МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

національний фармацевтичний університет

ткаченко вячеслав георгійович

УДК 615.246.8:615.9:54.061/.062:543.544:577.352.523]001.8

Хіміко-токсикологічне дослідження лопераміду

15.00.02 — фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків — 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аналітичної хімії

Національного фармацевтичного університету,

Міністерство охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

БОЛОТОВ Валерій Васильович

Національний фармацевтичний університет, завідуючий кафедрою
аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

БЕЗУГЛИЙ Петро Овксентійович

Національний фармацевтичний університет,
завідуючий кафедрою фармацевтичної хімії

кандидат фармацевтичних наук, доцент

ДМИТРІЄВСЬКА Жанна Василівна

Харківська медична академія післядипломної oсвіти, доцент кафедри
клінічної біохімії та судово — медичної токсикології

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної

освіти ім. П.Л. Щупіка МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та
фармакогнозії

Захист відбудеться “28”_травня 2004 року о _1200год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному
фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул.
Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного
фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “24” квітня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради д. біол. н., професор
малоштан Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збільшення асортименту антидіарейних препаратів
різноманітної хімічної структури та будови потребує розширювати наукові
дослідження в галузі розробки нових, а також удосконалювати існуючі
методи їх хіміко-аналітичного контролю. Розробка методів
хіміко-токсикологічного аналізу сильнодіючих лікарських засобів є
актуальною задачею токсикологічної і фармацевтичної хімії, оскільки
перелік імпортних і вітчизняних лікарських препаратів, що пропонуються
на фармацевтичному ринку України, постійно розширюється.

Великий інтерес в аналітичному і хіміко-токсикологічному відношенні
представляють антидіарейні препарати. Відомі випадки використання
препаратів цієї групи із суїцидною ціллю, передозувань, дитячих отруєнь.

В хіміко-токсикологічному відношенні практично не вивчений сильнодіючий
препарат лоперамід. У літературі відсутні дані про надійні методи
ізолювання лопераміду з біологічного матеріалу, виявлення і кількісного
визначення, що придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу.
Відсутні відомості про оптимальні умови екстракції лопераміду з водних
розчинів, розподіл препарату в органах і біологічних рідинах організму,
зберігання препарату в біологічному матеріалі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію
виконано згідно з планом науково-дослідних робіт Національного
фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України, номер
держреєстрації 0103U000475 “Хімічний синтез і аналіз
біологічно-активних речовин, створення лікарських засобів синтетичного
походження”.

Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження є розробка
ефективних та експресних методів виділення лопераміду з біологічного
матеріалу, методів його виявлення і кількісного визначення, що придатні
для хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу.

Для досягнення наміченої мети були поставлені такі задачі:

запропонувати кольорові, осадові та мікрокристалоскопічні реакції для
ідентифікації лопераміду, виділеного з біологічного матеріалу;

розробити чутливі методики виявлення лопераміду за допомогою методу
хроматографії в тонких шарах сорбенту та УФ-спектроскопії, що дозволяють
відрізнити його від препаратів, які можуть застосовуватися разом із ним;

вивчити можливість застосування методу хроматографії в тонких шарах
сорбенту для ідентифікації та очищення лопераміду від співекстрактивних
речовин у витяжках з біологічного матеріалу;

розробити методики кількісного визначення лопераміду, що придатні для
цілей хіміко-токсикологічного і фармацевтичного аналізу
(УФ-спектроскопічну, екстракційно-фотометричну, іонометричну та методику
кількісного визначення за допомогою високоефективної рідинної
хроматографії);

розробити склад мембрани та конструкцію твердоконтактного
іонселективного електроду на лоперамід і застосувати його для
кількісного визначення лопераміду в розчинах, лікарських формах і
витяжках з біологічного матеріалу;

вивчити вплив природи органічних розчинників, рН середовища на
екстракцію лопераміду з водних розчинів;

порівняти ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному
аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру (О.О.
Васильєвої — витягання водою, підкисленою кислотою щавлевою;
В.П.Крамаренка — витягання водою , підкисленою кислотою сірчаною;
Стаса-Отто — витягання спиртом етиловим, підкисленим кислотою щавлевою,
Е.М. Саломатіна – витягнення ацетоннітрилом підкисленим кислотою
сірчаною) стосовно до лопераміду;

розробити ефективну і експресну індивідуальну методику ізолювання
лопераміду з біологічного матеріалу;

запропонувати методики виділення лопераміду з біологічних рідин
організму (крові, сечі);

вивчити розподіл лопераміду в органах тварин, що отруєні препаратом;

дослідити зберігання лопераміду в трупному матеріалі при його гнильному
розкладенні;

на підставі виконаних досліджень запропонувати схему
хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лоперамід.

Об’єкт дослідження. Препарат антидіарейної дії – лоперамід.

Предмет дослідження. Розробка методик (виявлення, кількісного
визначення, виділення з біологічного матеріалу) хіміко-токсикологічного
аналізу.

Методи дослідження. Для ідентифікації лопераміду в розчинах, у витяжках
з біологічного матеріалу і лікарських формах використовували методи
тонкошарової та високоефективної рідинної хроматографії, УФ- та ІЧ-
спектроскопії, кольорові та осадові реакції, іонометрії з використанням
розробленого твердоконтактного лоперамідселективного електроду; для
кількісного визначення – спектрофотометричний,
екстракційно-фотометричний, іонометричний та метод високоефективної
рідинної хроматографії. Для ізолювання лопераміду з біологічного
матеріалу використовували загальноприйняті в хіміко-токсикологічному
аналізі методи О. О. Васильєвої, В. П. Крамаренка, Стаса-Отто,
Е. М. Саломатіна, а також часткову методику ізолювання
ацетонітрилом, яка запропанована нами.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виконано систематичні
дослідження лопераміду в хіміко-токсикологічному відношенні.

Запропоновані кольорові та осадові реакції, методики хроматографії в
тонкому шарі сорбенту та УФ-спектроскопії для виявлення лопераміду, який
виділено з біологічного матеріалу. Вказані методи і реакції дозволяють
ідентифікувати лоперамід у присутності інших препаратів, що можуть
застосовуватись разом з ним.

Розроблені нові УФ-спектроскопічна, екстракційно-фотометрична, ВЕРХ та
іонометрична методики кількісного визначення лопераміду, що придатні для
цілей хіміко-токсикологічного, фармацевтичного та криміналістичного
аналізу.

Разом із співавторами нами розроблено конструкцію і склад мембрани
твердоконтактного іонселективного електрода на лоперамід що працює в
спирто-водних розчинах. На склад мембрани твердоконтактного
лоперамідселективного електроду отримано позитивне рішення про видачу
патенту України. Електрод застосовано для кількісного визначення
лопераміду в спирто-водних розчинах, лікарських формах і в витяжках з
біологічного матеріалу.

Вивчені умови (природа органічного розчинника, рН середовища) екстракції
лопераміду з водних розчинів, на основі чого розроблена методика його
ізолювання з біологічного матеріалу для хіміко-токсикологічних
досліджень.

Вперше проведено порівняльне вивчення загальноприйнятих у
хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин
стосовно до лопераміду. Розроблено ефективну і експресну індивідуальну
методику ізолювання лопераміду з біологічного матеріалу за допомогою
ацетонітрилу.

Запропоновано методики виділення лопераміду з біологічних рідин
організму (крові, сечі).

Вперше вивчено розподіл лопераміду в органах отруєних тварин, що
дозволяє вибрати оптимальні об’єкти для проведення
хіміко-токсикологічного аналізу.

Вперше досліджено зберігання лопераміду в біологічному матеріалі при
його гнильному розкладенні.

На підставі виконаних досліджень запропоновано схему
хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лоперамід.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методики виявлення
і кількісного визначення лопераміду, який виділено з біологічного
матеріалу, можуть використовуватися в практиці судово-хімічних
досліджень для вирішення питань отруєнь лоперамідом, в клінічних
лабораторіях з метою визначення лопераміду в біологічних рідинах, а
також у фармацевтичному та криміналістичному аналізі.

Твердоконтактний іонселективний електрод на лоперамід, на склад мембрани
якого отримано патент України, може знайти застосування в медицині, у
фармацевтичному і хіміко-токсикологічному аналізі.

Розроблені методики хіміко-токсикологічного дослідження лопераміду
впроваджені в практику лабораторії судово-хімічних експертиз Луганського
обласного бюро судово-медичної експертизи, а також у навчальний процес
Національного фармацевтичного університету, кафедри клінічної біохімії й
судово-медичної токсикології Харківської медичної академії
післядипломної освіти; кафедри неорганічної хімії з курсом
токсикологічної Запорізького державного медичного університету, та
кафедри фармакології з курсом токсикології Луганського державного
медичного університету.

Особистий внесок здобувача:

проведено аналіз літературних даних з методів виявлення і кількісного
визначення, фармакології і токсикології антидіарейного препарату
лопераміду;

розроблено методи ідентифікації і кількісного визначення лопераміду у
витяжках з біологічного матеріалу і в лікарських формах (кольорові та
осадові реакції, методи тонкошарової хроматографії лопераміду і інших
препаратів, що застосовують разом з ним, УФ-спектроскопії і
екстракційної фотометрії, ВЕРХ);

розроблено склад мембрани та конструкцію твердоконтактного ІСЕ на
лоперамід;

розроблено методики кількісного визначення лопераміду в спирто-водних
розчинах, лікарських формах і витяжках з біологічного матеріалу за
допомогою іонселективного електроду на лоперамід;

вивчені умови екстракції лопераміду з водних розчинів органічними
розчинниками в залежності від їх природи та рН середовища;

проведено порівняльну оцінку ефективності ізолювання лопераміду з
біологічного матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному
аналізі методами;

розроблено ефективну і експресну індивідуальну методику ізолювання
лопераміду з біологічного матеріалу за допомогою ацетонітрилу;

запропоновані методики виділення лопераміду з біологічних рідин
організму (крові, сечі);

досліджено розподіл лопераміду в органах отруєних тварин, а також
зберігання препарату в біологічному матеріалі;

запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного
матеріалу на лоперамід.

Апробація результатів дисертації. Доповіді основних результатів
дисертаційної роботи заслуховувалися на Наукової студентської
конференції (Харків, 2002), Всеукраїнській науково-практичній
конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002), ІІІ Міжнародної
науково-практичної конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства:
Медицина, Фармація, Біотехнологія”, (Харків, 2003).

Робота доповідалась та обговорювалась на міжкафедральній конференції
фармацевтичного факультету Національного фармацевтичного університету.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 4 статтях, 1
патенті України, 3 тезах доповідей.

Об’єм і структура дисертації. Робота викладена на 129 сторінках, містить
27 таблиць, 17 рисунків, 1 схему. Складається із введення, п’яти
розділів, загальних висновків та списку літератури (195 істочників, з
котрих 110 на іноземних мовах).

На захист виносяться наступні результати експериментальних випробувань і
їх теоретичне обґрунтування:

методи виявлення лопераміду за допомогою кольорових реакцій,
хроматографії в тонких шарах сорбенту, на папері, УФ-, ІЧ-спектроскопії;

методики кількісного визначення лопераміду екстракційно-фотометричними,
УФ-спектроскопічними методами, та методом ВЕРХ;

склад мембрани і конструкція лоперамідселективного електроду;

іонометричний аналіз лопераміду;

умови екстракції лопераміду органічними розчинниками;

методики ізолювання лопераміду з органів трупу і біологічних рідин
(кров, сеча);

результати розподілу лопераміду органах отруєних їм тварин і його
зберігаємість в біологічному матеріалі.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Лоперамід (лопераміду гідрохлорид)–4–[4–(4–хлорфеніл)–4
гідроксіпіперидино]–N,N–диметил–2,2–дифенилбутіраміду гідрохлорид Широко
застосовується в медичній практиці, як ефективний антидіарейний засіб.

1. Ідентифікація лопераміду

Для ідентифікації лопераміду в фармацевтичному аналізі використовують
методи УФ-, ІЧ-спектроскопії, ТШХ, ВЕРХ та деякі інші.

Безпосереднє використання цих методів не завжди можливе у
хіміко-токсикологічному аналізі. Деякі з них недостатньо чутливі та
специфічні. Інші потребують попереднього ретельного очищення витяжок з
біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин, які заважають
ідентифікації. Тому в хіміко-токсикологічному аналізі проводять комплекс
досліджень, який включає різні методи аналізу, що значно підвищує
надійність одержаних даних.

В зв’язку з цим нами вивчена можливість використання для виявлення
лопераміду при хіміко-токсикологічних дослідженнях кольорових та
осадових реакцій, методів (ТШХ, ВЕРХ), УФ- та ІЧ-спектроскопії.

Нами вивчено кольорові реакції лопераміду з реактивами: реактив Маркі
(до 1 мл концентрованої сірчаної кислоти додають 1 краплю формаліну),
реактив Лібермана (5 г натрію нітриту в 50 мл концентрованої сірчаної
кислоти), реактив Фреде (розчин молібдату амонію в концентрованій
сірчаній кислоті), реактив Ердмана (суміш 20 мл концентрованої сірчаної
кислоти і 10 мл розведеної азотної кислоти), реактив Манделіна (розчин
0,01 г ванадата амонію в 2 мл концентрованої сірчаної кислоти),
концентровану сірчану та азотну кислоти

Найчутливішими й специфічними серед них виявилися реактиви Лібермана та
Манделіна, які дозволяють виявити до 50 мкг лопераміду в пробі.

При вивченні мікрокристалоскопічних реакцій з осадовими реактивами:
Драгендорфа (розчин вісмуту йодиду в калію йодиді), Марме, (розчин
кадмію йодиду в калію йодиді) Зонненшейна (розчин кислоти
фосфорномолібденової), Бертрана (розчин кислоти кремнійвольфрамової),
Шейблера (розчин кислоти фосфорновольфрамової), сіль Рейнеке (1% розчин
амонію тетрароданодіамінохроміату), 1% розчин калію перманганату давали
з лоперамідом аморфні осади різного забарвлення.

Найбільш чутливими виявилися реактиви Зонненшейна і Марме (межа
виявлення 0,5 мкг в пробі, граничне розведення 1:100000).

Нами вивчені умови виявлення лопераміду за допомогою методу
хроматографії в тонких шарах сорбенту. Вибір оптимальних систем
розчинників різної полярності та тонких шарів проводили з урахуванням їх
здатності розділяти лоперамід, співекстрактивні речовини з біологічного
матеріалу, а також лікарські препарати, які можуть бути призначені разом
з лоперамідом.

В якості тонких шарів в методі ТШХ використовували готові скляні
пластини для високоефективної тонкошарової хроматографії (ВЕТШХ,
виробництво Естонії, сорбент КСКГ, фракція 5–20 мкм, товщина шару 130(25
мкм, розмір 10(10 см), пластини “Silufol UW-254”, пластини “Sorbfil”
(силікагель СТХ-1А, тип подложки ПЕТФ-Е), скляні пластини фірми Merck
(Германія, силікагель GF-254, розмір пластин 10(10 см).

Хроматографування проводили в камері об`ємом 500 см3, в яку вносили по
50 мл систем розчинників. Камеру насичували протягом 30 хвилин. Пластини
заздалегідь активували нагріванням при 110(С протягом 30 хвилин. На
лінію старту активованих пластин (пластинок) на відстані 2-х см від
нижнього краю наносили зразки лопераміду (0,05% розчин в хлороформі),
які містять від 0,1 мкг до 100 мкг препарату. Шлях пробігу розчинників
складав 8 см. Після досягнення системами розчинників лінії фронту
пластини виймали з камери, висушували під тягою при кімнатній
температурі і виявляли відповідними реактивами. В якості проявників були
використані пари йоду (бурі плями), послідовну обробку реактивами 0,3 М
розчину міді сульфату та 0,3 М розчину калію йодиду, реактив Драгендорфа
модіфікований за Муньє. Найбільш чутливими проявниками є реактив реактив
Драгендорфа модіфікований за Муньє (на пластинах “Sorbfil” і Merck
вдається виявити 0,25 мкг лопераміду).

Нами також вивчена можливість використання тонкошарової хроматографії
для виявлення лопераміду в присутності інших лікарських препаратів, що
можуть бути використані спільно з ним. Вибір оптимальних систем
розчинників різноманітної полярності проводили з урахуванням їхньої
здатності поділяти лоперамід, інші препарати, що можуть застосовуватися
спільно з ним, та соекстрактивні речовини з біологічного матеріалу.

Вивчена можливість застосування розроблених умов хроматографування для
виявлення лопераміду та його очистки від співекстрактивних речовин в
витяжках з біологічного матеріалу. Найбільш придатною для цієї мети
виявилася система хлороформ-метанол (90: 10);

Вивчена можливість застосування УФ-спектроскопії для ідентифікації
лопераміду.

ІЧ-спектр лопераміду (в таблетках з KBr) характеризується наявністю смуг
поглинання, см–1: 1625, 1386, 984, 709.

2. Кількісне визначення лопераміду

Для кількісного визначення лопераміду нами розроблені доступні і надійні
УФ-спектроскопічну, екстракційно-фотометричну методики, а також методику
ВЕРХ.

Для спектрофотометричного кількісного визначення лопераміду ми
побудували спочатку калібрований графік. Оптичну густину отриманих
розчинів вимірювали на спектрофотометрі СФ-46, у кюветі з товщиною шару
рідини 10 мм, при довжині хвилі 259±2 нм. Як розчин порівняння
використовували 0,1 М розчин кислоти хлористоводневої. Оптична густина
розчинів лопераміду підпорядковується законові світлопоглинання
Бугера-Ламберта-Бера в інтервалах концентрацій від 100 до 800 мкг
кінцевого об’єму проби.

Екстракційно-фотометричний метод визначення лопераміду заснований на
утворенні іонного асоціату препарату з метиловим оранжевим (молярне
співвідношення 1:1), який при рН 4,6 екстрагується хлороформом. Вказаний
іонний асоціат поступово розкладається, тому для підвищення чутливості
та надійності методики ми відразу розкладали його за допомогою
спиртового розчину кислоти сірчаної. При цьому виділялася еквівалентна
препарату кількість вільного метилового оранжевого.

При розробці даного методу ми вивчили вплив рН водної фази на утворення
та екстракцію іонних асоціатів лопераміду з метиловим оранжевим, вплив
на цей процес кількості азобарвника, а також провели вибір оптимального
світлофільтра та робочої довжини кювети.

Оптичну густину забарвлених розчинів вимірювали на фотоколориметрі КФК-2
(світлофільтр з ?еф = 540±10 нм, кювета з товщиною шару 10 мм). Оптична
густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону
світлопоглинання в межах концентрацій від 20 до 150 мкг лопераміду в
пробі, що аналізується.

Розрахунок вмісту лопераміду в розчинах, що досліджували, проводили за
допомогою калібрувального графіку, або за рівнянням прямої, яке було
розраховане за допомогою методу найменших квадратів: А=0,0081·C+0,0804,
де А- оптична густина розчину, С – вміст лопераміду в пробі, мкг.
Відносна помилка визначень становить ±2,09 %. Метод застосований для
кількісного визначення лопераміду в водних розчинах, а також в витяжках
з біологічного матеріалу.

Кількісний аналіз лопераміду методом ВЕРХ проводили з урахуванням його
максимуму поглинання в УФ- області спектра

(при ? 259 нм).

Рис.1. Градуювальний графік кількісного визначення лопераміду

методом ВЕРХ

Для визначення вмісту лопераміду в об’єктах досліджень використовували,
побудований градуювальний графік (Рис.1), або за рівнянням прямої, яке
було розраховане за допомогою методу найменших квадратів: Y=30,26·C
+95,36, де Y- площа піку, С – вміст лопераміду в 1 мл розчину, мкг.

Лінійність побудованого графіка спостерігалась в інтервалі концентрацій
від 0,002 мкг/мл до 202 мкг/мл, з відносною помилкою серднього
результату ±1,21%.

3. Іонометричний аналіз лопераміду

Нами розроблені склад мембрани та конструкція твердоконтактного
іонселективного електрода (ІСЕ) на лоперамід. Іонометричний аналіз
лопераміду утруднений у звязку з його низькою розчинністью у воді, але у
спирто-водних розчинах розчинність зростає.

b

?

0 Ae o u ?

?

A

u ?

?

&

&

&

(ід складається з структурного компонента (полівінілхлорид),
пластифікатора-розчинника (диоктилфталат), електродоактивної речовини
(комплекс лопераміду з гексанітрокобальтатом натрію) та стабілізатора
потенціалу електрода на межі мембрана – графітовий стріжень –
високодисперсне активоване вугілля (Таблиця 1).

Таблиця 1

Співвідношення компонентів мембрани (вагові %):

№ п/п Компонент мембрани Вміст, % вага.

1 Полівінілхлорид порошкоподібний ПЖ-З-70 35,00 – 38,00

2 Диоктилфталат 57,00 – 61,00

3 Електродоактивна речовина 2,70 — 3,30

4 Вугілля активоване ОУ-А високодисперсне 1,00 — 2,40

Конструктивно ІСЕ на лоперамід являє собою поліхлорвініловий стрижень
діаметром 10 мм і довжиною 120 мм. Всередині цього стрижня висвердлено 2
співосних канали: перший діаметром 3 мм і довжиною 90 мм і другий
діаметром 5 мм до кінця стрижня. У канал більшого діаметру запресований
графітовий стрижень, на внутрішній торець якого гальванічно нанесений
шар міді і припаяний вивід електрода.

Конструкція твердоконтактного ІСЕ на лоперамід представлена на рис.2:

Рис.2. Конструкція твердоконтактного ІСЕ на лоперамід:

1 – полівінілхлоридна трубка;

2 – графітовий стержень;

3 – шар міді;

4 – мембрана електроду;

5 – місце припаювання провідника;

6 – корок, що загвинчується;

7 – провідник.

Електродна функція є лінійною в інтервалі концентрацій

(2,0±0,2) 10-3-(4,0±0,4) ?10-5 М з крутизною 59±1 мВ; мінімальна
концентрація лопераміду гідрохлориду, що можна визначити запропонованим
електродом, складає 1,5?10-5 М.

Запропоновано методику іонометричного визначення лопераміду в
спирто-водних розчинах (відносна помилка ±3,41%) за допомогою
розробленого ІСЕ на препарат. Лоперамідселективний електрод застосовано
для кількісного визначення препарату в витяжках з біологічного
матеріалу.

На склад мембрани нового твердоконтактного лоперамідселективного
електрода отримано рішення про видачу патенту України.

4. Вивчення умов екстракції лопераміду з водних розчинів

Для наступної розробки оптимальних умов ізолювання лопераміду з
біологічного матеріалу нами вивчено екстракцію препарату з водних
розчинів деякими органічними розчинниками в залежності від рН
середовища.

Для утворення необхідних значень рН водних розчинів використовували
універсальну буферну суміш. Кислотність буферних розчинів контролювали
потенціометрично. Використовували розчини з рН від 2,0 до 10,0. Як
органічні розчинники (екстрагенти) застосовували найбільш поширені в
хіміко-токсикологічному аналізі, свіжоперегнані хлороформ, диетиловий
ефір, гексан і етилацетат. Проводили одноразову екстракцію лопераміду.
Об’єм органічного розчинника (екстрагента) дорівнював об’єму водної
фази. Органічний шар випарювали на водяній бані в випарювальній чашці
досуха, додавали до сухого залишку 10 мл хлороформу і ретельно
перемішували. Визначали кількісний зміст лопераміду
екстракційно-фотометричною методикою.

Одержані дані свідчать про те, що з кислого середовища (рН 2,0-4,0) у
диетиловий ефір, етілацетат та гексан лоперамід майже не переходе.
Максимальний ступінь екстракції диетиловим ефіром 98%±2%, етилацетатом
56%±2%, гексаном 95%±2%, досягається при рН 10,0, при використанні
хлороформу ступінь однократної екстракції не залежить від рН та
становить 70%±2%.Таким чином, кращим з вищевказаних екстрагентів для
виділення лопераміду з водних витяжок є хлороформ, а диетиловий ефір
зручно використовувати для екстракційного очищення кислих водних
витяжок, що містять препарат.

5. Виділення лопераміду з біологічного матеріалу

В літературі відсутні відомості про методи виділення лопераміду з
біологічного матеріалу.

Спочатку ми порівняли ефективність загальноприйнятих в
хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин
основного характеру з біологічного матеріалу стосовно до лопераміду:

О.О. Васильєвої (витягання водою, підкисленою кислотою щавлевою);

В.П. Крамаренка (витягання водою, підкисленою кислотою сірчаною);

Стаса-Отто (витягання спиртом етиловим, підкисленим кислотою щавлевою).

Е.М. Саломатіна (витягання ацетонітрилом підкисленим кислотою сірчаною).

Виявилося, що ці методи дозволяють ізолювати від 4% (В.П. Крамаренка) до
8% (Е.М. Саломатін) препарату з біологічного матеріалу (тканина
печінки).

Ми поставили задачу розробити ефективну та експресну індивідуальну
методику ізолювання лопераміду з біологічного матеріалу. Методика
заснована на розтиранні подрібненого біологічного матеріалу, що містить
препарат, з потрійною кількістю безводного натрію сульфату. та наступним
трьократним настоюванням лопераміду з одержаної суміші у хімічному
стакані ацетонітрилом. Об’єднані ацетонітрильні витяжки, фільтрували та
випаровували до сухого залишку. Залишок розчиняли в гексані. Гексанову
витяжку фільтрували та тричі збовтували з розчином кислоти
хлористоводневої. Гексанові витяжки відокремлювали і надалі не
досліджували. Кислі водні витяжки тричі збовтували з хлороформом.
Отриману хлороформну витяжку фільтрували і використовували для
ідентифікації лопераміду за допомогою кольорових і осадових реакцій,
методики ТШХ, а для кількісного визначення препарату
екстракційно-фотометричною, УФ-спектроскопічною та іонометричною
методиками.

Розроблений метод ізолювання лопераміду за допомогою ацетонітрилу
дозволяє виділити до 45% препарату з біологічного матеріалу.

Слід зазначити, що співекстрактивні речовини з біологічного матеріалу
часто заважають процесу хроматографування (розтягнуті плями лопераміду
разом із співекстрактивними речовинами, близьке значення Rf препарату та
вищезгаданих речовин).

Тому, для покращення умов хроматографування, пластини з нанесеними
зразками вміщували в хроматографічну камеру з хлороформом. При цьому
плями лопераміду залишалися на старті, а плями співекстрактивних речовин
мігрували в бік фінішу. Після цього пластини висушували та вміщували в
камеру з системою розчинників метанол-амоніак (100:1,5). В цих умовах
спостерігався задовільний розподіл плям лопераміду та співекстрактивних
речовин.

Нами також запропоновані методики виділення лопераміду з біологічних
рідин організму (крові, сечі).

Методика виділення лопераміду з крові заснована на осадженні форменних
елементів крові 0,1М розчином кислоти хлористоводневої (з
центрифугуванням), очищенні кислої водної витяжки ефіром диетиловим, та
екстракції препарату за допомогою хлороформу. Методика дозволяє виділити
55,38% лопераміду з крові.

Виділення лопераміду з сечі засноване на підкисленні проби з препаратом
0,1М розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-3,0, очищенні кислої
водної витяжки ефіром діетиловим та екстракції препарату хлороформом.
Методика дозволяє виділити 95,01% лопераміду з сечі.

Результати вивчення розподілу лопераміду в органах отруєних тварин
(щурів) через 3 години після внутрішньошлункового введення препарату
показали, що лоперамід в найбільших кількостях знаходиться в кишечнику
із вмістом, селезінці, мозку, нирках, і шлунку із вмістом (в порядку
зменшення).

Вивчено зберігання лопераміду в трупному матеріалі при його гнитті.
Вказано, що метод ізолювання за допомогою ацетонітрилу через 50 діб
зберігання біологічного матеріалу (тканина печінки) дозволяє виділити з
нього біля 11 % лопераміду.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

Запропоновано кольорові і осадові реакції, а також методики ТШХ,
УФ-спектроскопії, що придатні для виявлення лопераміду, який виділено з
біологічного матеріалу. Межа виявлення становить 50; 0,5; 100 мкг
препарату в пробі для кольорових реакцій, методики ТШХ та
УФ-спектроскопії відповідно.

Розроблено доступну і чутливу екстракційно-фотометричну методику
кількісного визначення лопераміду, що заснована на утворенні іонного
асоціату лопераміду з метиловим оранжевим; оптична густина забарвлених
розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах
концентрацій від 20 до 150 мкг лопераміду в 10 мл кінцевого об’єму.
Метод застосований для кількісного визначення лопераміду в водних
розчинах та в витяжках з біологічного матеріалу. Відносна помилка
середнього визначення становить ±2,09% та 3,75% відповідно.

Розроблено склад мембрани і конструкцію твердоконтактного
іонселективного електроду на лоперамід. Електрод застосовано для
кількісного визначення препарату в спирто-водних розчинах і у витяжках
із біологічного матеріалу. На склад мембрани ІСЕ на лоперамід отримано
рішення про видачу патенту України. Запропонований електрод може знайти
застосування у фармацевтичному і хіміко-токсикологічному аналізі.

Вивчено умови екстракції лопераміду з водних розчинів у залежності від
рН середовища. Вказано, що екстракція препарату хлороформом не залежить
від рН, а диетиловий ефір зручно використовувати для екстракційного
очищення водних витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних
речовин.

Вперше проведена порівняльна оцінка виділення лопераміду з біологічного
матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному аналізі методами,
а також розроблений більш ефективний і експресний індивідуальний метод
ізолювання препарату за допомогою ацетонітрилу. Метод дозволяє виділити
до 45% лопераміду з біологічного матеріалу.

Вивчено умови виявлення лопераміду у витяжках із біологічного матеріалу
методикою ТШХ. Для кількісного визначення препарату у витяжках із
біологічного матеріалу застосовано екстракційно-фотометричну та
іонометричну методику.

Запропоновано методики виділення лопераміду з біологічних рідин
організму (крові і сечі), що дозволяють ізолювати до 55 і до 95%
препарату відповідно.

Встановлено, що найбільша кількість лопераміду, через 3 години після
внутрішньошлункового введення тваринам, знаходиться в кишечнику із
вмістом, селезінці, мозку, нирках, та шлунку із вмістом. Ці органи
рекомендовано відправляти на судово-хімічні дослідження біологічного
матеріалу на лоперамід в разі летальних отруєнь препаратом.

Вивчено зберігання лопераміду в біологічному матеріалі при його гнитті.
Вказано, що за допомогою методу ізолювання ацетонітрилом через 50 діб з
тканини печінки, що піддалася гнильним змінам, можна виділити до 11%
препарату.

На основі проведених досліджень запропонована схема
хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лоперамід.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Болотов В.В., Ткаченко В.Г. Спектрофотометричне та
екстракційнофотометричне визначення лопераміду // Вісник фармації.–
2002.– №4 (32).– С. 12-14. Особистий внесок здобувача полягає в розробці
УФ-спектрофотометричного та екстракційно-фотометричного методик
кількісного визначення лопераміду та участі у написанні та оформленні
статті.

Болотов В.В., Ткаченко В.Г. Застосування тонкошарової та
високоефективної рідинної хроматографії і кольорових реакцій для
виявлення лопераміду та його кількісного визначення // Вісник Фармації
2003. — №2. – С.31-34. Особистий внесок здобувача полягає в розробці
методів ідентифікації лопераміду за допомогою тонкошарової
хроматографії, кольорових реакцій, кількісного визначення лопераміду
методом ВЕРХ та участі у написанні і оформленні статті.

Болотов В.В., Зареченський М.А., Ткаченко В.Г. Разработка и исследование
твердоконтактного лоперамидселективного электрода // Журнал органічної
та фармацевтичної химии. 2003. – Т. 1. – вип. 3–4. – С. 73–76. Особистий
внесок здобувача полягає в розробці складу мембрани ІСЕ, та розробці
методів ідентифікації, кількісного визначення лопераміду за методом
іонометрії, участі у написанні та оформленні статті.

Болотов В.В., Ткаченко В.Г. Методи виділення лопераміду з біологічного
матеріалу // Клінічна Фармація. 2004. – Т. 8. – №1. – С.12-15. Особистий
внесок здобувача полягає в розробці, експериментальній перевірці нового
методу виділення, участі у написанні та оформленні статті.

Рішення про видачу патенту України по заявці №2003076722 MПK7

G 01 N27/333. Мембрана твердоконтактного іоноселективного електродудля
визначення концентрації іонів лопераміду у водно-спиртових розчинах /
Болотов В.В., Ткаченко В.Г., Зареченський М.А. (Україна). Заявл.
17.07.03.

Болотов В.В., Ткаченко В.Г., Асефса Фатіма. Применение хроматографии в
тонких слоях сорбента (ТСХ) для идентификации лоперамида. // В кн.: Тези
доповідей наукової студентської конференції, Харків: Вид. НФаУ – 2002. —
С. 22.

Болотов В.В., Ткаченко В.Г. Вивчення залежності ступеня екстракції
лопераміду з водних розчинів в залежності від рН // В кн.: Фармація ХХІ
століття. Тез. доп. Всеукраїнської науково-практичної конференції,
Харків: Вид. НФаУ “Золоті сторінки” – 2002. – С. 104-105.

Болотов В.В., Зареченський М.А., Ткаченко В.Г. Розробка
лоперамідселективного електроду. // В кн.: Наука і соціальні проблеми
суспільства: медицина, фармація, біотехнологія. Тез. доп. ІІІ
Міжнародної науково-практичної конференції, Харків: Вид. НФаУ “Золоті
сторінки” – 2003. – С.47.

Ткаченко В. Г. “Хіміко-токсикологічне дослідження лопераміду”. –
Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за
спеціальністю 15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія.

Національний фармацевтичний університет, Харків, 2004.

Дисертаційна робота присвячена хіміко-токсикологічному дослідженню
антидіарейного препарату лопераміду.

У роботі представлені результати виявлення лопераміду за допомогою
кольорових та осадових реакцій, методик ТШХ, ВЕРХ, УФ- та
ІЧ-спектроскопії.

Запропоновані доступні та чутливі УФ-спектроскопічну,
екстракційно-фотометричну та ВЕРХ методики кількісного визначення
препарату в водних розчинах та витяжках з біологічного матеріалу.

Розроблено склад мембрани і конструкцію твердоконтактного
лоперамідселективного електроду. Електрод застосовано для визначення
концентрацій іонів препарату в спирто-водних розчинах, лікарських формах
та в витяжках з біологічного матеріалу.

Вивчено виділення лопераміду з біологічного матеріалу загальноприйнятими
у хіміко-токсикологічному аналізі методами і запропоновано ефективну
індивідуальну методику ізолювання лопераміду за допомогою ацетонітрилу.

Розроблені методики ізолювання лопераміду з біологічних рідин організму
(крові, сечі).

Вивчено розподіл лопераміду в органах отруєних тварин та його зберігання
в біологічному матеріалі.

На основі проведених досліджень запропонована схема
хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лоперамід.

Ключові слова: лоперамід, кольорові та осадові реакції, тонкошарова
хроматографія, спектрофотометрія, високоефективна рідинна хроматографія,
твердоконтактний іонселективний електрод, екстракція, біологічний
матеріал, хіміко-токсикологічний аналіз.

Ткаченко В. Г. “Химико-токсикологическое исследование лопераміда”. –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
по специальности 15.00.02. – Фармацевтическая химия и фармакогнозия. –
Национальный фармацевтический университет,

Харьков, 2004.

Диссертационная работа посвящена химико-токсикологическому исследованию
антидиарейного препарата лоперамида.

В работе представлены результаты обнаружения лоперамида с помощью
цветных, осадочных и микрокристаллоскопических реакций, методов ТСХ,
ВЭЖХ, УФ-, ИК-спектроскопии.

Показано, что высокую чувствительность имеют цветные реакции лоперамида
с реактивами Либермана, Манделина (предел обнаружения 50 мкг препарата в
пробе). Эти реактивы дают с лоперамидом окрашивание отличное от ряда
препаратов, выбранных для сравнения.

Среди осадочных наиболее чувствительными оказались реакции с реактивами
Зонненшейна и Марме (предел обнаружения 0,5 мкг в пробе, предельное
разведение 1:100000).

Для обнаружения и разделения лоперамида и ряда препаратов, которые могут
назначаться вместе с ним, использовали хроматографические пластины
“Sorbfil”, “ВТСХ”, “Silufol UV-254”, “Merck” и девять систем
растворителей. Предел обнаружения в данных условиях 0,05 мкг в пробе,
значение Rf от 0,20 до 0,80.

Предложен простой и надежный метод экстракционно-фотометрического
определения лоперамида в водных растворах и вытяжках из биологического
материала, основанный на образовании ионного ассоциата препарата с
метиловым оранжевым. Метод позволяет обнаружить от 20 до 150 мкг
лоперамида в 11 мл конечного объема с относительной ошибкой ±2,09%.
Также предложен УФ-спектроскопический метод количественного определения
лоперамиду в водных растворах. Метод позволяет обнаружить от 100 до 800
мкг препарата в конечном объеме с относительной ошибкой 1,33 %.

Разработаны конструкция и состав мембраны твердоконтактного
ионоселективного электрода (ИСЭ) на лоперамид, работающий в
спирто-водних растворах.

Ионоселективный электрод на лоперамид применен для количественного
определения препарата в водных растворах, лекарственных формах и
извлечениях из биологического материала.

Получено решение на выдачу патента Украины на состав мембраны
предложенного ИСЭ на лоперамид.

Исследованы условия экстракции лоперамида из водных растворов
хлороформом, диэтиловым эфиром, гексаном и этилацетатом в интервале рН
от 2,0 до 10,0. Показано, что экстракция препарата хлороформом не
зависит от рН (степень экстракции около 70%), а диэтиловый эфир удобно
использовать для очистки кислых водных вытяжек, содержащих лоперамид.

Изучены условия изолирования лоперамида из биологического материала с
помощью общепринятых в химико-токсикологическом анализе методов А.А.
Васильевой, В.Ф. Крамаренко, Стаса-Отто, Е.М. Саломатина.
Установлено, что методы Васильевой и Крамаренко позволяют изолировать
4-6% препарата из биологического материала, а метод Саломатина– около
8%.

Разработана эффективная частная методика изолирования лоперамида с
помощью ацетонитрила, которая позволяет выделить до 45% препарата из
биологического материала.

Предложены методы изолирования лоперамида из биологических жидкостей
организма (крови и мочи), которые позволяют выделить 55% препарата из
крови, и 95% из мочи.

Изучено распределение лоперамида в органах отравленных животных.
Установлено, что через 3 ч после внутрижелудочного введения лоперамида
крысам, наибольшее количество препарата содержится в кишечнике с
содержимым, селезенке, мозге, почках, желудке (в порядке уменьшения).

Исследована сохраняемость лоперамида в биологическом материале при его
гнилостном разложении. Показано, что с помощью метода изолирования
ацетонитрилом после 50 суток хранения (при температуре 5°С) из
биологического материала (ткань печени) можно выделить около 11%
лоперамида.

На основе проведенных исследований предложена схема
химико-токсикологического анализа биологического материала на лоперамид.

Ключевые слова: лоперамид, цветные и осадочные реакции, тонкослойная
хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография,
спектрофотометрия, твердоконтактный ионоселективный электрод,
экстракция, биологический материал, химико-токсикологический анализ.

Tkachenko V.G. “The chemico-toxicological investigation of loperamide”.
– Manuscript.

The thesis for Ph.D. in Pharmacy on speciality 15.00.02 – Pharmaceutical
chemistry and Pharmacognosy. – National University of Pharmacy, Kharkov,
2004.

The thesis is devoted chemico-toxicological analysis of antidiarrheal
preparation loperamide.

The results of colour and sedimentary reactions, thin-layer
chromatographic, high pressure liquid chromatographic, UV-,
IR-spectroscopic methods are represented in the thesis.

Sensitive methods of loperamide quantitative determination in
pharmaceutical preparations and extracts from biological material –
UV-spectroscopic, extractive photometry and HPLC are offered.

Optimum membrane structure and design of solid-contact ion-selective
electrode on loperamide. The electrode is applied for definition of
concentration of ions of a preparation in the medicinal forms and in
extracts from a biological material.

The loperamide extraction from biological material with generally
accepted in chemico-toxicological analysis methods has been studied. The
effective individual method of loperamide isolation by acetonitrile is
carried out.

Isolation techniques of loperamide from bode biological liquids are
developed. Loperamide distribution in bodies of the poisoned animals and
it preservation in a biological material is investigated.

On the basis of accomplished researches the scheme of
chemico-toxicological analysis in extracts from biological material is
offered.

Key words: loperamide, colour and sedimentary reactions, thin-layer
chromatography, high pressure liquid chromatography, spectrophotometry,
solid-contact ion-selective electrode, extraction, biological material,
chemico-toxicological analysis.

Підписано до друку 13.04.2004 р. Формат 60х90/16.

Папір офсетний. Друк офсетний. Ум. друк. арк. 1,0.

Обл..-вид.арк. 0,8.Тираж 100 примір. Замовлення № 119.

Надруковано у видавничому центрі

Луганського державного медичного університету,

91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська,1.

PAGE 1

С, мкг/мл

0

100

Площа

піку

1000

2000

3000

4000

5000

6000

150

50

200

7

6

1

5

3

2

4

Похожие записи