.

Кальцієва сигналізація в спінальних нейронах соматосенсорної системи в умовах наявності ноціцептивних синдромів (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5696
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

ВОЙТЕНКО НАНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.822:611.813.14

Кальцієва сигналізація в спінальних нейронах соматосенсорної системи в
умовах наявності ноціцептивних синдромів

03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,
Міжнародному Центрі молекулярної фізіології НАН України та Державному
університеті штата Айова (США)

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Ліманський Юрій Петрович,

зав. відділом фізіології стовбуру мозку Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів
Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук, професор

Макарчук Микола Юхимович,

зав. кафедрою фізіології людини і тварин Київського Національного
університету ім. Тараса Шевченка.

Провідна установа: Київський Національний Медичний університет ім.
О.О.Богомольця, кафедра фізіології.

Захист дисертації відбудеться 21.12.2004 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 19.11.2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Ідентифікація причин і розробка способів запобігання розвитку больових
синдромів при різних захворюваннях є принципово важливими задачами
сучасної фізіології. Незважаючи на величезну кількість
експериментального і клінічного матеріалу, який накопичено з цих проблем
за останні десятиліття (Лиманський 1986, Milan 1999), питання про те, як
формується біль, залишається значною мірою відкритим. Дослідження
механізмів, процесів і явищ у тих системах мозку, що сприймають і
обробляють інформацію про вплив больових факторів на організм, мають
забезпечити істотний прогрес у рішенні цієї задачі.

Механізми розвитку больових синдромів, таких як гіпералгезія та
алодінія, або, навпаки, втрати больової чутливості до теперішнього часу
вивчені недостатньо. Так, дані про зміни внутрішньоклітинного
метаболізму і, зокрема, кальцієвого гомеостазу, які відбуваються у
нейронах входу ноцицептивної системи при больових впливах, поки що
практично відсутні, хоча очевидно, що ці механізми мають відігравати
найважливішу роль у змінах передачі ноцицептивних сигналів, що
спостерігаються при нейропатіях та запаленнях різного генезу.

Також невідомо, порушення яких саме механізмів, котрі задіяні у
регулюванні концентрації вільного цитозольного кальцію ([Ca2+]i) у
клітині, мають первинне значення. Показано, що розлади клітинного
метаболізму Ca2+ відіграють істотну роль у розвитку порушень в секреції
інсуліну та його дії на організм при діабеті. Порушення кальцієвого
гомеостазу, вірогідно відіграють істотну роль у судинних ускладненнях,
що супроводжують діабет, таких як артеріальна гіпертензія, атеросклероз
та ангіопатії. Є підстави вважати, що пов’язані з діабетом зміни в
нервових тканинах можуть базуватися на модифікаціях кальційакумулюючої
функції мітохондрій та параметрів деполяризаційних кальцієвих сигналів і
призводити до анормального проведення больових імпульсів в первинних
сенсорних нейронах.

Таким чином, запалення і сенсорна діабетична нейропатія являють собою
такі патологічні стани організму, яки призводять до значних метаболічних
перебудов у різних клітинах організму, у тому числі й у нервових.
Розуміння принципів регуляції кальцію та їх змін при запаленні і діабеті
необхідно як для розширення нашого уявлення про виникнення сенсорних
нейропатій і больових синдромів, так і для знаходження шляхів їх
лікування. Тому логіка виконаної роботи полягала в поетапному вивченні
та порівнянні змін кальцієвої сигналізації у спінальних нейронах
соматосенсорної системи гризунів в умовах нейропатії та запалення, а
саме: (і) встановленні наявності порушень проведення больових сигналів
на рівні цілого організму; (іі) дослідженні функціонування молекулярних
механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу в ізольованих
соматосенсорніх нейронах та нейронах у зрізах спинного мозку тварин з
больовими синдромами; (ііі) порівнянні змін кальцієвого гомеостазу при
запаленні та нейропатії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології
нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України:
“Дослідження впливу різних нейромедіаторів на гомеостаз кальцію в
ізольованих нейронах мозку щурів”, “Зміни дії нейромедіаторів та
модуляторів гомеостазу кальцію в сенсорних нейронах щурів на різних
стадіях розвитку діабетичної нейропатії”, “Вивчення ролі потенціал- та
лігандкерованих кальцієвих каналів ізольованих сенсорних нейронів
дорсальнокорінцевих ганглиїв та нейронів дорсального рогу під час
розвітку больової нейропатії у щурів”, а також наукових тем Міжнародного
Центру молекулярної фізіології НАН України: “Дослідження молекулярних
механізмів гомеостазу кальцію в нервових клітинах під час ішемії та
діабету”, “Дослідження кальційової провідності глутаматних рецепторів
трансгенних мишей з нокаутованими генами цих рецепторів” та “Зміни
ефективності синаптичної передачі на різних рівнях нервової системи за
експериментально викликаних патологічних станів”.

Мета роботи.

Мета виконаної роботи полягала у виявленні і порівняльному аналізі змін
кальцієвої сигналізації та їх механізмів у первинних та вторинних
нейронах соматосенсорної системи (клітини дорсальнокорінцевих гангліїв
(ДКГ), та нейрони дорсального рогу (ДР) спинного мозку, відповідно)
тварин (гризунів) в умовах наявності експериментально викликаних
больових синдромів.

Задачі дослідження.

Визначити адекватність використання стрептозотоцинової моделі цукрового
діабету як моделі нейропатичного болю шляхом вимірів больової чутливості
щурів у нормі і при експериментально викликаному діабеті.

Провести порівняльний аналіз основних параметрів кальцієвих транзієнтів
у первинних і вторинному (ноцицептивних та неноцицептивних) сенсорних
нейронах здорових щурів і щурів із синдромами діабетичної нейропатії.

Визначити залежність змін кальцієвого гомеостазу у соматосенсорних
нейронах від терміну розвитку діабетичної нейропатії.

Провести порівняльний аналіз основних параметрів кальцієвих транзієнтів,
викликаних деполяризацією цитоплазматичної мембрани, у первинних
соматосенсорних нейронах здорових тварин і тварин з карагенініндукованим
периферичним запаленням.

Виявити зміни кальцієвих сигналів, які викликані вивільненням іонів
кальцію з внутрішньоклітинних органел сенсорних нейронів мишей і щурів
на тлі карагеніниндукованого запалення.

Вивчити функціонування іонотропних та метаботропних глутаматних
рецепторів в умовах викликаного карагеніном запалення.

Провести зіставлення змін кальцієвої сигналізації в соматосенсорних
нейронах при наявності больових синдромів запального і нейропатичного
походження.

Наукова новизна отриманих результатів.

У роботі вперше проведено порівняння модифікацій механізмів
внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації, котрі можуть лежати в
основі розвитку больових синдромів при запаленні і діабетичній
нейропатії. Виявлено зміни кальцієвого гомеостазу в первинних (нейрони
ДКГ) і вторинних (нейрони ДР) соматосенсорних нейронах, характерні для
станів як ноцицептивного, так і нейропатичного болю у гризунів.
Показано, що ці зміни відбуваються у функціях кальцієвих каналів і
внутрішньоклітинних кальцієвих депо досліджених нейронів мишей та щурів.
Вперше продемонстровано, що при больових синдромах амплітуди кальцієвих
транзієнтів, які індуковані кофеїном, АТФ та іономіцином, зменшуються, а
вхід іонів кальцію в цитозоль через іонотропні глутаматні рецептори
посилюється. Часовий перебіг цих змін чітко корелює з динамікою розвитку
алодінії та гіпералгезії після ініціації захворювання. Отримані дані
свідчать про можливість того, що зменшення кальційакумулюючої активності
эндоплазматического ретикулуму і мітохондрій може бути основним
фактором, відповідальним за процеси центральної сенситизації. Уперше
показані специфічні риси кальцієвої сигналізації у первинних і вторинних
соматосенсорних нейронах щурів з периферичним запаленням і цукровим
діабетом.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Результати, які отримані в роботі, мають як фундаментальне, так і
практичне значення. Порівняння роботи внутрішньоклітинних
кальційрегулюючих структур в умовах діабетичної нейропатії та запалення
істотно допомагають розумінню механізмів виникнення больових синдромів і
збагачують знання, що стосуються цих патологій.

Практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що вони
дозволяють зрозуміти, які саме механізми внутрішньоклітинного
кальцієвого гомеостазу у первинних і вторинних сенсорних нейронах
ушкоджуються при розвитку різних патологій, пов’язаних з виникненням
больових синдромів. Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть
стати основою для розробки високоселективних фармакологічних підходів до
лікування вищеназваних патологій. Є підстави вважати, що речовини, які
впливають на роботу кальцієвих каналів плазмалемми, кальцієвих насосів
ендоплазматичного ретикулуму і плазмалемми, а також можливі модулятори
кальцієвого уніпортеру мітохондрій можуть бути використані для лікування
сенсорних нейропатій у людей, які хворіють діабетом, а також для
зменшення страждань хворого на гостре і, можливо, хронічне запалення тих
чи інших тканин та органів.

Особистий внесок здобувача.

Автор поставила задачу досліджень і самостійно розробила методики
приготування тонких зрізів спинного мозку та ізоляції функціонально
повноцінних вторинних сенсорних нейронів, внесла ряд удосконалень у
методику проведення поведінкових тестів, а також самостійно виконувала
основну частину експериментів, здійснювала аналіз, статистичну обробку й
узагальнення результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами
опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г.Костюком, доктором медичних
наук О.П.Костюк, кандидатами біологічних наук Б.С.Сушко, О.В.Грищенко,
І.Кругликовим, В.Шишкіним, а також аспірантами Е.Потапенко и Л.Шутовим.
Біохімічні експерименти були виконані сумісно з доцентом кафедри
фізіології людини та тварин Львівського державного університету ім.
І.Франка к.б.н. Н.В.Федірко. У роботі використовували деяке унікальне
устаткування, яке було створено провідним інженером Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця С.І.Кабанченко.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації докладено на семінарах Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України, а також на міжнародних симпозіумах і
з’їздах: щорічних конференціях Американського Товариства Нейронаук, США
(Новий Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Маямі, 1999; Сан Діего, 2001;
Орландо, 2002; Новий Орлеан, 2003, Сан Дієго 2004); щорічних
конференціях Американського Біофізичного Товариства, США (Новий Орлеан,
1997; Новий Орлеан, 2000; Сан Антоніо 2003); спільному Богомолец-Ненскі
симпозіумі (Сулеєв, Польша, 2001); 33-м і 34-м міжнародних Конгресах
фізіологичних наук (Санкт-Петербург, Росія 1997; Крайстчерч, Нова
Зеландія, 2001); міжнародному семінарі по нейронаукам (Прага, Чехия,
2001); 37-м щорічнім засіданні Європейської Наукової Діабетичної
Асоціації (Глазго, Велика Британія, 2001); XIV міжнародному біофізичному
Конгресі (Буэнос-Айрес, Аргентина, 2002); 62-й Научній Сесії
Американської Діабетичної Асоциації (Сан-Францисько, США, 2002);
Ювілейній школі IBRO (Ялта, Україна, 2004), а також на засіданнях
сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України, 2000, 2001, 2002, 2003 и 2004 років.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 31 стаття у провідних вітчизняних і
закордонних журналах і 45 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів
досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих
результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 501
найменування. Робота викладена на 326 сторінках, містить 5 таблиць та
проілюстрована 60 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкти дослідження. В експериментах використовували модель
ноцицептивного болю, який викликано карагеніновим запаленням, та модель
невропатичного болю, що викликаний стрептозотоциновим (СТЗ) діабетом.
Для одержання моделі експериментального запалення ми використовували
самців щурів лінії Вистар віком 21 день (маса 30-35 г) або дорослих
мишей віком 2 місяця (маса 25-30 г). Запалення викликалося
внутрім’язовою ін’єкцією 100 мкл розчину карагеніна (Carrageenan Lambda,
Type ІV, Sіgma-Aldrich, США) у задню кінцівку (2 мг на 100 мкл 0.9 %
розчину NaCl для ін’єкцій, Галичфарм, Україна). Експозиція для розвитку
запалення становила 3 години. Контрольним тваринам того ж віку
ін’єкували аналогічний об’єм чистого 0.9% розчину NaCl. Для одержання
моделі експериментального діабету використовували самців щурів лінії
Вистар віком 21 день (маса 30-35 г). Діабет викликався одноразовою
внутрішньочеревинною ін’єкцією 80 мг/кг СТЗ, що був розчинений в
ізотонічному розчині NaCl. Ін’єковані СТЗ і контрольні тварини такого ж
віку утримувалися на однаковій дієті протягом усього періоду розвитку
захворювання; тварин брали в експеримент через 3-4 або 6-7 тижнів після
ін’єкції СТЗ. Концентрацію глюкози в плазмі крові, вимірювали за
допомогою оптичного сенсора глюкози (Roche Dіagnostіcs, Німеччина).
Концентрація глюкози в плазмі крові знаходилася в межах 5 – 9 мМ у
контрольних тварин і 14 – 28 мМ у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом.
Експерименти з тваринами були затверджені і проводилися відповідно до
вимог Клініки піддослідних тварин Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України.

Після експозиції, достатньої для розвитку запалення або діабету,
проводили стандартну процедуру ферментативного виділення сенсорних
нейронів ДКГ або ДР люмбального відділу (L4-L6) спинного мозку (Voitenko
et al. 2004). У разі індукції запалення нейрони ДКГ і ДР виділялися з
тієї сторони, у яку виконували ін’єкцію. Тонкі зрізи спинного мозку
готували за методикою Рандич і співавторів (Randіc et al. 1993). Для
цього під глибокою ефірною анестезією проводили ламінектомію та
препарували люмбосакральну ділянку спинного мозку (сегменти L4 -S1).
Відразу ж після цього фрагмент спинного мозку занурювали в охолодженій
до 4°С інкубаційний розчин, постійно насичуваний сумішшю 95% + O25% CO2,
у якому виконували подальші операції. Після очищення від твердої
мозкової оболонки, препарат прикріплювали до столика вібротома (Campden
Іnstruments, Велика Британія), за допомогою якого готували тонкі
фронтальні зрізи (300 мкм) сегментів L4-L6. Після приготування зрізи
витримували протягом принаймні 1 години в оксигенованому базовому
розчині при температурі 32°С.

Для дослідження змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію в
ізольованих нейронах ДКГ і ДР були використанні кальцієві барвники
іndo-1 та fura-2. В експериментах на недіалізованих клітинах
використовували мембранопроникні форми барвників (іndo-1/АМ та
fura-2/АМ). Для завантаження кальцієвих барвників були застосовані наші
оригінальні методики (Voitenko et al. 2000; Kostyuk et al. 2001;
Voitenko et al. 2004).

Встановлення наявності діабетичних нейропатій. Для встановлення
наявності відхилень в роботі нервової системи тварин з діабетом
використовували методи “формалінового тесту” та “гарячої поверхні”.
Перший метод використовували для дослідження поведінкових реакцій тварин
при гострому болі, другий метод дозволяв досліджувати больові реакції
щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової
температурної чутливості.

Одночасна реєстрація трансмембранних струмів і внутрішньоклітинних
кальцієвих сигналів. Нейрони візуально ідентифікували, використовуючи
довгофокусний об’єктив NA 0.9, х60 (Olympus, Японія) і відеокамеру
Hamamatsu C2400, (Hamamatsu Corp., Японія) у режимі інфрачервоного
диференційно-інтерференційного контрасту. Іонні струми (“пэтч-клэмп” у
конфігурації “ціла клітина”) реєстрували з використанням неоплавлених
тонкостінних піпеток з боросілікатного скла (8-10MО; VWR Scіentіfіc,
США), підсилювача Lіst EPC7 (HEKA Electronics, Німеччина). Клітини,
котрі мали гладку поверхню мембрани і низький контраст, демонстрували
найкращі ознаки життєздатності нейронів, такі як потенціал спокою,
потенціал дії (рис. 1), вхідний опір і постійну часу мембрани. Після
одержання гігаомного контакту нейрони утримували при потенціалі -60 мВ.
Стимуляцію і реєстрацію електричних сигналів проводили з використанням
програмного забезпечення pClamp – 8.0 (Axon Іnstruments, США). Зміни
внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію визначали згідно зі
змінами флуоресценції барвника fura-2, яку вимірювали з використанням
охолоджуваної CCD камери (PXL; EEV-37-GІ, Photometrіcs, США) на довжині
хвилі 510 нм зі збуджуючим випромінюванням на довжині хвиль 360 та 380
нм. В разі використання барвника іndo-1 зміни внутрішньоклітинної
концентрації кальцію визначали як зміни флуоресценції на довжинах хвиль
400 та 500 нм за допомогою двох фотопомножувачів зі збудженням на
довжині хвилі 360 нм. Для виміру змін флуоресценції використовували
програмне забезпечення ІPLAB (Scanalytіcs, США) або Tida ( HEKA
Electronics, Німеччина).

Відносну зміну інтенсивності флуоресценції (R) на зазначених довжинах
хвиль застосовували для розрахування [Ca2+]i у цитозолі за формулою
Грінкевіча (Grynkiewicz G. et al. 1985):

[Ca2+]i = Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, що входять у формулу (Kd, B, Rmin, Rmax), одержували
за допомогою калібрування відповідного експериментального устаткування.

Вимірювання активності Ca2+, Mg2+-АТФаз ДКГ і ДР. Мікросомальну фракцію
одержували шляхом диференціального центрифугування. Величину
АТФ-гідралазної активності визначали по кількості відщепленого
неорганічного фосфату Рi, вміст якого визначали за допомогою
модифікованого методу Фиске-Субарроу.

Розчини і реактиви. Інкубаційний фізіологічний розчин, що застосовували
у перебігу препарування спинного мозку, містив (мМ): NaCl – 125; KCl –
5; CaCl2 – 2.5; MgSO4 – 1.5; NaHCO3 – 25; KH2PO4 – 1.6; глюкоза – 10; рН
7.4. Температуру розчину підтримували на рівні 4°С протягом усього
процесу виділення і приготування зрізів. Базовий фізіологічний розчин,
що застосовували під час експериментальних процедур і завантаження
зрізів флуоресцентними кальцій чуттєвими зондами містив (мМ): NaCl –
128; KCl – 2; CaCl2 – 2.5; MgSO4 – 1.5; NaHCO3 – 25; KH2PO4 – 1.6;
глюкоза – 10; рН 7.4, в умовах постійного насичення сумішшю 95 % O2 + 5%
CO2; температуру розчину підтримували на рівні 32°С.
Внутрішньопіпетковий розчин, що використовували в електрофізіологічних
експериментах, містив (мМ): глюконат калію – 133; NaCl – 5; MgCl2 – 0.5;
HEPES-Na – 10; MgATP – 2; GTP – 0.1; fura-2 калієву сіль – 0.2-0.3; pН
7.3 доводили за допомогою KOH. Базовим позаклітинним розчином, який
використовували для ізольованих нервових клітин, перфузії
експериментальної камери і приготування інших позаклітинних розчинів,
був модифікований розчин Тироде наступного складу (мМ): NaCl – 140; KCl
– 2; MgCl2 – 2; CaCl2 – 2; HEPES – 10; глюкоза – 10; рН 7.4 доводили за
допомогою NaOH. Для одержання гіперкалієвого розчину 50 мМ Na+ у розчині
Тироде ізоосмотично заміщували 50 мМ K+. Безкальцієвий фізіологічний
розчин одержували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl2 у
базовому розчині на MgCl2, а також додаванням 1 мМ хелатора кальцію
EGTA. З метою запобігання можливого впливу потенціалів дії на генерацію
кальцієвих транзієнтів у всіх експериментах з тонкими зрізами спинного
мозку до базового розчину додавали 1 мкМ блокатора потенціалзалежних Na+
каналів тетродотоксину (ТТХ).

Аналіз даних. У процесі експерименту дані оцифровували аналого-цифровими
перетворювачами (Axon Іnstruments, США та HEKA Electronics, Німеччина) і
зберігали на твердому диску комп’ютера з використанням програмних
пакетів pClamp – 8.0, Axolab 3.0 (Axon Іnstruments, США), ІPLAB
(Scanalytіcs, США) та Tida ( HEKA Electronics, Німеччина). Аналіз даних
виконували з використанням аналітичних програмних продуктів (Clampex –
8.0, Axon Іnstruments; Tida HEKA Electronics; Origin 3.54, Microcal
Software; Excel 2000, Microsoft). У подальшому результати представлені
як середні значення ± середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n.
Вірогідність розходжень між значеннями визначали за критерієм
t-Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Больова чутливість щурів в нормі та зі СТЗ-індукованим діабетом У даних експериментах ми оцінювали зміни поведінкових реакцій щурів зі СТЗ-індукованим діабетом у відповідь на біль, викликаний підшкірною ін’єкцією формаліна (формаліновий тест). Досліди проводили на самцях щурів лінії Wistar двох груп: контрольної (10 тварин) й зі СТЗ - індукованим діабетом (7 тварин). При введенні формаліну (20 мкл 5% розчину), як у хворих, так і у здорових щурів розвивалися реакції неконтрольованого посмикування та активного лизання кінцівки, у яку був уведений формалін. При цьому характер розвитку даніх реакцій був достовірно різним у контрольних щурів й у щурів зі СТЗ-індукованим діабетом. У діабетичних щурів відповідь носила яскраво виражений двофазний характер; вона складалася з першої “гострої” фази, що тривала близько 10 хв, і другої “тонічної” фази, що була тривалою (85-90 хв), без яскраво виражених максимумів. У контрольних тварин значно менш виражена перша фаза; друга фаза, навпаки, проявлялася більш інтенсивно і мала яскраво виражений максимум на 40-45 хв. Реакції припинялися через 70-75 хв, тобто набагато раніше, ніж у діабетичних тварин. При застосуванні тесту “гаряча поверхня” ноцицептивну стимуляцію виконували, розміщуючи експериментальну тварину на поверхні, розігрітій до температури, здатної викликати больову реакцію. Як больові реакції ми розглядали посмикування кінцівок, що контактують з нагрітою поверхнею, і їх лизання. У перебігу експериментів було встановлено, що поріг больової чутливості у контрольних щурів і щурів зі СТЗ-індукованим діабетом статистично не відрізнявся; він складав 420 С. При підвищенні температури поверхні з 43 до 470 С, не спостерігалося достовірних розходжень у латентності больової реакції, проте при 480 С ці розходження ставали достовірними, (експерименти з подальшим збільшенням температури не проводилися з гуманних міркувань). Так, у щурів, розміщених на гарячій поверхні з температурою 480 С, час настання больової реакції склав 10 ± 0.8 с (n = 5) для контрольних тварин й 22 ± 1.5 с (n = 5), для діабетичних щурів (р 0.1). Це свідчить
про те, що початковий обсяг кальцію в ЕР майже однаковий у нормі та при
діабеті. До цього, ефективність виведення кальцію через ріанодинові
рецептори, очевидно, не змінюється.

Як це показано на рис. 2А, амплітуди кальцієвих відповідей на кофеїн
після перезаповнення кальцієвих депо ЕР за допомогою деполяризації були
достовірно меншими при діабеті: 1083 ± 93 нМ (n=14) у порівнянні з 757 ±
72 нМ у контролі (n=16, p 0.1)
для нейронів діабетичних щурів (табл.1). Отже, у нейронах ДКГ, які
знаходилися в спокої, InsP3-чутливі депо заповнені кальцієм приблизно до
однакового рівня і у діабетичних, і у контрольних щурів.

ref SHAPE \* MERGEFORMAT Наступним етапом наших досліджень був
аналіз амплітуд кальцієвих транзієнтів в умовах вивільнення Ca2+ з
InsP3-чутливих кальцієвих депо після їхнього перезаповнення,
індукованого гіперкалієвою деполяризацією. Аплікація 200 мкМ АТФ у
безкальцієвому позаклітинному розчині на малі (ноцицептивні) нейрони ДКГ
викликала кальцієвий транзієнт із середньою амплітудою 232 ± 47 нМ
(n=10) у контролі й 88 ± 12 нМ (n=13) у діабетичних тварин (рис. 3).
Таким чином, зниження амплітуди АТФ-індукованого вивільнення Ca2+ з
InsP3-чутливого кальцієвих депо склало 62 ± 5 % (p 0.09

Рівень залишкового [Ca2+]i на 60 с після закінчення деполяризації, % 10
± 1 (n = 19) 15 ± 3 (n = 17) 0.1

Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM
1083 ± 93 (n = 14) 757 ± 72 (n = 16) 0.1

Амплітуда АТФ-індукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM
232 ± 47 (n = 10) 88 ± 12 (n = 13) 0.1) й описувалася
моноекспоненційною функцією.

Різниця між піковими значеннями кальцієвих транзієнтів, що викликані
деполяризацією, також не була достовірною. Відповідні значення склали
636 ± 36 нМ (n = 28) і 564 ± 51 нМ (n = 38, p > 0.1), у контрольних
тварин і тварин із діабетичною нейропатією відповідно (табл. 2). Основна
різниця характеристик [Ca2+]i транзієнтів у нейронах ДР була виявлена
нами щодо кінетики спаду таких транзієнтів, що відображає характер
вилучення Са2+ із цитозолю. Найбільш істотну різницю було виявлено в
значеннях рівню залишкового [Ca2+]i, який вимірювали на 90-й секунді
після початку деполяризації. Рівень залишкового кальцію був достовірно
вищім у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом і становив (у відсотках
пікового значення) 2.8 ± 0.5 % (n = 25) і 14.1 ± 1.2 % (n = 25) у
контрольних тварин і щурів з діабетичною нейропатією відповідно
(р 0.1). Таким чином, амплітуда АТФ-індукованого [Ca2+]i
транзієнту не змінювалася у нейронах тварин з нейропатією у порівнянні з
нейронами контрольних щурів (табл.2). При додаванні 200 мкМ АТФ у
безкальцієвому розчині, навпаки, спостерігалося істотне зменшення
амплітуди кальцієвого транзієнту. Так, амплітуда [Ca2+]i транзієнту при
додаванні 200 мкМ АТФ до нейронів ДР в безкальцієвому розчині склала 156
± 14 нМ (n = 45) у контрольних умовах та 104 ± 6 нМ (n = 21) при
діабетичній нейропатії (p Таблиця 2. Параметри, визначені для нейронів ДР контрольних щурів та тварин із діабетичною нейропатією. Дані представлені в вигляді: середнє значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р – параметр вірогідності. Параметр Контроль Діабет p Концентрація глюкози в плазмі крові, мM 7.4 ( 1.2 (n=65) 26.6 ( 1.8 (n=73) 0.06

KCl-індуковане підвищення [Ca2+]i, нM 636 ( 36 (n = 28) 564 ( 51 (n =
38) >0.09

Рівень залишкового [Ca2+]i на 90 с після початку деполяризації, % 2.8 ±
0.5 (n = 25) 14.1 ± 1.2 (n = 25) 0.1

Амплітуда АТФ-індукованого (0Са) підвищення [Ca2+]i, нM 156 ± 14 (n =
45) 104 ± 6 (n = 21) Було виявлено, що концентрація Рі, яку виміряли на 300 секунді після ініціації реакції, суттєво зменшувалася при діабеті в тканинах як ДКГ, так і ДР (табл. 1, 2). У ДКГ загальна Ca2+, Mg2+-АТФазна активність становила 263 ± 43 мкМ ч-1 мг-1 у контролі й 113 ± 5 мкМ ч-1 мг-1 при діабеті. Питома активність РМСА становила 216 ± 32 мкМ ч-1 мг-1 й 89 ± 4мкМ ч-1 мг-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Питома активність SERCA становила 47 ± 14 мкМ ч-1 мг-1 й 24 ± 4мкМ ч-1 мг-1 у контролі й при діабеті, відповідно. Таким чином, зменшення питомих активностей РМСА й SERCA при діабеті становило 63 ± 6 % й 50 ± 8 % відповідно (p 0.6

в нейронах ДР 89±7 (n=19) 68±6 (n=17) 0.6). Основні параметри зміни стану тварин і
кальцієвої сигналізації в нейронах соматосенсорної системи на різних
термінах розвитку діабетичної нейропатії представлені в таблиці 3. З цих
даних можна зробити висновок, що часовий хід розвитку діабетичної
нейропатії корелює з розвитком та посиленням абнормальностей
внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу як в первинних, так і у
вторинних соматосенсорних нейронах.

Зміни кальцієвої сигналізації в нейронах ДКГ, які викликані
карагеніновим запаленням

Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією нейронів ДКГ
великого й малого діаметрів у нормі та при запаленні, показало
відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик:
базального рівня [Ca2+]i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвих
транзієнтів, часу напівспаду (t0,5), а також рівня залишкового кальцію в
цитозолі на 60 с спаду деполяризаціонного транзіента (R60). Слід
зазначити, що достовірних змін амплітуди кальцієвих транзієнтів у
відповідь на деполяризацію цитоплазматичної мембрани не було виявлено як
у великих, так й у малих сенсорних нейронах. Для більш глибокого
дослідження можливих змін кальційрегулюючої ролі внутрішньоклітинних
кальцієвих депо нейронів ДКГ при запаленні ми застосували відповідні
експериментальні процедури, що дозволяють активувати викид і захоплення
Ca2+ ЕР і мітохондріями.

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДКГ при запаленні

Функціонування мітохондрій

Для визначення того, як змінюється ефективність функціонування
мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди деполяризаційних
[Ca2+]i транзієнтів у контрольних умовах і на тлі дії 10 мкМ СССР. При
цьому для всіх типів клітин не спостерігалося змін у співвідношенні
амплітуд даних Ca2+ відповідей у присутності та відсутності СССР при
запаленні в порівнянні з нормою. Однак аплікація 10 мкМ СССР на спаді
кальцієвого транзієнту викликала викид Ca2+ набагато меншої амплітуди
при запаленні, ніж у контрольних експериментах (табл. 4). Для великих
нейронів ДКГ амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду при
запаленні склала 38 ± 9 % (n=21) у порівнянні з 71 ± 10 % (n=25) у
контролі (p ?& \ l n O , . †?& \ O U d?]„1`„ ??????? ?x?x??&?? ??? \ ` b d ????????? ]„ay”kda ?????????? ?x?x????? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? q! „ ¤x ¤x]„ q! ???r???????? q! ? ???r???????? q! ? ???r???????? q! ?????x?x????? ?x?x?????? 86 нМ (n=8) у контролі до 123 ± 27 нМ (n=10, p 0.5).

Функцианування ІnsР3 депо ЕР

Для того, щоб викликати продукування ІnsР3 з наступним вивільненням
кальцію з ЕР через ІnsР3-рецептори ми проводили аплікацію 100 мкМ АТФ у
безкальцієвому розчині. У цьому випадку ситуація була цілком аналогічною
[Ca2+]i сигналам, викликанім кофеїном. Амплітуда АТФ-індукованого
кальцієвого транзієнту зменшилася з 98 ± 15 нМ (n=12) у контролі до 35 ±
3 нМ (n=9, p 0.1). Для деполяризації клітин
використовували додавання гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів
К+ близько 50 мМ. Ми не виявили істотної різниці в значеннях пікових
амплітуд або часу наростання кальцієвих транзієнтів, викликаних
деполяризацією, у контрольних тварин і тварин з карагеніновим
запаленням. Так, постійна часу наростання [Ca2+]i транзієнтів становила
4.5 ± 0.7 c (n = 39) і 4.9 ± 0.6 c (n = 60) для контрольної групи і для
тварин з карагеніновим запаленням, відповідно, і описувалася
моноекспоненційною функцією. Різниця в пікових значеннях кальцієвих
транзієнтів, викликаних деполяризацією, також не була статистично
достовірною. Деяка різниця в характеристиці [Ca2+]i транзієнтів нейронів
ДР була виявлена нами під час описання кінетики спаду транзієнтів, яка
характеризує характер виведення Са2+ із цитозоля клітини. Найбільш
істотна різниця була встановлена у рівні залишкового [Ca2+]i, виміряного
на 15 та 30 секунді після закінчення деполяризації. Ця різниця зникала
на 60 секунді після закінчення деполяризації (табл. 5). Так, на 15
секунді після закінчення деполяризації рівень залишкового кальцію склав
у контрольних умовах 12.7 ± 1.5 % (n=39) від максимальної амплітуди
транзієнту, а в клітинах в умовах запалення 18.8 ± 2.1 % (n=60,
р0.1).

Функціонування внутрішньоклітинних органел нейронів ДР при запаленні.

Функціонування мітохондрій

Для того, щоб проаналізувати можливий внесок мітохондрій у зміни
кальцієвої сигналізації сенсорних нейронів мишей при інфламаторному
болі, проводилася аплікація СССР, що припиняв накопичення іонів кальцію
мітохондріями. У контрольних клітинах аплікація 10 мкM CCCP перед
деполяризацією викликала збільшення амплітуди зростання [Ca2+]i,
індукованого деполяризацією, що свідчить про участь мітохондрій у
процесі швидкого захоплення іонів кальцію під час досягнення піка
транзієнту. Для визначення того, як змінюється ефективність
функціонування мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди
деполяризаційних [Ca2+]i транзієнтів у контрольних умовах і на тлі дії
СССР. При цьому для нейронів ДР не спостерігалося змін у співвідношенні
амплітуд таких Са2+ відповідей при запаленні в порівнянні з контролем.

Аплікація CCCP після досягнення піка транзієнта викликала додаткове
зростання [Ca2+]i, що свідчить про значний викид кальцію, що був
попередньо запасений мітохондріями. Однак у нейронах ДР тварин з
карагеніновим запаленням таке зростання було надзвичайно зниженим. У
середньому у нейронах ДР амплітуда кальцієвого транзієнту, викликаного
аплікацією CCCP після деполяризації, склала 36 ± 6 % (n=34) у контролі і
16 ± 4 % (n=9, р 0.1) у нейронах щурів з карагеніновым запаленням (табл. 5).
Однак, після перезаповнення кальцієвого депо ЕР за допомогою
деполяризації, амплітуди кофеїн-індукованих [Ca2+]i транзієнтів
достовірно зменшувалися в нейронах тварин з периферичним запаленням у
порівнянні з нейронами контрольних тварин. У середньому амплітуда
кальцієвого транзієнту, викликаного аплікацією кофеїну після
деполяризації цитоплазматичної

Таблиця 5. Параметри, визначені для нейронів ДР контрольних тварин та
тварин із периферичним запаленням. Дані представлено в вигляді: середнє
значення ± середньоквадратична похибка (кількість експериментів), р –
параметр вірогідності.

Параметр Контроль Запалення p

Відновлення [Ca2+]i після закінчення деполяризації на 15 сек., % 12.7 ±
1.5 (n = 39) 18.8 ± 2.1 (n = 60) 0.1

СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i під час відновлення [Ca2+]i
транзієнту в нейронах ДР, % від пікової амплітуди 36 ± 6 (n=34) 16 ± 4
(n=9) 0.05

Амплітуда кофеїніндукованого підвищення [Ca2+]i після деполяризації, нM
302 ± 23 (n=15) 238 ± 41 (n=15) 0.5).
Амплітуда потенціалів дії становила 77.0±2.8мВ (n=35) у нейронах
контрольних щурів й 75.8±2.1 мВ (n=46) у нейронах щурів з карагеніновим
запаленням (р > 0.5). Вхідний опір нейрона був 451.7 ± 39.5 МОм (n=35) у
нейронах контрольних щурів й 491.3 ± 46.9 МОм (n=46) у нейронах щурів з
карагеніновим запаленням (р > 0.5).

Активація метаботропних глутаматних рецепторів (mGluR) у нейронах ДР.

Інформація про механізми кальцієвої сигналізації і їхній потенційній
участі в клітинній відповіді на активацію mGluR у нейронах ДР дотепер
відсутній. У даній частині роботи були досліджені кальцієві сигнали, які
викликані аплікацією 1-100 мкМ (S)-3,5-дигідрипіридину (DHPG), у
нейронах ДР спинного мозку. Дана речовина є специфічним агоністом mGluR
групи I. Експерименти проводили в присутності 1 мкМ TTX, 50 мкМ APV, 10
мкМ 6-ціано-7-нітроквіноксалина-2,3-дііону (CNQX), 10 мкМ
6-нітро-7-сульфанойлбензо(f)квіноксалина-2,3-дііону (NBQX) для
блокування потенціал-залежних Na+-каналів, NMDA й AMPA/каінатного
підтипів іонотропних глутаматних рецепторів. У режимі фіксації
потенціалу аплікація 100 мкМ DHPG (90 с) викликала збільшення [Ca2+]i
одночасно в сомі та дендритах більшості досліджених нейронів ДР.
DHPG-активовані кальцієві сигнали були схожі за формою, яка складається
з початкового піка і фази повільного відновлення, але відрізнялися за
своїми кінетичними характеристиками (рис. 7А). У номінально
безкальцієвому зовнішньому розчині відповіді на DHPG зберігалися; при
цьому швидка транзієнтна компонента зникала, а повільна компонента
тільки зменшувалась. Число клітин, що відповідають на DHPG, достовірно
зростало в зрізах, отриманих з щурів з карагеніновим запаленням (рис.
7Б). Процентне співвідношення клітин (від загального числа тестованих
нейронів), що відповідають на додавання різних концентрацій DHPG
збільшенням базального рівня кальцію, у контрольних тварин склало: 1 мкМ
DHPG – 13 % (n=16); 5 мкМ DHPG – 3 % (n=16); 10 мкМ DHPG – 4 % (n=14). У
щурів з карагеніновим запаленням число клітин, що відповіли, суттєво
зростало: 1 мкМ DHPG – 44% (n=17); 5 мкМ DHPG – 50%, (n=17); 10 мкМ DHPG
– 64%, (n=18). Середнє підвищення базального рівня кальцію (вимірюваного
в одиницях -?F/F) у нейронів, що відповіли на аплікацію DHPG у нейронах
контрольних тварин, склало (рис. 7В): 1 мкМ DHPG – 102 ± 5 % (n=11); 5
мкМ DHPG – 124.1 ± 7.3 % (n=13); 10 мкМ DHPG – 156.5 ± 17.4 % (n=16).
При запаленні: 1 мкМ DHPG – 120.3 ± 6.7 % (n=14); 5 мкМ DHPG – 153.6 ±
10.6 % (n=15); 10 мкМ DHPG – 165.3 ± 14.9 % (n=7, табл. 5).

Активація NMDA рецепторів у нейронах ДР.

У даних експериментах ми досліджували дію агоністів іонотропних
глутаматних рецепторів NMDA типу на електричну активність і кальцієві
відповіді в нейронах ДР контрольних щурів і щурів з карагеніниновим
запаленням. Аплікація 25 мкМ NMDA (60 с) у відсутності іонів магнію
збільшувала рівень цитозольного кальцію в нейронах як контрольних, так і
щурів з карагеніновим запаленням, що свідчить про наявність
кальційпровідних NMDA рецепторів (рис. 8). У нейронах щурів з
карагеніновим запаленням амплітуда NMDA-індукованого [Ca2+]i транзієнту
зростала в дендритах, але не в сомі тестованих клітин (табл. 5).
Карагенінове запалення призводило до суттєвого зростання кальцієвого
транзієнту, викликаного аплікацією NMDA у дендритах нейронів на 26.2 ±
6.5% у порівнянні з нейронами контрольних щурів. У середньому амплітуда
кальцієвих транзієнтів викликаних аплікацією NMDA у дендритах нейронів
ДР, становила 50.1 ± 5.3 % (n = 20) у нейронах контрольних тварин та
63.7 ± 4.2 % (n = 14) при запаленні (p 0.5).

Порівняння нормованих амплітуд [Ca2+]i транзієнтів, зазначених величиною
?F/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих
відповідей на аплікацію 100 мкМ КА (60 с) значно збільшені в нейронах ДР
щурів з карагеіновим запаленням у порівнянні з контрольними тваринами. У
середньому амплітуди КА-індукованих змін флуоресценції в сомі складали
4.9 ± 1.7 % (n = 9) у нейронах контрольних тварин й 16.6 ± 4.1 % (n =
10) при запаленні (р 0.5).

Порівняння нормованих амплітуд [Ca2+]i транзієнтів, виражених величиною
?F/F, показало, що амплітуди соматичних і дендритних кальцієвих
відповідей на аплікацію 3 мкМ DA (60 с), як й у випадку дії КА, значно
збільшені в нейронах ДР щурів з карагеніновим запаленням у порівнянні з
контрольними тваринами (рис. 10C). У середньому амплітуди DA-індукованих
змін флуоресценції в сомі становили 3.1 ± 1.4 % (n = 7) у нейронах
контрольних тварин й 19.8 ± 5.1 % (n = 9) при запаленні (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020