НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

шуваєва Галина Юріївна

УДК 577.112.7:576.32/36

Експресія ізоформ адаптерного білка ruk/cin85 в пухлинах людини

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, доцент

Дробот Людмила Борисівна,

Інститут біології клітини НАН України,

в.о. завідувача відділу сигнальних механізмів клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Філоненко Валерій Вікторович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу
структури та функцій нуклеїнових кислот;

доктор медичних наук, професор

Кияк Юліан Григорович,

Львівський національний медичний університет

ім. Данила Галицького МОЗ України,

завідувач кафедри сімейної медицини.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 20 ” червня 2006 р. о 14 годині на
засіданні cпеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології
клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова,
14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини
НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий “ 17 ” травня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Убийвовк В.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Завдяки успіхам, що були досягнуті в процесі
дослідження геномів, в тому числі і геному людини, біологія, а разом з
нею і медицина, знаходяться зараз в центрі величезної кількості
інтелектуальних і експериментальних змін. Використання інтенсивних
методів структурної і функціональної геноміки відкрило принципово нові
можливості у вирішенні фундаментальних і прикладних проблем медицини, у
розробці молекулярних підходів до діагностики, лікування і прогнозування
перебігу онкологічних, спадкових та інших захворювань. Зокрема,
переконливо було показано, що в основі канцерогенезу лежить існування
системних взаємодій між чисельними генетичними подіями, які включають
хромосомні аномалії, активацію протоонкогенів, інактивацію супресорних
генів пухлин, аберантну експресію рецепторів факторів росту, їхніх
лігандів та внутрішньоклітинних ефекторних білків (Kahn & Weinberg,
2002). Зміни функціональної активності білкових продуктів протоонкогенів
і генів супресорів пухлин, так само як і зміни в рівні їхньої експресії,
викликані генетичними причинами, ведуть до порушень в регуляції
сигнальних мереж, залучених до контролю клітинного циклу, апоптозу,
генетичної стабільності, клітинної диференціації, морфогенетичних
реакцій, що в кінцевому рахунку призводить до трансформації клітин. В
той же час складні питання про причинно-наслідкові взаємозв’язки між
масованими змінами в експресії генів і вказаними патологічними процесами
залишаються нерозв’язаними, а точні молекулярні механізми їхнього
розвитку і прогресії залишаються невідомими.

Провідну роль в організації та регулюванні сигнальних мереж клітин
відіграють адаптерні/риштувальні білки, характерною особливістю будови
яких є наявність множинних доменів та мотивів, залучених до
міжмолекулярної взаємодії (Pawson, 2003). Одним з таких білків є білок
Ruk/CIN85. Особливості структурно-функціональної організації дозволяють
вважати його представником окремої родини SH3-вмісних адаптерних білків
(Dikic, 2002), які виконують інтегруючу роль в регуляції апоптозу (Chen
et al., 2000; Gout et al., 2000), ліганд-опосередкованому ендоцитозі
рецепторних тирозинових протеїнкіназ (Petrelli et al., 2002; Soubeyran
et al., 2002), мітогенному сигналюванні (Petrelli et al., 2002;
Soubeyran et al., 2002) та архітектури актинового цитоскелету і адгезії
клітин (Hutchings et al., 2003; Schmidt et al., 2003; Shih et al., 2001;
Tibaldi & Reinherz, 2003). Наявні функціональні дані свідчать про те, що
адаптерний білок Ruk/CIN85/SETA виконує важливу роль не тільки у
підтриманні гомеостазу нормальних клітин, але може бути також залученим
до регуляції шляхів злоякісної трансформації клітин людини і тварин і,
як наслідок, слугувати молекулярним маркером канцерогенезу та, в
перспективі, представляти привабливу мішень для антипухлинної терапії.

Беручи до уваги сказане, дослідження експресії ізоформ Ruk/CIN85 у
зразках пухлин нирки, передміхурової залози та мозку людини було
покладено в основу даної дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у відповідності з планами наукових досліджень відділу
сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України. У
роботі використані результати досліджень, отримані в рамках бюджетної
теми: „Роль SH3-вмісних адаптерних білків Ruk/CIN85/SETA в регулюванні
сигнальних мереж нормальних і трансформованих клітин”, № держреєстрації
0104V000724, 2004-2006 рр. Робота виконувалась також у рамках
вітчизняних конкурсних програм: проекту Державного фонду фундаментальних
досліджень „З’ясування біологічної ролі адаптерного білка Ruk в
регуляції процесів проліферації, диференціації та апоптозу клітин людини
і тварин”, № 05.07/00283, 2001-2005 рр. та проекту “Моніторинг профілю
експресії адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах людини як фактора
прогнозу захворювання та параметра чутливості клітин до протипухлинної
терапії” в рамках програми “Новітні медико-біологічні проблеми та
оточуюче середовище людини”, договір №5. Крім того, дослідження,
представлені в роботі, були підтримані грантом Західно-Українського
біомедичного наукового центру (West-Ukrainian BioMedical Research
Center), 2002-2003 рр.

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було проаналізувати
експресію ізоформ Ruk/CIN85 у пухлинах людини.

Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні
завдання:

Отримати та охарактеризувати поліклональні та моноклональні антитіла до
різних фрагментів адаптерного білка Ruk/CIN85.

Дослідити експресію ізоформ білка Ruk/CIN85 в лініях клітин різного
тканинного походження.

Дослідити експресію ізоформ Ruk/CIN85 в пухлинах нирки людини на рівні
мРНК та білка.

Дослідити експресію ізоформ Ruk/CIN85 в пухлинах передміхурової залози
людини на рівні мРНК та білка.

Дослідити експресію ізоформ Ruk/CIN85 в пухлинах головного мозку людини
на рівні мРНК та білка.

Об’єкт дocліджeння: адаптерний білок Ruk/CIN85.

Пpeдмeт дocліджeння: особливості експресії ізоформ адаптерного білка
Ruk/CIN85 в пухлинах нирки, передміхурової залози та мозку людини.

Методи дослідження: експресія рекомбінантних білків в бактерійній
системі та в клітинах ссавців, афінна хроматографія білків, методи
роботи з культурами клітин, гібридомна біотехнологія, отримання
поліклональних антитіл, електрофорез білків в ПААГ та нуклеїнових кислот
в агарозному гелі, Нозерн- та Вестерн- блот аналізи, імунопреципітація,
метод імуногістохімії.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримано та
охарактеризовано моноклональні антитіла до N-кінцевого SH3A домену
адаптерного білка Ruk/CIN85. Вперше досліджено особливості експресії
ізоформ Ruk/CIN85 в пухлинах нирки, передміхурової залози та головного
мозку людини як на рівні мРНК, так і на рівні білка. Вперше встановлено
як зниження, так і підвищення експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у
зразках світлоклітинної карциноми нирки людини порівняно з відповідними
контрольними зразками. Виявлені зміни в рівні експресії Rukl/CIN85
корелюють із ступенем злоякісності досліджених зразків пухлин. Показано,
що зниження рівня експресії Rukl/CIN85 у зразках світлоклітинної
карциноми нирки людини супроводжується змінами субклітинної локалізації
адаптерного білка – транслокацією до ядра та переважним накопиченням в
примембранній зоні. Низький рівень експресії або практичну відсутність
р85 продемонстровано в зразках аденокарцином передміхурової залози
людини, в той час як при доброякісній гіперплазії детектовано значний
поліморфізм у рівні експресії досліджуваного адаптерного білка. Серед
аденокарцином мінімальний рівень експресії Ruk/CIN85 відповідав зразкам
з найагресивнішими параметрами злоякісного росту (ступінь злоякісності
G3-G4). Показано суттєве зниження рівня експресії Rukl/CIN85 в
центральній ділянці зразків гліобластом порівняно з периферійною
ділянкою, що обернено корелює з рівнем експресії рецептора
епідермального фактора росту (EGFR).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані полі- та
моноклональні антитіла інтенсивно використовуються у відділі сигнальних
механізмів клітини для подальшого дослідження молекулярних механізмів
дії, особливостей експресії та субклітинної локалізації ізоформ
адаптерного білка Ruk/CIN85 в лініях клітин та пухлинах людини різного
походження. Отримання моноклональних антитіл проти досліджуваного білка
може стати основою для розробки специфічних діагностикумів. Виявлення
змін в рівні експресії Ruk/CIN85 в пухлинах людини закладає теоретичні
основи створення фармакологічних препаратів нового покоління, мішенями
для яких стануть ключові центри організації сигнальних мереж клітин,
адаптерні і риштувальні білки. Результати дисертаційної роботи
рекомендуються для використання в загальному курсі „Молекулярна біологія
клітини” та спецкурсі „Клітинне сигналювання” для студентів
університетів зі спеціальностей „біохімія” та „молекулярна біологія”.

Особистий внесок здобувача. Результати дисертаційної роботи отримані
здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Моноклональні антитіла
отримано в співробітництві з к.б.н., м.н.с. Маєвською О.М. та провідним
інженером Ігуменцевою Н.І. Дослідження експресії мРНК ruk/cin85
проведено спільно з к.б.н., с.н.с. Бобаком Я.П. та професором Бучманом
В.Л. (Кардіфський університет, Велика Британія). Імуногістохімічний
аналіз парафінових зрізів нирковоклітинного раку та умовно нормальних
тканин нирки людини виконано в рамках співпраці зі співробітниками
морфологічної лабораторії БІОНТЕК (м. Дніпропетровськ) к.б.н Лизогубовим
В.В. та к.мед.н. Усенко В.С.

Автор висловлює подяку д.мед.н. Шуляку О.В., доценту кафедри урології,
д.мед.н., професору Поспішилю Ю.О., завідувачу кафедри патологічної
анатомії Львівського медичного університету імені Данила Галицького та
співробітнику нейрохірургічного відділення Львівської обласної лікарні
швидкої допомоги Федорко О.І. за допомогу у підборі клінічного матеріалу
і морфологічні дослідження, а також співробітникам відділу сигнальних
механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України за сприяння у
виконанні роботи. Отримані результати опубліковано у спільних
публікаціях.

За темою проведеного наукового дослідження автором самостійно зроблено
пошук та аналіз сучасних даних літератури, опрацьовано та інтерпретовано
отримані результати згідно з поставленими завданнями.

Планування експериментальної роботи, аналіз та обговорення результатів
досліджень проведено спільно з науковим керівником д.б.н., доц. Дробот
Л.Б.

Апробація результатів досліджень. Оcнoвні пoлoжeння диcepтaції бyли
представлені на всеукраїнській науково-практичній конференції “Біохімія”
(Дніпропетровськ, 2003); кoнфepeнції для мoлoдиx нayкoвців, acпіpaнтів
тa cтyдeнтів з мoлeкyляpнoї біoлoгії і гeнeтики (Київ, 2003);
Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів,
2004); на 5-ій Міжнapoдній Парнасівській кoнфepeнції “Molecular
mechanisms of cellular signaling” (Київ, 2005); ХХХV Науковому конгресі
Польського урологічного товариства (Люблін, 2005), наукових конференціях
молодих вчених Інституту біології клітини у 2001 – 2005 рр.

Публікації. Зa тeмoю диcepтaції oпyблікoвaнo 12 poбіт, які включaють 4
cтaтті в фахових виданнях y cпівaвтopcтві, тa тeзи 8 дoпoвідeй нa
міжнapoдниx та вітчизняних нayкoвиx конференціях, з’їздах, конгресах.

Cтруктура та обсяг дисертації. Диcepтaція міcтить тaкі poзділи: вcтyп,
аналітичний oгляд літepaтypи, мaтepіaли тa мeтoди дocліджeнь, peзyльтaти
дocліджeнь, aнaліз тa oбгoвopeння peзyльтaтів дocліджeнь, виcнoвки тa
cпиcoк викopиcтaниx джepeл. Диcepтaцію виклaдeнo нa 142 cтopінках
мaшинoпиcнoгo тeкcтy і пpoілюcтpoвaнo 26 pиcyнками тa 6 тaблицями.
Спиcoк літepaтypи oxoплює 221 нaймeнyвaння.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасний стан
проблеми організації і функціонування сигнальних мереж клітин, детально
висвітлені дані стосовно порушень у клітинному сигналюванні, що
призводять до злоякісної трансформації клітин. Особливу увагу приділено
аналізу будови та біологічної ролі адаптерного білка Ruk/CIN85 у
регулюванні сигнальних процесів у клітинах.

Матеріали і методи досліджень. В дисертаційній роботі використано
наступні плазмідні вектори, сконструйовані для експресії в клітинах
бактерій і ссавців: pGEX-2T/Ruk-SH3A, pGEX-2T/Ruk-SH3B, pGEX-2T/Ruk-SH3C
(вказані вектори були люб’язно надані проф. І. Гутом, Лондонський
університет, UCL, Велика Британія); pGEX-4T/CIN85-3SH3 (плазміда була
люб’язно надана проф.

І. Дікісом, Інститут біохімії, Франкфурт, Німеччина); pGEX-4T/Ruks,
pRc/CMV2/Rukl, pRc/CMV2/Rukm, pRc/CMV2/Rukh, pCMV5/Rukl-Flag-tag,
pCMV5/Rukm-Flag-tag, pCMV5/Rukh-Flag-tag, pCMV5/?SH3А-Ruk-Flag-tag
(вказані вектори були люб’язно надані проф. В. Бучманом, Кардіфський
університет, Велика Британія); а також pcDNA3.1/myc-tag-CD2AP
(експресувальний вектор був люб’язно наданий проф. A. Шао
(Вашингтонський університет, Сант-Льюіс, США)).

В роботі також використано анти-мишачі та анти-кролячі IgG, кон’юговані
з пероксидазою хрону (“Promega”, США), анти-FLAG, анти-myc,
анти-в-актинові антитіла (“Sigma”, США), поліклональні анти-CD2AP
антитіла (“Santa Cruz Biotech”, США).

Поліклональні антитіла до найменшої ізоформи Ruk, білка Ruks, що містить
спільну для всіх ізоформ С-кінцеву суперспіралізовану ділянку,
отримували шляхом імунізації кролів антигеном GST- Ruks за стандартною
схемою з наступним афінним очищенням.

Для отримання моноклональних антитіл до SH3A домену білка CIN85 мишей
лінії Balb/с імунізували GST-3SH3 фрагментом CIN85. Процедуру злиття
спленоцитів імунізованої тварини з клітинами мієломи миші SpI проводили
за стандартною методикою. Відбір позитивних клонів клітин, що
продукували специфічні антитіла, проводили методом твердофазного
імуноферментного аналізу (ELISA) з використанням відповідних антигенів.
Як джерело моноклональних антитіл використовували інфільтрат асцитної
пухлини та середовище RPMI, кондиційоване гібридомними клітинами. Всі
роботи з тваринами виконано згідно з правилами регіонального комітету по
етиці.

В експериментах було використано клітини таких ліній: NIH3T3
(фібробласти миші), Cos1 (клітини нирки африканської зеленої мавпи),
HEK293 (клітини ембріональної нирки людини), HeLa S3 (клітини
аденокарциноми шийки матки людини), MDCK (епітеліальні клітини нирки
Мадін-Дарбі собаки), С6 (клітини гліоми щура), А549 (клітини
аденокарциноми легень людини), L1210 (клітини лейкемії миші), Ramos
(клітини В-лімфоми людини), U937 (клітини гістоцитарної лімфоми людини)
та SрI (клітини мишачої мієломи). Клітини постійних ліній вирощували в
середовищах DMEM та RPMI (“Sigma”, США) за присутності 10% ембріональної
сироватки теляти (“GibcoBRL”, США), 2 мМ L-глутаміну, 50 МО/мл
пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину (“GibcoBRL”, США) в зволоженій
атмосфері з 5% СО2 при 37оС.

Трансформовані бактерії E.coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene”, США)
вирощували в середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл),
а бактерії штаму BL-21 (“Stratagene”, США) з екстраплазмідою
резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі LB з додаванням
хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл, відповідно) на шейкері
при 37 0С.

Лізування клітин проводили як описано в роботі Доміна (Domin et al.,
1996). Концентрацію білка в лізатах визначали за методом Петерсена
(Peterson, 1977).

Взаємодії між ізоформами Ruk/CIN85 досліджували в імунопреципітатах,
використовуючи поліклональні анти-Ruks та моноклональні анти-SH3A
антитіла. Імунні комплекси осаджували за допомогою білок G-сефарози. Для
імунопреципітації повнорозмірної форми Ruk/CIN85 використовували білок
G-сефарозу, ковалентно кон’юговану з моноклональним анти-SH3A антитілом.
Як зшиваючий агент було застосовано диметилпімелімідат (Sigma) згідно
рекомендацій фірми-виробника. Клітинні лізати та імунопреципітати
розділяли електрофорезом в градієнтному ПААГ (5-17%) за присутності SDS
(Laemmli, 1970) з наступним імуноблотингом (Тоwbin, 1979).

Експресію ізоформ Ruk/CIN85 аналізували в зразках пухлин нирки,
передміхурової залози та головного мозку людини, які отримували в рамках
співпраці з кафедрою урології Львівського національного медичного
університету ім. Д. Галицького, а також з нейрохірургічним відділенням
Львівської обласної лікарні швидкої допомоги. Класифікацію пухлин
проводили згідно класифікації ВООЗ. Пацієнти були проінформовані та дали
згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях.

Тотальну РНК із отриманих зразків тканин виділяли гуанідинтіоціонатним
(GTC) методом (Маниатис и др., 1984). Для Нозерн-гібридизації
використовували 32P-мічений зонд клону ЗЕ7 кДНК гену ruk (Gout et al.,
2000). Експресію ізоформ Ruk/CIN85 на рівні білка вивчали методом
імуноблот-аналізу в Тритон Х-100-розчинних та Тритон Х-100-нерозчинних
екстрактах, а також у солюбілізованих фракціях загального білку
GTC-інтерфази зразків, що попередньо піддавалися процедурі виділення
нуклеїнових кислот. рівень специфічних сигналів мРНК ruk/cin85 та
відповідних білкових продуктів у зразках вирівнювали відносно експресії
28S рРНК та актину, відповідно. Імуногістохімічні дослідження зразків
тканин проводили на парафінових зрізах за схемою непрямого методу
виявлення антигенів із застосуванням авідин-біотинової системи та
пероксидази як ферментної мітки згідно зі стандартними протоколами.
Отримані препарати аналізували за допомогою світлового мікроскопа
“Axioplan” (“Zeiss”, Німеччина) із застосуванням окуляра х2,5, та
імерсійного об’єктиву х100.

Всі експерименти проводили 3-5 разів. Денситометричний аналіз
результатів Нозерн-блот та імуноблот-аналізів здійснювали з
використанням програми “GelPro 32”. аналіз даних та побудову графіків
здійснювали за допомогою програми

“Excel 97”.

Результати досліджень та їх обговорення

Однією з основних умов подальшого всебічного вивчення біологічної ролі
ізоформ Ruk/CIN85 в нормальних та пухлинних клітинах є наявність
специфічних антитіл. Більш того, успішний аналіз білково-білкових
взаємодій, опосередкованих нативними формами білків, в нормі та при
патології потребує антитіл, які б надійно працювали не тільки в
імуноблот-аналізі, але й в імунопреципітації, імуногістохімії та
імунофлуоресцентній мікроскопії.

Отримання поліклональних та моноклональних антитіл проти адаптерного
білка Ruk/CIN85. Для отримання поліклональних та моноклональних антитіл
до адаптерного білка Ruk/CIN85 як антигени нами було використано
рекомбінантні білки GST-Ruks і GST-CIN85-3SH3, відповідно, які очищали з
лізатів клітин E. coli штаму BL-21, трансформованих плазмідними
векторами pGEX-2T/Ruks і pGEX-4T/CIN85-3SH3. Експресію білків в клітинах
запускали додаванням IPTG. На 4-ту год інкубації, після досягнення
максимального рівня експресії, клітини лізували, а отримані лізати
використовували для очищення GST-Ruks та GST-3SH3 афінною хроматографією
на глутатіон-сефарозі 4В. Результати очищення рекомбінантних білків
представлені на рис. 1.

Як видно з рис. 1 (доріжки 3), було отримано практично гомогенні
препарати рекомбінантних білків, ступінь чистоти яких склав близько 95%.

Для отримання поліклональних антитіл до С-кінцевої ділянки адаптерного
білка Ruk/CIN85 кролів імунізували препаратом рекомбінантного білка
GST-Ruks за стандартною схемою. Фракцію імуноглобулінів висолювали з
антисироватки при 50% насиченні (NH4)2SO4, після чого специфічні
антитіла очищали афінною хроматографією на Ruks-сефарозі.
Імуноблот-аналіз продемонстрував, що афінно очищені поліклональні
анти-Ruks антитіла однаково ефективно розпізнають основні Flag-tagged
ізоформи Ruk в лізатах клітин НЕК293, трансфікованих відповідними
векторами, виявляючи одночасно ряд імунореактивних смуг ендогенного
походження (рис. 2, а, б). Для більш ретельного дослідження
специфічності отриманих поліклональних антитіл був використаний такий
підхід як конкурентне інгібування зв’язування антитіл за присутності
антигена. З цією метою aнти-Ruks антитіла (1 мкг/мл) попередньо
інкубували протягом 30 хв з 5-кратним надлишком очищеного білка
His-tagged Rukm, і потім використовували цю суміш для імуноблот- аналізу
клітинних лізатів. Результати проведеного експерименту свідчать, що
детекція всіх імунореактивних смуг усувається за рахунок
антиген-опосередкованої конкуренції. Було проведено також додатковий
експеримент, який включав імунопреципітацію лізатів клітин L1210
aнти-Ruks антитілами з наступним aнти-Ruks імуноблотингом. З рис. 2 в
видно, що в отриманому преципітаті виявляються всі основні ендогенні
форми досліджуваного адаптерного білка при порівнянні зі спектром
імунореактивних смуг в загальному лізаті клітин L1210.

Рис.2. Аналіз специфічності С-кінцевих поліклональних анти-Ruks антитіл:
а, б – імуноблот-аналіз лізатів клітин НЕК293, тимчасово трансфікованих
конструкціями, які кодують Flag-tagged ізоформи Ruk: 1 – Rukl; 2 –
RukДA; 3 – Rukm; 4 – Ruke; 5 – Rukh; 6 – Ruks; в – імунопреципітація
ендогенних ізоформ Ruk анти-Ruks антитілами з лізатів клітин L1210: 1 –
імунопреципітат;

2 – загальний клітинний лізат. ЛЛ – легкі ланцюги та ВЛ – важкі ланцюги
імуноглобулінів.

Для отримання моноклональних антитіл до N-кінцевої ділянки адаптерного
білка Ruk/CIN85 самців мишей лінії Balb/c імунізували препаратом
рекомбінантного білка GST-3SH3. Злиття спленоцитів селезінки мишей, в
яких був виявлений високий титр антитіл в сироватці крові до
використаного антигену (10-5-10-6), з мієломними клітинами SрІ
здійснювали за допомогою PEG-1500. Селекцію гібридом вели за присутності
в середовищі ГАТ (гіпоксантин, аденін, тимідин). Відбір позитивних
клонів клітин, що продукували специфічні антитіла, проводили методом
твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) з використанням антигенів
GST-3SH3 та GST. Загалом було проаналізовано 263 клони, 12 з яких
виявилися позитивними до 3SH3-фрагмента використаного антигену.
Специфічність антитіл, що продукувались відібраними гібридомами, до
окремих доменів GST-3SH3 аналізували за допомогою ELISA з використанням
рекомбінантних білків GST, GST-SH3A, GST-SH3B та GST-SH3C. Один з
позитивних клонів, ідентифікований як клон, що продукує анти-SH3А
антитіла (MISh-A1), був двічі реклонований методом лімітуючих розведень.
Для підтвердження SH3A-доменної специфічності моноклональних антитіл
середовище, кондиційоване гібридомою MISh-A1, було протестоване методом
імуноблотингу, який дозволяє аналізувати здатність антитіл впізнавати
епітоп в денатуруючих умовах (рис. 3). З цією метою нами були
використані рекомбінантні GST-кон’юговані фрагменти білка Ruk (домени
SH3A, SH3B, SH3C) та сама GST, а також лізати клітин HEK293,
трансфіковані конструкціями pCMV5/Rukl-Flag-tag та pCMV5/Rukm-Flag-tag.
Як видно з рис.3, отримане антитіло взаємодіє з SH3А доменом Ruk та
повнорозмірною Rukl Flag-tagged формою цього білка і не розпізнає SH3B-,
SH3C-домени, саму GST та середню форму Rukm Flag-tagged, яка не містить
SH3A- та SH3B-доменів.

Беручи до уваги високий рівень структурної гомології (39% ідентичності і
54% подібності в амінокислотній послідовності) між Ruk/CIN85 і
CD2AP/CMS, які належать до однієї родини адаптерних/риштувальних білків,
важливо було також дослідити перехресну реактивність отриманих
моноклональних і поліклональних антитіл. За результатами
імуноблот-аналізу (рис. 4, доріжки 1, 3), ендогенні білки Ruk/CIN85 і
CD2AP/CMS володіють ідентичною електрофоретичною рухливістю в SDS-ПААГ.
Враховуючи цю обставину, ми спочатку провели імунопреципітацію
ендогенної форми Rukl/CIN85 і myc-tagged CD2AP з лізатів клітин HEK293,
тимчасово трансфікованих конструкцією pcDNA3.1/myc-tag-CD2AP, з
наступним імуноблотингом. В імунопреципітатах, отриманих за допомогою
моноклональних анти-SH3A та анти-myc антитіл, були детектовані яскраві
специфічні смуги з уявною молекулярною масою близько 85 кДa, які
відповідають Rukl/CIN85 (рис. 4 б, доріжка 2) і myc-tagged CD2AP (рис. 4
в, доріжка 4). Дуже слабкі Rukl/CIN85- і

Рис. 4. Аналіз перехресної реактивності анти-Ruks поліклональних та
анти-SH3A моноклонального антитіла до CD2AP: загальні клітинні лізати
нетрансфікованих клітин НЕК293 (1) та клітин HEK293, трансфікованих
конструкцією pcDNA3.1/myc-tag-CD2AP (3), білки, імунопреципітовані з
лізатів трансфікованих клітин НЕК293 за допомогою моноклональних
анти-SH3A (2) і анти-myc (4) антитіл. ІБ – імуноблотинг.

CD2AP-специфічні смуги були виявлені в анти-myc (ІБ aнти-Ruks
антитілами, доріжка 4) та анти-SH3A (ІБ анти-CD2AP антитілами, доріжка
2) імунопреципітатах, відповідно. Отримані дані узгоджуються з
результатами попередніх досліджень (Hutchings et al., 2003), які
свідчать про можливість олігомеризації між двома білками в живих
клітинах.

Таким чином, отримані C-кінцеві поліклональні та N-кінцеві моноклональні
антитіла є специфічними до Ruk/CIN85, що дозволяє використати їх для
вивчення експресії та біологічної ролі ізоформ Ruk/CIN85 в лініях клітин
та зразках пухлин людини різного тканинного походження із застосуванням
низки експериментальних підходів.

B

j

?

TH

? A 0

l

yoooooo?ooaeooooooooooooooo

B

D

?

TH

, ? ? l

??

??????????

??????????? ???????

??

?????

8-мотивів чутливих до дії протеаз, які локалізуються в С-кінцевій
половині поліпептидного ланцюга адаптерного білка (34-40 кДа)
(Rechsteiner & Rogers, 1996; Gout et al., 2002). Наявність множинних
центрів для серин/треонін-специфічних протеїнкіназ в структурі Ruk/CIN85
дозволяє припустити, що субформи навколо ідентифікованих молекулярних
мас є переважно результатом пост-трансляційної модифікації ізоформ
Ruk/CIN85 шляхом фосфорилювання. Результати анти-Ruks

Вестерн-блотингу відповідають, в основному, рівню експресії
повнорозмірної форми, що виявляється при використанні моноклонального
анти-SH3A антитіла (рис. 5 б). Профілі експресії ізоформ Ruk/CIN85 є
специфічними для кожної з досліджених ліній клітин. Очевидно, виявлені
закономірності відображають різну біологічну роль ізоформ адаптерного
білка в клітинах різного походження, що визначається особливостями
їхньої фізіологічної активності.

Внутрішньомолекулярні взаємодії між доменами та мотивами Ruk/CIN85
можуть призводити до формування різних, за складом ізоформ, олігомерних
комплексів адаптерного білка. Результати експерименту, представленого на
рис. 6, свідчать, що анти-SH3A антитіло ефективно преципітує р85 з
лізатів всіх досліджених ліній клітин: HeLa S3, HEK293, C6 та NIH3T3.
Співпреципітація білків з молекулярною масою близько 50-56 кДа, які
можуть представляти форму без двох N-кінцевих SH3 доменів, є характерною
для клітин C6 і NIH3T3, але не клітин HeLa S3 та HEK293. Не виключено,
що стан і склад ізоформ в Ruk/CIN85-опосередкованих надмолекулярних
комплексах визначає їх специфічні сигнальні функції в клітинах різного
походження.

з’ясування можливої біологічної ролі Ruk/CIN85 в канцерогенезі було
здійснено на моделях пухлин урогенітального походження (світлоклітинна
карцинома нирки людини, доброякісна гіперплазія та аденокарцинома
передміхурової залози) та гліальних пухлин людини.

Експресія адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах нирки людини. Експресію
ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 досліджували в 20 зразках
нирковоклітинного раку людини та відповідних контрольних зразках
(морфологічно незмінена тканина, ізольована із того самого органу при
радикальній нефректомії). Нозерн-блот аналізом (рис. 7 а, б) було
виявлено основний транскрипт мРНК ruk/cin85 розміром 3,5 тн, який кодує
повнорозмірну форму білка. Транскрипти меншого розміру виявити не
вдалося. У 8 з 10 проаналізованих цим методом зразків пухлин встановлено
зниження експресії мРНК ruk/cin85 порівняно з відповідними контрольними
зразками (у 5 зразках – від 40 до 93% і в 2 – до 21%).

Експресію на рівні білка досліджували імуноблот-аналізом. Встановлено,
що патерн множинних молекулярних форм в Тритон Х-100-розчинних
екстрактах та солюбілізованій фракції білків GTC-інтерфази зразків
пухлин є подібним до профілю експресії ізоформ в клітинних лініях (рис.
7 в-е). Водночас, співвідношення рівнів експресії ізоформ Ruk/CIN85 є
специфічним як для контрольних, так і пухлинних зразків. Сила сигналу
при використанні моноклональних антитіл, що розпізнають тільки
повнорозмірну форму білка, корелює з силою сигналу Rukl/CIN85 при
використанні поліклональних антитіл (рис. 7, д, е). Детальний аналіз
отриманих даних дозволив зробити наступні висновки: з 20 пар
проаналізованих зразків світлоклітинної карциноми нирки людини тенденція
до зниження рівня експресії повнорозмірної форми білка в пухлинній
тканині порівняно з нормальною спостерігалася в 12 парах зразків, для 6
пар характерним було зростання рівня експресії Rukl/CIN85 в пухлинах,
для двох пар зразків результати виявились неоднозначними.

Співставлення інформації стосовно стадії і ступеня злоякісного росту з
особливостями експресії повнорозмірної форми досліджуваного білка в
відповідних зразках дозволило виявити такі закономірності: з 12 зразків,
де було зафіксовано зниження експресії Rukl/CIN85, 9 зразків (від 40% до
100%), характеризувались найбільш агресивними параметрами злоякісного
росту (стадія III-IV, ступінь злоякісності G3-4–G4), а в 3 зразках
помірнодиференційованих карцином (стадія I-II, ступінь злоякісності G2)
спостерігалось зниження рівня експресії до 40%. Зразки світлоклітинних
карцином нирки, в яких було виявлено зростання рівня експресії
повнорозмірної форми, були представлені, в основному, високо- або
помірнодиференційованими карциномами (G1-G2, I та II стадії
захворювання), що відповідає найкращому прогнозу виживання пацієнтів.
Виняток склав зразок а55/а56, де при виявленій чіткій „up”-регуляції
Rukl/CIN85 пухлина характеризувалась вираженим агресивним фенотипом.

Як відомо, Rukm, ізоформа без двох SH3 доменів, може функціонувати як
негативний регулятор Rukl, пригнічуючи проапоптичну функцію останнього
(Gout et al., 2000). У зв’язку з цим було проаналізовано співвідношення
в рівні експресії р85/р56 в парах зразків з „up”-регуляцією Rukl/CIN85.
Встановлено, що в 5 з 6 пар таких зразків нирковоклітинної карциноми
детектувалося одночасне зростання експресії p56. Не виключено, що
виявлені особливості експресії Rukm є залученими до контролю злоякісного
росту, функціонально компенсуючи зростання експресії проапоптичного
білка Rukl/CIN85.

За результатами імуногістохімічного аналізу (рис. 7 є), з використанням
як поліклональних анти-Ruks, так і моноклонального анти-SH3A антитіл, в
нормальній тканині білок локалізується в епітеліальних клітинах ниркових
канальців, але не в клітинах строми. Поряд із загальним зниженням
інтенсивності зафарбовування в клітинах досліджених зразків пухлин
детектуються зміни субклітинної локалізації Ruk/CIN85 – транслокація до
ядра та переважне накопичення в примембранній зоні.

Експресія адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах передміхурової залози
людини. В рамках проведеного дослідженя було проаналізовано 20 зразків
доброякісної гіперплазії передміхурової залози (ДГПЗ) та 12 зразків
аденокарцином, отриманих від пацієнтів віком від 40 до 80 років під час
хірургічного втручання.

Результати Нозерн-блот аналізу виявили поліморфізм у рівні експресії
транскрипту розміром 3,5 тн у зразках ДГПЗ. У зразках аденокарцином
простати мРНК rukl/cin85 не детектувалась або детектувалась на дуже
низькому рівні. Транскрипти меншого розміру виявити не вдалось (рис. 8).

Профілі експресії ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 в Тритон
Х-100-розчинних екстрактах зразків ДГПЗ та солюбілізованій фракції
загального білка GTC-інтерфази зразків аденокарцином є подібними (рис. 9
а). основні імунореактивні смуги відповідають білкам з молекулярними
масами 130, 85, 56 і 34 кДа. У всіх проаналізованих зразках смуга на
рівні 70 кДа, що відповідає ізоформі без одного SH3 домену, не
детектувалась, за виключенням деяких зразків аденокарцином. Зразки ДГПЗ
характеризувалися поліморфізмом в рівні експресії Rukl/CIN85, в той час
як в зразках аденокарцином експресія р85 була низькою, або зовсім не
виявлялась (рис. 9 а, б). Слід зауважити, що рівень експресії р85
корелює, в основному, з рівнем експресії мРНК-транскрипту у відповідних
зразках.

Серед аденокарцином мінімальний рівень експресії Rukl/CIN85 (0,0-0,5, в
ум. од.) відповідав зразкам із ступенем злоякісності G3-G4. Відсоток
зразків аденокарцином з найнижчим рівнем експресії був вищим порівняно
зі зразками ДГПЗ, причому рівень експресії в діапазоні 5-10 ум. од. в
аденокарциномах не виявлявся.

Експресія ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах мозку людини.
Було проаналізовано 13 зразків пухлин нейроепітеліального походження:
анапластичної астроцитоми (ступінь злоякісності G2-3) та мультиформної
гліобластоми (ступінь злоякісності G4).

Рис. 9. Експресія ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 в зразках пухлин
передміхурової залози людини. Імуноблот-аналіз проводили з використанням
поліклональних анти-Ruks (а) та моноклональних анти-SH3A (б) антитіл.

Результати Нозерн-блот аналізу представлено на рис. 10. У більшості
проаналізованих зразків виявлено транскрипти розміром 3,5, 2,5 та 1,5
тн, які, згідно даних літератури (Buchman et al., 2000), кодують rukl,
rukm та ruks ізоформи досліджуваного білка. Виявлений поліморфізм у
рівні експресії мРНК-транскриптів ruk/cin85 підтверджено результатами
імуноблот-аналізу. Оскільки проаналізовані зразки пухлин відрізнялись за
розміром, тривалістю росту, наявністю зон некрозу, а також клітинною
гетерогенністю отриманого пухлинного матеріалу, було вирішено
проаналізувати експресію Rukl/CIN85 в центральній та периферійній
ділянках однієї пухлини. Як видно з рис. 11 а, б, незалежно від способу
екстракції пухлин та типу використаних антитіл, в центральній частині
пухлини рівень експресії Rukl/CIN85 був суттєво нижчим порівняно з
периферійною ділянкою.

Рис. 10. Нозерн-блот аналіз мРНК ruk/cin85 в зразках пухлин гліального
походження.

Зразки мультиформної гліобластоми характеризуються змінами сигналювання,
залежного від EGFR, що обумовлено як точковими мутаціями, так і
зростанням рівня експресії рецептора на рівні білка (Wong et al., 1987;
Konopka&Bonni, 2003). Тому отримані блоти були проаналізовані за
допомогою антитіл до EGFR (рис. 11 в). Було встановлено обернену
залежність у рівні експресії двох білків: високий рівень експресії EGFR
в центральних ділянках пухлин відповідав низькому рівню експресії
Rukl/CIN85 і навпаки в периферійній ділянці.

Таким чином, посилення EGFR-залежного сигналювання в пухлинах людини
може бути наслідком не тільки генетично обумовленого підвищення рівня
експресії EGFR, а й порушення механізмів їх ліганд-індукованого
ендоцитозу, критичною регуляторною ланкою яких є CIN85 (Dikic, 2002). З
другого боку, беручи до уваги здатність Rukl інгібувати ліпідкіназну
активність РІ-3-кінази, яка в ряді клітинних систем володіє вираженим
антиапоптичним потенціалом, виявлене зниження рівня експресії Rukl/CIN85
може одночасно вносити вклад в посилення виживання пухлинних клітин.
Такі властивості, зокрема, здатність інгібувати РІ-3-кіназне
сигналювання та зниження експресії в пухлинах, роблять Rukl/CIN85
функціонально подібним до відомого білка-супресора пухлин PTEN (Sansal &
Sellers, 2004).

Висновки

досліджено особливості експресії ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 в
пухлинах нирки, передміхурової залози та головного мозку людини.
Результати проведених досліджень дозволяють припустити, що виявлене
зниження експресії адаптерного білка Rukl/CIN85 в проаналізованих типах
пухлин людини може призводити до втрати узгодженого контролю процесів
апоптозу і проліферації в трансформованих клітинах та вносити вклад в
прогресію пухлинного росту.

Отримано і охарактеризовано поліклональні та моноклональні антитіла до
адаптерного білка Ruk/CIN85.

Продемонстровано, що профілі експресії ізоформ Ruk та його ортолога у
людини, білка CIN85, їх здатність до олігомеризації є специфічними для
ліній клітин різного видового та тканинного походження. виявлені
закономірності можуть відображати особливості функціонування ізоформ
Ruk/CIN85 залежно від конкретного клітинного контексту.

Встановлено як зниження (у 12 випадках з 20), так і підвищення (у 5
випадках з 20) експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у зразках
світлоклітинної карциноми нирки людини порівняно з відповідними
контрольними зразками. Виявлені зміни в рівні експресії Rukl/CIN85
корелюють із ступенем злоякісності досліджених зразків пухлин.

Показано, що зниження рівня експресії Rukl/CIN85 у зразках
світлоклітинної карциноми нирки людини супроводжується змінами
субклітинної локалізації адаптерного білка – транслокацією до ядра та
переважним накопиченням в примембранній зоні.

Виявлено поліморфізм у рівні експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у
зразках доброякісної гіперплазії передміхурової залози, тоді як в
аденокарциномах експресія Rukl/CIN85 детектується на дуже низькому рівні
або зовсім не детектується. Низький рівень експресії Rukl/CIN85 в
зразках аденокарцином співпадає з їх високим ступенем злоякісності.

встановлено обернену залежність у рівні експресії Rukl/CIN85 і EGFR в
центральній і периферійній ділянках зразків гліобластом: високий рівень
експресії EGFR в центральних ділянках пухлин відповідає низькому рівню
експресії Rukl/CIN85 і навпаки.

Виявлені особливості експресії Rukl/CIN85 в досліджених типах пухлин
можуть бути використані як прогностичний фактор розвитку онкологічних
захворювань.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Дрель В.Р., Дульцева Н.А., Ковальова В.А.,
Поспішіль Ю.О., Шуляк О.В., Бухман В., Дробот Л.Б. Експресія гена
ruk/cin85 у пухлинах передміхурової залози людини // Експер. і Клін.
Фізіологія і Біохімія. — 2004.-N 1. –С.35-42.

Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Маєвська О.М., Ігуменцева Н.І., Ржепецький
Ю.А., Машталір О.М., Поспішиль Ю.О, Шуляк О.В., Возіанов С.О., Дробот
Л.Б. Експресія адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах нирки людини //
Експер. і Клін. Фізіологія і Біохімія. — 2004.-N 4. –С.92-99.

Дробот Л.Б., Маєвська О.М., Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Барська М.Л.,
Ігуменцева Н.І., Басараба О.І., Федорко О.І. Поліклональні та
моноклональні антитіла проти адаптерного Ruk/CIN85 білка: отримання
характеристика, можливості застосування // В зб.: фундаментальні
орієнтири науки (біологія та науки про Земдю і навколишнє
середовище).-К.: Академперіодика.-2005.-С.105-118.

Vynnytska B.O., Basaraba O.I., Bobak Ya.P., Shuvayeva G.Yu., Mayevska
O.M., Barska M.L., Fedorko O.I., Drobot L.B. Study of Ruk/CIN85 isoforms
expressionin normal and transformed human tissues // Visnyk of Lviv
Nation. University. Biology Series.-2006.-Vol.41.-P. 26-30.

Шуваєва Г.Ю., Бобак Я.П., Дрель В.Р., Ковальова В. А., Дульцева Н.М.,
Ігуменцева Н.І., Маєвська О.М., Федишин Я.Я., Воробець Д.З., Шуляк О.В.,
Борис Ю.Б., Дробот Л. Б. Дослідження експресії ізоформ адаптерного білка
Ruk в пухлинах нирки та передміхурової залози людини // Матеріали
всеукраїнської науково-практичної конференції “Біохімія”. —
Дніпропетровськ (Україна). — 2003. — С. 49-50.

Shuvayeva G.Yu., Bobak Ya.P., Kovalyova V.A., Dul’ceva N.A., Igumenceva
N.I., Shulyak O.V., Drobot L.B. Expression of adapter protein Ruk
isoforms in kidney, urinary bladder and adenoma prostate tumors //
Abstracts of Conference for students, PhD students and young scientists
on molecular biology and genetics. – Kyiv (Ukraine). — 2003. — P. 127.

Бобак Я., Шуваєва Г., Ігуменцева Н., Машталір Н., Басараба О., Дрель В.,
Федорко О., Бухман В., Дробот Л. Дослідження експресії гену ruk/cin85 в
гліальних пухлинах головного мозку людини // Установ. з’їзд Укр.
товариства клітин. біології. – Львів (Україна). – 2004. – С. 117.

Mayevska O. M., Bobak Ya. P., Shuvayeva G. Yu., Igumentseva N. I.,
Barska M. L., Dul’tseva N. A., Basaraba O. I., Fedyshyn Ya.
Ya.,Rzhepetsky Yu. A., Mashtalir N. B., Havrylov S. V., Lyzogubov V. V.,
Usenko V. S., Buchman V. L., Drobot L. B. Monoclonal and polyclonal
antibodies produced against adaptor/scaffold protein Ruk/CIN85/SETA:
characterization and practical applications // Ukr. Biochem. J. –
Abstracts of 5th Parnas Conference. – Kyiv (Ukraine). — 2005.-Vol.
77.-2.-P. 211.

Shuvayeva G., Bobak Ya.P., Igumentseva N., Dultseva N., Mayevska O.,
Zhurovchak A., Sheremeta R., Shulyak O., Buchman V., Drobot L. The study
of ruk/cin85 gene expression in human behind prostatic hyperplasia and
malignant prostate // Poland Urological Congress. – Lublin (Poland). –
2005. – P.82-83.

Mayevska O.M., Shuvayeva G.Yu., Ihumentseva N.I., Barska M.L., Drobot
L.B. Monoclonal anti-SH3A antibodies against Ruk/CIN85 in studying of
full-length form expression in various transformed cell lines //
Materials of VII Int. Conf. of young oncologists “Current problems of
experimental and clinical oncology”. – Kyiv. – 2006. — P.91.

Shuvayeva G.Yu., Bobak Ya.P., Mayevska O.M., Basaraba O.I., Barska M.L.,
Shulyak A.V., Buchman V.L., Drobot L.B. Expression of adapter protein
Ruk/CIN85 isoforms in human renal tumors // Materials of VII Int. Conf.
of young oncologists “Current problems of experimental and clinical
oncology”. – Kyiv. – 2006. — P.92.

Basaraba O.I., Shuvayeva G.Yu., Mayevska O.M., Fedorko O.I., Bobak
Ya.P., Drobot L.B. Study of the adaptor protein Ruk/CIN85 isoforms
expression in human brain tissues // Materials of VII Int. Conf. of
young oncologists “Current problems of experimental and clinical
oncology”. – Kyiv. – 2006. — P.89.

Анотація

Шуваєва Г.Ю. Експресія ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах
людини. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. –
Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню особливостей експресії адаптерного
білка Ruk/CIN85 в пухлинах людини урогенітального (нирка, передміхурова
залоза) та гліального походження. З метою реалізації основних завдань
роботи отримано і проаналізовано поліклональні та моноклональні антитіла
до С- і N-кінцевих фрагментів досліджуваного білка, відповідно.
Встановлено, що профілі експресії ізоформ Ruk та його ортолога у людини,
білка CIN85, їх здатність до олігомеризації є специфічними для ліній
клітин різного видового та тканинного походження.

Методами Нозерн-блот та імуноблот аналізу виявлено як зниження, так і
підвищення експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у зразках
світлоклітинної карциноми нирки людини. Показано, що зниження рівня
експресії Rukl/CIN85 у досліджених зразках пухлин нирки супроводжується
змінами субклітинної локалізації адаптерного білка – транслокацією до
ядра та переважним накопиченням в примембранній зоні. Продемонстровано
поліморфізм у рівні експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у зразках
доброякісної гіперплазії передміхурової залози, тоді як в
аденокарциномах експресія Rukl/CIN85 детектується на дуже низькому рівні
або зовсім не детектується. встановлено обернену залежність у рівні
експресії Rukl/CIN85 і EGFR в центральній і периферійній ділянках
зразків гліобластом: високий рівень експресії EGFR в центральних
ділянках пухлин відповідає низькому рівню експресії Rukl/CIN85 і
навпаки.

Низький рівень експресії Rukl/CIN85 в досліджених неоплазіях співпадає з
їх високим ступенем злоякісності, що дозволяє використати отримані дані
для прогнозування розвитку онкологічних захворювань.

Ключові слова: адаптерний білок Ruk/CIN85, експресія, канцерогенез.

Аннотация

Шуваева Г.Ю. Экспрессия изоформ адаптерного белка Ruk/CIN85 в опухолях
человека. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.11 – цитология, клеточноя биология, гистология. –
Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2006.

Диссертация посвящена исследованию особенностей экспрессии адаптерного
белка Ruk/CIN85 в опухолях человека урогенитального (почка,
предстательная железа) и глиального происхождения. Для реализации
основных заданий работы были получены и проанализированы поликлональные
и моноклональные антитела к С- и N-концевым фрагментам исследуемого
белка, соответственно. Установлено, что профили экспрессии изоформ Ruk и
его ортолога у человека, белка CIN85, их способность к олигомеризации
являются специфическими для линий клеток разного видового и тканевого
происхождения.

Методами Нозерн-блот иммуноблот-анализа выявлено как снижение, так и
повышение экспрессии полноразмерной формы Ruk/CIN85 в образцах
светлоклеточной карциномы почки человека. Показано, что снижение уровня
экспрессии Rukl/CIN85 в исследованных образцах опухолей почки
сопровождается изменениями субклеточной локализации адаптерного белка –
транслокацией в ядро и преимущественным накоплением в примембранной
зоне. Продемонстрировано полиморфизм в уровне экспрессии полноразмерной
формы Ruk/CIN85 в образцах доброкачественной гиперплазии предстательной
железы, в то время как в аденокарциномах экспрессия Rukl/CIN85
детектируется на очень низком уровне или совсем не детектируется.
Установлено обратную зависимость в уровне экспрессии Rukl/CIN85 и EGFR в
центральной и периферической областях образцов глиобластом: высокий
уровень экспрессии в центральной области опухоли отвечает низкому уровню
экспрессии Rukl/CIN85 и наоборот.

Низкий уровень экспрессии Rukl/CIN85 в исследованных неоплазиях
совпадает с их высокой степенью злокачественности, что позволяет
использовать полученные данные для прогнозирования развития
онкологических заболеваний.

Ключевые слова: адаптерный белок Ruk/CIN85, экспрессия, канцерогенез.

Summary

Shuvayeva G.Yu. Expression of adaptor protein Ruk/CIN85 isoforms in
human tumors. – Manuscript.

Thesis for a Doctor of Philosophy (Ph.D) degree in biology, field
03.00.11 – cytology, cell biology, histology. Institute of Cell Biology
of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2006.

The thesis is devoted to investigation of Ruk/CIN85 expression profiles
in tumors of urogenital (kidney, prostate) and glial (brain) origins. To
realize the main objectives of this study, polyclonal and monoclonal
antibodies (Abs) against recombinant GST-fused proteins which include C-
terminal and N-terminal parts, correspondingly, of adaptor protein
Ruk/CIN85 have been generated. Polyclonal antibodies against C-terminal
coiled-coil region of Ruk were purified from serum of immunized rabbit
by affinity chromatography on GST-Ruks-Sepharose. Monoclonal antibodies
(mAbs) against 3SH3 fragment of CIN85 were developed using hybridoma
technique. It was shown that one of the obtained hybridomas produces mAb
recognizing an epitope, which resides within first SH3A domain.

Expression profiles of Ruk/CIN85 isoforms and their oligomerization in
cell lines of various tissue origins were analyzed using Western
blotting and immunoprecipitation. Using anti-Ruks Abs, multiple
molecular forms of Ruk/CIN85 with apparent molecular weight of 130,
80-85, 70-75, 50-56, 34-40 and 29 kDa were detected in lysates of
NIH3T3, Cos1, L1210, HEK293, Ramos, HeLa S3, MDCK, C6, A549 and U937
cells. Notably, the produced antibodies did not cross-react with CD2AP,
the member of the same family of adaptor proteins. The oligomerization
between p85 and p50-56 forms was revealed in C6 and NIH3T3 cells, but
not in HeLa S3 and HEK293 cells, using anti-SH3A precipitation followed
by anti-Ruks Western-blot analysis. Possibly, these features may reflect
specific biological role of Ruk/CIN85 isoforms in cell lines of various
species and tissue origins.

Decrease as well as increase of full-length form of Ruk/CIN85 expression
level was revealed in clear cell carcinoma samples in comparison with
corresponding control samples (morphologically nontransformed tissue
isolated from the same operated organ under radical nephrectomy) both at
the level of mRNA and protein using Nothern-blot and Western-blot
analysis respectively. It was shown with immunocytochemical analysis
that decrease of Rukl/CIN85 expression in investigated renal carcinomas
is accompanied with changes of adaptor protein subcellular distribution
– translocation to the nuclei and predominant accumulation near plasma
membrane zone. Polymorphism in the expression level of main Ruk/CIN85
isoforms was demonstrated in benign prostate hyperplasia (BPH) samples.
In adenocarcinomas, the immunoreactive band with apparent molecular
weight of 85 kDa was detected at very low level or was not detected. The
data of Western-blot analysis were correlated with Nothern-blotting
results. Inverse relationship between expression of Rukl/CIN85 and EGFR
was revealed in the central and peripheral regions of glioblastoma
samples: the high level of Rukl/CIN85 expression in the central area
corresponded to low level of EGFR expression and vice versa. Low level
of Rukl/CIN85 expression in investigated types of human neoplasia
coincides with their high grade of tumorigenicity (G3-G4) that allow
using this parameter to predict the progression potential of tumor
growth.

The obtained results suggest that decrease in the expression level of
full-length form of Ruk/CIN85 adaptor protein can lead to the loss of
coordinated control of apoptosis and proliferation in the transformed
epithelium cells.

Key words: adaptor protein Ruk/CIN85, expression, carcinogenesis.

PAGE 2

Рис.1. Очищення рекомбінантних білків GST-Ruks (а) та GST-CIN85-3SH3 (б)
з лізатів клітин E.coli BL-21, трансформованих векторами pGEX-2T/Ruks
(а) та pGEX-4T/CIN85-3SH3 (б), відповідно: 1 – загальний лізат бактерій
до індукції синтезу білка; 2 – загальний лізат бактерій на 4-у год після
індукції експресії рекомбінантного білка IPTG; 3 – очищені препарати
рекомбінантних білків.

Рис. 3. Ідентифікація специфічності моноклонального антитіла MISh-A1 до
окремих SH3-доменів Ruk/CIN85: 1, 2 – лізати клітин НЕК293,
трансфікованих pCMV5/Rukl-Flag-tag та pCMV5/Rukm-Flag-tag, відповідно;
3, 4, 5, 6 – рекомбінантні білки GST, GST-SH3С, GST-SH3B, GST-SH3А,
відповідно. Як перші антитіла використовували середовище, кондиційоване
гібридомою MISh-A1 в розведенні 1:200.

Рис. 5. Профілі експресії ізоформ Ruk/CIN85 в лініях клітин різного
тканинного походження. Як перші антитіла в імуноблот-аналізі
викорис-товували поліклональні анти-Ruks (а) та моноклональне анти-SH3A
(б) антитіла. Як контроль для нормалізації кількості білка
використовували рівень експресії в-актину (в).

Рис. 6. Олігомеризація між різними ізоформами Ruk/CIN85 in vivo.
Загальні лізати клітин HeLa S3, НЕК293, С6 і NIH3T3 імунопреципітували
за допомогою ковалентно кон’югованого до білок G-сефарози
моноклонального анти-SH3A антитіла з наступним анти-Ruks (а) та
анти-SH3A (б) імуноблот-аналізом: 1, 3, 5, 7 – iмунопреципітати;

2, 4, 6, 8 – загальні клітинні лізати.

a)

Рис. 7. Дослідження експресії адаптерного білка Ruk/CIN85 у зразках
світло клітинних карцином нирки людини: Нозерн-блот аналіз зразків
пухлин (а, б); імуноблот аналіз з використанням поліклональних анти-Ruks
(в, д) та моноклональних анти-SH3A (г, е) антитіл; імуногістохімічний
аналіз зразків нормальної і пухлинної тканин нирки людини (є).

нт – нормальна тканина, пт – пухлинна тканина.

Рис. 8. Нозерн-блот аналіз ruk/cin85 в зразках доброякісної гіперплазії
та аденокарциноми передміхурової залози людини

Рис. 11. Експресія Ruk/CIN85 та EGFR в центральних (ц) та периферійних
(п) ділянках зразків мультиформної гліобластоми. Імуноблот аналіз при
використанні поліклональних анти-Ruks (а), а також моноклональних
анти-SH3A (б) та анти-EGFR1 антитіл (в): А – Тритон Х-100 розчинна (ЕВ)
та Тритон Х-100 нерозчинна (RIPA) фракції екстрактів пухлин, Б
–солюбілізована фракція FITC-інтерфази загального білку зразків пухлин.

Похожие записи