потенційній
участі в клітинній відповіді на активацію mGluR у нейронах ДР дотепер
відсутній. У даній частині роботи були досліджені кальцієві сигнали, які
викликані аплікацією 1-100 мкМ (S)-3,5-дигідрипіридину (DHPG), у
нейронах ДР спинного мозку. Дана речовина є специфічним агоністом mGluR
групи I. Експерименти проводили в присутності 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV, 10
мкМ 6-ціано-7-нітроквіноксалина-2,3-дііону (CNQX), 10 мкМ
6-нітро-7-сульфанойлбензо(f)квіноксалина-2,3-дііону (NBQX) для
блокування потенціал-залежних Na+-каналів, NMDA й AMPA/каінатного
підтипів іонотропних глутаматних рецепторів. У режимі фіксації
потенціалу аплікація 100 мкМ DHPG (90 с) викликала збільшення [Ca2+]i
одночасно в сомі та дендритах більшості досліджених нейронів ДР.
DHPG-активовані кальцієві сигнали були схожі за формою, яка складається
з початкового піка і фази повільного відновлення, але відрізнялися за
своїми кінетичними характеристиками (рис. 7А). У номінально
безкальцієвому зовнішньому розчині відповіді на DHPG зберігалися; при
цьому швидка транзієнтна компонента зникала, а повільна компонента
тільки зменшувалась. Число клітин, що відповідають на DHPG, достовірно
зростало в зрізах, отриманих з щурів з карагеніновим запаленням (рис.
7Б). Процентне співвідношення клітин (від загального числа тестованих
нейронів), що відповідають на додавання різних концентрацій DHPG
збільшенням базального рівня кальцію, у контрольних тварин склало: 1 мкМ
DHPG – 13 % (n=16); 5 мкМ DHPG – 3 % (n=16); 10 мкМ DHPG – 4 % (n=14). У
щурів з карагеніновим запаленням число клітин, що відповіли, суттєво
зростало: 1 мкМ DHPG — 44% (n=17); 5 мкМ DHPG — 50%, (n=17); 10 мкМ DHPG
— 64%, (n=18). Середнє підвищення базального рівня кальцію (вимірюваного
в одиницях -?F/F) у нейронів, що відповіли на аплікацію DHPG у нейронах
контрольних тварин, склало (рис. 7В): 1 мкМ DHPG — 102 ± 5 % (n=11); 5
мкМ DHPG — 124.1 ± 7.3 % (n=13); 10 мкМ DHPG — 156.5 ± 17.4 % (n=16).
При запаленні: 1 мкМ DHPG — 120.3 ± 6.7 % (n=14); 5 мкМ DHPG — 153.6 ±
10.6 % (n=15); 10 мкМ DHPG — 165.3 ± 14.9 % (n=7, табл. 5).

Активація NMDA рецепторів у нейронах ДР.

У даних експериментах ми досліджували дію агоністів іонотропних
глутаматних рецепторів NMDA типу на електричну активність і кальцієві
відповіді в нейронах ДР контрольних щурів і щурів з карагеніниновим
запаленням. Аплікація 25 мкМ NMDA (60 с) у відсутності іонів магнію
збільшувала рівень цитозольного кальцію в нейронах як контрольних, так і
щурів з карагеніновим запаленням, що свідчить про наявність
кальційпровідних NMDA рецепторів (рис. 8). У нейронах щурів з
карагеніновим запаленням амплітуда NMDA-індукованого [Ca2+]i транзієнту
зростала в дендритах, але не в сомі тестованих клітин (табл. 5).
Карагенінове запалення призводило до суттєвого зростання кальцієвого
транзієнту, викликаного аплікацією NMDA у дендритах нейронів на 26.2 ±
6.5% у порівнянні з нейронами контрольних щурів. У середньому амплітуда
кальцієвих транзієнтів викликаних аплікацією NMDA у дендритах нейронів
ДР, становила 50.1 ± 5.3 % (n = 20) у нейронах контрольних тварин та
63.7 ± 4.2 % (n = 14) при запаленні (p < 0.05). Не було виявлено достовірних змін ні в амплітудах NMDA-індукованих [Ca2+]i транзієнтів у сомі нейронів, ні в NMDA-індукованих струмах (табл. 5). AMPA-індуковані мембранні струми і [Ca2+]i транзієнти в нейронах ДР Добре відомо, що циклотіазид (ЦТЗ) помітно потенціює фармакологічні й функціональні відповіді, які викликано AMPA, запобіганням десенситизації AMPA-рецепторів (Partin et al, 1994). Для того, щоб запобігти десенситизації AMPA-рецепторів, яка потенційно може маскувати зміни AMPA-опосередкованих струмів і кальцієвих відповідей, викликаних запаленням, нами була перевірена дія АМРА на мембранні струми і [Ca2+]i транзієнти в нейронах ДР у присутності 20 мкМ ЦТЗ. Після інкубації зрізів в позаклітинному розчині, котрий містить 0.5 мкМ АМРА протягом 60 с у присутності 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV і 20 мкМ ЦТЗ, амплітуди AMPA-індукованих мембранних струмів у нейронах ДР були значно вище в клітинах щурів з карагеніновым запаленням, у порівнянні з контрольними щурами (рис. 9). У середньому амплітуди AMPA-індукованих струмів були 198.0 ± 38.2 пА (n=10) для нейронів контрольних щурів та 497.7 ± 50.8 пА (n=12) для нейронів щурів із запаленням (р<0.001). Порівняння нормованих амплітуд [Ca2+]i транзієнтів, зазначених величиною ?F/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих відповідей на АМРА значно збільшені в нейронах ДР щурів з карагеніновым запаленням у порівнянні з контрольними тваринами (табл. 5). У середньому амплітуди AMPA-індукованих змін флуоресценції в сомі були 25.6 ± 7.7 % (n=10) у нейронах контрольних тварин й 54.9 ± 7.1 % (n=12) при запаленні (р<0.01). У дендритах AMPA-індуковані [Ca2+]i транзієнти мали середні амплітуди 27.6 ± 6.5 % (n=9) у нейронах контрольних тварин та 59.2 ± 7.1 % (n=12) при запаленні (р<0.001). [Ca2+]i транзієнти, які викликано активацією каінатних (КА) рецепторів у нейронах ДР. Було показано, що КА рецептори не мають кальцієву провідність в нейронах ДКГ (Lee et al, 2001). Для того, щоб показати наявність такої провідності КА рецепторів, експресованих у нейронах желатинозної субстанції ДР, ми провели серію експериментів на генетично трансформованих (трансгенних) мишах. Ми використали мишей трьох трансгенних груп: 1) миші з нокаутованим 5-м типом КА рецептору (Glu5 k/o); 2) миші з нокаутованим 6-м типом КА рецептору (Glu6 k/o); 1) миші з нокаутованими 5-м й 6-м типами КА рецептору (Glu5/6 k/o). Аплікація 100-300 мкМ каінату в омиваючому розчині, що містить TTX, D-APV й 100 мкМ селективного блокатору АМРА рецепторів GYKI 53655, викликала вхідні струми й збільшення [Ca2+]i тільки в групах Glu5 k/o і контрольних мишей. У групах Glu6 k/o й Glu5/6 k/o мишей аплікація каінату не викликала ні трансмембранних струмів, ні збільшення [Ca2+]i. З отриманих даних можна зробити висновок, що Glu6 k/o тип каінатных рецепторів, експресований у нейронах желатинозної субстанції ДР спинного мозку, має кальцієву провідність. Показавши наявність кальцієвої провідності каінатних рецепторів у нейронах желатинозної субстанції дорсального рогу, ми провели серію експериментів у порівнянні КА-індукованих струмів та [Ca2+]i транзієнтів у нейронах нормальних тварин і щурів з карагеніновим запаленням. Аплікація 25-100 мкМ КА (60 с) до нейронів ДР щурів у присутності TTX і D-APV викликала вхідні струми та [Ca2+]i транзієнти як у сомі, так і у дендритах всіх тестованих клітин у зрізах контрольних щурів і щурів з карагеніновим запаленням. Після інкубації зрізів в позаклітинному розчині, що містить 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV та GYKI 53655, нами не було виявлено достовірних змін у КА-індукованих мембранних струмах нейронів щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з контрольними щурами (табл. 5). У середньому амплітуди КА-індукованих струмів становили 108.0 ± 20.2 пА (n=10) для нейронів контрольних щурів й 117.7 ± 20.8 пА (n=12) для нейронів щурів із запаленням (р > 0.5).

Порівняння нормованих амплітуд [Ca2+]i транзієнтів, зазначених величиною
?F/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих
відповідей на аплікацію 100 мкМ КА (60 с) значно збільшені в нейронах ДР
щурів з карагеіновим запаленням у порівнянні з контрольними тваринами. У
середньому амплітуди КА-індукованих змін флуоресценції в сомі складали
4.9 ± 1.7 % (n = 9) у нейронах контрольних тварин й 16.6 ± 4.1 % (n =
10) при запаленні (р < 0.05). У дендритах КА-індуковані [Ca2+]i транзієнти мали середні амплітуди 7.6 ± 4.3 % (n = 9) у нейронах контрольних тварин й 22.2 ± 3.9 % (n = 10) при запаленні (р < 0.05). Для підтвердження збільшення кальцій-провідної активності КА рецепторів при карагенініндукованому запаленні досліджували дію іншого, більш селективного, агоністу КА рецепторів домоївої кислоти (DА). Також, як і при дії КА, аплікація 3 мкМ DА (60 с) до нейронів ДР у присутності 1 мкМ TTX і 50 мкМ APV викликала вхідні струми і [Ca2+]i транзієнти як у сомі, так і дендритах всіх тестованих клітин у зрізах контрольних щурів і щурів з карагеніновим запаленням. Після інкубації зрізів в позаклітинному розчині, що містить 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV та 100 мкМ GYKI 53655, нами не було виявлено достовірних змін в DA-індукованих мембранних струмах нейронів щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з контрольними щурами (табл. 5). У середньому амплітуди DA-індукованих струмів були 82.0 ± 20.2 пА (n=10) для нейронів контрольних щурів й 91.7 ± 20.8 пА (n=12) для нейронів щурів із запаленням (р > 0.5).

Порівняння нормованих амплітуд [Ca2+]i транзієнтів, виражених величиною
?F/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих
відповідей на аплікацію 3 мкМ DA (60 с), як й у випадку дії КА, значно
збільшені в нейронах ДР щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з
контрольними тваринами (рис. 10C). У середньому амплітуди DA-індукованих
змін флуоресценції в сомі становили 3.1 ± 1.4 % (n = 7) у нейронах
контрольних тварин й 19.8 ± 5.1 % (n = 9) при запаленні (р < 0.05). У дендритах DA-індуковані [Ca2+]i транзієнти мали середні амплітуди 8.6 ± 2.5 % (n = 7) у нейронах контрольних тварин й 24.2 ± 3.7 % (n = 8) при запаленні (р < 0.05). Контрольні експерименти з розчином, що не містить карагеніну. Всі перераховані вище експерименти на нейронах мишей та щурів з карагеніновою моделлю запалення були повторені на нейронах тварин, яким робилась контрольна ін'єкція 0.9 % розчину NaCl того ж об’єму, але без карагеніну. Усі без винятку результати в обох типах клітин співпали з тими, які були одержані на нейронах здорових тварин. Отже, виявлені зміни були пов'язані винятково із впливом карагенінового запалення й не були наслідком підвищення тиску і появою набряку в кінцівці після ін'єкції, дії розчину NaCl, короткочасного ефірного наркозу або можливим стресом і болем, викликаними у тварини процедурою ін'єкції. АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ У роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що можуть лежати в основі розвитку центральної сенситизації при больових синдромах. Виконане дослідження дозволяє значно розширити наші знання про фізіологічні зміни, що відбуваються в нервових клітинах при різних патологічних станах. Крім того, воно може допомогти вирішити питання про походження больових синдромів при карагеніновому запаленні і діабетичній нейропатії, що дозволяє стверджувати про можливість клінічного застосування отриманих у цій роботі даних. В експериментах із тваринами, що страждають діабетичною нейропатієй, ми спостерігали як посилення больової реакції на гострий біль, так і ослаблення больової реакції на тонічну "інфламаторну" біль (формаліновий тест), а також наявність у діабетичних тварин термічної гіпоалгезії. Ці дані свідчать, що індукція діабету диференційовано змінює механізми, які відповідальні за різні типи болю. У багатьох роботах була показана наявність у діабетичних тварин різних форм прояву нейропатій, таких як тактильна гиперальгезія й алодінія, порушення чутливості до хімічних стимулів і ін. (Cesena & Calcutt 1999, Malmberg et al. 2003). Як видно, СТЗ модель цукрового діабету у щурів супроводжується значними змінами в больових реакціях, патофізиологічні причини яких не з'ясовані дотепер. Останнім часом, однак, усе більша увага приділяється порушенням кальцієвого гомеостазу, які, щонайменше супроводжують, а, можливо, є однією з головних причин, що призводять до розвитку діабетичних нейропатій. Показані в роботі зміни кальцієвого гомеостазу і збільшений рівень [Ca2+]і у соматосенсорних нейронах можуть призводити до безлічі процесів, які змінюють нейрональну активність. Було показано, що збільшений рівень [Ca2+]і ініціює підвищення викиду нейромедіаторів (Stanley 1997). Однак, збільшення рівня [Ca2+]і в нейронах ДР, може грати більш специфічну роль у їхній сенсибілізації. Недавні дослідження показали, що визначені кальційрегулюючі механізми, наприклад, потенціалзалежні Ca2+ канали і NMDA рецептори впливають на модуляцію нейронної діяльності, наприклад, у генерації внутрішньоклітинних медіаторів, NO і простагландинів (Robello et al. 1997), а також у модуляції експресії генів (Bіto et al. 1997). Таким чином, показана нами активація Ca2+ каналів L-типу та N-типу в ноцицептивних нейронах при діабеті (Voіtenko et al. 2000), а також іонотропних глутаматних рецепторів при запаленні (Voіtenko et al. 2004) може мати специфічне значення в модуляції сумарних повільних Ca2+ потоків, що сприяють поступовому і тривалому збільшенню збудливості нейронів. Крім того, L-тип Ca2+ каналів - важливе джерело наповнення тих внутрішньоклітинних кальцієвих депо, що модулюють транскрипцію генів за допомогою різних ядерних регулюючих елементів (Delmas & Brown 2002). З іншого боку, N- і P - типи Ca2+ каналів, що сконцентровані в поверхневих ламінах дорсального рога, беруть участь у синаптичній передачі, а, значить, відображають зміни, що відбуваються в терміналях периферійних аферентних волокон (Dіaz & Dіckenson 1997). При вивченні впливу патологій на ефективність роботи внутрішньоклітинних кальцієвих депо нами були виявлені значні зміни у функціонуванні мітохондрій і ЕР. У випадку карагениніндукованого запалення, як і при СТЗ-індукованої нейропатії, спостерігалося зниження амплітуди СCCP-індукованих відповідей на спаді деполяризаційних кальцієвих транзієнтів в обох типах досліджених нейронів (Voitenko et al. 2004, Svіchar et al. 1998). Порушення акумуляції Са2+ мітохондріями при запаленні і діабеті може порушувати синтез АТФ і змінювати співвідношення АТФ/АДФ. Цей процес може бути тісно пов'язаний із процесами надлишкового накопичування фосфору мітохондріями. У його присутності навіть незначне підвищення [Ca2+]m призведе до зниження мембранного потенціалу мітохондрій і буде сприяти припиненню синтезу АТФ (Nіcholls & Budd 2000). Оскільки участь мітохондрій у посттетанічній потенціації і виділенні нейромедіаторів було показано в деяких дослідженнях (Melamed-Book & Rahamіmoff 1998)(Stanton & Schanne 1986), то порушення роботи мітохондрій може відігравати істотну роль у виникненні діабетичних нейропатій. Вивчення кальційрегулюючої ролі ЕР при карагениновому запаленні і СТЗ-індукованної нейропатії виявило істотне зменшення амплітуди кальцієвого викиду у відповідь на додавання різних агонистів, таких як кофеїн, іономицин і АТФ у соматосенсорних нейронах щурів. Таким чином, ми, імовірно, маємо справу або зі зменшенням кальцієвої ємності ЕР, або з модуляцією ріанодинових і/чи InsP3 рецепторів, або з уповільненням роботи Са2+-АТФази ЕР. Зниження активності кальцієвого депо ЕР може являти собою протекторний механізм, що виникає у відповідь на могутню нейрональну і хімічну стимуляцію даних клітин при запаленні (Usachev et al. 1993). Прямий вимір активності Са2+-АТФаз у мікросомах ДКГ і ДР підтвердили нашу гіпотезу про переважаючу роль зміненої активності SERCA у зменшенні кальцієвого викиду з ЕР при діабетичної нейропатії. Зменшення активності як SERСA, так і PMCA у первинних і вторинних сенсорних нейронах може також пояснювати збільшення базального рівня кальцію в даних нейронах і уповільнення його відновлення після деполяризації. Те, що уповільнення виводу кальція з цитозоля відбувається в ноцицептивних нейронах, може бути однієї з причин виникнення змін больової чутливості при діабеті, оскільки підвищений рівень базального кальцію може впливати на процеси потенціації сигналізації нейрона і модулювати частоту передачі сенсорної імпульсації (Konnerth et al. 1992). Часовий характер змін функції внутрішньоклітинних Са2+-акумулюючих структур при карагеніновому запаленні та діабетичній нейропатії добре корелює з розвитком алодінії і гипералгезії, що були досліджені в тому же інтервалі після індукції запалення або діабету (Stanfa & Dіckenson 1999, Stanfa & Dіckenson 1998, Sandkuhler 2004). Ці дані допускають можливість того, що зменшення Са2+-акумулючих активностей мітохондрій і ЕР може бути чинником, що робить вагомий внесок у процес центральної сенситизації. У природних умовах виявлені зміни можуть, у визначеній мірі, коректуватися частотою, кількістю і ритмічністю виділення нейромедіатора із синаптических закінчень первинних нейронів і посиленням його дії в умовах запалення або нейропатії. Про те, наскільки важливу роль у розвитку нейропатій грає кальцієве депо ЕР свідчить той факт, що спинномозкове введення ріанодина значно зменшувало амплітуду фази "гострого" болю при формаліновому тесті у діабетичних мишей (Kameі et al. 2000). У той же час на фазі "тонічного" болю при формаліновому тесті ріанодин робив потенціюючу дію, причому у контрольних тварин не відзначалося достовірних змін при дії ріанодина ні в першій, ні в другій фазі формалінового тесту (Kameі et al. 2000). Оскільки при запаленні ми маємо справу з "тонічним" болем, то одержані в наший роботі відомості можуть дати ключ до пояснення змін, що спостерігаються в роботі кальцієвого депо ЕР при запаленні. Також у декількох роботах (Ohsawa & Kameі 1999) було показано, що спинномозкове введення ріанодина діабетичним мишам збільшувало тривалість реакції в taіl-flіck тесті, що наближало величину даного показника до здорових тварин. Це означає, що ріанодинове депо ЕР відіграє першорядну роль у розвитку термічної алодінії і гипералгезії, що може бути також використано для аналізу процесів, які відбуваються не тільки при діабеті, а й при різноманітних запаленнях. Таким чином, отримані нами результати свідчать про значні зміни кальційрегулуюючих функцій мітохондрій, кальцієвих каналів плазмалемми, а також ефективності роботи кальцієвого депо ЕР при периферичному запаленні і діабетичній нейропатії в первинних і вторинних ноцицептивних нейронах ссавців. Всі вищенаведені зміни у регуляції [Ca2+]i внутрішньоклітинними механізмами при запаленні та діабеті схематично наведені на рис. 10. Роль збуджуючих амінокислот у розвитку больових синдромів. Постсинаптичне збільшення Са2+ при синаптичній передачі – важливий пусковий механізм для короткочасних і довгочасних змін в ефективності синапсу (Bliss and Collingridge 1993). Основний об'єм передачі між первинними аферентами і нейронами ДР відбувається через постсинаптично розташовані глутаматні рецептори (Gerber et al. 1991). Активація глутаматних рецепторів являє собою інтегральну складову процесу, за допомогою якого при запаленні в переферійних тканинах встановлюються стани, що пов'язані із біллю, такі як алодінія та гіпералгезія (Millan 1999). Нещодавні наукові дослідження показали, що запалення за допомогою речовини Фрейнда (CFA) викликає підсилення експерсії субодиниць глутаматних рецепторів у ланцюгу ствола мозку, що регулює біль (Guan 2003). Це може вносити вклад до змін пластичності після тривалого вхідного больового сигналу (Stanfa and Dickenson 1999). Повторна стимуляція первинних аферентів, чи больова стимуляція, як було показано, викликає синаптичну пластичність в дорсальному розі спинного мозку (Randic 1996), а іонотропні глутаматні рецептори і кальцій беруть участь у явищах сенситизації та змінах ефективності синапсу між первинними і вторинними ноцицептивними нейронами (Bliss and Collingridge 1993). Глютаматні NMDA, АМРА і КА іонотропні рецептори відіграють ключову роль у синаптичній передачі аферентних сигналів. Зміни активності NMDA-рецепторів, викликають виникнення синдромів підвищеного болю, наприклад нейропатичного болю (Isaev 2000). Було показано, що антагоніст NMDA- рецепторів МК-801 може запобігати чи звертати розвиток алодінії, яка може виникати внаслідок прямих змін внутрішньоклітинного рівню кальцію чи змін в екзоцитозі. При хронічній гіпергликемії активація NMDA рецепторів в нейронах DRG і ДР (ламіни І і ІІ) пов'язана із зниженим больовим порогом. NMDA рецептори можуть також бути знайдені на тормозних інтернейронах, функціональне ушкодження яких також може відігравати роль при нейропатії. NMDA канали тісно взаємодіють із рецепторами нейрокініну-1 і простагландинами і можуть модулюватися оксидом азоту. Взаємодія всіх цих факторів може збільшити тяжкість гіпералгезії (Low 1999). Крім того, гіперосмотичний стан (можливо, внаслідок збільшення внутрішньоклітинного рівня натрію) може відігравати рол в надмірній активації NMDA (Nachemson and Bennett 1993). Відповідно, антагоністи NMDA можуть викликати зменшення термічної гіпералгезії. Існують дані, що за умов діабету збільшується активність NMDA рецепторів тільки тих нейронів, які містять субстанцію P (Garrison 1993). Резюмуючи, можна сказати, що представлені дані можуть вказувати на можливі клітинні механізми, що лежать в основі змін проведення і обробки ноцицептивної інформації в дорсальному розі спинного мозку, що безпосередньо може віддзеркалюватись на поведінкових больових реакціях щурів. Представлені в роботі дані вперше показують, що клітинні механізми, що лежать в основі інфламоторного болю, можуть бути опосередковані синаптичною і нейрональною пластичністю, що є результатом тривалого посилення NMDA, АМРА і/чи КА-індукованих кальцієвих транзієнтів із наступною активацією внутрішньоклітинних каскадів в ДР спинного мозку щурів. Аналогічні дані були отримані на нейронах ДР щурів із нейропатієй (Isaev 2000). Таким чином, наші дані підтверджують нейромодуляторну роль ендогенної глутаматергічної системи в функціонуванні нейронів ДР спинного мозку і в супутньою запаленню і нейропатії центральній сенситизації. Опираючись на літературні дані і власні результати, можна запропонувати наступну схему підвищення сенсорної чутливості спінальних нейронних механізмів: ноцицептивна імпульсація викликає підвищений вхід іонів кальцію у первинні сенсорні нейрони; із терміналей первинних сенсорних нейронів відбувається звільнення глутамату і нейропептидів в дорсальному розі; потенціюються постсинаптичні NMDA та не-NMDA рецептори і пресинаптичні КА рецептори; деполяризуються нейрони ДР; збільшується вхід кальцію у ноцицептивні нейрони дорсального рога; відбувається експресія ранніх генів (наприклад, C-FOC генів), які забезпечують підвищену чутливість рецепторів до нейромедіаторів; підсилюється взаємодія Са2+ і PKС в процесі фосфорилювання мембранних протеїнів, включаючи білки іонних каналів і мембранних рецепторів; змінюється активність Са2+-АТФаз; змінюється активність кальцій-кальмодулін залежної NO-синтази і прдукції NO, що, в свою чергу, може призвести до змін активності гуанілатциклази і продукції цГМФ; збільшується утворення глутамату і, як наслідок, розвиток ефектів токсичності, що обумовлюють клітинну дисфункцію і навіть загибель клітин. Якщо деякі нейрони ДР функціонують як тормозні одиниці, їх виключення може викликати підвищення збудженості нейронів, і, як наслідок, центральну сенситизацію. Дана схема може стати певним орієнтиром для подальших досліджень функціональних змін в нервових структурах при розвитку різноманітних больових синдромів. Використання моделей больових синдромів у тварин необхідно для розуміння нейронних механізмів, котрі задіяні в розвиток хронічних больових станів у клінічних хворих. Розуміння принципів функціонування цих механізмів дасть надію розробити засоби для ефективного полегшення патологічних станів, пов'язаних із хронічними болями. Висновки. У представленій роботі вперше проведено порівняльний аналіз змін кальцієвої сигналізації в первинних (дорсальнокорінцеві ганглії) і вторинних (дорсальний ріг спинного мозку) соматосенсорних нейронів гризунів при станах експериментально викликаних нейропатичного і ноцицептивного болю. Зроблені наступні висновки: В експериментах проведених із використанням формалінового тесту і тесту "гаряча поверхня" виявилося, що больова і термічна чутливості щурів із СТЗ-індукованим діабетом істотно відрізняється від таких у контрольних тварин, що свідчить про правомірність використання СТЗ-індукованого діабету для моделювання нейропатичного болю. Концентрація вільного цитозольного кальцію ([Са2+]і) в первинних і вторинних соматосенсорних нейронах здорових тварин і тварин із карагеніновим запаленням істотно не відрізняється. При порівнянні [Са2+]і в первинних і вторинних соматосенсорних нейронах було знайдено, що цей параметр в нейронах ДКГ щурів з діабетичною нейропатією вірогідно віщій у порівнянні із нейронами контрольних тварин. В нейронах ДР цей параметр також демонструє тенденцію до збільшення, проте різниця не досягала статистичної достовірності. При карагеніновому запаленні достовірної різниці рівня залишкової [Са2+]і після деполяризації плазматичної мембрани нейронів ДКГ у порівнянні з нормою не спостерігається. Кінетика спаду кальцієвих транзієнтів, індукованих деполяризацією в нейронах ДР щурів із периферичним запаленням, істотно уповільнюється порівняно з такою у нейронах контрольних тварин. Рівень залишкової [Са2+]і на спаді кальцієвого транзієнта після припинення деполяризації в нейронах ДКГ і ДР щурів з діабетичною нейропатією вірогідно вищий, ніж у нормі. Амплітуда [Са2+]і транзієнтів, які викликано звільненням іонів кальцію із ріанодин- і ІnsР3-чутливих депо ЕР нейронів ДКГ і ДР, достовірно знижується як при діабетичній нейропатії, так і при периферійному запаленні (порівняно із такою у контрольних тварин). Активності Са2+-АТФаз плазматичної й ретикулярної мембран у мікросомальних фракціях ДКГ і ДР істотно зніжуються при діабетичній нейропатії. В нейронах ДКГ і ДР функціонування уніпортера мітохондрій значно пригнічується як при діабетичній нейропатії, так і при карагеніновому запаленні. Фармакологічне дослідження внеску потенціалкерованих кальцієвих каналів в генерацію [Са2+]і транзієнтів показало, що внесок кальцієвих каналів L- і N-типів зростає при діабетичній нейропатії, тоді як внесок каналів Т-типу залишається незмінним. Карагенінове запалення призводить до збільшення мембранних струмів і амплітуди кальцієвих транзієнтів, що викликані активацією АМРА- і КА-рецепторів в сомі і в проксимальних дендритах нейронів ДР. При цьому NMDA-індуковані струми і амплітуди кальцієвих транзієнтів достовірно збільшуються тільки в дендритах нейронів ДР. При карагеніновому запаленні збільшується кількість нейронів ДР, чутливих до активації групи І метаботропних глутаматних рецепторів. В той же час при діабетичній нейропатії амплітуди [Са2+]і транзієнтів, що викликані активацією метаботропних глутаматних рецепторів в нейронах ДР достовірно зменшуються. Динаміка змін кальцієвої сигналізації досить чітко корелює із розвитком алодінії і гіпералгезії, яки характерні для післязапального періоду. Часовий хід розвитку діабетичної нейропатії також корелює із розвитком та збільшенням порушень внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу як у первинних, так і у вторинних соматосенсорних нейронах. Виявлені порушення внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в первинних і вторинних соматосенсорних нейронах можна розглядати як один із загальних механізмів зміни передачі больових сигналів при ноцицептивному і нейропатичному болю. Список опублікованих праць за темою дисертації Н.Войтенко (2004) Кальциевая сигнализация при диабетической нейропатии. // Нейрофизиология, 36 (4), 331-336 Н.Федирко, Ю. Вац, И.Кругликов, Н.Войтенко (2004) Роль Ca2+,Mg2+-AТФаз в диабет-индуцированных изменениях кальциевого гомеостаза в ноцицептивных нейронах. // Нейрофизиология, 36 (3), 187-192 I.Kruglikov, O.Gryshchenko, L. Shutov, E. Kostyuk and N. Voitenko (2004) Mechanisms of diabetes–induced alterations in calcium homeostasis in primary and secondary nociceptive neurons: role of Ca2+ pumps. // Pfluger Archive, 448 (4), 395-401 E. Potapenko, E. Kostyuk, N. Voitenko, P. Kostyuk (2004) Alkalinization-induced changes in intracellular calcium in rat spinal cord neurons // Neurochemical Research, 29 (9), 1659-1665 N.Voitenko, G.Gerber, D.Youn, M.Randic (2004) Peripheral inflammation-induced increase of AMPA-mediated currents and Ca2+ transients in the rat substantia gelatinosa neurons // Cell Calcium, 35 (5), 461-469 О.Kopach, I.Kruhlykov, N.Voitenko, P.Kostyuk, N.Fedirko (2003) Permeabilized salivary gland cells as a model to study Ca2+-transporting systems of endoplasmic reticulum membrane // Fiziol Zh. 49 (5), 31-42 P. Kostyuk, E. Potapenko, I. Siryk, N. Voitenko, E. Kostyuk (2003) Intracellular calcium homeostasis changes induced in rat spinal cord neurons by extracellular acidification. // Neurochemical Research 28 (10), 1541-1545 V. Shishkin, E. Potapenko, E. Kostyuk, O. Girnyk, N. Voitenko and P. Kostyuk (2002) Role of mitochondria in intracellular calcium signaling in primary and secondary sensory neurones of rats. // Cell Calcium 32 (3), 121-130 I.Kruglikov, L.Shutov, E.Potapenko, P.Kostyuk and N.Voitenko (2002) Metabotropic purinoreceptors in rat dorsal horn neurons: predominantly dendritic location // Neurophysiology, 34 (2/3), 181-183. V. Shishkin, E. Potapenko, D.Puchkov, E. Kostyuk, N. Voitenko, and P. Kostyuk (2002) Dissimilar roles of the mitochondria in modulation of intracellular calcium signals in primary and secondary nociceptive neurons // Neurophysiology, 34 (2/3), 238-241. L.Shutov, I.Kruglikov, V.Shishkin, M.Borisovskaya, E.Kostyuk, and N.V.Voitenko (2002) Calcium release from the internal stores as a possible target for antinociceptive treatment in rats with experimentally-induced diabetes // Neurophysiology, 34 (2/3), 242-244. N.Fedirko, Ju.Vats, M.Klevets, I. Kruglikov, N. Voitenko. (2002). Neuronal control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology, 34 (2/3), 144-147. Y.Vats, N.Fedirko, M.Klevets, N.Voitenko (2002) Role of SH groups in the functioning of Ca 2+ -transporting ATPases regulating Ca 2+ homeostasis and exocytosis. // Neurophysiology 34(1), 5-12. I.Kruglikov, L.Shutov, E.Potapenko, N.Voitenko and P.Kostyuk (2001) Metabotropic purinoreceptors in rat dorsal horn neurones: predominant dendritic location. // NeuroReport 12 (16), 3503-3508 I.Kruglikov, L.Shutov, V.Shishkin, E.Kostyuk, E.Potapenko, N.Voitenko (2001) Intracellular mechanisms of changes in the functioning of rat sensory neurones with streptozotocin-induced diabetes mellitus. // Fiziol Zh. (Kiev) 47(5), 18-25. N.Fedirko, M.Klevetz, I.Kruglikov, N.Voitenko (2001) Mechanisms supporting calcium homeostasis in rat submandibular salivary gland acinar cells. // Neurophysiology 33(4), 252-259. E.Kostyuk, P.Kostyuk and N.Voitenko (2001) Structural and functional characteristics of nociceptive pathways and their alterations under conditions of neuropathy // Neurophysiology 33(4), 266-276. E. Kostyuk, N. Voitenko, I. Kruglikov, A. Shmigol, V. Shishkin, A. Efimov and P. Kostyuk (2001) Diabetes-induced changes in calcium homeostasis and the effects of calcium channel blockers in rat and mice nociceptive neurons. // Diabetologia 44 (10), 1302-1309 L.Shutov, I.Kruglikov and N.Voitenko (2001) Participation of intracellular Ca2+ stores in Ca2+ signalling in neurons of the thalamic laterodorsal nucleus of rat. // Neurophysiology 33 (2) 106-110 N.Voitenko, I.Kruglikov, E.Kostyuk and P.Kostyuk (2001) Calcium signalling in nociceptive neurons - effect of diabetes. // Calcium Signaling. M.Morad and P.Kostyuk (Eds.) IOS Press, Amstardam,145-150 P.Kostyuk, N.Svichar, N.Voitenko, V.Shishkin and E.Kostyuk (2001) The role of mitochondria in calcium signalling in mammalian sensory neurons. // Calcium Signaling. M.Morad and P.Kostyuk (Eds.) IOS Press, Amstardam, 203-208 P.Kostyuk, A.Efimov, E.Kostyuk, N.Voitenko, I.Kruglikov (2000) Changes in intracellular turnover of calcium ions in nociceptive neurons in experimental diabetes and influence of blockers of potential-dependent calcium channels upon them // Zhurn. AMN Ukrainy v.6 (4) 637-650 N.Voitenko, I.Kruglikov, E.Kostyuk and P.Kostyuk (2000) Effect of streptozotocine-induced diabetes on activity of calcium channels in rat dorsal horn neurons // Neuroscience 95 (2), 519-524. P.Kostyuk, A.Shmigol, N.Voitenko, N.Svichar, E.Kostyuk (2000) The endoplasmic reticulum and mitochondria as elements of the mechanism of intracellular signaling in the nerve cell // Neurosci Behav Physiol 30 (1), 15-18 N.Voitenko, E.Kostyuk, I.Kruglikov and P.Kostyuk (1999) Changes in calcium signalling in dorsal horn neurons in rats with streptozotocin - induced diabetes // Neuroscience 94 (3), 887-890. N.Voitenko, E.Kostyuk, I.Kruglikov, N.Svichar, V.Shishkin (1999) Changes in calcium signalling of mammalian nociceptive neurones under diabetes. // Fiziol Zh (Kiev), 45 (4), 45-54. U.Lalo, N.Voitenko, P.Kostyuk (1998) Iono- and metabotropically induced purinergic calcium signalling in rat neocortical neurons // Brain Research 799, 285-291 N.Svichar, V.Shishkin, E.Kostyuk and N.Voitenko (1998) Changes in mitochondrial Ca2+ homeostasis in primary sensory neurons of diabetic mice // NeuroReport 9 (6) 1121-1125 P.Kostyuk, A.Shmigol, N.Voitenko, N.Svichar, E.Kostyuk (1998) Endoplasmic reticulum and mitochondria as elements of mechanism of intracellular signaling in neurons // Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova 84(10):979-84 P.Kostyuk, N.Svichar, N.Voitenko, V.Shishkin and E.Kostyuk (1998) Role of mitochondria in Calcium Signalling in Mammalian Sensory Neurons // Neurophysiology 30 (4/5) 191-193 S.Kirischuk, V.Matiush, A.Kulik, N.Voitenko, P.Kostyuk & A.Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino-, (1-adreno and H1-histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Purkinje neurons // Neuroscience 73 (3), 643-647 Тези доповідей (за останні 4 роки) N.Voitenko, D.H.Youn, G.Gerber M.Randic (2004) Kainate receptors are involved in long-term synaptic plasticity in the spinal cord substantia gelatinosa. 34 th Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, CA, USA. #56.8 N.Voitenko, I.Kruglikov, V.Shishkin, E.Kostyuk, B.Sushko, L.Shutov, V.Snitsarev (2003) Alteration in calcium homeostasis in rat nociceptive neurons under diabetic neuropathy: effect of nimodipine treatment. 33 d Annual Meeting Society for Neuroscience, New Orleans, LU, USA. Illya Kruglikov, Leonid Shutov, Nataly Fedirko, Platon Kostyuk, Nana Voitenko (2003) PMCA and SERCA Contribute to Alteration of Ca2+ Homeostasis in Rat DH Neurons under Diabetic Neuropathy. 47 th Biophysical Society Meeting, San Antonio, TX, USA. #1896– poster V.A.Shishkin., P.G.Kostyuk, N.V.Voitenko (2002) Changes in calcium-regulating functioning of mitochondria in primary sensory neurones under diabetic conditions. 3rd Ukrainian Biophysical Society Congress, Lviv, Ukraine L.Shutov, I.Kruglikov, N.Voitenko (2002) Functioning of intracellular calcium stores is impaired in dorsal horn neurons under experimental diabetes. 3rd Ukrainian Biophysical Society Congress, Lviv, Ukraine N.Voitenko; V.Shishkin; E.Potapenko; E.Kostyuk; O.Girnyk; P.Kostyuk (2002) Mitochondria play a different role in modulation of calcium signaling in primary and secondary sensory neurons. 32 th Annual Meeting Society for Neuroscience, Orlando, FL, USA. #436.3 M.Randic, N.Voitenko, D.H.Youn, G.Gerber (2002) Peripheral inflammation modulates AMPA - and kainate - mediated currents and Ca2+ transients in substantia gelatinosa of the rat spinal dorsal horn. 32 th Annual Meeting Society for Neuroscience, Orlando, FL, USA. #36.7 Voitenko, N., Kruglikov, I., Shutov, L., Shishkin, V., Kostyuk, E. and Kostyuk, P. (2002) Relief of diabetes-induced changes in nociceptive system of nimodipine-treated rats. Diabetes, Suppl. 2, A195. V.Shishkin, N.Voitenko, E. Kostyuk and P.Kostyuk (2002) Interaction of Ca2+ accumulating structures in primary sensory neurones of rats and their changes under diabetic neuropathy. 3rd Forum of European Neuroscience, Paris, France. Abstracts. 183.22 Kruglikov, V.Shishkin, L.Shutov, E.Kostyuk and N.Voitenko (2002) Long-term nimodipine treatment reverses diabetes-induced changes in calcium signalling of rat nociceptive neurons. Physiological Society Meeting, University of Liverpool, UK. Abstracts. PC8. Kruglikov, L.Shutov, E.Kostyuk, N.Voitenko (2002) Role of calcium ATPases in diabetes-induced changes of intracellular Ca2+ signalling in rat sensory neurons. XIV International Biophysics Congress, Buenos Aires, Argentina. Abstracts P11-01 E.Kostyuk, I.Kruglikov, V.Shishkin, N.Voitenko (2002) Changes in Ca2+ signalling in nociceptive neurones during diabetic neuropathy. The First Multilateral Conference of the Physiologists from Central Europe, Slovak Republic. Abstracts. N74 P.Kostyuk, V.Shishkin, E.Potapenko, E.Kostyuk, O.Girnyk, N.Voitenko (2002) Kinetic and spatial separation of Ca2+ accumulating structures in different types of sensory neurons. The First Multilateral Conference of the Physiologists from Central Europe, Slovak Republic. Abstracts. N75 Kruglikov, L. Shutov, N. Voitenko. (2001) Changes in intracellular calcium signalling in rat secindary nociceptive neurones under diabetic neuropathy. Programme and Abstract book of 4th Conference of the Czech Neuroscience Society, Prague, October 26-27, P.67. Kruglikov, L. Shutov, N. Voitenko and A. Tepikin, (2001) Changes in endoplasmic reticulum calcium accumulation under experimental diabetes in rat sensory neurones. Physiological Society Joint Meeting with the Biochemical Society, University of York, York, UK N.Voitenko, I.Kruglikov, V.Shishkin, E.Kostyuk, B.Sushko, L.Shutov, V.Snitsarev (2001) Simultaneous changes in nociceptive response and calcium signaling of nociceptive neurons in diabetic rats. 31 th Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, Calif., USA. #281.8 M.Randic, N.Voitenko, G.Gerber, D.H.Youn (2001) Decrease of kainate-induced currents and Ca2+ transients in the rat substantia gelatinosa neurons following carrageenan inflammation. 31 th Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, Calif., USA. #53.5 E. Kostyuk, I. Kruglikov, V. Shishkin, N. Voitenko, A. Efimov, P. Kostyuk (2001) Changes in calcium signalling in rat nociceptive neurons during experimentally-induced diabetes. 37th Annual Meeting Of The European Association For The Study Of Diabetes (EASD), Glasgow, United Kingdom N.Voitenko, E.Kostyuk, P.Kostyuk, I.Kruglikov, L.Shutov (2001) Calcium stores in dorsal horn neurones: diabetes-induced changes. XXXIV Congress of Physiological Sciences, Christchurch, New Zealand P.Kostyuk, E.Kostyuk E.Potapenko, V.Shishkin, N.Voitenko (2001) Role of mitochondria in formation of calcium signals in rat primary and secondary sensory neurons XXXIV Congress of Physiological Sciences, Christchurch, New Zealand Анотації. Войтенко Н.В. Кальцієва сигналізація в спінальних нейронах соматосенсорної системи в умовах наявності ноціцептивних синдромів. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин. Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2004. Дисертація присвячена дослідженню кальцієвої сигналізації в первинних (дорсальнокорінцеві ганглії, ДКГ) і вторинних (дорсальний ріг спинного мозку, ДР) соматосенсорних нейронів гризунів при експериментально викликаному нейропатичному і ноцицептивному болю. Було встановлено, що і в первинних, і вторинних ноцицептивних нейронах щурів зі СТЗ-індукованою нейропатією спостерігалося підвищення вільного цитозольного кальцію, а також драматичне уповільнення відновлення [Ca2+]і після періоду електричної активності нейрона. У нейронах же щурів з карагеніновим запаленням ми не спостерігали змін цих параметрів. Було показано достовірне зниження амплітуди [Са2+]і транзієнтів, які викликано звільненням іонів кальцію із кальцієвих депо ЕР нейронів ДКГ і ДР як при діабетичній нейропатії, так і при периферійному запаленні, порівняно із контрольними тваринами. Показано, що при діабетичній нейропатії зростає вклад високопорогових кальцієвих каналів в генерацію кальцієвих транзієнтів в нейронах ДКГ і ДР, а периферичне запалення призводить до збільшення мембранних струмів і зростання амплітуди [Са2+]і транзієнтів, що викликані активацією іонотропних глутаматних рецепторів в нейронах ДР. Виявлені порушення внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в первинних і вторинних сенсорних нейронах можна розглядати як один із загальних механізмів зміни передачі больових сигналів при ноцицептивному і нейропатичному болю. Ключові слова: діабетична нейропатія; периферичне запалення; дорсальнокорінцеві ганглії; дорсальний ріг; нейрон; кальцієва сигналізація. Войтенко Н.В. Кальциевая сигнализация в спинальных нейронах соматосенсорной системы при наличии ноцицептивных синдромов. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2004. Диссертация посвящена изучению механизмов внутриклеточной кальциевой сигнализации, которые могут лежать в основе развития болевых синдромов при воспалении и диабетической нейропатии. В экспериментах, проведенных с использованием формалинового теста и теста “горячая поверхность”, были показаны достоверные изменения в болевой и термической чувствительности крыс со стрептозотоцин - индуцированным диабетом, что говорит о правомерности использования стрептозотоциновой модели сахарного диабета как модели нейропатической боли. При сравнении двух моделей болевых синдромов различного патогенеза нами было установлено, что и в случае периферического воспаления, и в случае диабетической нейропатии, в первичных (дорсальнокорешковые ганглии, ДКГ) и вторичных (дорсальный рог, ДР) соматосенсорных нейронах происходят значительные изменения кальциевого гомеостаза. Эти изменения были практически идентичными в ноцицептивных нейронах ДКГ и ДР, однако отличались у животных с различными болевыми синдромами. Так, и в первичных и вторичных сенсорных нейронах крыс с диабетической нейропатией наблюдалось повышение свободного цитозольного кальция, а также драматическое замедление восстановления [Ca2+]i после периода электрической активности клетки. В нейронах же крыс с карагениновым воспалением мы не наблюдали ни повышения свободного цитозольного кальция, ни значительного замедления восстановления [Ca2+]i после деполяризации клетки. В работе показано, что изменения также происходят в функциях кальциевых каналов и внутриклеточных кальциевых депо исследованных нейронов. Изучение кальцийрегулирующей роли эндоплазматического ретикулума при периферическом воспалении и диабетической нейропатии выявило достоверное снижение амплитуды [Ca2+]i транзиентов, вызванных освобождением ионов кальция из рианодин- и InsP3-чувствительных депо эндоплазматического ретикулума в ответ на приложение различных агонистов, таких как кофеин, иономицин и АТФ в нейронах ДКГ и ДР исследованных животных. Прямое измерение активности Са2+-АТФаз плазматической (PMCA) и ретикулярной (SERCA) мембран в микросомах ДКГ и ДР подтвердили нашу гипотезу о превалирующей роли измененной активности SERCA в уменьшении кальциевого выброса из эндоплазматического ретикулума при диабетической нейропатии. Уменьшение активности как SERСA, так и PMCA в первичных и вторичных сенсорных нейронах может также объяснять увеличение базального уровня кальция в данных нейронах и замедление его восстановления после деполяризации при нейропатии. В экспериментах с использованием разобщителя протонного градиента СССР в ДКГ и ДР нейронах обнаружено значительное угнетение работы унипортера митохондрий как при диабетической нейропатии, так и при периферическом воспалении. Фармакологическое исследование вклада Ca2+ каналов в генерацию [Ca2+]i транзиентов показало, что вклад каналов L- и N- типов возрастает при диабетической нейропатии, в то время как вклад Т-типа остается неизменным. Периферическое воспаление приводит к увеличению мембранных токов и возрастанию амплитуды [Ca2+]i транзиентов, вызванных активацией АМРА и КА рецепторов в соме и проксимальных дендритах нейронов ДР. При этом NMDA–индуцированные токи и амплитуды [Ca2+]i транзиентов достоверно увеличиваются только в дендритах нейронов ДР. При периферическом воспалении увеличивается количество нейронов ДР, чувствительных к активации группы I метаботропных глутаматных рецепторов. При диабетической нейропатии достоверно уменьшаются амплитуды [Ca2+]i транзиентов, вызванных активацией метаботропных глутаматных рецепторов. Временной характер этих изменений четко коррелирует с развитием алодинии и гипералгезии, которые были исследованы в соответствующем интервале после инициации заболевания. Полученные данные свидетельствуют о том, что уменьшение кальций-аккумулирующей активности эндоплазматического ретикулума и митохондрий, а также усиление входа ионов кальция в цитозоль через потенциал и/или агонист-управляемые кальциевые каналы могут быть основными факторами, которые вносят вклад в процессы центральной сенситизации. Выявленные нарушения внутриклеточной кальциевой сигнализации в спинальных нейронах соматосенсорной системы можно рассматривать как один из общих механизмов изменения передачи болевых сигналов при ноцицептивной и нейропатической боли. Проведенное исследование позволяет значительно расширить наши знания о физиологических изменениях, происходящих в нервных клетках при различных патологических состояниях. Кроме того, оно может помочь решить вопрос о происхождении болевых синдромов при воспалении и нейропатии, что позволит говорить о клиническом применении полученных данных. Ключевые слова: диабетическая нейропатия; периферическое воспаление; дорсальнокорешковые ганглии; дорсальный рог; нейрон; кальциевая сигнализация. Voitenko N.V. Calcium signaling in spinal somatosensory neurons under nociceptive syndromes. Manuscript. Dissertation for doctor of science degree by specialty 03.00.13 – human and animal physiology. A.A.Bogomoletz Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kiev, 2004. The dissertation is devoted to investigation of calcium signaling in primary (dorsal root ganglia, DRG) and secondary (dorsal horn, DH) sensory neurons under experimentally-induced neuropathic and inflammatory pain. We have shown an increase in cytosolic free calcium concentration and level of residual calcium after depolarization-induced calcium increase in both primary and secondary nociceptive neurons of diabetic animals. We have not found any changes in these parameters in neurons of carrageenan-inflamed animals. We have shown a significant decrease in amplitudes of [Са2+]і transients induced by activation of calcium release from the ER calcium stores of DRG and DH neurons of both neuropathic and inflamed animals as compared to control ones. It has been shown that under diabetic neuropathy the involvement of high-threshold calcium channels in the generation of calcium transients are increased. At the same time peripheral inflammation causes an increase in membrane currents and calcium transients induced by ionotropic glutamate receptor activation in DH neurons. The above mentioned abnormalities in calcium signaling of spinal sensory neurons might be a common mechanism of changes in nociceptive signal transduction under inflammatory and neuropathic pain. Key words: diabetic neuropathy; peripheral inflammation; dorsal root ganglia; dorsal horn; neuron; calcium signaling. PAGE 1

Похожие записи