.

Енергозалежний транспорт Ca2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію: Автореф. дис… канд. біол. наук / Н.А. Струтинська, НАН України. Ін-т

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2344
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут біохімії ім. О.В.ПАЛЛАДІНА

СТРУТИНСЬКА НАТАЛІЯ АНДРІЇВНА

УДК 557.352.465.

ЕНЕРГОЗАЛЕЖНИЙ ТРАНСПОРТ Са2+ В ЕНДОПЛАЗМАТИЧНОМУ РЕТИКУЛУМІ КЛІТИН МІОМЕТРІЮ

03.00.04 – біохімія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.

Науковий керівник- доктор біологічних наук
Костерін Сергій Олексійович,
Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України,
завідувач відділу біохімії м’язів.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Малишева Маргарита Костянтинівна,
Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,
завідувач відділу нейрохімії;

кандидат біологічних наук
Терлецька Яніна Тимофіївна,
Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України,
провідний науковий співробітник відділу нейрохімії.

Провідна установа- Київський університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біофізики.

Захист відбудеться “7” грудня 1998 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України за адресою: 252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий “29” жовтня 1998 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гладенькі м’язи (ГМ), поряд із скелетовими м’язами та міокардом, відіграють важливу роль у забезпеченні життєдіяльності організму. Міомерій займає особливе місце серед ГМ, що обумовлено специфічністю функції, яку матка виконує в організмі при виношуванні плоду та пологах. Численні порушення скоротливої функції матки, котрі, як правило, є основою різноманітних патологій (слабкість пологової діяльності, невиношування плоду, спонтанні аборти, передчасні пологи, викидні, атонія, гіпо- і гіпертонус міометрію), пов’язані значною мірою саме з порушенням внутрішньоклітинного гомеостазу йонів Са, яким, як відомо [Wray S., 1993], належить важлива роль у контролі скорочення-розслаблення ГМ. Контроль концентрації Са2+ в клітинах міометрію, як і інших ГМ, забезпечується функціонуванням мембранозв’язаних систем енергонезалежного пасивного (Са2+-канали) та енергозалежного активного (Са2+-помпи і обмінники) транспорту цього катіону .
Відомо, що саме позаклітинному Са2+ належить найбільш важлива роль в активації скорочення ГМ [Шуба М.Ф., Бурый В.А., 1984]. У той же час надійно доведено, що внутрішньоклітинне Са2+-депо – ендоплазматичний ретикулум (ЕР) також приймає активну участь у забезпеченні контролю скорочення гладеньком’язових клітин (ГМК), зокрема клітин міометрію [Kosterin S.A. et al.,1994]. Проте, на відміну від Са2+-помпи плазматичної мембрани (ПМ) ГМК матки [Костерин С.А., 1990; Cлинченко Н.Н. и др., 1996], дані про властивості (зокрема кінетичні) Са2+-помпи ЕР клітин міометрію дуже обмежені. По-перше, при отриманні фракції мікросом ГМ матки система енергозалежного транспорту Са2+, що локалізована в цій субклітинній структурі, суттєво інактивується [Grower A. аnd Kwan C., 1983]. По-друге, на сьогодні не вдалося виділити із ретикулуму міоцитів матки високоочищений Са2+-транспортуючий фермент. Саме тому у літературі майже немає ніяких відомостей щодо спорідненості Са2+-помпи ЕР до реагентів (АТР, Мg2+), її субстратної та катіонної специфічності, чутливості до дії різноманітних ефекторів – інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем, йонів металів, фізіологічно-активних та фармакологічних утеротонічних речовин, зокрема до окситоцину.
У зв’язку з вищесказаним актуальною є надійна біохімічна ідентифікація Ca2+-помпи ЕР клітин міометрію, вивчення її кінетичних властивостей та чутливості до утеротонічного пептидного гормону окситоцину. Є підстави вважати, що саме суспензія пермеабілізованих міоцитів може бути корисною для біохімічного тестування внутрішньоклітинних енергозалежних Са2+-помп ГМ [Fittingoff M. and Krall J.F., 1988; Вian J. et al., 1991]. Тому особливої перспективи набуває комплексне біохімічне дослідження Са2+-помпи ЕР ГМК матки на рівні такої експериментальної моделі, як суспензія міоцитів, для котрих властива підвищена неспецифічна проникність ПМ внаслідок попередньої обробки клітин розчинами сапонінів, зокрема, дигітоніну [Fiskum G., 1985].
Мета і задачі дослідження.
Мета: у дослідах, проведених з використанням ізотопного (45Са2+) методу на оброблених розчином дигітоніну ГМК матки естрогенізованих невагітних щурів, ідентифікувати Са2+-помпу ЕР клітин міометрію, вивчити її кінетичні властивості та чутливість до дії окситоцину.
Задачі:
1. У комплексних дослідженнях, проведених з використанням Са2+-преципітуючих проникаючих аніонів, Са2+-йонофору А 23187 і селективних інгібіторів мембранозв’язаних енергозалежних Са2+-транспортуючих систем, тестувати Мg2+, АТР-залежне включення Са2+ у немітохондріальне внутрішньоклітинне Са2+-депо хімічно скінованих клітин міометрію.
2. Дослідити властивості Мg2+, АТР-залежної Са2+-помпи ЕР міоцитів матки – спорідненість до реагентів (АТР, Мg2+), субстратну та катіонну специфічність, чутливість до дії двовалентних катіонів та класичних інгібіторів мембранозв’язаних Са2+-помп.
3. Вивчити вплив окситоцину на Са2+-помпу ЕР ГМК матки.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у комплексних дослідах, що були проведені з використанням ізотопного (45Са2+) методу на суспензії клітин міометрію, оброблених розчином дигітоніну, ідентифікована та систематично вивчена компонента Мg2+,АТР-залежного накопичення Са2+, що є нечутливою до дії інгібітора акумуляції Са2+ в мітохондріях (МХ) рутенієвого червоного і відображає функціонування Са2+-помпи ЕР ГМК матки. Ця компонента стимулюється Са2+-преципітуючими проникаючими через ретикулярну мембрану аніонами (оксалат, фосфат), запобігається Са2+-йонофором А 23187 і пригнічується селективними інгібіторами Са2+-помпи ендо(сарко)плазматичного ретикулуму (Е(С)Р) тапсигаргіном та циклопіазонієвою кислотою.
Вивчені кінетичні властивості Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ЕР ГМК матки. Залежності початкової швидкості накопичення Са2+ в ЕР від концентрації АТР та Мg2+ характеризуються насиченням. Значення уявної константи Міхаеліса Кm по АТР та константи активації Ка по Мg2+ становлять відповідно 1,0 і 0,6 мМ. Йони Mn i Co можуть замінювати йони Мg у забезпеченні АТР-залежного накопичення Са2+. Ступінь гальмівного ефекту катіонів двовалентних металів на Мg2+, АТР-залежне накопичення Са2+ в ЕР клітин міометрію зменшується у ряду: Cu2+ >> Zn2+ >> Ni2+ = Mn2+ = Co2+.
Вперше показано, що Мg2+,АТР-залежна Са2+-помпа ЕР клітин міометрію чутлива до дії утеротонічного пептидного гормону окситоцину. Попередня обробка суспензії міоцитів розчином окситоцину (100 нМ) до внесення в середовище інкубації дигітоніну (0,1 мг/мл) призводила до часткового (на 25-30 %) інгібування активності цієї помпи.
Теоретичне і практичне значення одержаних результатів.
У теоретичному відношенні вищенаведені дані розширюють сучасні уявлення щодо властивостей Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ЕР клітин міометрію і вказують на важливу роль цієї Са2+-транспортуючої системи як фактора окситоцинчутливого позитивного зворотного зв’язку, спрямованого на підтримання підвищеної концентрації йонів Са у клітинах матки.
У практичному відношенні одержані результати є основою для подальшого розвитку вивчення функціональної ролі Са2+-помпи ЕР у Са2+-залежному контролі скорочення-розслаблення ГМ матки. Накопичені факти є перспективними для розробки загальної концепції фармакологічного корегування порушень скоротливої активності міометрію за умов різноманітних патологій та цілеспрямованого пошуку ефективних фізіологічно активних і фармакологічних речовин, що селективно впливають на активність цієї помпи.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота була виконана здобувачем під науковим керівництвом докт. біол. наук Костеріна С.О. у тісному співробітництві з канд. біол. наук Бабіч Л.Г. та канд. біол. наук Шликовим С.Г., з якими автор має спільні публікації. Наведені в рукописі результати були отримані здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні експериментів. Весь текст дисертаційної роботи особисто написаний здобувачем.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були апробовані на наукових семінарах відділу біохімічної кінетики та відділу біохімії м’язів, засіданнях вченої ради та семінарах Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, а також на VII Українському біохімічному з’їзді.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано чотири статті та двоє тез доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, методичної частини, результатів досліджень та їх обговорення, висновків та переліку літературних посилань (247 джерел). Робота викладена на 133 сторінках, містить 19 рисунків.

ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі роботи подано огляд літератури, в якому висвітлюються основні механізми, що залучені в регуляцію концентрації Са2+ у ГМК. Особлива увага приділена опису саме систем енергозалежного транспорту Са2+ у цих клітинах.
У другому розділі описано матеріали та основні методи досліджень.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Одержання гладеньком’язових клітин. Суспензію міоцитів матки невагітних щурів, що були естрогенізовані за добу до забору тканини, отримували за допомогою методу Міронно і співроб. [Mollard P., et al.,1988], який використовували у деякій модифікації [Бабич Л.Г. и др., 1994]. У 1 мл отриманої клітинної суспензії містилось (4-6)*106 міоцитів, кількість життєздатних клітин – від 90 до 95 % від загальної кількості клітин. Підрахунок клітин проводили з використовуванням гемоцитометра (камери Горяєва).
Вивчення Мg2+,АТР-залежного транспорту Са2+ у ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію. Енергозалежний транспорт Са2+ у суспензії ГМК матки досліджували за допомогою ізотопної методики (45Са2+).
Склад стандартного інкубаційного середовища (мМ): 20 HEPES-NaOH (pH 7,4, 370C), 125 KCl, 25 NaCl, 0,01 рутенієвий червоний, 3 АТР, 3 MgCl2, 0,01 (40CaCl2 + 45CaCl2) (0,5 мкКи/мл). Температура – 370С. Об’єм – 0,5мл.
При вивченні впливу різних концентрацій дигітоніну (0,02-0,2 мг/мл) на транспорт Са2+ даний детергент безпосередньо вносили у стандартне інкубаційне середовище. У всіх інших нижчеописаних експериментах використовували концентрацію дигітоніну 0,1 мг/мл, що забезпечувало тестування оптимального накопичення йонів Са. Діапазон концентрацій Са2+-преципітуючих проникаючих аніонів – 0-10 і 0-40 мМ відповідно для оксалату та фосфату калію.
У дослідах з Са2+-йонофором А 23187 (1 мкМ) ця сполука попередньо була присутня у стандартному середовищі інкубації. При цьому використовували розчин йонофору, що готували на етиловому спирті, кінцева концентрація спирту в середовищі інкубації – 1 %. У попередніх дослідах було показано, що етиловий спирт у даній концентрації не впливав на накопичення Са2+ у внутрішньоклітинних структурах ГМК матки.
У всіх експериментах транспортний процес ініціювали введенням у інкубаційне середовище аліквоти розчину АТР (кінцева концентрація – 3 мМ). Енергозалежну акумуляцію Са2+ зупиняли швидким (5-10 сек) фільтруванням інкубаційної суміші через мембранні фільтри (“Millipore”, США; “Химифил”, Естонія; діаметр пор 45 мкм) під вакуумом з наступним одноразовим промиванням їх 5 мл холодного (4oС) “стоп”-розчину, який містить 20 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 150 мМ KCl, 5 мМ CoCl2. Радіоактивність фільтрів вимірювали на рідинному сцинціляційному спектрометрі SL-4000 фірми “Intertechnique” (Франція).

Вивчення властивостей Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму клітин міометрію.
У дослідах по вивченню впливу різних концентрацій MgCl2 (1*10-5-5*10-3 М) і АТР (1*10-5-5*10-3 М) на початкову швидкість v0 акумуляції Са2+ в хімічно перфорованих ГМК у відсутності і в присутності оксалату (10 мМ) концентрація відповідно АТР і МgCl2 у стандартному середовищі інкубації була постійною і становила 3 мМ як у першому, так і в другому випадку.
При вивченні субстратної специфічності Са2+-помпи ЕР 3 мМ АТР у стандартному середовищі інкубації замінювали на 3 мМ CTP, GTP чи UTP.
Дослідження катіонної специфічності Са2+-транспортуючої системи проводили, замінюючи 3 мМ MgCl2 у стандартному середовищі інкубації на MnCl2, CoCl2, NiCl2, ZnCl2 або CuCl2 у тій же концентрації.
При вивченні впливу катіонів двовалентних металів на Са2+-помпу ці катіони (у вигляді хлоридів), використані у відповідних концентраціях, вносили у Мg2+-вмісне стандартне середовище інкубації.
Вплив ізотонічної заміни К+ на Na+ досліджували, заміщуючи частину KCl (125-25 мМ) на NaCl (25-125 мМ), причому сумарна концентрація обох солей становила 150 мМ.
У експериментах по вивченню концентраційних залежностей впливу інгібіторів енергозалежних трансмембранних потоків йонів Са на Мg2+,АТР-залежну Са2+-помпу ЕР використовували розчини: тапсигаргіну (1-100 нМ), циклопіазонієвої кислоти (0,05-10 мкМ) і еозину Y (0,05-100 мкМ) – на диметилсульфоксиді; п-хлормеркурібензоату (0,05-100 мкМ) – на воді, що мала слабку лужну реакцію; рутенія червоного (0,1-100 мкМ) і о-ванадату натрію (0,1-1000 мкМ) – на воді. У дослідах з рутенієвим червоним у стандартне середовище інкубації вносили 10 мМ азиду натрію.
Вивчення впливу окситоцину на Мg2+,АТР-залежну Са2+-помпу ендоплазматичного ретикулуму клітин міометрію.
При дослідженні впливу окситоцину на Са2+-помпу ЕР суспензію інтактних міоцитів преінкубували з водним розчином пептидного гормону (10-7 М) протягом 5 хв при 37оС в середовищі інкубації вищеописаного складу (але використовували інший буфер – 10 мМ HEPES-NaOH i 150мМ NaCl), яке проте не містило АТР і дигітонін. Потім у таке середовище послідовно вносили аліквоти розчинів дигітоніну (0,1 мг/мл) і АТР (3 мМ).
У третьому та четвертому розділах наведені основні результати роботи та їх обговорення.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Ідентифікація Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму
в клітинах міометрію, оброблених розчином дигітоніну
З метою підбору оптимальної концентрації дигітоніну для тестування Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ЕР ми дослідили вплив даного детергента, використаного у концентрації 0-0,2 мг/мл, на нечутливе до дії інгібітора акумуляції Са2+ у МХ рутенієвого червоного (10 мкМ) накопичення Са2+ у ГМК матки (рис.1). Залежність включення йонів Са у міоцити від концентрації дигітоніну за умов наявності в середовищі інкубації 10 мМ Са2+-преципітуючого аніону оксалату мала куполодібний вигляд (рис.1, графік 1).
Як можна бачити, максимальна акумуляція Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію виявилась при концентрації дигітоніну 0,05-0,1 мг/мл, і становила 700-800 пмоль Са2+/106 клітин за 10 хв. Тому у подальших дослідах була використана концентрація дигітоніну саме 0,1 мг/мл, як оптимальна. При використаних нами умовах проведення експерименту (4*105-5*105 клітин/мл; час взаємодії міоцитів з дигітоніном – 10 хв) концентрація детергента, при якій спостерігалась напівмаксимальна акумуляції Са2+ (с0,5), становила 0,02 і 0,17 мг/мл відповідно для висхідної і низхідної гілки концентраційної залежності. Згідно з даними літератури [Fiskum G., 1985; Костерин С.А., 1990] висхідна гілка даної концентраційної залежності обумовлена перфорацією ПМ детергентом, що призводить до збільшення доступу реагентів (АТР, Са2+, Мg2+) до Cа2+-транспортуючої системи внутрішньоклітинного немітохондріального Са2+-депо. Низхідна гілка концентраційної залежності може бути зумовлена декількома причинами – перфорацією немітохондріального внутрішньоклітинного депо, можливим прямим пригнічуючим ефектом детергенту на Са2+-транспортуючу систему, що локалізована у цьому депо і (чи) інактивацією цієї системи гідролітичними ферментами, що звільнюються із пошкоджених дигітоніном лізосом. Незалежно від концентрації дигітоніну (0,02-0,2 мг/мл) в інкубаційному середовищі, селективний інгібітор Са2+-помпи Е(С)Р терпеновий лактон тапсигаргін [Sagara Y. and Inesi G., 1991; Lytton J. et al., 1991], що був використаний у концентрації 50 нМ, повністю пригнічував акумуляцію Са2+ в міоцитах (рис.1, графік 2).
Ми показали, що у присутності Са2+-преципітуючих аніонів оксалату та фосфату, які, як відомо [Missiaen L. et al.,1991], добре проникають через ретикулярну мембрану, Мg2+,АТР-залежна акумуляція Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію лінійно зростала в часі. Початкова швидкість v0 транспортного процесу за умов наявності у середовищі інкубації 10 мМ оксалату становила в середньому 80-130 пмоль Са2+ /106 клітин за 1 хв.

Рис.1. Концентраційна залежність впливу дигітоніну на нечутливу до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) Мg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в міоцитах матки у відсутності (1) і присутності (2) тапсигаргіну (50 нМ). Концентрація оксалату – 10 мМ.
Оксалат та фосфат в діапазоні концентрацій 0-10 мМ та 0-40 мМ відповідно потенціювали Мg2+ АТР-залежне накопичення Са2+ у немітохондріальному внутрішньоклітинному Са2+- депо майже лінійно (рис.2,а і 2,б, графіки 1). У кількісному відношенні потенціююча дія Са2+-преципітуючих аніонів залежала від їх хімічної природи, так як ефект оксалату був більш вираженим, ніж фосфату (середні значення тангенсу кута нахилу концентраційних графіків становили 54,0 і 19,2 пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв на 1 мМ аніону відповідно). Причина цього полягає, ймовірно, у різних величинах добутків розчинності для комплексів “Са2+-оксалат” і “Са2+-фосфат”, що преципітують у внутрішньому просторі немітохондріального депо. Селективні інгібітори Са2+-помпи Е(С)Р тапсигаргін і мікотоксин циклопіазонієва кислота [Seidler N.W. et al.,1989; Sagara Y. and Inesi G., 1991; Lytton J. et al., 1991], що були використані у концентрації 50 нМ і 10 мкМ відповідно, повністю пригнічували (рис.2, графіки 2 і 3 відповідно) акумуляцію Са2+, яку тестували як в присутності, так і в відсутності (пунктирна лінія) Са2+-преципітуючих аніонів.
Йонофор А-23187 (1 мкМ), відомий як фактор збільшення кальцієвої проникності мембран [Овчинников Ю.А. и др., 1974], котрий вносили до середовища інкубації за умов наявності оксалату (10 мМ) або фосфату (20 мМ), ефективно запобігав енергозалежному накопиченню Са2+ (рис. 3, графіки 4 і 5 відповідно). Тобто, дія Са2+-йонофору на акумуляцію Са2+ не залежила від хімічної природи Са2+-преципітуючих аніонів.

Рис.2. Концентраційні залежності впливу оксалату (а) та фосфату (б) калію на нечутливу до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) Мg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію: 1 – у присутності Са2+-преципітуючого аніону; 2 і 3 – у присутності Са2+-преципітуючого аніону і тапсигаргіну (50 нМ) або циклопіазонієвої кислоти (10 мкМ) відповідно. Пунктиром показаний рівень включення Са2+ в міоцити, який спостерігають у відсутності Са2+-преципітуючих аніонів і вказаних вище інгібіторів у стандартному середовищі інкубації.

Рис. 3. Вплив Са2+-йонофору А 23187 на нечутливу до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) Мg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію: 1 – контроль; 2 і 3 – у присутності фосфату (20 мМ) або оксалату (10 мМ) калію відповідно; 4 і 5 – у присутності йонофору А 23187 (1 мкМ) разом з фосфатом (20 мМ) або оксалатом (10 мМ) відповідно.
Дані, отримані нами у експериментах з Са2+-преципітуючими проникаючими аніонами (рис. 2) і Са2+-йонофором А-23187 (рис. 3), вказують на те, що в основі нечутливого до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) Мg2+, АТР-залежного включення Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію лежить саме трансмембранне перенесення Са2+, яке здійснюється у мембранну структуру, що має фіксований об’єм, а не адсорбція цього катіону на поверхні субклітинних структур і (чи) його хелатування внутрішньоклітинними метаболітами.
Тапсигаргін та циклопіазонієва кислота, використані в діапазоні концентрацій 1-100 нМ та 0,05-10 мкМ відповідно, з високим ступенем ефективності інгібували Мg2+, АТР-залежну акумуляцію Са2+ у клітинах, яку реєстрували як в присутності оксалату калію (10 мМ) (рис. 4, графіки 1 і 2 відповідно), так і в відсутності Са2+-преципітуючого аніону у середовищі інкубації (пунктирна пряма). При концентрації тапсигаргіну і циклопіазонієвої кислоти відповідно 100 нМ і 10 мкМ акумуляція Са2+ повністю пригнічувалась. Результати кінетичного аналізу вказують на те, що спорідненість тапсигаргіну до Са2+-транспортуючої системи значно вища у порівнянні з циклопіазонієвою кислотою: уявні константи інгібування К0,5 становили 0,9 нМ та 0,6 мкМ відповідно.
Як відомо, внутрішньоклітинні немітохондріальні Са2+-депо деяких ГМ (наприклад, vas deferens хом’яка, аорта свині) у функціональному і фармакологічному відношенні не є гомогенними, а являють собою сукупність двох-трьох пулів, які розрізняються по чутливості обміну Са2+ в них до дії інгібіторів Са2+-помпи Е(С)Р, оксалату, інозитол-1,4,5-трифосфату, GTP і характеризуються різною спорідненістю Мg2+,АТР-залежної Са2+-транспортуючої системи до Са2+ [Missiaen L. et al.,1991]. У відповідності до наших даних про повне інгібування тапсигаргіном і циклопіазонієвою кислотою нечутливого до дії рутенієвого червоного Мg2+,АТР-залежного накопичення Са2+ у хімічно скінованих клітинах міометрію (рис. 1, 2, 4), можна було припустити, що у міоцитах матки естрогенізованих щурів відсутні пули, що нечутливі до дії даних інгібіторів. Наступний експеримент був спрямований на перевірку такого припущення. Виявилось, що у відсутності тапсигаргіну оксалат (10 мМ) стимулював Мg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ у пермеабілізованих ГМК матки не тільки у випадку попередньої присутності Са2+-преципітуючого аніону у середовищі інкубації, але й у випадку введення його у це середовище через деякий час (5 хв) після ініціації транспортного процесу. Проте оксалат (10 мМ) не стимулював Мg2+, АТР-залежне накопичення Са2+ у пермеабілізованих міоцитах за умов попереднього введення у середовище інкубації тапсигаргіну (50 нМ).

Рис.4. Вплив різних концентрацій тапсигаргіну (1) і циклопіазонієвої кислоти (2) на нечутливу до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) Мg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію у присутності оксалату калію (10 мМ).
Ми припустили, що, по-перше, у ГМК матки немає інших немітохондріальних внутрішньоклітинних депо, крім ЕР. По-друге, за винятком Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи, в ЕР клітин міометрію відсутні інші енергозалежні Са2+-транспортуючі системи, тобто ретикулярне депо ГМК матки є гомогенним у структурно-функціональному відношенні (у випадку міоцитів аорти, наприклад, нечутлива до дії інгібіторів Са2+-помпи ретикулуму акумуляція Са2+ у немітохондріальному внутрішньоклітинному депо може забезпечуватись Н+-Са2+-обмінником [Missiaen L. et al., 1991]). Цей факт підтверджують також дані про відсутність впливу ізотонічної заміни К+ на Na+ на накопичення Са2+ у ЕР пермеабілізованих міоцитів, що опосередковано вказують на відсутність системи Na+-Са2+-обміну у цій субклітинній структурі (див. далі).
Таким чином, вищенаведені дані у сукупності являють собою біохімічне обгрунтування наявності у ЕР клітин міометрію Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи, транспортна активність якої не є чутливою до дії рутенієвого червоного, потенціюється оксалатом та фосфатом і ефективно інгібується тапсигаргіном та циклопіазонієвою кислотою.

Властивості Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму
клітин міометрію
Важливою характеристикою Са2+-помпи ЕР є її спорідненість до реагентів – АТР та йонів Мg.

Активність Са2+-помпи ЕР міоцитів зростала по мірі збільшення як концентрації АТР (при постійний концентрації Мg2+ 3 мМ) (рис.5,а), так і концентрації Мg2+ (при постійній концентрації АТР 3 мМ) (рис.5,б) і характеризувалась тенденцією до насичення по цим реагентам. Відповідні концентраційні залежності акумуляції Са2+ були значно більше виражені у випадку використання оксалату (10 мМ) (рис. 5, графіки 1), ніж при відсутності Са2+-преципітуючого аніону у середовищі інкубації (рис. 5, графіки 2). При концентрації оксалату 10 мМ величини уявної константи Міхаеліса Кm і уявної константи активації Ка по Мg2+ становили 1,0 мМ і 0,6 мМ відповидно, тобто були фізіологічно значимими.

Рис.5. Концентраційні залежності впливу реагентів – АТР (а) та Мg2+ (б) на початкову швидкість v0 Мg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ в ЕР пермеабілізованих клітин міометрію: 1 і 2 – у присутності і відсутності оксалату (10 мМ) відповідно; 3 – у присутності оксалату (10 мМ) і тапсигаргіну (50 нМ). Концентрація Мg2+ (а) та АТР (б) – 3 мМ. Концентрація рутенієвого червоного – 10 мкМ.
При дослідженні субстратної специфічності Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ЕР клітин міометрію було встановлено, що найбільш ефективним джерелом енергії для акумуляції Са2+ є АТР (3 мМ), а не інші нуклеозидтрифосфати. При вивченні катіонної специфічності Са2+-помпи (рис. 6) ми показали, що Mn2+ і Со2+ (3 мМ) частково можуть замінювати Мg2+ у забезпеченні стимульованої оксалатом (10 мМ) АТР-залежної акумуляції Са2+: рівень накопичення йонів Са за 10 хв інкубації складає 33-34 % відносно контрольної величини, яку тестували у присутності йонів Мg (рис. 6, графіки 2 і 3 відповідно). У випадку заміщення 3 мМ Мg2+ на 3 мМ Ni2+, Zn2+ або Сu2+ акумуляція Са2+ практично не спостерігалась (рис.6, графіки 4, 5 і 6 відповідно). Отже, катіонна специфічність Са2+-помпи ЕР клітин міометрію не є абсолютною.

Рис.6. До ілюстрації катіонної специфічності АТР-залежної Са2+-помпи ЕР пермеабілізованих клітин міометрію: 1, 2, 3, 4, 5 і 6 – акумуляція Са2+ у присутності 3 мМ Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ чи Cu2+ відповідно. Концентрація рутенієвого червоного – 10 мкМ.
Ми дослідили вплив вищевказаних катіонів двовалентних металів на транспортну активність Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ЕР клітин міометрію. Дані катіони в концентрації 3 мМ з різним ступенем ефективності гальмували Мg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ в ЕР ГМК матки. При цьому найбільш ефективно проявлялась дія Сu2+: величина К0,5 становила 1,4 мкМ, а повний ефект гальмування спостерігався при концентрації йонів міді, рівній 10 мкМ. Йони Zn також ефективно пригнічували активність досліджуваної нами транспортної системи: величина К0,5 становила 25 мкМ, при цьому повне гальмування реєструвалось при концентрації даного катіону 1 мМ. Гальмівний ефект йонів Ni, Mn i Co на акумуляцію Са2+ у ЕР клітин міометрію був виражений значно слабкіше, ніж при дії йонів Сu або Zn: значення К0,5 спостерігалось при концентрації цих йонів > 10 мМ.
Результати порівняльного дослідження впливу класичних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем на Са2+-помпу ЕР клітин міометрію вказують на слідуюче. Якщо селективний інгібітор Са2+-помпи Е(С)Р терпеновий лактон тапсигаргін найбільш ефективно інгібував Мg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в ЕР клітин міометрію (К0,5=0,9 нМ) (рис.7, графік 1), то циклопіазонієва кислота – інший селективний інгібітор Са2+-помпи – Е(С)Р,

Рис.7. Концентраційні залежності впливу класичних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем на Мg2+,АТР-залежну Са2+-помпу ЕР клітин міометрію: 1, 2, 3, 4, 5 і 6 – в присутності тапсигаргіну, циклопіазонієвої кислоти, п-хлормеркурібензоату, еозину Y, о-ванадату і рутенієвого червоного відповідно. У випадках 1-5 стандартне середоовище інкубації містило 10 мкМ рутенієвого червоного, а у випадку 6 – 10 мМ азиду натрію.

а також тіоловий яд п-хлормеркурібензоат і еозин Y (тетрабромофлуоресцеїн) – неспецифічний інгібітор Са2+-помпи ПМ [Gatto C. et al., 1995], гальмували Са2+-помпу ЕР ГМК матки значно менш ефективно в порівнянні з тапсигаргіном: значення К0,5 становило 0,6, 0,6 і 0,8 мкМ відповідно (рис.7, графіки 2, 3 і 4 відповідно). Аналог фосфату о-ванадат – неспецифічний інгібітор Са2+-помп ПМ та Е(С)Р [Bian J. et al.,1991], гальмував функціонування Са2+-помпи ЕР клітин міометрію з К0,5=45,0 мкМ (рис.7, графік 5). Рутенієвий червоний, який ефективно пригнічує енергозалежну акумуляцію Са2+ в МХ [Missiaen L. et al.,1991], в концентрації до 100 нМ практично не впливав на Са2+-помпу ЕР міоцитів матки (рис.7, графік 6).
Нами було показано, що заміна КСl (125-25 мМ) на NaCl (25-125 мМ) в ізотонічному режимі у стандартному середовищі інкубації не призводила до зміни початкової швидкості Мg2+, АТР-залежного накопичення Са2+ у ЕР клітин міометрію. Ці дані, а також факт про повне інгібування тапсигаргіном та циклопіазонієвою кислотою Мg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ за умов наявності у стандартному середовищі інкубації 25 мМ Na+, опосередковано вказують на відсутність системи Na+-Ca2+-обміну у ретикулумі ГМ матки.
Таким чином, використовуючи таку експериментальну модель, як суспензія скінованих під дією дигітоніну клітин міометрію, нам вдалося охарактеризувати Мg2+,АТР-залежну Са2+-помпу ЕР ГМК матки за деякими властивостями: чутливістю до реагентів (АТР, Мg2+), субстратною та катіонною специфічністю, чутливістю до інгібуючої дії деяких двовалентних катіонів, спорідненістю до різноманітних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем, залежністю від присутності одновалентних катіонів.

Вплив окситоцину на Мg2+,АТР-залежну Са2+- помпу
ендоплазматичного ретикулуму клітин міометрію
Октапептид окситоцин широко використовується в акушерській практиці як фактор стимуляції скорочення матки. Відомо, що окситоцин стимулює вхід Са2+ у міоцити із позаклітинного середовища через електрокеровані Са2+-канали ПМ, а також індукує синтез інозитол-1,4,5-трифосфату, який звільнює йони Са із внутрішньоклітинного депо – ЕР [Sanborn B.M. et al., 1994; Phaneuf S. et al., 1994]. Крім того, окситоцин частково пригнічує Мg2+,АТР-залежну Са2+-помпу ПМ ГМК матки [Шлыков С.Г. и др., 1993; Kosterin S.A. et al., 1994]. У нашому випадку попередня обробка інтактних міоцитів розчином окситоцину (10-7 М) протягом 5 хв до внесення дигітоніну і АТР в оксалатвмісне (10 мМ) середовище інкубації призводила до зниження (на 25-30 %) Мg2+,АТР-залежного накопичення Са2+ в ЕР клітин міометрію (рис. 8, графік 2).

Рис.8. Вплив окситоцину на кінетику нечутливої до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) і стимульованої оксалатом (10 мМ) Мg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ в пермеабілізованих клітинах міометрію: 1 і 2 – до і після попередньої обробки інтактних міоцитів розчином окситоцину (10-7 М) відповідно; 3 – стимульована оксалатом і пригнічувана окситоцином компонента акумуляції Са2+ у немітохондріальному внутрішньоклітинному Са2+- депо.
Нами була ідентифікована пригнічувана окситоцином і стимульована оксалатом компонента Мg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ у ЕР (рис. 8, графік 3), яку розрахували по різниці між графіками 1 і 2. Тапсигаргін (50 нМ) і циклопіазонієва кислота (10 мкМ) повністю інгібували резистентну до дії рутенієвого червоного (10 мкМ) окситоцинчутливу компоненту енергозалежної акумуляції Са2+ у хімічно скінованих ГМК матки за умов наявності у середовищі інкубації 10 мМ оксалату.
Ми припустили, що ефект окситоцину опосередкується попередньою взаємодією октапептиду з поверхнею інтактних міоцитів, на якій, як відомо [Солофф М., 1979], ідентифіковані його рецептори. Що стосується механізму дії окситоцину, то, можливо, даний гормон діє на Са2+-транспортуючу систему ЕР через утворення вторинних посередників (інозитол-1,4,5-трифосфат, діацилгліцерол). Мабуть, у функціональному аспекті пригнічувальний вплив пептидного гормону на дану помпу, додатковий до активації Са2+-каналів ПМ та ЕР та інгібування Са2+-помпи ПМ (див. вище), лежить в основі позитивного зворотного зв’язку, що сприяє пролонгованому підтриманню підвищеної концентрації Са2+ в міоплазмі збуджених ГМК матки.
Таким чином, у даній роботі з використанням такої експериментальної моделі, як суспензія пермеабілізованих міоцитів, у ГМК матки була ідентифікована компонента Мg2+, АТР-залежного транспорту Са2+, що локалізована в ЕР, досліджені деякі властивості Са2+-помпи ЕР, а також показана її чутливість до інгібуючої дії утеротонічного пептидного гормону окситоцину.

ВИСНОВКИ

1. У дослідах, проведених на суспензії клітин міометрію невагітних естрогенізованих щурів, показано, що оптимальна концентрація дигітоніну, при котрій спостерігається нечутливе до дії рутенієвого червоного Мg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ у внутрішньоклітинному немітохондріальному кальцієвому депо, становить 0,05-0,1 мг/мл.
2. Доведено, що нечутливе до дії рутенієвого червоного накопичення Са2+ у пермеабілізованих клітинах міометрію потенціюється оксалатом і фосфатом, запобігається кальцієвим йонофором А 23187 та інгібується тапсигаргіном і циклопіазонієвою кислотою і, відповідно, є проявом функціональної активності Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму.
3. Залежності початкової швидкості накопичення Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію від концентрації АТР та Мg2+ характеризуються насиченням. У присутності 10 мМ оксалату величини уявної константи Міхаеліса Кm по АТР та константи активації Ка по Мg2+ становлять відповідно 1,0 і 0,6 мМ і є фізіологічно значимими.
4. Для Мg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму клітин міометрію не властива абсолютна катіонна специфічність щодо йонів Мg. Йони Mn i Co можуть замінювати йони Мg у забезпеченні АТР-залежного накопичення Са2+. При заміні Мg2+ на Ni2+, Zn2+ i Cu2+ акумуляція Са2+ у цій субклітинній структурі не спостерігалась.
5. Катіони двовалентних металів неспецифічно пригнічували Мg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію. Ступінь гальмівного ефекту зменшувався у ряду: Cu2+ >> Zn2+ >> Ni2+ = Mn2+ = Co2+.
6. Інгібітори енергозалежних мембранозв’язаних Са2+-транспортуючих систем з різним ступенем ефективності пригнічували Мg2+,АТР-залежну Са2+-помпу ендоплазматичного ретикулуму клітин міометрію. У відповідності зі значеннями коефіцієнту інгібування К0,5 інгібіторний ефект відповідає послідовності: тапсигаргін (К0,5=0,9 нМ) >> циклопіазонієва кислота (К0,5=0,6 мкМ)  п-хлормеркурібензоат (К0,5=0,6 мкМ)  еозин Y (К0,5=0,8 мкМ) >> о-ванадат (К0,5=45,0 мкМ). Рутенієвий червоний (100 мкМ) не впливав на активність цієї помпи.
7. У ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію відсутня система Na+-Ca2+-обміну. На користь цього свідчить той факт, що тапсигаргін і циклопіазонієва кислота повністю інгібували енергозалежне накопичення Са2+ у цій субклітинній структурі і це накопичення не є чутливим до ізотонічної заміни К+ на Na+ у середовищі інкубації.
8. Мg2+,АТР-залежна Са2+-помпа ендоплазматичного ретикулуму клітин міометрію є чутлива до дії стимулятора скоротливої активності матки окситоцину (100 нМ), котрий на 25-30 % пригнічував активність цієї помпи.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Костерин С.А., Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Ровенец (Струтинская) Н.А. Мg2+,АТР-зависимый транспорт Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме клеток миометрия // Биохимия.- 1996.- Т.61, N 1.- С.73-81.
2. Шлыков С.Г., Бабич Л.Г., Ровенец (Струтинская) Н.А., Костерин С.А. Обработка окситоцином интактных клеток миометрия ингибирует Мg2+,АТР-зависимую аккумуляцию Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме // Укр. биохим. журн.- 1996.- Т.68, N 5.- С.25-34.
3. Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Бабич Л.Г., Шинлова О.П., Слинченко Н.Н., Шлыков С.Г., Зимина В.П., Ровенец (Струтинская) Н.А., Веклич Т.А. Влияние ингибиторов энергозависимых Са2+-транспортирующих систем на кальциевые насосы гладкомышечной клетки // Укр. биохим. журн.- 1996.- Т.68, N 6.- С.5-61.
4. Бабич Л.Г., Костерин С.А., Шлыков С.Г., Ровенец (Струтинская) Н.А. Влияние тапсигаргина и циклопиазониевой кислоты на стимулируемую оксалатом (фосфатом) Мg2+,АТР-зависимую аккумуляцию Са2+ в пермеабилизированных клетках миометрия // Доклады АН России.- 1995.- Т.345, N 2. – С.259-262.
5. Бабіч Л.Г., Шликов С.Г., Струтинська Н.А., Костерін С.О. Суспензія хімічно скінованих клітин – модель для вивчення Мg2+,АТР-залежної кальцієвої помпи ендоплазматичного ретикулуму // Тези доповідей VII Укр. біохім. з’їзду (м. Київ).- вересень, 1997.- Ч.1.- С.34-35.
6. Шликов С.Г., Бабіч Л.Г., Струтинська Н.А. Обробка інтактних міоцитів окситоцином призводить до інгібування Мg2+,АТР-залежної кальцієвої помпи ендоплазматичного ретикулуму міометрію // Тези доповідей VII Укр. біохім. з’їзду (м.Київ).- вересень, 1997.- Ч.1.- С.55-56.

Струтинська Н.А. Енергозалежний транспорт Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі клітин міометрію. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 1998.
Дисертацію присвячено вивченню енергозалежного транспорту Са2+ в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) гладеньком’язових клітин (ГМК) матки. Використовуючи таку експериментальну модель, як суспензія пермеабілізованих під дією дигітоніну клітин міометрію, за допомогою ізотопної методики (45Са2+) вперше була ідентифікована та систематично досліджена компонента Мg2+,АТР-залежного накопичення Са2+, яка є нечутлива до дії рутенієвого червоного, стимулюється оксалатом та фосфатом, пригнічується тапсигаргіном та циклопіазонієвою кислотою і відображає функціонування Са2+-помпи ЕР ГМК матки. Вивчені властивості цієї помпи: спорідненість до АТР та Мg2+, субстратна та катіонна специфічність, чутливість до дії різноманітних інгібіторів мембранозв’язаних Са2+-помп та обмінників, йонів металів. Показано, що окситоцин (100 нМ) частково інгібує Мg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ в ЕР ГМК матки.
Ключові слова: ендоплазматичний ретикулум, гладеньком’язові клітини, Са2+-помпа, тапсигаргін, циклопіазонієва кислота, окситоцин.

Струтинская Н.А. Энергозависимый транспорт Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме клеток миометрия. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 1998.
Диссертация посвящена изучению энергозависимого транспорта Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) гладкомышечных клеток (ГМК) матки.
Используя такую экспериментальную модель, как суспензия пермеабилизированных под действием дигитонина клеток миометрия, с помощью изотопной методики (45Са2+) впервые была идентифицирована и систематически исследована компонента Мg2+,АТР-зависимого накопления Са2+, которая нечувствительна к действию рутениевого красного, стимулируется оксалатом и фосфатом, ингибируется тапсигаргином и циклопиазониевой кислотой и отражает функционирование Са2+-насоса ЭР ГМК матки. Изучены свойства этого насоса: сродство к АТР и Мg2+, субстратная и катионная специфичность, чувствительность к действию различных ингибиторов мембрансвязанных Са2+-насосов и обменников, ионов металлов. Показано, что окситоцин (100 нМ) частично ингибирует Мg2+,АТР-зависимое накопление Са2+ в ЭР ГМК матки.
Ключевые слова: эндоплазматический ретикулум, гладкомышечные клетки, Са2+-насос, тапсигаргин, циклопиазониевая кислота, окситоцин.

Strutinskaja N.A. Energy-dependent Ca2+ transport in endoplasmic reticulum of myometrial cells.- Manuscript.
Thesis for candidate of sciences degree by speciality 03.00.04 – biochemistry. – A.V.Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.
The dissertation is devoted to the investigation of the energy-dependent Ca2+ transport in endoplasmic reticulum (ER) of the uterine smooth muscle cells (SMC). Using such experimental model as suspension of digitonin-permeabilized myometrial cells the component of Mg2+,ATP-dependent Ca2+-accumu1ation insensitive to rethenium red, stimulated by oxalate and phosphate, inhibited by thapsigargin and cyclopiazonic acid was first identifiеd and systematicaly investigated by isotopic method (45Ca2+). It reflects the functioning of Ca2+-pump ER of uterine SMC. Properties of this pump were studied: relation to ATP and Mg2+, substrate and catione specificity; sensitivity to action of different inhibitors of membrane-linked Ca2+-pumps and exchangers, ions of metals. It is demonstrated thаt oxytocin (100 nM) partly inhibits Mg2+,ATP-dependent Ca2+ accumulation in ER of uterine SMC.
Key words: endoplasmic reticulum, smooth muscle cells, calcium pump, thapsigargin, cyclopiazonic acid, oxytocin.

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020