.

Фізіолого-біохімічні властивості та функціональна роль запасних білків буряків: Автореф. дис… д-ра біол. наук / Л.О. Лісневич, НАН України. Ін-т фіз

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3708
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Лісневич Лариса Олексіївна

УДК 581.134.14.15:633.41

ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТА ФУНКЦІОНАЛЬНА РОЛЬ ЗАПАСНИХ БІЛКІВ БУРЯКІВ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат дисертації
на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

КИЇВ1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в лабораторії фізіології і біохімії Інституту цукрових буряків УААН та Інституті фізіології рослин і генетики НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
КОСТИШИН Степан Степанович
Чернівецький державний університет ім.Ю.Федьковича, зав.кафедрою

доктор біологічних наук,
КОСАКІВСЬКА Ірина Василівна
Інститут ботаніки ім.М.Г.Холодного
НАН України, старший науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор
ДМИТРІЄВ Олександр Петрович
Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, зав.лабораторією.

Провідна установа : Дніпропетровський державний університет Міністерства освіти України

Захист відбудеться “ 14 “ жовтня 1999 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01. в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою : 252022, Київ-22, вул.Васильківська, 31/17.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.

Автореферат розіслано “ 8 “ вересня 1999 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми Підвищення продуктивності цукрових буряків, як важливої сільськогосподарської культури в Україні, передбачає створення нових сортів і гібридів з високим нетто-фотосинтезом, оптимальним розподілом асимілятів, інтенсивним водообміном, ефективним використанням поживних речовин на основі генетично різноманітного вихідного матеріалу (Болелова, 1986; Bosemark 1979; Курсанов 1976). Ефективність добору цінних для селекції форм залежить від наявності точних методів їх оцінки, серед яких особливе місце займає метод білкових маркерів, що базується на біологічній специфічності білків, яка виявляється електрофорезом та іммунохімічно (Конарeв, 1989). При цьому найбільш досконалими маркерами вважаються запасні білки, яким властива гетерогенність, мінливість в онтогенезі, стабільність складу в різних умовах вирощування і поліморфізм.
Методи білкових маркерів детально розроблені на зернових культурах (Конарев, 1983; Созинов, 1985; Попереля, 1986; Кук, 1987). Вивчення запасних білків та розробка цих методів для перехреснозапилювальних культур, як жито, кукурудза, соняшник, бавовник почалось відносно недавно і потребує істотних модифікацій.
Доцільність розробки таких методів для цукрових буряків очевидна. При цьому білкові маркери можуть бути залучені не тільки до розкриття всієї родової і видової різноманітності буряків, їх ідентифікації та паспортизації, але й до виявлення нових джерел збагачення та оздоровлення сортового генофонду.
Білки насіння цукрових буряків практично не вивчались. В літературі відома одна робота О.Даніельсона (1949), в якій представлені уривчасті дані про глобулін B.vulgaris. Дещо більше уваги приділялось білкам вегетативних органів цукрових буряків. При цьому досліджувались їх кількісні характеристики в залежності від екологічних факторів, умов вирощування рослин, сортових і видових відмінностей, якості насіння тощо (Бузанов, Борисюк і др., 1981; Борисюк, Самойлова, 1984). Відсутність інтересу дослідників до білків насіння буряків, можливо, пов’язана з біологічними особливостями цієї культури, тобто вуглеводним типом обміну, невеликим розміром насінини та незначним вмістом білка в ній.
Глобуліни, як відомо, є запасними білками дводольних рослин, але у різних видів вони різні. Так, у бобових – це 11S та 7S глобуліни; соняшника, гарбуза – 11S глобулін; рапса, арахіса – 12S глобулін, гречки – 13S глобулін (Соболев, 1975; Гаврилюк, 1975; Белозерський, 1975; Рядчиков, 1978). Для цукрових буряків не відомо які білки виконують запасну функцію і які їх фізіолого-біохімічні властивості.
Мета та основні завдання досліджень. Головною метою роботи було експериментально виявити запасні білки цукрових буряків, дослідити їх функціональну роль, деякі властивості, мінливість в онтогенезі та різних умовах вирощування рослин, а також поліморфізм на різноманітному вихідному матеріалі для виявлення можливості оцінки генофонду буряків по компонентам запасних білків. Виходячи з цього поставлені слідуючі завдання:
 вивчити склад субодиниць та поліпептидів 11S глобуліну в електрофоретичному та іммунохімічному аналізах;
 дослідити мінливість 11S глобуліну в онтогенезі, тобто в функціонально різних органах і тканинах цукрових буряків;
 експериментально довести запасну функцію 11S глобуліну при порівнянні його складу і вмісту в процесі дозрівання та проростання насіння, в аналізі розподілу амінокислот та кріовластивостей;
 виявити особливості складу дослідженого глобуліну в різних умовах вирощування цукрових буряків;
 детально вивчити поліморфізм запасного глобуліну у сортів по індивідуальних насінинах та можливість біохімічної паспортизації і реєстрації сортопопуляцій по електрофоретичних спектрах;
 дослідити поліморфізм глобуліну різних інбредних ліній та показати вплив інбридингу і експериментального мутагенезу на запасні білки;
 проаналізувати поліморфізм 11S глобуліну диких видів Beta та особливості їх ідентифікації по електрофоретичних і антигенних спектрах.
Наукова новизна досліджень. Вперше проведено детальне вивчення білків насіння цукрових буряків в індивідуальному аналізі при застосуванні методів електрофорезу та іммунохімії на різноманітному вихідному матеріалі: районованих і стародавніх сортах, диких і культурних видах, інбредних та чс-лініях, О-типах, компонентах сортів і гібридів, чс-гібридах, індукованих мутантах.
Вперше експериментально виявлено запасний білок цукрових буряків – 11S глобулін, який розкладається на декілька субодиниць, а при електрофорезі з додецилсульфатом натрію та меркаптоетанолом утворює дві групи поліпептидів з молекулярною масою 20 та 40 кД. Вивчена його електрофоретична та іммунохімічна гетерогенність, кріовластивості та розподіл амінокислот, варіабельність складу в онтогенезі та різних умовах вирощування, а також поліморфізм. Дано фізіолого-біохімічне обгрунтування можливості застосування 11S глобуліну як маркера для оцінки генофонду буряків. Показано, що електрофорез в дисоціюючій системі поліакріламідного гелю, застосований для аналізу 11S глобуліну окремих насінин, спроможний виявити внутрішньовидову, сортову та лінійну мінливість цього глобуліну.
Вперше встановлено, що електрофоретичні спектри 11S глобуліну та частота, з якою вони зустрічаються в популяціях можуть розглядатись як маркерна ознака в ідентифікації видів, сортів, ліній буряків, що стало вихідним положенням при розробці методу оцінки генофонду буряків по спектрах 11S глобуліну. Біохімічна паспортизація та сформований на основі цих даних каталог вітчизняних сортів і ліній по білкових формулах глобуліну дозволили порівняти структуру їх популяцій в одній системі, виявити різноманітність генофонду цукрових буряків, визначити оригінальні та подібні форми, походження та їх відмінність від матеріалів зарубіжних фірм.
Доведено, що низький поліморфізм глобулінів інбредних ліній може бути критерієм оцінки їх генетичної чистоти.
Вперше виявлено взаємозв’язок деяких компонентів запасних білків з фізіологічним процесом накопичення маси коренеплоду, яку записано у вигляді формули.
Доведена можливість оцінки насіння від міжвидових схрещувань на гібридність по антигенних компонентах 11S глобуліну.
Практична значимість. В роботі розроблено та дано фізіолого-біохімічне обгрунтування нового для цукрових буряків методу оцінки генофонду по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну (авторське свідоцтво СРСР №1433190 та патент України №8546). Суть його в реєстрації електрофоретичних спектрів 11S глобуліну окремих насінин, підрахуванні частоти, з якою вони зустрічаються у встановленій вибірці насіння та порівнянні цих показників по 2 . Метод може бути застосований в
1) фізіології рослин для :
– вивчення накопичення поживних речовин в насінні та їх використання в процесі росту і розвитку молодої рослини;
– виявлення взаємозв’язку компонентів запасних білків з важливими фізіоло-гічними процесами;
– визначення якості та життєздатності насіння;
2) в генетиці та селекції для :
– скринінгу генетичних колекцій;
– паспортизації сортів і ліній, оцінки різноманітності їх генофонду;
– визначення генетичної чистоти інбредних ліній;
– ідентифікації видів Beta, прогнозування їх сумісності при міжвидовій гібридизації.
Паспортизація вихідних селекційних матеріалів по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну та знання взаємозв’язку компонентів запасних білків з господарсько-цінними ознаками можуть бути використані для добору пар при створенні нових перспективних гібридів з бажаними ознаками.
Основні положення, що виносяться на захист.
1. Запасним білком цукрових буряків є 11S глобулін, який по молекулярній масі, складу субодиниць, поліпептидів, амінокислот та відношенню до кріопреципітації подібний запасним білкам інших дводольних рослин. Цей глобулін накопичується в насінні при дозріванні і першим використовується в процесі проростання.
2. Мінливість 11S глобуліну в онтогенезі, стабільність складу в різних умовах вирощування рослин, характерний розподіл амінокислот, співвідношення поліпептидів в електрофоретичних спектрах, дають фізіолого-біохімічне обгрунтування можливості застосування 11S глобулінів як білкових маркерів.
3. Поліморфізм 11S глобуліну проявляється при електрофорезі екстрактів індивідуальних насінин в дисоціюючій системі поліакріламідного гелю, що дало змогу виявити різноманітні типи спектрів цього глобуліну. Типи спектрів, їх число та частота, з якою вони зустрічаються відрізняється у різних сортів, видів і ліній буряків, що стало вихідним положенням при розробці методу оцінки генофонду по запасних білках.
Апробація роботи. Основні результати досліджень, викладені в дисертації, доповідались і обговорювались на Міжнародних координаційних нарадах по фізіології, біохімії та біотехнології цукрових буряків (Київ, 1983,1990), V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987), Всесоюзному семінарі ВІР “Білкові маркери в сортовій ідентифікації та реєстрації генетичних ресурсів культурних рослин” (Ленінград, 1983), ІІІ Міжнародному симпозиумі ISTA “Біохімічна ідентифікація сортів і ліній” (Ленінград, 1987), ІІ з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ,1992), V, VI з’їздах УТГІС (Умань, 1986; Полтава, 1992), Всесоюзному симпозиумі “Молекулярні механізми генетичних процесів” (Москва, 1993), Міжнародних конференціях “Молекулярно-генетичні маркери в селекції рослин” (Ялта, 1992; Київ, 1995) на 15 міжнародних, всесоюзних, республіканських наукових конференціях і з’їздах по фізіології, біохімії, молекулярній біології та генетиці цукрових буряків.
Публікація результатів досліджень. За матеріалами дисертації опубліковано 45 наукових робіт, з них одне авторське свідоцтво та один патент України.
Структура і об’єм роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, шести розділів, основних висновків, аналізу та узагальнення результатів досліджень, списку використаної літератури до якого входить 343 роботи вітчизняних та зарубіжних авторів, додатків. Дисертація має об’єм 290 сторінок, проілюстрована 78 таблицями і рисунками.
Декларація особистої участі. Дисертантом сформульовано напрямок досліджень, розроблено програму та методику експерименту, інтерпретовано отримані результати, сформульовані практичні рекомендації. Експериментальні дослідження проводились самостійно або спільно із співробітниками лабораторії фізіології і біохімії ІЦБ УААН та відділу молекулярної біології ВІР ім. М.І. Вавилова. Доля особистої участі в одержанні результатів та підготовці матеріалів до друку складає 85%.
Ступінь обгрунтованності та достовірність отриманих результатів. Наукові положення та висновки грунтуються на власному експерименталь¬ному матеріалі з урахуванням існуючих літературних даних. Вони обгрунтовані, відповідають змісту дисертації, оброблені статистично, мають високий ступінь достовірності.

Об’єкти і методи досліджень
Вивчення запасних білків буряків проводили: 1) в онтогенезі; на різних етапах розвитку цукрових буряків; 2) в насінні сортів, репродукованих в різних умовах вирощування рослин в індивідуальному аналізі; 3) в насінні різних сортів, ліній і видів по індивідуальним генотипам.
Об’єктами досліджень в останньому випадку були 132 представника 10-и видів роду Beta, серед яких вітчизняні сорти, гібриди і лінії із стерильною цитоплазмою, інбредні лінії, компоненти сортів і гібридів, індуковані мутанти, дикі види та міжвидові гібриди. Найбільш детально вивчались представники підвиду B.vulgaris L. saccharifera Alef., насіння яких одержано від ІЦБ УААН, Тростянецького насінневого заводу, Ялтушківської ДСС, філіалу ІЦБ м.Умань, ВІР ім. М.І.Вавилова, фірм Hilleshog, KWS. Для одержання насіння різних видів нами була створена колекція диких видів Beta на ІКР ІЦБ УААН.
Вивчення 11S глобуліну в онтогенезі проводили в насінневих зачатках, зрілому насінні, набряклому у воді насінні, шестиденних проростках, листкових пластинках, черешках та коренеплодах на двох сортах Білоцерківська однонасінна 45 та Білоцерківська однонасінна 34 в умовах вегетаційного досліду.
Особливості складу глобуліну при різних умовах вирощування цукрових буряків вивчали в насінні двох сортів (Білоцерківська одно¬насінна 45, Веселоподолянська однонасінна 29) та гібриду Ювілейний, репродукованих в різних зонах бурякосіяння та в різні роки.
В усіх аналізах з білками насіння використовували власне насіння, яке звільняли від оплодня за допомогою скальпеля та припарувальної голки.
11S глобулін для електрофоретичного та імунохімічного аналізів виділяли із сумарної солерозчинної фракції білків насіння методом кріопреципітації, тобто осадженням дистильованою водою при 40С.
Основним робочим методом аналізу поліпептидного складу глобулінів був електрофорез в вертикальних пластинах в дисоціюючій системі 12,5% поліакріламідного гелю в присутності додецилсульфату натрію та меркаптоетанолу по Laemlli (1970). Однак, для покращення розділення поліпептидів 11S глобуліну буряків в гель додавали карбамід, сахарозу, змінювали концентрацію додецилсульфату натрію, використовували кип’ячіння з меркаптоетанолом та інше.
Склад субодиниць 11S глобуліну аналізували в 12,5% поліакріламідному гелі з додецилсульфатом натрию. Електрофорез проводили в вертикальних пластинах апарату ABГE (Естонія).
Молекулярну масу поліпептидів визначали при електрофорезі в дисоциюючій системі гелю. Як мітчики молекулярних мас були цитохром С (12,3 кД), міоглобін (17,2 кД), карбоангідраза (32 кД), овотрансферін (78 кД).
Імунохімічний аналіз проводили по рекомендаціям І.П. Гаврилюк (1986) трьома методами: подвійною імунодифузією в 1%-ному агарозному гелі на трис-ЕДТА боратному буфері рН8,3; імуноелектрофорезом в 1,5%-ній агарозі на 0,05М мединалцитратному буфері рН8,6; ракетним імуноелектрофорезом в 10%-ній агарозі на 0,05М мединалцитратному буфері рН8,6. Імуноелектрофорез здійснювали в апараті Multifоr (Pharmacia) на протязі 1 години. Ракетний імуноелектрофорез застосовували як варіант кількісного імуноелектрофорезу, де утворений преципітат проявляється у формі піків (ракет), площа яких пропорційна вмісту білка-антигена (Егги, Гаврилюк, 1987). Вміст 11S глобуліну визначали по спеціально побудованій калібровочній кривій.
Імунні сироватки одержували імунізацією кролів 11S глобуліном буряків з ад’ювантом Фрейда. В аналізах використовували сироватку на глобуліни сортів Білоцерківська однонасінна 34, Рамонська 06, видів B.trigyna, B.maritima, B.corolliflora.
Амінокислотний склад 11S глобуліну вивчали після гідролізу 6N HCl при хроматографічному розділенні на амінокислотному аналізаторі ААА-339 (Чехія).
Визначення концентрації білків проводили експрес-методом в реакції Лоурі (Lowry, 1970) та при зв’язуванні білка з кумассі-синім (Скоупс, 1985).
Розроблений нами метод оцінки генофонду буряків по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну зареєстрований А.С.№1433190 та патентом України №8546 і складається з 5-и основних етапів:
1. Добір середньої проби насіння – 100 шт. для сортів, 50 шт. для інбредних ліній.
2. Виділення 11S глобуліну із кожної відібраної насінини.
3. Електрофоретичне фракціонування глобуліну індивідуальних насінин.
4. Реєстрація електрофоретичних спектрів по білкових формулах та частоті, як описано в роботах В.Г. Конарєва (1993).
5. Математична обробка даних по 2 .
Вегетаційний дослід проводили на вегетаційному майданчику ІЦБ УААН, польовий дослід – на дослідному полі Ялтушківської ДСС по загальноприйнятим методикам. Статистичну обробку даних здійснювали методом дисперсійного аналізу (Доспехов, 1985).

Результати досліджень та їх обговорення

1.Гетерогенність і біохімічні властивості 11S глобуліну.
В насінні цукрових буряків міститься 7,4% білків від сухої речовини клубочка (Максимович, 1940). Подібно іншим дводольним рослинам більша частина цих білків представлена глобулінами (Лесневич, 1982). Якщо із сумарного солерозчинного екстракту білків насіння буряків осаджувати глобулін методом кріопреципітації, тобто при низьких температурах, то він випадає в осад із чистотою достатньою для електрофоретичного та іммунохімічного аналізів.
Нами встановлено, що критична температура кріопреципітації цього глобуліну дорівнює мінімальній температурі проростання насіння цукрових буряків і становить 4оС.
При електрофоретичному фракціонуванні осадженого глобуліну з додецилсульфатом натрію, тобто при руйнуванні водневих зв’язків в його молекулі, на електрофореграмах виявлено 6 субодиниць з молекулярною масою 60-70 кД. Кількість і розподіл цих субодиниць не відрізняється у різних сортів цукрових буряків.
При електрофорезі в дисоціюючій системі поліакріламідного гелю з додецилсульфатом натрію та меркаптоетанолом глобулін цукрових буряків розкладається на 7 – 11 поліпептидів, утворюючи дві основні групи – кислі та основні поліпептиди з молекулярною масою 40 і 20 кД, відповідно (Рис. 1). Низькомолекулярні поліпептиди представлені в такому спектрі нерозділеною групою, але при зміні тривалості електрофорезу, вони мають 3-5 компонентів.
В антигенному складі глобуліну буряків виявлено один основний антиген (Рис. 2).
В імуноелектрофорезі він проявляється у вигляді однієї дуги преципітації (Рис. 2а). В ракетному імуноелектрофорезі цей глобулін формує один основний пік (ракету), висота якого відрізняється у різних сортів цукрових буряків (Рис. 2б). В подвійній імунодифузії він показує 1-3 антигенних компоненти в залежності від виду або сорту (Рис. 2в).
При порівнянні електрофоретичних та антигенних спектрів глобуліну буряків з такими ж спектрами інших дводольних рослин виявилось, що досліджений солерозчинний кріобілок буряків по молекулярній масі, складу субодиниць та поліпептидів подібний 11S глобуліну інших дводольних рослин.
Вивчення розподілу амінокислот в 11S глобуліні буряків показало, що він характеризується незбалансованим складом (Табл. 1). Так, 11S глобулін буряків має низький вміст незамінних амінокислот, таких як лізин, треонін, валін, фенілаланін, ізолейцин (1,35-3,54 мг в 100 мг білка) при практичній відсутності метионіну, цистину і триптофану. В дещо більшій кількості міститься лейцин (4,0–5,74 мг в 100 мг білка). Разом з тим в глобуліні буряків відмічено високий вміст глутамінової (10,57-15,79 мг), аспарагінової кислот (5,43–7,55 мг) та аргініну (5,89–9,29 мг).
Підвищений вміст цих амінокислот пояснюється їх особливим значенням у розгортанні метаболічних процесів при проростанні насіння (Прянішніков, 1945; Соболев, 1985). Відносно низький вміст проліну (2,2 – 6,5 мг в 100 мг білка) можна пояснити метаболічною спорідненністю проліну і аргініну, які на думку О.М. Соболєва (1985), в запасних білках знаходяться в зворотній залежності.
Таким чином було встановлено, що 11S глобулін буряків по молекулярній масі, складу субодиниць, поліпептидів, амінокислот та відношенню до кріопреципітації подібний запасним білкам інших дводольних рослин і, можливо, є запасним білком цукрових буряків.
Таблиця 1
Вміст характерних амінокислот в 11S глобулінах насіння буряків, мг/100мг білка

Аміно-кислота Вид, сорт, лінія % від середньо-го
B.trigyna Ялт. одн. 30 Улад. чс 5 Інбр. лінія №88-103
1. Аспарагіно¬ва кислота 7,550,14 6,030,12 5,430,13 7,470,14 9,2
2. Треонін 2,550,31 1,830,24 1,710,09 2,230,18 2,9
4. Глутамінова кислота 15,790,25 11,530,27 10,570,23 13,620,28 17,9
5. Пролін 2,410,16 2,010,12 1,980,11 2,130,16 2,8
10. Лейцин 5,740,14 4,420,15 4,000,20 5,690,14 6,9
15. Аргінін 9,290,22 6,560,12 5,890,18 8,170,21 10,4
Сума всіх амінокислот 72,84 55,53 49,62 67,24

2. Варіабельність 11S глобуліну в онтогенезі та в різних умовах вирощування цукрових буряків.
Вивчення електрофоретичного складу 11S глобуліну в онтогенезі цукрових буряків дозволило спостерігати особливості функціонування білкових систем в процесі росту і розвитку рослин, а також закономірності накопичення та використання цього глобуліну при дозріванні та проростанні насіння. Аналіз одержаних електро¬форетичних спектрів (Табл. 2) показав, що кожний етап онтогенезу характеризується певним набором 11S глобуліну, серед яких виявлено органоспецифічні поліпептиди: в насінні – Rf 0.46, 0.54, 0.56; шестиденних проростках – Rf 0.54, 0.55, 0.60; листкових пластинках – Rf 0.28, 0.30, 0.41; черешках – Rf 0.46; коренеплодах – Rf 0.65. Встановлені поліпептиди, що синтезуються de novo, або активується їх синтез, порівнюючи з попереднім етапом – Rf 0.07, 0.09, 0.14, 0.16, 0.18, 0.28, 0.30, 0.36, 0.41, 0.65, 0.67, 0.70, 0.80; а також поліпептиди, що розкладаються до амінокислот – Rf 0.20, 0.46, 0.54, 0.60, 0.74.
Дозрівання насіння супроводжується поступовим накопиченням поліпептидів та вмісту в них білків в зоні електрофоретичного спектру Rf 0.46 – 0.74. В цей період дослідники спостерігали значне підвищення кількості рибосом в цитоплазмі та збільшення загального вмісту РНК (Beevers, Paulson, 1972; Гумилевская и др., 1995). По нашим даним з ракетного іммуноелектрофорезу вміст 11S глобуліну поступово збільшується в насінних зачатках цукрових буряків починаючи з 10-го до 26-го дня після запилення, досягаючи максимального значення в зрілому насінні. Однак, з перших же днів проростання насіння вміст глобуліну падає і зменшується з кожним днем (Рис. 3). Електрофоретичні компоненти глобуліну насіння Rf 0.46, 0.54, 0.56, 0.74 стають вужчими, менш рухливими або зникають зовсім в проростках, що говорить про використання цих білків на ріст і розвиток молодої рослини.
В.П. Баннікова (1970), Д. Баултер (1970), О.М. Соболєв (1985) вважають, що білки, які накопичуються при дозріванні та першими використовуються в процесі проростання є запасними білками.
Таким чином, результати одержані нами в електрофоретичних та іммунохімічних аналізах 11S глобуліну буряків при дозріванні та проростанні насіння, у вивченні амінокислотного, поліпептидного та субодиничного складу експерементально підтвердили висновок, що 11S глобулін є запасним білком цукрових буряків.
Таблиця 2
Відносна електрофоретична рухливість (Rf) поліпептидів 11S глобуліну насіння і вегетативних органів цукрових буряків в онтогенезі на прикладі сорту Бц.одн.45.
Номер компоненту Насінні зачатки Дозріле насіння Насіння, що набрякало у воді Шестиденні проростки Листкові пластинки Черешки Коренеплоди
6 0.200.04 0.200.05 0.200.05 – – – –
7 0.280.06 0.280.08 0.280.08 0.280.10 0.280.04 0.280.04 0.280.08
8 0.300.04 0.300.12 0.300.12 0.300.12 0.300.07 0.300.06 0.300.10
9 – – – – 0.360.06 0.360.04 0.360.06
10 – – – 0.410.08 0.410.06 0.430.08 0.430.07
11 0.460.07 0.460.08 0.460.10 0.450.06 0.460.03 0.460.06 0.460.03
12 – – – – 0.480.04 0.480.04 0.480.04
13 0.540.03 0.540.04 0.540.04 0.540.04 – – –
14 0.560.06 0.560.04 0.560.04 0.550.04 0.550.08 0.550.06 0.550.08
15 – 0.610.09 0.610.09 0.600.08 0.600.08 0.600.04 –
16 – – – – 0.650.10 0.650.04 0.650.04
17 – – – 0.670.08 0.670.08 0.670.06 0.670.04
18 – – – – – – 0.700.03
19 – 0.740.10 0.740.10 – 0.740.06 0.740.04 0.740.06
20 – 0.780.08 0.780.08 0.780.06 0.780.04 0.780.04 0.780.08
21 – – – – – – 0.800.08
22 – 0.850.04 0.850.04 0.850.03 0.850.03 0.880.08 0.850.09
23 – 0.900.03 0.900.03 0.900.03 0.900.09 0.900.09 0.900.04
24 – 0.960.08 – – – – –
Загальне чис-ло ком-понен-тів 6 13 12 14 19 19 20
Примітка: значення Rf, що відповідають інтенсивнозабарвленим компонентам виділені жирним шрифтом.

Електрофоретичне фракціонування 11S глобуліну окремих насінин двох сортів та одного гібриду, репродукованих в різних зонах, тобто в різних умовах вирощування рослин та в різні роки показало, що його склад достовірно не відрізняється в досліджених варіантах (Табл. 3). Тільки в одному випадку у гібриду Ювілейний №507Е імовірність відмінності від популяції №28Е мала критичне значення, що можливо, пов’язано з особливостями насінництва гібриду в 1992 році. Тобто, електрофоретичний склад 11S глобуліну цукрових буряків детерміно¬ваний генотипом і не залежить від умов вирощування рослин.

Таблиця 3
Імовірність відмінності між популяціями цукрових буряків, репро¬дукованих в різних умовах вирощування на основі розподілу частот електрофоретичних спектрів 11S глобуліну, розрахована по 2 .

Білоцерківська однонасінна 45
Партія насіння Мезен. насін. гос-во 1989р. Бц ДСС, 1992р. Бц. ДСС, 1989р.
№5Ф №554Е №64Е
№5Ф – 0,035 0,546
№554Е 0,034 – 0,630
№64Е 0,536 0,541 –
F1 Ювілейний
Партія насіння Уманський філіал ІЦБ
1990р. №25Ф 1989р. №275Е 1992р. №507Е 1989р. №28Е
№25Ф – 0,161 0,334 0,592
№275Е 0,151 – 0,669 0,325
№507Е 0,260 0,625 – 0,901
№28Е 0,585 0,306 0,951 –
Дві популяції вважаються відмінними, якщо імовірність відмінності між ними перевищує значення 0.95.

3. Фізіолого-біохімічне обгрунтування можливості застосування 11S глобулінів як маркерів для оцінки генофонду буряків.
Запасні білки (11S глобуліни), як показано в наших дослідженнях синтезуються в насінних зачатках цукрових буряків на пізніх етапах онтогенезу, коли рослинний організм повністю сформований і йде дозрівання насіння. При цьому білки накопичуються поступово. Спочатку з’являються кислі поліпептиди, а потім основні. Максимального значення вміст і число поліпептидів глобуліну досягає в зрілому насінні.
Умови, за яких відбувається синтез запасних білків, дуже своєрідні. Вони, як відомо з літератури, пов’язані з відтоком білків з усієї рослини і реутилізацією продуктів роскладу дозріваючою насіниною. Матеріал для синтезу цих білків надходить у формі амінокислот із молодих листків від синтетичних процесів або із старіючих листкових пластинок від розкладу існуючих там білків. Крім того, транспортні форми азоту у вигляді деяких амінокислот надходять із коренеплода (Bonner, Huang, 1963; Баннікова, 1970; Лібберт, 1976; Соболев, 1985).
Тобто, вся рослина приймає участь у синтезі та накопиченні запасних білків, перенесенні інформації до них. При цьому кількість білків в насінні залишається постійною на протязі довгого часу – періоду спокою. Досліджені нами властивості запасних білків цукрових буряків, зокрема, склад субодиниць, поліпептидів та амінокислот, здатність до кріопреципітації дають можливість зберігати неушкодженою структуру цих білків, незважаючи на обезводнення цитоплазми, збіднення її активними органоїдами. Але в разі необхідності, при проростанні вони можуть стати поживним матеріалом для молодого проростка.
Нами було встановлено, що ні листя, ні коріння, ні проростки не здатні синтезувати глобулін із таким складом. 11S глобулін, як запасний білок, характерний тільки для насіння, тобто йому властива тканинна специфічність.
При цьому електрофоретичний склад 11S глобуліну насіння буряків виявився настільки стабільним, що не змінювався в різних умовах вирощування рослин, тобто він обумовлений генотипом. Це дуже важлива особливість, що дозволяє порівнювати поліпептиди глобуліну різних генотипів, не зважаючи на те, в якій зоні і при яких умовах було репродуковане досліджене насіння.
На ранніх етапах проростання молодий проросток не залежить від екзогенних джерел азоту. Він росте і розвивається виключно із поживних речовин, і запасних білків в тому числі, які знаходяться в періспермі. Наші дослідження свідчать про зменшення вмісту 11S глобуліну в насінні буряків з кожним днем проростання. В перші дні прростання зменшується кількість білків і структура кислих та основних поліпептидів – Rf 0.46-0.74. Відбувається дезамідування білків, “старі” ферменти та запасні білки гідролізуються і розкладаються до амінокислот. Метаболічні фонди амінокислот використовуются тепер для синтезу нових білків, необхідних для росту і формування молодого проростка (Гумилевская, Чумикина, 1995; Wohlfarth, Braun et all., 1998).
Насіння позбавлене запасних білків виявляється нежиттєздатним. Особливо наочно це проявляється в гібридному насінні від міжвидових схрещувань або в примусовому самозапиленні, коли порушується або взагалі не відбувається синтез поживних речовин у сформованому насінні.
Існує думка (Гаврилюк, 1986), що причину порушення синтезу запасних глобулінів слід шукати в структурних відмінностях білків вихідних форм, які приводять до гальмування процесів відкладання запасних білків в гібридному насінні або до ускладнення використання їх зародком при проростанні. Тобто, структура молекули запасних глобулінів служить елементом розпізнавання “свого-чужого” при схрещуванні та забезпечує можливість синтезу і використання запасних білків при внутрішньовидових схрещуваннях, перешкоджаючи їм при віддаленій гібридизації та примусовому самозапиленні.
Тільки таке фізіолого – біохімічне обгрунтування дає нам підставу перейти до аналізу поліморфізму 11S глобуліну і розробки методу оцінки генофонду буряків по запасних білках.

4. Поліморфізм 11S глобуліну як критерій оцінки генофонду буряків.
У цукрових буряків, як перехреснозапилювальної культури, сорти – це складні популяції з високим рівнем генетичної та біохімічної мінливості. Згідно з Ф. Айала (1984) ступінь цієї мінливості можна оцінити, якщо визначити число варіантних форм білків та частоту, з якою вони зустрічаються в популяціях. Цей підхід був застосований нами для аналізу поліморфізму 11S глобуліну у сортів, ліній і видів буряків. При цьому кожний сорт аналізували у вибірці 100 насінин, лінії та види – 50 насінин. Розмір вибірки, необхідної для характеристики сортів встановлено у спеціально поставленому експерименті.
В результаті проведеного електрофоретичного аналізу виявлено внутрішньосортовий та лінійний поліморфізм 11S глобуліну, а також поліморфізм у диких видів Beta.
Внутрішньосортовий поліморфізм. Аналіз 22 вітчизняних сортів цукрових буряків та 5-ти гібридів із стерильною цитоплазмою по електро¬форетичних спектрах окремих насінин виявив 47 фенотипових класи (типи спектрів) 11S глобуліну, які представлені на рис.4 у вигляді схем. Кожний стовбчик цієї схеми відповідає типу спектру глобуліну і відрізняється один від одного принаймні одним компонентом. Останній стовбчик цієї схеми – це сумарний спектр глобуліну, в якому представлені всі поліпептиди, які існують у вітчизняних сортах і відрізняються по електрофоретичній рухливості.
Порівнюючи з іншими культурами поліморфізм цукрових буряків не високий. Так у 66-ти сортів, форм і ліній жита виявлено 315 спектрів авеніну (Пенева, Мартыненко, Конарев, 1989), одна популяція кукурудзи показала 26 типів спектру зеїну (Конарев, Сидорова, 1993), один сорт соняшника – 45 типів спектрів геліантиніну (Анисимова, 1993).
Кожний досліджений сорт записували у вигляді таблиці, де характеризували його по:
– загальному числу спектрів, що відображає поліморфізм популяції;
– білковій формулі, записаній по конкретному типу спектру;
– частоті, з якою ці спектри зустрічаються у вибірці 100 насінин.

Таблиця 4
Характеристика двох сортів Білоцерківської селекції по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну.
Типи спектрів Білкова формула Частота спектрів, %
1 2 5 6 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Бц.одн.34 Бц.одн.45
1 2 2 3 3 3 3 9.0 14.0
2 2 2 3 1 3 3 3 – 4.0
3 2 2 3 2 3 1 3 3 2.0 4.0
4 2 2 3 1 3 1 3 3 2.0 1.0
5 2 2 3 1 2 3 1 3 3 2.0 2.0
7 2 3 3 3 2 5.0 1.0
13 1 2 3 2 2 – 3.0
14 2 3 2 3 8.0 19.0
15 3 3 1 2 3 2.0 –
16 2 3 3 2 3 4.0 2.0
18 2 3 2 2 3 1 2 3 3.0 –
25 2 3 3 1 3 9.0 7.0
26 2 3 3 3 – 1.0
27 2 3 3 3 1 – 4.0
32 2 3 3 3 23.0 14.0
33 1 3 3 3 1.0 –
34 2 3 3 1 3 2.0 5.0
35 2 2 3 3 3 1 1.0 2.0
36 2 3 3 1 3 1 – 2.0
37 2 2 1 3 2 3 21.0 1.0
39 2 3 3 3 2.0 5.0
40 2 2 3 1 3 1 3 4.0 1.0
42 2 2 3 1 3 1 3 1 – 6.0
Загальне число спектрів 17 20
Примітка. В білковій формулі інтенсивність кожного поліпептиду позначена в балах: інтенсивний поліпептид – 2 бали, дуже інтенсивний поліпептид – 3 бали, слабкий – 1 бал.
В табл. 4 представлена характеристика двох сортів – Білоцерківської однонасінної 34 та Білоцерківської однонасінної 45 по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну. По цим трьом показникам всі досліджені сорти відрізняються між собою.
По загальному числу спектрів найбільш поліморфним виявився сорт Рамонська однонасінна 47, який має 24 типи спектрів; найменш поліморфним -сорт Білоцерківська однонасінна 34 (17 типів спектрів). У Рамонської 06, Ялтушківської однонасінної 30, Веселоподолянської однонасінної 29, Уладівської однонасінної 35 – 23, 22, 21, 19 типів спектрів відповідно. Гібриди із стерильною цитоплазмою менш поліморфні (16-19 типів спектрів), що пов’язано з особливостями їх селекційного конструювання із ліній – компонентів, поліморфізм яких значно нижчий. Іноземні гібриди ще менш поліморфні (15-16 типів спектрів).
По частоті, з якою зустрічаються ці типи спектрів сорти також відрізняються між собою. Більшість сортів мають 2-3 характерних спектри, частота яких становить 45-66% від усіх частот. Порівняння частот спектрів досліджених популяцій дозволяє виявляти характерні та унікальні біотипи, аналізувати їх популяційний склад, вивчати зміни в процесі еволюції і селекції, визначати сортову чистоту партій насіння.
Аналіз сортів по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну після математиматичної обробки по 2 виявив оригінальні та подібні сорти, показав їх істотну відмінність від інбредних ліній та дійсну різноманітність вітчизняного генофонду (Табл. 5).
Так, встановлено, що сорти Рамонська 06, Білоцерківська однонасінна 34, Веселоподолянська однонасінна 29, Бійська однонасінна 12, Ялтушківська
однонасінна 30, Межотненська 104, Верхнячська 103, Уладівська 752 покращена достовірно відрізняються між собою та від інших популяцій. Це оригінальні сорти, що були створені на основі аборигенних матеріалів в даній екологічній ниші одним або групою селекціонерів. Взагалі аналіз достовірної відмінності між сортами по 2 відображає особливості популяційного складу сортів, пов’язані з їх походженням.
Враховуючи вище наведені дані, було встановлено, що генофонд вітчизняних сортів – популяцій є унікальним і не має аналогів в інших бурякосіючих країнах.
Таким чином, застосування розробленого нами методу аналізу 11S глобуліну та математичної обробки по 2 дозволило нам провести біохімічну паспортизацію та сформувати Каталог вітчизняних сортів цукрових буряків по білкових формулах.
Таблиця 5
Достовірність відмінностей по критерію 2 при попарному порівнянні розподілу частот спектрів 11S глобуліну у сортів та ліній цукрових буряків

п/п Сорт, компо-нент, лінія 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Інбредна лінія ЯДСС
1 Білоцерківська одн.34 15.5 20.9 14.4 28.7 64.5 46.9 37.3 11.3 53.2 12.1 17.0 19.4 37.6 113.8 107.3
2 Білоцерківська одн.45 10.2 28.3 5.7 29.2 16.8 23.7 19.4 38.1 9.7 8.2 11.1 32.9 108.0 98.2
3 Білоцерківська одн.60 82.6 4.9 57.4 36.0 53.2 12.6 35.3 10.4 9.8 25.8 21.1 98. 104.3
4 Рамонська 06 29.8 75.7 60.8 14.5 64.2 24.6 34.8 21.8 56.9 25.5 105.4 115.1
5 Рамонська одн.47 34.7 16.3 36.1 20.1 26.9 9.5 10.8 21.3 16.8 80.1 141.2
6 Веселоподолянська одн.29 13.8 49.5 56.7 41.1 47.8 41.5 33.4 88.7 117.1 50.9
7 Індустріальний 15.2 22.5 57.5 15.0 23.4 25.2 17.4 111.2 54.9
8 Ялтушківська одн.30 18.2 62.4 11.0 22.3 16.4 13.8 188.2 59.7
9 Ялтушківська одн.64 31.3 18.1 8.7 17.0 15.0 203.1 78.2
10 Уладівська 752 покр. 45.9 24.9 35.3 63.8 200.5 87.3
11 Льговська одн.52 8.9 11.9 12.7 130.1 116.7
12 Північнокавказька одн.42 6.9 30.2 110.8 188.3
13 Межотненська 104 12.9 186.1 93.7
14 Компонент Ял.одн.30 №7405 73.1 98.5
15 ЧС-лінія Умань 70.4
Примітка. Відмінність достовірна при Р=99,9% (2  18.5), при Р=99% (2 13.3), при Р=95% (2  9.5); відмінність недостовірна при Р=95% (2 9,5).

Математичний розрахунок даних, проведений із застосуванням множинного лінійного регресійного аналізу по частоті електрофоретичних спектрів 11S глобуліну в сортах цукрових буряків з одного боку та показниками маси коренеплодів і врожайності з другого боку дозволив нам виявити взаємозв’язок деяких поліпептидів глобуліну з фізіологічним процесом накопиченя маси коренепдлоду, яку записували у вигляді формули.
Так, середня маса коренеплоду М для кожного сорту при даних умовах вирощування дорівнює:
М=М0+Nаma+Nвmв+Nсmс
де М0 – маса коренеплода при відсутності компонентів а, в, с;
ma, mв, mс – прибавки маси коренеплода, пов’язані з присутністю в спектрі компонентів а, в, с відповідно.
Nа, Nв , Nс – частоти, з якими зустрічаються компоненти а, б, с відповідно.
Якщо Г – густота насадження, то врожайність сорту можна записати так:
Вр=МГ=(Мо+ Nаma+Nвmв+Nсmс)Г.

Поліморфізм 11S глобуліну у інбредних ліній. Інбридинг у цукрових буряків істотно впливає на поліпептидний склад 11S глобуліну, зменшує його поліморфізм та підвищує частоту одного-двох типів спектрів.
Аналіз популяцій та ліній Ялтушківської ДСС, тобто сорту Ялтушківська однонасінна 30, його компонентів, субкомпонентів та різних ліній показав, що ступінь гомозиготності цих матеріалів пов’язаний із поліморфізмом по глобулінам. Інбредні лінії порівнюючи із сортопопуляціями менш поліморфні (2-9 типів спектрів) і мають значно більшу частоту одного двох спектрів. Кожна лінія відрізняється від іншої наявністю найбільш характерного типу спектру, який зустрічається із частотою 61-95%. При цьому
найчастіше зустрічаються спектри з одним кислим поліпептидом (№32, №25). Тобто, низький рівень поліморфізму глобуліну може бути показником генетичної чистоти інбредних ліній цукрових буряків. Зменшення числа поліпептидів в електрофоретичних спектрах та загального поліморфізму по білках в інбредних лініях описано на інших культурах. Це явище пояснюється репресією генів, що контролюють синтез цих білків і розглядається як одна із причин інбредної депресії лінійних матеріалів (Айала, 1984). З літератури відомо, що ні одна із досліджених ліній жита не була однорідною по складу запасних білків (Пенева, Мартыненко, Конарев, 1989). Вирівняні інбредні лінії соняшника мають один тип спектру геліантиніну. Однак із 70 зареєстрованих ліній тільки 13 мали чіткі маркерні ознаки (Анисимова, 1993). Інбридинг у кукурудзи проходить з найбільшим успіхом. Відома значна кількість інбредних ліній з оригінальним складом зеїну. Це не тільки лінії зарубіжних фірм, але й інбредні та мутантні лінії вітчизняної селекції (Попереля, Асыка, 1989; Моргун, Борейко і др., 1977; Конарев, Сидорова, 1993).
В електрофоретичному аналізі 11S глобуліну ліній із стерильною цитоплазмою встановлено, що матеріали різного походження достовірно відрізняються між собою по значеннях 2. При цьому найбільш істотні відмінності від умовного стандарту (чс-лінія м. Умань) спостерігались у ліній іноземного походження (Табл. 6).
Експериментальний мутагенез змінює частоту та співвідношення типів спектрів у мутантних ліній, порівнюючи з вихідними та викликає появу 11S глобулінів з оригінальним поліпептидним складом, який відрізняється від 47 типів спектрів зареєстрованих для сортів.

Таблиця 6
Різноманітність електрофоретичних спектрів 11S глобуліну та їх частота в лініях із стерильною цитоплазмою різного походження
Чс-лінія
походжен-ня  спект-рів Типи спектрів та їх частота Достовір. відмін. по 2
1 7 8 12 14 25 32 35 39
Умань
№2219 6 – – 10.0 6.0 10.0 10.0 60.0 – 4.0 станд.
№2231 2 – – – – 6.0 – 94.0 – – 40.0
ІЦБ УААН
№759 4 – 6.0 – – 14.0 – 70.0 10.0 – 47.5
№888 7 6.0 10.0 – – – 22.0 50.0 8.0 4.0 48.5
Hilleshog
чс-8 4 20.0 10.0 – – 60.0 10.0 – – – 145.6
чс-12 2 10.0 – – – – – 90.0 – – 56.0

Поліморфізм 11S глобуліну у диких видів Beta. Розкриття генетичного потенціалу або всієї видової різноманітності роду Beta необхідна умова ефективної селекційної роботи з цукровим буряком.
Це потребує чіткої ідентифікації видів та визначення місця кожної таксономічної одиниці в еволюційному циклі роду. Тим більше, що дикі види – це донори цінних ознак, що втрачені культурними формами в процесі еволюції і селекції.
Перші дані в цьому напрямку одержані нами та іншими дослідниками раніше при вивченні сумарних білків в загальній пробі насіння (Буренин, Гаврилюк и др., 1981; Лесневич, 1983). Однак, на думку Р. Левонтина (1978) чіткі відмінності між видами можна встановити тільки по частоті варіантних форм білків у певній вибірці.
Вивчення електрофоретичного складу 11S глобуліну диких видів в індивідуальному аналізі (вибірка 50 насінин) показало, що види відрізняються між собою наявністю та кількістю типів спектрів з різним поліпептидним складом та частотою, з якою вони зустрічаються. На рис. 5 видно оригінальний склад глобуліну кожного виду, який в свою чергу не повторює склад електрофоретичних спектрів культурних буряків, що представлені на рис. 4. У 8-и диких видів виявлено 23 нових типів спектрів глобуліну. В табл. 7 типи спектрів диких видів нумеруються від №48 до №70, №53-№58 відповідають видам, не представленим в таблиці. Як видно із цієї таблиці кожний вид має різні типи спектрів, які відрізняються також частотою. Види секції Patellares Тr. найменш поліморфні (1 тип спектру), у видів секції Corollinae Тr. – 3 типи спектрів, у диких видів Vulgares Тr. виявлено 4-5 типів спектрів глобуліну.
Такий детальний аналіз дозволив чітко ідентифікувати кожну таксономічну одиницю і встановити. що види секції Patellares , особливо вид B.patellaris Moq. найбільш давній серед видів роду. Види секції Corollinae виникли дещо пізніше. При цьому вид B.macrorhiza Stev. самий давній в цій секції, а B.intermedia Bunge проміжний між B.trigуna W. et K. та B.lomatogona F et М., що підтвердило уявлення В.П.Зосимовича (1940) про походження цих видів. Найбільш молодими є види секції Vulgares . Встановлено, що склад глобулінів та частота типів спектрів B.maritima L. найбільш подібні до культурних форм цукрових буряків, що дає підставу, згідно з існуючими в літературі уявленнями (Благовещенский и др., 1974; Конарев, 1983) передбачати найкращу сумісність цих видів при гібридизації. Сумісність, в свою чергу, забезпечує повнішу інтрогресію корисних ознак від диких форм у культурні (Szota, Jassen, 1967). Ці дані підтвердили висновки, одержані нами раніше.
Тобто, попередній добір пар для схрещування на основі електрофоретичних властивостей запасних білків насіння може значно полегшити завдання створення віддалених гібридів. Міжвидові гібриди від гібридизації культурних форм з видами секції Patellares і Corollinae часто виявляються нежиттєздатними або стерильними (Буренин,1984). Для подолання міжвидової несумісності у буряків застосовують метод щеплень (Jonson, 1956), температурний вплив (Savitsky, 1978) та фізіологічно-активні речовини типу лектинів (Болелова, Петрушина и др., 1984). Відомі поодинокі випадки одержання таких міжвидових гібридів. Найбільш вдалою була робота Г.Савицької (1978, 1983) по переносу в культурні рослини гена стійкості до нематоди від виду B.patellaris .

Таблиця 7
Типи спектрів 11S глобуліну та їх частота у деяких диких видів буряків.
Типи спек-трів Частота типів спектрів у диких видів буряків,%
B.patellaris
Moq. B.procum-bens
Сhr.Sm. B.trigyna W. et K B.macro-rhiza
Stev. B.maritima L. B.cicla L.
48 100
49 100
50 84
51 12
52 4
59 90
60 8
61 2
62 22
63 14
64 16
65 10
66 38
67 12
68 10
69 46
70 32

Наявність міжвидової несумісності ускладнює гібридизацію цукрових буряків з дикими видами, що потребує додаткової ідентифікації гібридних форм. В нашій роботі показано, що антигенний спектр глобуліну міжвидових гібридів поєднує в своєму складі поліпептиди дикого і культурного видів. Гібридність насіння від міжвидових схрещувань можна визначити по наявності в спектрі гібриду видоспецифічного антигену B.vulgaris.
Підсумовуючи одержані результати досліджень та існуючі літературні дані по запасних білках різних рослин, слід відзначити, що знання про фізіолого-біохімічні властивості білків буряків перестають бути білою плямою в цій галузі. Нами встановлено, що запасним білком цукрових буряків є 11S глобулін. Вивчено його фізіолого-біохімічні властивості, зокрема електрофоретичний, іммунохімічний та амінокислотний склад, відношення до кріопреципітації, особливості накопичення та використання в онтогенезі, тканинну специфічність, відсутність залежності від умов вирощування рослин. Експериментально доведена функціональна роль 11S глобуліну, як запасного білка. Дано фізіолого-біохімічне обгрунтування можливості його застосування як маркера для оцінки генофонду буряків. Здійснено детальний аналіз поліморфізму 11S глобуліну у сортів, гібридів, ліній і диких видів, що дало змогу розробити метод оцінки генофонду буряків по компонентах запасних білків. Це, в свою чергу, дозволило здійснити біохі-мічну паспортизацію та реєстрацію сортів і ліній в єдиному каталозі, виявити їх різноманітність та оригінальні форми, визначити критерій оцінки генетичної чистоти ліній, уточнити філогенетичні взаємовідносини в межах роду.

ВИСНОВКИ

Електрофоретичне та іммунохімічне дослідження глобулінів цукрових буряків в онтогенезі, різних умовах вирощування рослин та в генотипах видів, сортів, гібридів і ліній дозволило вперше виявити запасні білки цієї культури та дослідити їх фізіолого-біохімічні властивості, функціональну роль, мінливість в онтогенезі, стабільність в різних умовах вирощування та поліморфізм.
1. Встановлено, що запасним білком цукрових буряків є 11S глобулін – солерозчинний білок, який при руйнуванні водневих зв’язків розкладається на декілька субодиниць з молекулярною масою 60-70 кД, а при дисоціації дисульфідних зв’язків утворює кислі та основні поліпептиди з молекулярною масою 40 та 20 кД, відповідно. В його антигенному спектрі виявлено одну основну лінію преципітації.
2. Доведено, що 11S глобулін буряків – кріобілок. Критична температура його кріопреципітації відповідає мінімальній температурі проростання насіння цукрових буряків і становить 40С.
3. Функціональна роль 11S глобуліну, як запасного білка, експериментально доведена особливостями його накопичення та використання при дозріванні та проростанні насіння, характерним співвідношенням амінокислот, тканинною специфічністю, стабільністю складу в різних умовах вирощування.
4. Кислі поліпептиди 11S глобуліну більш гетерогенні, еволюційно та генотипово мінливі, ніж основні поліпептиди. В процесі еволюції від виду B.patellaris Moq. до культурних форм буряків поступово збільшується їх число та кількість представленого в них білка. Поява нових поліпептидів в еволюції видів Beta співпадає з формуванням нових видових категорій і пов’язана з істотною зміною структури молекули глобуліну. Біохімічна збагаченність глобуліну деякими кислими поліпептидами у сортів та гібридів порівнюючи з інбредними лініями обумовлює властивий їм гомеостаз та забезпечує більшу інтенсивність метаболічних процесів, що, можливо, пов’язано з гетерозисом.
5. В процесі росту і розвитку цукрових буряків поступово змінюється вміст, а також електрофоретичний та іммунохімічний склад 11S глобу¬ліну. Для кожного етапу онтогенезу характерний певний набір цих глобулінів, серед яких виявлено органоспецифічні поліпептиди, а також поліпептиди, що синтезуються de novo або розкладаються до амінокислот.
6. Встановлено, що при дозріванні насіння відбувається поступове накопичення вмісту та варіантних форм 11S глобуліну, що пов’язано з відтоком білків із усієї рослини та реутилізацією продуктів розкладу дозріваючим насінням. При цьому першими з’являються кислі поліпептиди, які на самому початку проростання використовуються молодим проростком для росту.
7. Доведено, що електрофоретичний склад 11S глобуліну детермінований генотипом і не залежить від умов вирощування цукрових буряків.
8. 11S глобулін буряків характеризується незбалансованим амінокислотним складом і має низький вміст незамінних амінокислот, де практично відсутні метионін, цистин, триптофан. В найбільшій кількості представлені глутамінова, аспарагінова кислоти, а також аргінін поряд із заниженим вмістом проліну.
9. 11S глобулін буряків – поліморфний білок. У вивченому генофонді, що включає дикі види, сорти, гібриди, інбредні лінії, мутанти виявлено 70 фенотипових класів (типів спектрів) 11S глобуліну. Кожний тип спектру відрізняється від іншого принаймні одним поліпептидом. Відмінність між видами, сортами та лініями полягає в наявності різних типів спектрів, що відрізняються складом поліпептидів, а також їх частотою.
10. Аналіз внутрішньосортового поліморфізму 11S глобуліну показав, що генофонд вітчизняних сортів-популяцій є унікальним і не має аналогів в інших бурякосіючих країнах, в його складі виявлено 47 типів спектрів. Сорти поліморфні по складу глобулінів (17-24 типи спектрів) і мають 3-4 характерних типи спектрів, які зустрічаються із частотою 41-64%. Оригінальні сорти достовірно відрізняються між собою та від інших матеріалів по значенням 2, розрахованих на основі частот виявлених типів спектрів.
11. Встановлено, що інбридинг у цукрових буряків істотно впливає на поліпептидний склад 11S глобуліну, зменшує його поліморфізм та підвищує частоту одного-двох типів спектрів. Низький рівень поліморфізму глобуліну може бути показником генетичної чистоти інбредних ліній. Гомозиготні лінії мають 2-3 типи спектрів. Лінії із стерильною цитоплазмою різного походження достовірно відрізняються по частоті виявлених типів спектрів. Експериментальний мутагенез змінює співвідношення типів спектрів у мутантних ліній та викликає появу мутантних генотипів з оригінальним складом глобуліну.
12. Аналіз поліморфізму 11S глобуліну диких видів Beta виявив 23 типи спектрів, які не зустрічаються у вирощуваних сортів, що дало змогу ідентифікувати їх по цим спектрам та їх частоті, а також уточнити філо¬генетичні взаємовідносини між видами в межах роду і, зокрема, в секції Corollinae Tr. Антигенний спектр міжвидових гібридів поєднує в своєму складі поліпептиди дикого та культурного видів, гібридність насіння визначається по наявності видоспецифічного антигену B.vulgaris L.
13. Встановлено взаємозв’язок деяких поліпептидів 11S глобуліну з фізіоло¬гічним процесом накопичення маси коренеплоду при застосуванні математич¬ного аналізу даних частот електрофоретичних спектрів в сортах цукрових буряків з одного боку та показниками маси і врожайності з другого боку.
14. Одержані результати по вивченню фізіологічних та біохімічних властивостей 11S глобуліну, його мінливості в онтогенезі, різних умовах виро¬щування та поліморфізму дали можливість розробити та експериментально обгрунтувати новий для цукрових буряків метод оцінки генофонду по електрофоретичних спектрах запасних білків, показати напрямки подальшого розвитку досліджень та шляхи їх практичного використання.

ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ.
В роботі дано фізіолого-біохімічне обгрунтування можливості застосування запасних білків як маркерів для оцінки генофонду цукрових буряків, а також розроблено метод такої оцінки по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну (А.С. СРСР №1433190 та патент України №8546). Суть його в реєстрації електрофоретичних спектрів 11S глобуліну окремих насінин, підрахуванні частоти, з якою вони зустрічаються у встановленій вибірці насіння та порівнянні цих показників по 2 . Метод може бути застосований в 1) фізіології рослин для :
– вивчення накопичення поживних речовин в насінні та їх використання в процесі росту і розвитку молодої рослини;
– виявлення взаємозв’язку компонентів запасних білків з важливими фізіологічними процесами;
– визначення якості та життєздатності насіння;
2) в генетиці та селекції для :
– скринінгу генетичних колекцій;
– біохімічної паспортизації сортів і ліній, оцінки різноманітності їх генофонду;
– визначення генетичної чистоти інбредних ліній;
– ідентифікації видів Beta, прогнозування їх сумісності при міжвидовій гібридизації, визначення гібридності насіння.
Біохімічна паспортизація вихідних селекційних матеріалів по електрофоретичних спектрах 11S глобуліну та знання взаємозв’язку компонентів запасних білків з господарсько-цінними ознаками можуть бути використані для добору пар при створенні нових перспективних гібридів з бажаними ознаками.

СПИСОК ОСНОВНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лесневич Л.А., Болелова З.А. Изучение и оценка генофонда сахарной свеклы по белкам-маркерам // Сельскохозяйственная биология. -–1987. – №4. – С.58-63.
2. Гаврилюк И.П., Лесневич Л.А., Зайцева Л.Н., Лисицин Е.М. Идентификация сортов и линий сахарной свеклы по составу полипептидов 11S глобулина семян // Белковые маркеры в сортовой идентификации и регистрации генетических ресурсов культурных растений. Сборник научных трудов ВИР. – Л.: ВИР, 1987. – С.126-131.
3. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А. Новые генетические маркеры для свеклы // Сахарная свекла. – 1987. – №7. – С.37-39.
4. Лесневич Л.А., Гаврилюк И.П., Конарев В.Г., Зайцева Л.Н. Запасные глобулины семян свеклы // Физиология и биохимия культурных растений. – 1988. – т.20, №6. – С.592-597.
5. Lesnevich L., Borisjuk V. Polymorfism 11S globulin in the identicacion varieties and lines of sugar beet. // Biochemical identificat. varieties. Material Intern. Simpos. ISTA. – L. USSR: VIR. – 1988. – P.236-240.
6. Болелова З.А., Тихонова В.П., Лещенко Е.В., Лесневич Л.А. О создании новой формы сахарной свеклы с однолетним типом развития // Сельскохозяйственная биология. – 1985. – №7. – С.59-62.
7. Лесневич Л.А. Идентификация генофонда свеклы по запасным глобулинам семян // Физиолого – биохимические основы продуктивности сахарной свеклы. – Киев: ВНИС, 1989. – С.169-171.
8. Лесневич Л.А. Белковые маркеры в идентификации сортов и линий сахарной свеклы // Доклады ВАСХНИЛ. – 1990. – №7. С.28-32.
9. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Гаврилюк И.П. Применение белковых маркеров для идентификации селекционных материалов сахарной свеклы // Методические рекомендации. – Л.: ВИР, 1991. – 18 с.
10. Лесневич Л.А., Роик Н.В., Борисюк В.А., Дзись Н.С. Генетическое разнообразие селекционных материалов раздельноплодной сахарной свеклы по белкам-маркерам // Доклады ВАСХНИЛ. – 1992. – №4. – С.2-6.
11. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А. Каталог генофонда свеклы. Вып I. Характеристика отечественных сортов сахарной свеклы по белковым формулам. Киев: ВНИС, 1992.–33с.
12. Лесневич Л.А., Борисюк В.А. Полипептиды 11S глобулина в анализе подлинности сортов сахарной свеклы // Физиол. и биох. культ. растен. – 1993. – 25,№2. – С.175-181.
13. Лесневич Л.А., Борисюк В.А. Белковые маркеры в изучении и систематизации сортов и линий // Сахарная свекла. – 1993. -№5. – С.25-27.
14. Лесневич Л.А. Электрофоретическое и иммунохимическое изучение запасных белков семян свеклы // Физиол. и биох. культ. раст. – 1997. – т.29, №3. – С.200-208.
15. Лесневич Л.А. Запасные белки семян свеклы. Их гетерогенность, вариабельность в онтогенезе и полиморфизм // Физиол. и биох. культ. раст. – 1998. – т.30, №6. – С. 417-426.
16. Лісневич Л.О. Внутрішньовидова мінливість запасного глобуліну диких видів роду Beta L. // Физиол. и биох. культ. раст. – 1999. – т.31, №2. – С.129-135.
17. А.С.№1433190 СССР, МКИ А01 Н1/04. Способ идентификации сортов сахарной свеклы. / Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А., Конарев В.Г., Гаврилюк И.П. (СССР) – №4125635; Заявл. 25.07.86; Опубл. 08.11.88, Бюл. №9. – 1989.
18. Патент Украины №8546, МКИ А01 Н1/04. Способ идентификации сортов и линий сахарной свеклы / Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А., Конарев В.Г., Гаврилюк И.П. – Заявл.23.12.93; Опубл.30.09.96; Офіційний бюлетень Промислова власність. -№3.- 1996.

19. Болелова З.А., Лесневич Л.А., Петрушина М.П. К вопросу о биологической специфичности растворимых белков видов рода Beta в связи с преодолением межвидовой несовместимости // Сельскохозяйственная биология. –1984. – №2. – С.57-60.
20. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А. Значение белков, как генетических маркеров при идентификации геномов свеклы // Цитогенетические и цитоэмбриологические исследования в селекции сахарной свеклы. – Киев: ВНИС. – 1988. – С.88-98.
21. Богданова А.М., Поединок Н.Т., Лесневич Л.А. Серное питание и продуктивность сахарной свеклы. Серное питание и продуктивность растений. Сб.науч.тр. – Киев: Наукова думка, 1983. – С.103-114.
22. Лісневич Л.О., Борисюк В.О. Субодиниці глобулінів як біохімічні маркери у вивченні генофонду буряків // Український біохімічний з’їзд. Тези доповіді. Ч.ІІ. – Київ: УБТ, 1987. – С.56-57.
23. Лесневич Л.А., Борисюк В.А. Электрофорез 11S глобулинов в идентификации сортов и линий сахарной свеклы (Electrophoresis of globulins 11S in identification of varieties and lines of sugar beet) // III Международный симпозиум по биохимической идентификации сортов. Тезисы докладов. – Ленинград: ВИР, 1987. – С.45-46.
24. Болелова З.А., Лесневич Л.А. Биохимические маркеры при изучении гетерозиса и ЦМС у сахарной свеклы // Гетерозис. Теория и практика. – Харьков: Укр НИИ РСГ, 1988. – С.19.
25. Лесневич Л.А. Полиморфизм 11S глобулинов в изучении генома сахарной свеклы // Частная генетика растений: Тезисы докладов всесоюзной конференции (23-25 мая 1989 г., Киев). – Киев: УААН, 1989. – С.131-132.
26. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А. Полиморфизм 11S глобулинов в изучении эволюционных взаимоотношений рода Beta L. // Молекулярные механизмы генетических процессов. – М.: ИОГеН, 1990. – С.89.
27. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Болелова З.А. Идентификация генотипа сахарной свеклы по белкам-маркерам // VI съезд Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Полтава. Тезисы докладов. – Киев: АН Украины, 1992. – С.29-30.
28. Лесневич Л.А., Борисюк В.А., Шкляр А.Я. Изменчивость состава 11S глобулинов и адаптивные возможности сортов сахарной свеклы // Управление генетической изменчивостью с-х растений. – Ялта: УААН, 1992. – С.40-41.
29. Лісневич Л.О., Борисюк В.О. 11S глобуліни як маркери в ідентифікації та вивченні генофонду цукрових буряків // ІІ з’їзд Українського товариства фізіологів рослин. Тези доповідей. ч.І. – Київ: ІФРГ НАНУ, 1993. – С.131-132.
30. Лісневич Л.О. Поліморфізм запасних білків в ідентифікації та вивченні генофонду цукрових буряків // Молекулярно-генетические маркери в селекции растений. – Киев: Аграрная наука, 1994. – С.41-42.

Лісневич Л.О. Фізіолого-біохімічні властивості та функціональна роль запасних білків буряків. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 – фізіологія рослин. – Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 1999.
Дисертацію присвячено дослідженню фізіолого-біохімічних властивос-тей та функціональної ролі запасних білків буряків у зв’язку з виявленням можливості оцінки генофонду по компонентах цих білків. Вперше в електрофоретичних та іммунохімічних дослідженнях встановлено, що запасним білком цукрових буряків є 11S глобулін, який по складу субодиниць, поліпептидів, амінокислот та кріовластивостям подібний 11S глобулінам інших дводольних рослин. Функціональна роль 11S глобуліну буряків, як запасного білка, доведена особливостями його накопичення та використання в процесі дозрівання та проростання насіння, характерним розподілом амінокислот, мінливістю в онтогенезі та стабільністю складу в різних умовах вирощування рослин. В дисертації представлено фізіолого-біохімічне обгрунтування можливості застосування 11S глобулінів як маркерів для оцінки генофонду буряків. Розроблено та захищено авторським свідоцтвом СРСР (№1433190), патентом України (№8546) новий для цукрових буряків метод оцінки видів, сортів і ліній за електрофоретичними спектрами глобуліну. Критерієм такої оцінки встановлено типи спектрів, їх число та частоту, з якою вони зустрічаються у певній вибірці насіння. Результати проведених досліджень показали, що застосування запасних білків буряків як маркерів дає можливість з високим ступенем вирогідності здійснювати паспортизацію та реєстацію сортів і ліній, виявляти їх різноманітність та оригінальні форми, встановлювати взаємозв’язок деяких поліпептидів з важливими фізіологічними процесами, визначати якість та життєздатність насіння, оцінювати генетичну чистоту та походження ліній, уточнювати філогенетичні взаємовідносини в межах роду Beta L.

Ключові слова: 11S глобулін, електрофорез, іммунохімія, функціональна роль глобулінів, онтогенетична та генотипова мінливість, білкові маркери, оцінка генофонду, паспортизація сортів і ліній, філогенетичні взаємовідносини, буряки (сорти, гібриди, лінії, дикі види).

Лесневич Л.А. Физиолого-биохимические свойства и функциональная роль запасных белков свеклы. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.12 – физиология рстений. – Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 1999.
Диссертация посвящена исследованию физиолого-биохимических свойств и функциональной роли запасных белков свеклы в связи с определением возможности оценки генофонда по компонентам этих белков. Впервые в електрофоретических и иммунохимических исследованиях установлено, что запасным белком сахарной свеклы является 11S глобулин, который в диссоциирующей системе полиакриламидного геля образует две группы полипептидов с молекулярной массой 40 и 20 кД. Показано, что состав субъединиц, полипептидов, аминокислот и криосвойства этого глобулина подобны 11S глобулинам других двудольных растений. Этот глобулин постепенно накапливается при созревании семян и первым используется при прорастании. В процессе роста и развития свекловичного растения изменяется содержание, а также електрофоретический и иммунохимический состав 11S глобулина. Для каждого этапа онтогенеза характерен определенный набор этих белков, среди которых выявлены органоспецифичные полипептиды, а также полипептиды, которые синтезируются de novo или распадаются до более простых соединений. Установлено, что електрофоретический состав 11S глобулина детерминирован генотипом и не зависит от условий выращивания растений.
Функциональная роль 11S глобулина, как запасного белка, доказана особенностями его накопления и использования в процессе созревания и прорастания семян, характерным распределением аминокислот, изменчивостью в онтогенезе и стабильностью состава в разных условиях выращивания растений. Представлено физиолого-биохимическое обоснование возможности использования 11S глобулинов как маркеров для оценки генофонда свеклы.
В диссертации установлено, что полиморфизм 11S глобулина проявляется при электрофорезе экстрактов индивидуальных семян, что дало возможность выявить разнообразные типы спектров этого глобулина. Типы спектров, их число и частота с которой они встречаются в установленной выборке семян отличаются у разных сортов, линий и видов. Разработан и защищен авторским свидетельством СССР (№1433190), патентом Украины (№8546) новый для сахарной свеклы метод оценки генофонда по електрофоретическим спектрам 11S глобулина, где исследуемую партию семян характеризуют по этим показателям. В изученом генофонде свеклы выявлено 70 типов спектров 11S глобулина, из них 47 типов спектров соответствуют сортам и гибридам, 23 типа спектров – диким видам. Анализ внутрисортового полиморфизма глобулина показал, что отечественные сорта-популяции уникальны и не имеют аналогов в других свеклосеющих странах. Установленный нами оригинальный полипептидный состав диких видов и индуцированных мутантов, позволяет рассматривать их как значительный генетический резерв в расширении разнообразия новых гибридов, привнесении в них свойств устойчивости и продуктивности.
Результаты проведенных исследований показали, что использование запасных белков свеклы как маркеров дает возможность с высокой степенью достоверности осуществлять паспортизацию и регистрацию сортов и линий, выявлять их разнообразие и оригинальные формы, устанавливать взаимосвязь некоторых полипептидов с важными физиологическими процессами, определять качество и жизнеспособность семян, оценивать генетическую чистоту и происхождение линий, уточнять филогенетические взаимосвязи в пределах рода Beta L., устанавливать гибридность семян.

Ключевые слова: 11S глобулин, электрофорез, иммунохимия, функциональная роль глобулинов, онтогенетическая и генотипическая изменчивость, белковые маркеры, оценка генофонда, паспортизация сортов и линий, филогенетические взаимоотношения, свекла (сорта, гибриды, линии, дикие виды).

Lisnevych L.A. Physiologo-biochemical properties and functional role of beet storage proteins. – Manuscript.
Thesis for a doctor’s degree by specialiti 03.00.12 – plant physiology – Institut of Plant Physiology and Genetics of the National Academy of Scienses of Ukraine, Kyiv, 1999.
The dissertation is devoted to investigating physiologo-biochemical properties and functional role of beet storage protein in connection with determination of the possibility to estimate genetical pool by the components of these proteins. For the first time 11S globulin has been found to be a storage protein for sugar beet. Electrophoretical and immunochemical investigations show that globulin is similar to 11S globulin of other dicotyledonous plants by their composition of subunits, polypeptides, aminoacids and crioproperties. Functional role of 11S globulin as a storage protein is proved by the peculiarities of its accumulation and use in the process of seed maturing and germinating, by a characteristic aminoacid distribution, variability in ontogenesis and by a stability of the composition under different conditions of plant growing. Physiologo-biochemical grounds for a possibility of 11S globulin as markers for estimating beet genetical pool are presented in the dissertation. A new for sugar beet method which allows to estimate species, varieties and lines by using globulin electrophoretical spectra, is developed (A.S. №1433190, Patent №8546). Types of the spectra, their number and the frequency, they occur in a definite set of seeds, are a criterium of such estimating. The results of the investigations have shown that the use of beet storage proteins as markers makes it possible with high validity to introduce a passport system and registrate varieties and lines, to reveal their variations and original forms, to interconnect some polypeptides with important physiological processes, to define seed quality and viability, to estimate genetical purity and line origine, to detail phylogenetical interrelations in the range of Beta L.

Key words: 11S globulins, electrophoresis, immunochemistry, functional role of globulins, ontogenetic and genotypical variability, protein markers, estimating beet genetical pool, a passport system varieties and lines, phylogenetical interrelations, beet (variaties, hybrids, lines, wild species).

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2019