Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. акад. О.О.Богомольця

Іванова Світлана Юріївна

УДК 612.82:576.54:577.3

Дослідження пластичності гамкергічної синаптичної передачі в культурі
нейронів гіпокампа щура

03.00.13 — фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Міжнародному Центрі молекулярної фізіології НАН
України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук

Костюк Платон Григорович,

директор Міжнародного Центру молекулярної фізіології НАН України,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних
наук Веселовський Микола Сергійович,

зав. відділом фізіології нейронних мереж

Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

доктор біологічних наук

Макарчук Микола Юхимович,

зав. кафедри фізіології людини і тварин

Київського Національного університету ім. Т.Г.Шевченка.

Провідна установа: НДІ фармакології та токсикології АМН України.

Захист дисертації відбудеться 07.10.2004 року о 14 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.
акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
акад. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 05.09. 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення синаптичної пластичності – змін ефективності
передачі нервових сигналів через синапси нейронів — є актуальним і
важливим тому, що синаптична пластичність відіграє важливу роль у
нормальному функціонуванні ЦНС, розвитку нейронних мереж, у процесах
навчання та формування пам’яті. В залежності від часу, протягом якого
зберігаються зміни ефективності синаптичної передачі, розрізняють
короткотривалу та довготривалу пластичність. Останнім часом була
запропонована концепція, згідно з якою розглядають дві основні форми
пластичності в нейронних мережах (Turrigiano & Nelson, 2004), а саме:
дієзалежну пластичність, пов’язану з попередньою активністю синапса, та
гомеостатичну пластичність, яка протидіє дієзалежній пластичності,
забезпечуючи стабільність роботи нейронної мережі.

Довгий час більшість досліджень було спрямовано на вивчення пластичності
глутаматергічної передачі. Глутаматергічна передача і її пластичність
безперечно відіграють важливу роль у нормальному функціонуванні ЦНС.
Однак саме баланс збудження й гальмування є основою нормального
функціонування ЦНС, тому зміни ефективності ГАМКергічної синаптичної
передачі є не менш важливими. Відомо, що зменшення гальмування внаслідок
попередньої активності може призвести до виникнення й розповсюдження
епілептоформної активності. Тому пластичність ГАМКергічної синаптичної
передачі відіграє важливу роль як у нормальному функціонуванні ЦНС, так
і у розвитку патології. Знання основних принципів пластичності
ГАМКергічної синаптичної передачі є важливим для розуміння фізіологічної
та патологічної синаптичної пластичності в ЦНС. Синаптична пластичність
глутаматергічної передачі, як короткотривала, так і гомеостатична, добре
досліджена. Про пластичність ГАМКергічної синаптичної передачі відомо
значно менше. Зважаючи на все вищезгадане, дослідження короткотривалої
та гомеостатичної пластичності ГАМКергічної передачі в гіпокампі мають
науковий інтерес і практичне значення.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у рамках наукової програми Міжнародного центру молекулярної фізіології
НАН України: «Дослідження механізмів гальмівної синаптичної передачі
нейронів ЦНС».

Мета дослідження. Метою роботи було вивчення найменш досліджених форм
пластичності ГАМКергічної синаптичної передачі, а саме: короткочасної
пластичності, зумовленої тривалою тетанічною стимуляцією, та
гомеостатичної пластичності в культурі нейронів гіпокампа щура.

Завдання дослідження.

Дослідити можливість застосування змін депресії, зумовленої парною
стимуляцією, як індикатора пресинаптичної локалізації змін ефективності
ГАМКергічної синаптичної передачі.

Дослідити вплив тривалої тетанізації (30 Гц, 4 сек) на ефективність
ГАМКергічної синаптичної передачі в культурі нейронів гіпокампа.

Дослідити вплив тривалої блокади іонотропних глутаматних рецепторів у
культурі нейронів гіпокампа на властивості ГАМКергічної синаптичної
передачі.

Дослідити вплив тривалої блокади ГАМКА-рецепторів у культурі нейронів
гіпокампа на властивості ГАМКергічної синаптичної передачі.

Дослідити вплив тривалої блокади імпульсної активності в культурі
нейронів гіпокампа на властивості ГАМКергічної синаптичної передачі.

Наукова новизна одержаних результатів. Описано явище посттетанічної
депресії ГАМКергічної синаптичної передачі. Вперше показана наявність
двох різних за кінетикою компонентів посттетанічної депресії і
встановлено, що істотний внесок до швидшого з них вносять пресинаптичні
механізми. Встановлено, що гетерогенність ГАМКергічних синаптичних
зв`язків може бути виявлена за допомогою тривалої тетанічної
стимуляції. З`ясовано, що тетанічна стимуляція спричинює посттетанічну
депресію (ПТД) в 55 % досліджуваних пар нейронів та посттетанічну
потенціацію (ПТП) у 45 % синаптичних зв`язків. Встановлено, що в
синаптичних зв’язках, в яких спостерігається ПТП, ймовірність
вивільнення медіатора з пресинаптичних нервових закінчень значно менша,
ніж в синапсах, в яких спостерігається ПТД. Вперше для нейронних мереж
гіпокампа показано гомеостатичні зміни ГАМКергічної синаптичної
передачі. Встановлено, що тривала блокада імпульсної активності нейронів
гіпокампа в культурі за допомогою тетродотоксину (ТТХ) призводить до
зменшення ефективності ГАМКергічної синаптичної передачі, а тривала
блокада ГАМКА-рецепторів за допомогою бікукуліну (що ймовірно збільшує
нейронну активність) призводить до її збільшення.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати мають
теоретичне значення щодо розвитку уявлень про механізми, що
забезпечують: пластичність синаптичної передачі, гетерогенність
властивостей ГАМКергічної синаптичної передачі та рівновагу між
процесами збудження й гальмування в нейронних мережах.

Оскільки рівновага між процесами збудження і гальмування є необхідною
передумовою нормального функціонування головного мозку, отримані
результати щодо гетерогенності властивостей ГАМКергічної синаптичної
передачі можуть сприяти винайденню нових, більш специфічних
фармакологічних препаратів, спрямованих на відновлення рівноваги між
процесами збудження і гальмування (зокрема, антиепілептичних
препаратів).

Особистий внесок здобувача. Робота по приготуванню культури нейронів
гіпокампа щура, по дослідженню зміни депресії гальмівних постсинаптичних
струмів (ГПСС), зумовленої парною стимуляцією при впливах на
пресинаптичні та постсинаптичні механізми синаптичної передачі, по
дослідженню впливу тривалої тетанічної стимуляції пресинаптичного
ГАМКергічного нейрона на ГПСС, по дослідженню гомеостатичної
пластичності ГАМКергічної синаптичної передачі в культурі нейронів
гіпокампа щура була виконана особисто автором.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідалися на семінарах
сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України, на міжнародній школі — семінарі “Pharmacology of synaptic
transmission in nervous system” (Київ, 16-17 червня 2002р.), на ІІІ
З’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2000р.), на ІІ
міжнародному симпозіумі “Фізіологія та біофізика гладеньких м’язів”
(Київ, 2003р.) та на Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 25-28 квітня 2004р.)

Публікації. Результати роботи опубліковані в 5-ти журнальних статтях та
4-х тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, методів дослідження, результатів досліджень, обговорення
результатів, 9-ти висновків та списку використаних джерел із 217-ти
найменувань. Роботу викладено на 141 сторінках та ілюстровано 46
рисунками.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність дослідження пластичності ГАМКергічної
синаптичної передачі, сформульовано мету та задачі дослідження, наведені
відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих
результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1 “Огляд літератури” присвячений висвітленню 1) сучасних уявлень
про синаптичну передачу, гальмівну синаптичну передачу в головному мозку
та різноманітність ГАМКА-рецепторів; 2) Особливостей полегшення і
депресії збуджувальної та гальмівної синаптичних передач, зумовлених
парною стимуляцією та посттетанічної потенціації; 3) Аспектів
гомеостатичної пластичності глутаматергічної синаптичної передачі.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи
дослідження” описано використані методичні підходи, а саме:

Приготування культури нейронів гіпокампа.

Метод фіксації потенціалу в режимі “ціла клітина”.

Метод іонофоретичної аплікації.

Метод аплікації під тиском.

Статистична обробка отриманих результатів із використанням стандартних
методів аналізу.

Приготування культури нейронів гіпокампа. Дослідження проводились на
нейронах культури гіпокампа щура. Для отримання клітин у новонароджених
щурів лінії Вістар виділяли гіпокамп, розрізали його на п’ять шматочків,
які переносили до сольового розчину, що містив 0,05 % пронази Е (Serva).
Після ферментативної обробки протягом 18 хвилин при 32оС проводилося
відмивання шматочків гіпокампа з подальшим диспергуванням до окремих
клітин. Суспензію клітин щільністю 60 тис. на 200 мкл живильного
середовища наносили на покриті полі-L-орнітином покривні скельця
розміром 18х18 мм. Через 2 год інкубування при 36°С в атмосфері з 5%
СО2 у кожну чашку Петрі додавали 2 мл живильного середовища, яке
містило 90% мінімального середовища Ігла (МЕМ), 10% кінської сироватки,
10 мкг/мл інсуліну та антибіотики. Зміна середовища проводилася кожні
чотири доби. Після 5 — 6 діб in vitro культури обробляли фторурацилом
(1мкМ) протягом 36 год для пригнічення проліферації гліальних клітин,
після чого повністно заміняли живильне середовище. Нейрони гіпокампа
контрольних і вирощених в присутності блокатора (дослідних) культур
інкубували паралельно. Тривалу блокаду здійснювали: 1) іонотропних
глутаматних рецепторів за допомогою кінуренової кислоти (1мМ); 2)
ГАМКергічної синаптичної передачі за допомогою блокатора
ГАМКА-рецепторів — бікукуліна (20 мкМ); 3) імпульсної активності
нейронів з використанням ТТХ (1 мкМ). Безпосередньо перед експериментом
контрольні та дослідні культури інкубували протягом однієї години у
зовнішньоклітинному розчині без блокаторів.

Електрофізіологічні методи. Електрофізіологічні дослідження проводили з
14 по 26 день “in vitro”. Для отримання трансмембранних струмів
використовувався метод фіксації потенціалу в режимі «ціла клітина»
(Hamill et al., 1981). Опір реєструючої піпетки становив 4-6 МОм. В
експериментах використовували ділянки покривних скелець із відносно
низькою щільністю клітин (2 — 5 нейронів у полі зору з діаметром 400
мкм). Збудження пресинаптичної клітини здійснювали за допомогою
зовнішньоклітинного електрода, розташованого поблизу соми або аксона
цієї клітини. В експериментах, в яких досліджувалась депресія гальмівних
постсинаптичних струмів, зумовлена парною стимуляцією, пресинаптичну
клітину стимулювали парою стимулів кожні 2 секунди з міжімпульсним
інтервалом 100 мсек. Для вивчення впливу тривалої тетанізації на
викликані ГАМКергічні постсинаптичні струми пресинаптичну клітину
стимулювали пачкою імпульсів із частотою 30 Гц протягом 4-х секунд.
Склад розчинів, що використовувались у більшості експериментів, був
наступним : внутрішньоклітинний розчин (мМ): Cs глюконат 100, CsCl 30,
MgCl2 4, Na2ATP 4, EGTA 10, HEPES 10. Позаклітинний розчин (мМ): NaCl
140, KCl 4, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, глюкоза 10; pН усіх розчинів був
7,4. У серії експериментів з дослідження впливу хронічної блокади
іонотропних глутаматних рецепторів на властивості ГАМКергічної передачі
використовували внутрішньоклітинний розчин такого складу (мМ): Cs
глюконат 118, CsCl 11, MgCl2 4, Na2ATP 4, CaCl2 0.5, EGTA 10, HEPES 10;
pН – 7,4. Усі електрофізіологічні вимірювання проводились в присутності
в позаклітинному розчині APV (20 мкМ) та CNQX (10 мкМ), щоб заблокувати
синаптичні струми, опосередковані іонотропними глутаматними рецепторами.
Експерименти проводили при кімнатній температурі (20–22 °С).

Цифровані струми аналізували за допомогою програми ANDATRA (Ярослав
Бойчук, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця). Результати
представлені як середня величина ± середньоквадратична похибка
середнього. Для статистичних порівнянь використовувався t-тест
Стьюдента.

У третьому розділі “Результати досліджень” проведено детальний аналіз
пластичності ГАМКергічної синаптичної передачі, а саме: короткотривалої
пластичності, зумовленої тривалою тетанічною стимуляцією та
гомеостатичної пластичності ГАМКергічної передачі в культурі нейронів
гіпокампа щура.

Пластичність ГАМКергічної передачі досліджувалась в присутності
блокаторів іонотропних глутаматних рецепторів. Постсинаптичні струми, що
реєстрували за цих умов, мали потенціал реверсії, близький до хлорного
рівноважного потенціалу (рис. 1А) і блокувалися бікукуліном (рис. 1Б).
Ці результати показують, що досліджувані струми мають хлорну природу й
опосередковуються ГАМКА-рецепторами.

Депресія, зумовлена парною стимуляцією (ДЗПС) як індикатор пресинаптчних
змін. Одним з важливих питань, що виникають при вивченні синаптичної
пластичності, є питання про локалізацію процесів, відповідальних за
зміну ефективності синаптичної передачі — питання про те, які пре- чи
постсинаптичні зміни лежать в основі ефекту, що спостерігається. Одним з
індикаторів участі пресинаптичних процесів може бути зміна депресії,
зумовленої парною стимуляцією (ДЗПС), тобто зменшення амплітуди другого
ГПСС в парі у порівнянні з першим (ДЗПС = (ГПСС1-ГПСС2)/ГПСС1 =
1-ГПСС2/ГПСС1). Ми перевірили, чи можна застосовувати зміни ДЗПС як
індикатор пресинаптичних змін за наших експериментальних умов. Для цього
пресинаптичний нейрон стимулювали парами стимулів з інтервалом 2
секунди. Інтервал між стимулами в парі становив 100 мсек. Зменшення
ймовірності вивільнення медіатора за допомогою іонофорезу іонів кадмію
призводило до зменшення ДЗПС (рис. 2А).

У середньому, зменшення амплітуди ГПСС на 52,5±5%, (n=4)
супроводжувалося збільшенням співвідношення ГПСС2/ГПСС1 на 20,8.±6,1 %
(P<0,05). Для збільшення імовірності вивільнення медіатора використовували 4-амінопіридин - блокатор потенціалкерованних калієвих каналів, що збільшує тривалість потенціалу дії у пресинаптичній терміналі. Збільшення амплітуди ГПСС1 під впливом амінопіридину супроводжувалося збільшенням ДЗПС (рис. 2Б). У середньому, збільшення амплітуди ГПСС на 51±9,6% супроводжувалось зменшенням співвідношення ГПСС2/ГПСС1 до 60±0,6 % (n=3). Зменшення амплітуди ПСС за допомогою блокатора ГАМКА-рецепторів і зміна амплітуди ПСС при змінах підтримуваного потенціала не впливали на ДЗПС. Отже, впливи, які змінюють імовірність вивільнення медіатора, тобто впливають на пресинаптичні механізми, змінюють депресію, зумовлену парною стимуляцією, а впливи, що змінюють амплітуду ПСС за рахунок постсинаптичних механізмів, не впливають на депресію, зумовлену парною стимуляцією. Тому, зміни депресії, зумовленої парною стимуляцією у наших експериментальних умовах можна використовувати як інструмент, який вказує на пресинаптичну локалізацію змін. Короткочасна пластичність, викликана тетанічною стимуляцією. При дослідженні впливу тривалої тетанізації (30 Гц, 4 с) виявлено, що в різних парах нейронів тетанічна стимуляція призводить до збільшення чи до зменшення амплітуди викликаних гальмівних постсинаптичних струмів, а саме до посттетанічної потенціації ГПСС (рис. 3А) чи посттетанічної депресії ГПСС (рис. 3Б). Посттетанічна потенціація ГПСС (ПТП) спостерігалася в 45% досліджених пар та посттетанічна депресія (ПТД) в 55%. Оскільки явище ПТП детально досліджувалося раніше, а ПТД у культурі нейронів гіпокампа описана не була ми сфокусували увагу саме на ПТД. Посттетанічна депресія супроводжувалася збільшенням коефіцієнтів варіації (CV) амплітуд ГПСС (рис. 4Д) і зменшенням депресії ГПСС, зумовленої парною стимуляцією (рис. 4Г). Виявлено, що в процесі відновлення амплітуд ГПСС після тетанізації спостерігається два компоненти - швидкий зі сталою часу 11 секунд і повільний зі сталою часу 110 секунд (рис. 4Б), причому тривалість швидкого компонента була близькою до тривалості змін коефіцієнта варіації амплітуд ГПСС і тривалості змін ДЗПС. Тому видається ймовірним, що пресинаптичні зміни є головним чинником саме цього компонента ПТД. Відмінності властивостей ГАМКергічних синаптичних зв'язків. Приймаючи до уваги дані літератури про наявність різних типів ГАМКергічних нейронів, ми припустили, що протилежні ефекти тетанізації, а саме ПТП і ПТД, можуть пояснюватися гетерогенністю властивостей пресинаптичних нейронів. Щоб перевірити це припущення, досліджувалося, чи є ще якісь відмінності між синаптичними зв'язками, у яких спостерігається потенціація і депресія після тетанічної стимуляції. Загалом в цій серії експериментів досліджено 29 пар нейронів (“ПТП пари” n=13, “ПТД” пари n=16). Виявлено достовірні відмінності коефіцієнтів варіації (CV), викликаних ГПСС (рис. 5Б) та величин I·CV2 (рис. 5В). Різниця амплітуд ГПСС (рис. 5А) була на межі вірогідності (P=0,05), а відмінності потенціалів реверсії ПСС і депресії, зумовленої парною стимуляцією, не були виявлені. Статистично достовірна відмінність коефіцієнтів варіації ГПСС і величин I·CV2 (рис. 5Б,В) дозволяє припускати, що “ПТП” і “ПТД” зв’язки відрізняються на пресинаптичному рівні. Щоб перевірити це припущення, в частині вищезгаданих експериментів (n=10) після вивчення впливу тетанізації у позаклітинний розчин додавали тетродотоксин (1 мкМ), щоб заблокувати ГПСС, пов'язані з потенціалами дії і реєстрували спонтанні ГПСС. Такий підхід дозволив розрахувати квантові параметри для синаптичних зв'язків, у яких спостерігалася посттетанічна потенціація й посттетанічна депресія. Розмір кванта (q) визначали як середню амплітуду спонтанних ГПСС у присутності ТТХ, квантовий вміст розраховували як Imean/q, де Imean середня амплітуда викликаних постсинаптичних струмів. Потім розраховували середню ймовірність вивільнення медіатора (P), використовуючи рівняння: m=(1+ CVq2-P)/CVГПСС2, та біноміальний параметр N (ймовірно відповідає числу місць вивільнення медіатора) розраховувався як N = m/P. Хоча розмір кванта відрізнявся (рис. 6.А) для “ПТП” (-15,95±1,98 пА) та “ПТД” пар (-17,76±2,03 пА), ця відміна не була статистично достовірною (P>0,5). Середня величина квантового вмісту m
становила 37,85±15,73 для “ПТП пар” і 61,52±15,98 для “ПТД пар” (рис.
6Б). Незважаючи на те, що величина m (квантовий вміст) значно
відрізнялась в “ПТП” і “ПТД” парах, ця відмінність не є статистично
достовірною (P>0,3). Однак спостерігалася значна і статистично
достовірна відмінність розрахованих величин P. Розрахована ймовірність
вивільнення медіатора в “ПТП парах” 0,52±0,13 є значно меншою, ніж в
“ПТД парах” 0,89±0,04 (рис. 6В). Ця відмінність була статистично
достовірною (P<0,02). Величини N складали 94,4±35 та 70,0±16,8 для “ПТП” і “ПТД” пар відповідно (рис. 6Г) і статистично достовірно не відрізнялись (P=0,5). Тому ймовірним поясненням протилежного впливу тетанізації на ефективність ГАМКергічних зв'язків є різниця в імовірності вивільнення медіатора: більш низька ймовірність вивільнення в “ПТП парах” і більш висока в “ПТД парах”. На користь цього припущення свідчить кореляція між імовірністю вивільнення медіатора й ефектом тетанізації на амплітуду ГПСС (рис. 7). Ця кореляція була досить вираженою і статистично достовірною (P<0,05; R=-0,84). Дійсно, за винятком однієї пари, (з незначною ПТП) а синаптичних зв’язках з імовірністю вивільнення медіатора < 0,6 спостерігалась посттетанічна потенціація, у той час як у синаптичних зв'язках з більш високою ймовірністю вивільнення медіатора спостерігалась посттетанічна депресія. Можна припустити, що пари, для яких ми не оцінювали P, підкоряються подібній закономірності: більш низька ймовірність вивільнення характерна для пар із ПТП і більш висока для пар із ПТД. На користь цього припущення свідчить відмінність співвідношення Imean/Imax (яке для однакової кількості реєстрацій залежить від P) між “ПТП” і “ПТД” парами й кореляцією між співвідношенням Imean/Imax і ефектом тетанізації, розрахованим для всіх 29-ти синаптичних пар, досліджених у наших експериментах. Хоча кореляція була слабкою (R=-0,4), вона була статистично достовірною (P<0,03). Таким чином, порівняння властивостей “ПТП” і “ПТД” зв'язків не виявило достовірних відмінностей амплітуд викликаних струмів, а також квантових параметрів q, m і N, але в той же час виявлено, що коефіцієнт варіації викликаних ГПСС і ймовірність вивільнення медіатора з пресинаптичної терміналі істотно відрізняються в “ПТП” і “ПТД” зв'язках. Для “ПТП” зв'язків характерна більш низька імовірність вивільнення (Р=0,52), а для “ПТД” пар характерна висока ймовірність вивільнення медіатора (Р=0,89). Гомеостатична пластичність ГАМКергічної синаптичної передачі. В дослідженнях гомеостатичної пластичності були проведені три серії експериментів, у яких вивчалися можливі ефекти тривалого впливу факторів, що змінюють спонтанну імпульсну активність у культурі нейронів гіпокампа на деякі властивості ГАМКергічної синаптичної передачі. А саме, досліджувалися впливи: а) тривалої блокади глутаматергічної синаптичної передачі за допомогою кінурената (1 мМ); б) тривалої блокади імпульсної активності нейронів за допомогою ТТХ (1 мкМ); в) тривалої блокади ГАМКергічної синаптичної передачі за допомогою бікукуліна (20 мкМ). Перед електрофізіологічним дослідженням контрольні й дослідні культури інкубували без блокаторів протягом однієї години в позаклітинному розчині. В дослідженнях гомеостатичної пластичності порівнювали такі властивості викликаних ГАМКергічних ПСС: амплітуди ГПСС (на градієнті потенціалу 25 мВ), потенціали реверсії ГПСС, коефіцієнти варіації амплітуд ГПСС та депресію ГПСС, зумовлену парною стимуляцією (ДЗПС). ДЗПС розраховували як: (ГПСС1-ГПСС2)/ГПСС1, де ГПСС1 і ГПСС2 – амплітуда гальмівного постсинаптичного струму, у відповідь на перший і другий стимул у парі відповідно. Вплив тривалої блокади іонотропних глутаматних рецепторів на ГАМКергічні ПСС. Виявлено, що тривала блокада глутаматергічної передачі кінуренатом збільшує депресію ПСС, зумовлену парною стимуляцією (ДЗПС). Зменшення відповіді на другий стимул у парі було істотно більшим у культурах, вирощених у кінуренаті (дослідні культури), ніж у контрольних культурах (рис. 8А).У середньому, ДЗПС була 0,21±0,043 (n=8) у контрольних і 0,35±0,033 (n=9) у дослідних культурах (рис. 8Б). Таким чином, величина ДЗПС збільшилась на 67% і це було статистично достовірно (P<0,01). Як у контрольних, так і в дослідних культурах депресія, зумовлена парною стимуляцією, супроводжувалася збільшенням коефіцієнтів варіації (CV) амплітуд ГПСС2 у порівнянні з ГПСС1. Співвідношення CV2/CV1 складало 0,89±0,07 у контрольних і 0,7±0,06 у дослідних культурах. Відносне збільшення CV2 у дослідних культурах було статистично достовірним (P<0,02). Ці результати вказують на те, що пресинаптичні механізми беруть участь у депресії, зумовленої парною стимуляцією. У той же час не виявлено пливу тривалої блокади глутаматергічної синаптичної передачі на амплітуду викликаних ГАМКергічних ПСС (рис. 8В), на абсолютні величини коефіцієнтів варіації (CV) ГПСС (рис. 8Г) і на потенціал реверсії ГПСС (рис. 8Д). Таким чином, враховуючи зміну депресії, зумовлену парною стимуляцією, можна припустити, що в основі даного ефекту лежать пресинаптичні процеси. Вплив тривалої блокади ГАМКА-рецепторів. Виявлено, що тривала блокада ГАМКА-рецепторів бікукуліном призводить до значного збільшення амплітуд викликаних ГПСС (рис. 9А,В). Середнє значення амплітуди викликаних ГПСС складало –277,56±52,5 пА (n=15) у контрольних і –555,94±99,53 пА (n=15) у вирощених в присутності бікукуліну культурах (рис. 9.В). Аналіз цих результатів показав статистично достовірну відмінність (P<0,02). У той же час впливу тривалої блокади ГАМКергічної синаптичної передачі на депресію, зумовлену парною стимуляцією (рис. 9Б), на абсолютні величини коефіцієнтів варіації (CV) ГПСС (рис. 9Г) і на потенціали реверсії ГПСС (рис. 9Д) виявлені не були. Таким чином, збільшення амплітуд викликаних ГАМКергічних ПСС, що не супроводжується збільшенням коефіцієнтів варіації ПСС і зміною депресії ПСС, зумовленої парною стимуляцією в умовах хронічної блокади ГАМКА-рецепторів, дозволяє припускати, що ці зміни зумовлені постсинаптичними механізмами. Вплив тривалої блокади спонтанної імпульсної активності нейронів. Виявлено, що тривала блокада імпульсної активності нейронів призводить до значного зменшення амплітуд, викликаних ГПСС (рис. 10А) і збільшення коефіцієнтів варіації амплітуд ГПСС. У середньому, амплітуда викликаних ГПСС була –694,17±153,2 пА (n=7) у контрольних парах і –184,7±27,95 пА (n=5) у парах, вирощених в присутності TTX (рис. 10В). Статистичний аналіз цих результатів показав достовірну відмінність P< 0,02. Середня величина коефіцієнта варіації амплітуд ГПСС для контрольних пар складала –0,078±0,012, а для дослідних культур –0,241±0,0360 (рис. 10Г). Відмінності були статистично достовірними Р<0,01. В той же час вплив тривалої блокади імпульсної активності нейронів на депресію, зумовлену парною стимуляцією (рис. 10Б) та на потенціали реверсії ГПСС (рис. 10Д), виявлені не були. Таким чином, зменшення амплітуд викликаних ГАМКергічних ПСС, що супроводжується збільшенням коефіцієнтів варіації ПСС в умовах хронічної блокади спонтанної імпульсної активності нейронів дозволяє припускати, що ці зміни обумовлені частково пресинаптичними механізмами. ( A Ae e e D F v z th ~ ‚ ¦ O & ( 3/4 A A Ae ~ ? ‚ „ „io^„ & туд ГПСС. Аналіз часового перебігу посттетанічної депресії виявив два компоненти з постійними часу 11 сек і 110 сек. Тривалість швидкого компонента була близькою до тривалості змін коефіцієнта варіації (CV) амплітуд ГПСС і тривалості змін ДЗПС. Тому, ймовірно, що саме пресинаптичні зміни є головним чинником формування швидкого компонента ПТД. На користь цього припущення також свідчать наші дані про те, що стала часу більш швидкого компонента (11,4 сек) близька до сталої часу (14 секунд) поповнення запасів медіатора, готового до вивільнення в ГАМКергічних синапсах у культурі нейронів superior colliculus (Kirischuk & Grantyn, 2000), що дозволяє припустити подібність механізмів, що лежать в основі цих процесів. Незважаючи на досить велику тривалість більш повільного компонента ПТД у наших експериментах, він відрізнявся від тривалої депресії (LTD) ГАМКергічної передачі, описаної раніше (McLean et al., 1996); LTD блокувалося антагоністами НМДА (NMDA) рецепторів, а наші експерименти проводилися в присутності APV, відомого блокатора НМДА рецепторів. Беручи до уваги дані літератури про наявність декількох типів ГАМКергічних нейронів (Lacaille & Schwartzkroin, 1988; McBain et al., 1994) ми припустили, що протилежний ефект тетанізації, тобто виникнення ПТП і ПТД, пояснюється гетерогенністю властивостей пресинаптичних нейронів. Ми досліджували, чи є відмінності між синаптичними зв'язками, у яких спостерігається потенціація і депресія після тетанічної стимуляції. Крім відмінностей у величинах коефіцієнтів варіації ГПСС, ми знайшли істотну відмінність розрахованої ймовірності вивільнення медіатора в “ПТП” і в “ПТД” зв'язках. Імовірність вивільнення медіатора в “ПТП парах” була істотно вищою у порівнянні з “ПТД парами”. Наша оцінка Р для “ПТП зв'язків” близька до оцінки Р для синапсів між корзинчастими і гранулярними клітинами гіпокампа (Kraushaar & Jonas, 2000) у яких спостерігається посттетанічна потенціація (Jensen & Mody, 2001). На користь припущення про те, що саме відмінність Р лежить в основі протилежного ефекту тетанізації, свідчить також виявлена нами кореляція між розрахованою величиною Р і ефектом тетанізації. У парах з меншим значенням Р спостерігалася ПТП, а в парах із великим значенням Р - ПТД. Ці наші результати перегукуються з результатами роботи, у якій досліджували залежність ПТП від імовірності вивільнення медіатора. Зменшення концентрації іонів кальцію в позаклітинному середовищі спричинювало зменшення амплітуди ГПСС, але істотно збільшувало ПТП. І навпаки, збільшення концентрації іонів кальцію в позаклітинному середовищі збільшувало амплітуду викликаних ГПСС, але зменшувало ПТП. Дія баклофену на ГПСС і ПТП була якісно схожою на ефект низької концентрації кальцію на ГПСС і ПТП. Крім уже згадуваної ролі базової імовірності вивільнення медіатора й процесів зв'язування кальцію внутрішньоклітинними буферами, важливу роль у ПТП відіграють кальцієві канали L-типу. Незважаючи на те, що ці канали безпосередньо не беруть участь у вивільнені медіатора, вони забезпечують вхід кальцію під час тетанізації, необхідного для розвитку ПТП (Jensen et al., 1999). Блокатори L-типу кальцієвих каналів істотно зменшували ПТП у культурі нейронів гіпокампа. Останнє може вказувати на те, що протилежний ефект тетанізації, що спостерігався нами, може бути обумовлений відмінностями експресії L-типу кальцієвих каналів у різних типах інтернейронів. Вважається, що велика частина відмінностей імовірності вивільнення медіатора в різних синапсах обумовлена внутрішніми властивостями синапса. Важливу роль у внутрішніх відмінностях може відіграти неоднакова здатність інтернейронів експресувати кальційзв’язуючі білки (парвальбумін, кальбіндин), що було встановлено за допомогою імуноцитохімічних методів (Freund & Buzsaki, 1996). Дійсно, збільшення буферної ємності для іонів кальцію в пресинаптичному нейроні за допомогою екзогенного буфера зменшує ймовірність вивільнення медіатора і збільшує ПТП (Jensen et al., 1999). Видається ймовірним, що ендогенні кальцієві буфери можуть впливати на синаптичну передачу в природних умовах. Тому можна припустити, що “ПТП інтернейрони” можуть відрізнятися від “ПТД інтернейронів” більшою буферною ємністю для іонів кальцію за рахунок ендогенних буферів, таких як парвальбумін і кальбіндин. Таке припущення дозволяє пояснити протилежний ефект тривалої тетанізації, який ми спостерігали в наших експериментах. Відмінності ГАМКергічних зв'язків у нашій роботі були виявлені при тетанізації з частотою 30 Гц, тобто частотою, що лежить у діапазоні (-ритму. Це дозволяє припустити, що відмінності ГАМКергічних синаптичних зв'язків, що спостерігаються нами, можуть відіграти важливу фізіологічну роль. Зокрема, вони можуть по-різному брати участь у підтримці балансу між збудженням і гальмуванням під час осциляторної активності. Синаптичні зв'язки з високою імовірністю вивільнення більш ефективно контролюють (пригнічують) збудження на початку пачки активності, але їхня участь короткочасна внаслідок депресії, а синаптичні зв'язки з низькою ймовірністю вивільнення можуть контролювати процес збудження протягом більш тривалого часу. Гомеостатична пластичність Відомо, що рівновага між процесами гальмування і збудження в нейронних мережах головного мозку сильно залежить від ефективності як глутаматергічної, так і ГАМКергічної синаптичної передачі. Тривала потенціація (LTP) повинна була б приводити до зсуву рівноваги між збудженням і гальмуванням в бік збудження і, навпаки, тривала депресія (LTD) - у бік гальмування, і в обох випадках це мало б негативні наслідки. Але такого, як правило, не спостерігається при нормальному функціонуванні ЦНС. Для пояснення даного спостереження нещодавно було запропоновано гіпотезу гомеостатичної пластичності - пластичності, що компенсує тривалі зміни в нейронних мережах. Встановлено, що тривала зміна імпульсної нейронної активності призводить до компенсаторних змін глутаматергічної передачі. В літературі почали з’являтися дані щодо гомеостатичних змін ГАМКергічної передачі в нейронних мережах неокортексу та мозочка. Питання відносно можливості гомеостатичних змін ГАМКергічної передачі в нейронних мережах гіпокампа раніше не досліджувалось й було одним із завдань даної роботи. Нами встановлено, що тривале збільшення спонтанної імпульсної активності (експерименти з блокатором ГАМКергічної передачі бікукуліном) призводило до збільшення ефективності ГАМКергічної передачі. Тривале зменшення спонтанної імпульсної активності за допомогою тетродотоксину призводить до протилежних змін, а саме до зменшення ефективності ГАМКергічної синаптичної передачі. Наші дані щодо локалізації гомеостатичних змін ГАМКергічної передачі дозволяють припустити, що у разі тривалої дії ТТХ відбуваються перш за все пресинаптичні зміни, оскільки зменшення амплітуди викликаних постсинаптичних струмів супроводжувалось збільшення коефіцієнта варіації ГПСС. В випадку тривалої дії бікукуліну зміни відбуваються на постсинаптичному рівні, тому що збільшення амплітуди ТПСТ не супроводжувалось змінами коефіцієнтів варіації й депресії, зумовленої парною стимуляцією. Слід також зазначити наші результати щодо дії кінуренату. Хоча ефективність ГАМКергічної передачі за таких умов безпосередньо не змінювалась (при відносно низькій частоті тестування), спостерігалось істотне збільшення ДЗПС при стимуляції парами з міжімпульсним інтервалом 100 мс. Зважаючи на те, що нейрони в культурі можуть генерувати потенціали дії з частотою близькою до частоти стимуляції у наших експериментах, збільшення ДЗПС може призводити до зменшення сумарного гальмування в нейронних мережах. Таким чином, існують додаткові механізми гомеостатичної пластичності ГАМКергічної передачі. Однак постає питання, як синапс дізнається про зміну нейронної активності? Вважається, що ефективність гальмування в корі головного мозку може регулюватись за допомогою мозкового нейротрофічного фактора – BDNF. Відомо також, що BDNF синтезується і вивільняється нейронами під час їх активності і саме зменшення або збільшення вивільнення BDNF є сигналом для змін ефективності збуджуючих синапсів (Rutherford еt al., 1998; Turrigiano, 1999). Вважається, що BDNF відіграє важливу роль у регуляції ефективності ГАМКергічної передачі в культурі нейронів кори, гіпокампа, мозочка. Відомо, що тривалий вплив на BDNF сигналізацію призводить до протилежного ефекту на переміщення ГАМКА і AMPA рецепторів у гальмівних та збуджуючих синапсах (Kilman et al, 2002). Можна припустити, що за умов зменшення спонтанної активності нейронів (експерименти з ТТХ) рівень BDNF зменшується і в наслідок чого ефективність гальмівної синаптичної передачі знижується. Встановлено, що зниження рівня BDNF зменшує кількість ГАМКА рецепторів на постсинаптичній мембрані. Зважаючи на це, можна припустити, що в наших експериментальних умовах (в умовах збільшення імпульсної активності) рівень BDNF збільшується і це призводить до збільшення кількості постсинаптичних ГАМКА-рецепторів. Проте безпосередня відповідь на питання щодо участі BDNF у гомеостатичній пластичності ГАМКергічної синаптичної передачі потребує подальшого дослідження. Висновки 1. Досліджувалась ГАМКергічна синаптична передача у парах синаптично-поєднаних нейронів гіпокампа. Показано, що депресія, зумовлена парною стимуляцією змінюється під дією факторів, які змінюють ймовірність вивільнення медіатора. Фактори, що впливають на амплітуду ГПСС за рахунок постсинаптичних механізмів, не змінюють депресію, зумовлену парною стимуляцією. Таким чином, зміни депресії, зумовленої парною стимуляцією, можна використовувати як індикатор пресинаптичних змін за наших експериментальних умов. 2. Тетанічна стимуляція пресинаптичного нейрона з частотою 30 Гц протягом 4 секунд призводила до посттетанічної депресії (ПТД) в 55 % досліджених пар та до посттетанічної потенціації (ПТП) у 45 % зв'язків. ПТД супроводжувалась збільшенням коефіцієнта варіації ГПСС та зменшенням депресії ГПСС, зумовленої парною стимуляцією. Це показує, що не тільки постсинаптичні (як вважалося раніше), а і пресинаптичні зміни є чинниками зменшення ефективності ГАМКергічної синаптичної передачі під час посттетанічної депресії. 3. Аналіз часового перебігу відновлення амплітуд ГПСС після тетанізації у парах нейронів, в яких спостерігалась ПТД, виявив два компоненти з сталими часу 11 та 110 секунд. Тривалість більш швидкого компонента була близькою до тривалості змін коефіцієнта варіації ГПСС та депресії ГПСС, зумовленої парною стимуляцією. Тому, ймовірно, що пресинаптичні зміни є головною причиною саме цього компонента ПТД. 4. Порівняння властивостей ПТП і ПТД зв'язків не виявило достовірних відмінностей амплітуд, викликаних струмів, а також квантових параметрів q, m і N. У той же час коефіцієнт варіації викликаних ГПСС і ймовірність вивільнення медіатора з пресинаптичних терміналей істотно відрізнялася для ПТП і ПТД пар. Для ПТП зв'язків характерна більш низька імовірність викиду (Р=0,52), а для ПТД пар характерна висока ймовірність викиду медіатора (Р=0,89), що вказує на відмінності в характеристиці экзоцитоза у відповідних пресинаптичних закінченнях. 5. Тривала блокада іонотропних глутаматних рецепторів не впливала на амплітуду викликаних ГАМКергічних ПСС, потенціал реверсії ПСС, коефіцієнти варіації ПСС, але на 67% збільшувала депресію ПСС, зумовлену парною стимуляцією, що свідчить на користь пресинаптичного характеру цієї зміни. 6. Тривала блокада імпульсної активності нейронів не впливала на потенціал реверсії ПСС і депресію ПСС, зумовлену парною стимуляцією, але значно зменшувала амплітуду (у 3 рази) викликаних ГАМКергічних ПСС, і це супроводжувалося збільшенням їхнього коефіцієнта варіації. Останнє дає підстави припускати, що зменшення ефективності ГАМКергічної передачі, щонайменше частково, обумовлено пресинаптичними механізмами. 7. Тривале підвищення імпульсної активності нейронів не впливало на потенціали реверсії ПСС, коефіцієнти варіації ПСС і депресію ПСС, зумовлену парною стимуляцією, але значно збільшувало амплітуду (у 2 рази) викликаних ГАМКергічних ПСС. Збільшення амплітуди ПСС без збільшення коефіцієнтів варіації ПСС і депресії ПСС, зумовленої парною стимуляцією, дозволяють припускати, що ці зміни обумовлені постсинаптичними механізмами. 8. Таким чином, гомеостатична пластичність характерна не тільки для глутаматергічної передачі, але і для ГАМКергічної передачі. Наші результати свідчать про те, що в гомеостатичних змінах ГАМКергічної передачі можуть приймати участь як пре- так і постсинаптичні механізми і вони характерні не тільки для неокортекса, як було показано раніше, але і для гіпокампа. 9. Отримані дані істотно розширюють уявлення про просторову локалізацію механізмів, що лежать в основі різних форм пластичності гальмівних синаптичних зв'язків у гіпокампі і шляхів взаємодії між ними. Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації. Ivanova S. Y., Storozhuk M. V. and Kostyuk, P. G. Changes in paired pulse depression as an indicator for involvement of presynatic mechanism(s) in a modulation of GABAergic synaptic transmission in rat hippocampal cell cultures. Нейрофізіологія 2002, т.34, № 2/3, с. 161-163. Storozhuk M.V., Ivanova S.Y., Pivneva T.A., Melnick I.V., Skibo G.G., Belan P.V., Kostyuk P.G. Post-tetanic depression of GABAergic synaptic transmission in rat hippocampal cell cultures. Neuroscience Letters 2002, v. 323, p. 5-8. Ivanova S. Y., Storozhuk M.V., Melnick I. V. and Kostyuk P. G. Chronic treatment of rat hippocampal cell cultures with ionotropic glutamate receptor antagonist kynurenate affects GABAergic synaptic transmission. Neuroscience Letters 2003, v. 341, p. 61-64. Ivanova S. Y., Lushnikova I.V., Pivneva T. A., Belan P. V., Storozhuk M. V., and Kostyuk P. G. Differential properties of GABAergic synaptic connections in rat hippocampal cell cultures. Synapse 2004, v. 53, № 2, p. 122-130. Іванова С.Ю., Костюк П.Г. Збільшення ефективністі ГАМКергічної синаптичної передачі після тривалої блокади ГАМКА-рецепторів у культурі нейронів гіпокампа щура. Фізіологічний журнал 2004, т. 50, № 4, c 10-15. Тези доповідей. Сторожук М.В., Іванова С.Ю., Мельнік І.В., Півнєва Т.А., Білан П.В., Костюк П.Г. Посттетанічна депресія ГАМКергічної синаптичної передачі в культурі нейронів гіпокампа щурів. Тези ІІІ З’їзду Українського біофізичного товариства, Львів 2002, c. 81. Ivanova S.Y. and Kostuyk P.G. Homeostatic regulation of the efficacy of synaptic transmission. Тези ІІ міжнародного симпозіуму “Фізіологія та біофізика гладеньких м'язів”. Neurophysiology 2003, v.35, № 3/4, p.350. Storozhuk M., Ivanova S. and Kostyuk P. Differential properties of GABAergic synaptic connections in rat hippocampal cell cultures. First Ukrainian Congress for cell biology, Lviv, 2004, p.316. Іванова С., Сторожук М., Костюк П. Вплив тривалоЇ блокади ГАМКА- рецепторів на ефективність ГАМКергічної синаптичної передачі. Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології, Львів 2004, с. 310. Анотації. Іванова С.Ю. Дослідження пластичності ГАМКергічної синаптичної передачі в культурі нейронів гіпокампа щура. -Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія человека и животных. – Міжнародний молекулярний центр НАН України, Київ, 2004. Дисертація присвячена дослідженню пластичності ГАМКергічної синаптичної передачі в культурі синаптично-поєднаних нейронів гіпокампа щура. Показано, що зміни депресії, зумовленої парною стимуляцією можуть використовуватися, як індикатор пресинаптичних змін, за даних експериментальних умов. Виявлено, що тетанічна стимуляція пресинаптичного нейрона з частотою 30 Гц протягом 4 секунд призводила до посттетанічної депресії (ПТД) в 55 % досліджених пар та до посттетанічної потенціації (ПТП) у 45 %. ПТД супроводжувалась збільшенням коефіцієнта варіації ГПСС та зменшенням депресії ГПСС зумовленої парною стимуляцією. Аналіз часового перебігу відновлення амплітуд ГПСС після тетанізації у парах, в яких спостерігалась ПТД, виявив два компоненти зі сталими часу 11 та 110 секунд у цьому процесі. Тривалість більш швидкого компонента була близькою до тривалості змін коефіцієнта варіації ГПСС та депресії ГПСС, зумовленої парною стимуляцією. Тому, ймовірно, що пресинаптичні зміни є головним чинником саме цього компонента ПТД. Порівняння властивостей “ПТП” і “ПТД” зв'язків виявило достовірні відмінності коефіцієнтів варіації викликаних ГПСС і ймовірності вивільнення медіатора з пресинаптичних терміналей. Для “ПТП зв'язків” характерна більш низька імовірність викиду медіатора (Р=0,5), а для “ПТД пар” характерна висока ймовірність викиду медіатора (Р=0,9), що вказує на відмінності в характеристиці экзоцитозу у відповідних пресинаптичних закінченнях. В експериментах з вивчення гомеостатичної пластичності показано, що тривала блокада іонотропних глутаматних рецепторів збільшує на 67% депресію ПСС, зумовлену парною стимуляцією, що свідчить на користь пресинаптичного характеру цієї зміни. Показано, що тривала блокада імпульсної активності нейронів значно зменшувала амплітуду (у 3 рази) викликаних ГАМКергічних ПСС і це супроводжувалося збільшенням їхнього коефіцієнта варіації. Останнє дає підстави припускати, що зменшення ефективності ГАМКергічної передачі, щонайменше частково, обумовлено пресинаптичними механізмами. Виявлено, що тривале підвищення імпульсної активності нейронів значно збільшує амплітуду (у 2 рази) викликаних ГАМКергічних ПСС. Збільшення амплітуди ПСС без збільшення коефіцієнтів варіації ПСС і депресії ПСС, зумовленої парною стимуляцією, дозволяють припускати, що ці зміни обумовлені постсинаптичними механізмами. Таким чином, гомеостатична пластичність характерна не тільки для глутаматергічної передачі, але і для ГАМКергічної передачі. Наші результати свідчать про, що в гомеостатичних змінах ГАМКергічної передачі можуть приймати участь як пре- так і постсинаптичні механізми і вони характерні не тільки для неокортекса, як було показане раніше, але і для гіпокампа. Отримані дані істотно розширюють уявлення про просторову локалізацію механізмів, що лежать в основі різних форм пластичності гальмівних синаптичних зв'язків у гіпокампі і шляхів взаємодії між ними. Ключові слова: нейрони гіпокампа; синаптична пластичність; ГАМКергічна передача; гомеостатична пластичність. Иванова С.Ю. Исследование пластичности ГАМКэргической синаптической передачи в культуре нейронов гиппокампа крыс. -Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Международный центр молекулярной физиологии НАН Украины, Киев 2004. Диссертация посвящена изучению пластичности ГАМКэргической синаптической передачи в культуре нейронов гиппокампа. В настоящей работе исследовалась ГАМКэргическая передача в синаптически-связанных парах культивированных нейронов гиппокампа. Показано, что воздействия, изменяющие вероятность выброса медиатора, т.е. воздействия на пресинаптические механизмы, изменяют депрессию, вызванную парной стимуляцией. Воздействия, изменяющие амплитуду ПСТ за счет постсинаптических механизмов, не изменяют депрессию, вызванную парной стимуляцией. Поэтому изменение депрессии, вызванной парной стимуляцией в наших экспериментальных условиях, могло быть использовано как инструмент, указывающий на пресинаптическую локализацию изменений. Показано, что тетаническая стимуляция пресинаптического нейрона с частотой 30 Гц 4 сек приводила к посттетанической депрессии (ПТД) в 55% исследованных пар и к посттетанической потенциации (ПТП) в 45%. ПТД сопровождалось увеличением коэффициентов вариации (CV) амплитуд ТПСТ и уменьшением депрессии тормозных постсинаптических токов (ТПСТ), вызванной парной стимуляцией. Это указывает на то, что не только постсинаптические, как считалось ранее, но и пресинаптические изменения вносят вклад в ПТД тормозной синаптической передачи. Анализ временного хода восстановления амплитуд ТПСТ в нейронных парах, в которых наблюдалось ПТД, выявил два компонента с постоянными времени 11 сек и 110 сек. Длительность быстрого компонента была близкой к длительности изменений CV амплитуд ТПСТ и длительности изменений ДВПС. Поэтому представляется вероятным, что пресинаптические изменения являются главной причиной именно этого компонента ПТД. Сравнение свойств “ПТП” и “ПТД” связей не выявило достоверных различий амплитуд вызванных токов, а также их квантовых параметров: q (размер кванта), m (квантовое содержимое) и статистическое N. В тоже время коэффициент вариации вызванных ТПСТ и вероятность высвобождения медиатора из пресинаптической терминали существенно отличалась для “ПТП” и “ПТД” связей. Для “ПТП связей” характерна более низкая вероятность выброса (P=0,5) медиатора, а для “ПТД пар” характерна высокая его вероятность выброса (P=0,9), что указывает на различие в характеристике экзоцитоза в соответствующих пресинаптических окончаниях. В настоящей работе была исследована гомеостатическая пластичность ГАМКэргической синаптической передачи в культуре нейронов гиппокампа крысы. В экспериментах по исследованию гомеостатической пластичности были проведены три серии, в которых изучались возможные эффекты длительного воздействия факторов, изменяющих импульсную активность в культуре нейронов гиппокампа, на некоторые свойства ГАМКэргической синаптической передачи. А именно, исследовались влияния: а) длительной блокады глутаматэргической синаптической передачи с помощью кинурената (1 мМ); б) длительной блокады нейронной активности с помощью ТТХ (1 мкМ); в) длительной блокады ГАМКэргической синаптической передачи с помощью бикукуллина (20 мкМ). Все эти воздействия изменяющие активность нейронов в сетях широко используются для исследования гомеостатической пластичности. Показано, что длительная блокада ионотропных глутаматных рецепторов не оказывала влияния на амплитуду вызванных ГАМКэргических ПСТ, потенциалы реверсии ПСТ, коэффициенты вариации ПСТ, но на 67% увеличивала депрессию ПСТ, вызванную парной стимуляцией, что предположительно указывает на пресинаптический характер этого изменения. Показано, что длительная блокада импульсной активности нейронов не оказывала влияния на потенциалы реверсии ПСТ и депрессию ПСТ, вызванную парной стимуляцией, но значительно уменьшала амплитуду (в 3 раза) вызванных ГАМКэргических ПСТ, и это сопровождалось увеличением их коэффициента вариации. Последнее дает основания предполагать, что уменьшение эффективности ГАМКэргической передачи, по меньшей мере отчасти, обусловлено пресинаптическими механизмами. Показано, что длительное повышение импульсной активности нейронов не оказывало влияния на потенциалы реверсии ПСТ, коэффициенты вариации ПСТ и депрессию ПСТ, вызванную парной стимуляцией, но значительно увеличивало амплитуду (в 2 раза) вызванных ГАМКэргических ПСТ. Увеличение амплитуды ПСТ без увеличения коэффициентов вариации ПСТ и депрессии ПСТ, вызванной парной стимуляцией, позволяют предполагать, что эти изменения обусловлены постсинаптическими механизмами. Таким образом, гомеостатическая пластичность характерна не только для глутаматэргической передачи, но и для ГАМКэргической передачи. Наши результаты показывают, что в гомеостатические изменения ГАМКэргической передачи могут вовлекаться как пре-, так и постсинаптические механизмы и они характерны не только для неокортекса, как было показано раннее, но и для гиппокампа. Полученные данные существенно расширяют представление о пространственной локализации механизмов, лежащих в основе различных форм пластичности тормозных синаптических связей в гиппокампе и путей взаимодействия между ними. Ключевые слова: культура нейронов гиппокампа; ГАМКэргическая передача; посттетаническая депрессия; гомеостатическая пластичность. Ivanova S. Y. Plasticity of GABAergic synaptic transmission in rat cultured hippocampal neurones. - Manuscript. Thesis for candidate’s degree by specialty 03.00.13 – human and animal physiology . – International Center of Molecular Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2004. The dissertation is devoted to investigation of plasticity of GABAergic synaptic transmission in rat cultured hippocampal neurones. It has been proposed recently to consider plasticity in neuronal network as occurring in two forms use-dependent plasticity which modifies the network properties, and homeostatic plasticity which to some extent counteract use-dependent changes to stabilize neuronal firing. Several instances of use-dependent plasticity and homeostatic plasticity of GABAergic synaptic transmission are described in the dissertation. In particular: 1) use-dependent plasticity evoked by tetanic stimulation of the presynaptic neuron; 2) homeoestatic plasticity evoked by prolonged changes of neuronal firing (evoked by bicuculline, TTX and kynuranic acid pretreatments). Using whole-cell voltage clamp recording and local extracellular stimulation we investigated spontaneous and evoked inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) in cultured rat hippocampal neurons. It was found that the same tetanic stimulation (30 Hz, 4 seconds) elicited post-tetanic depression (PTD) of the evoked IPSCs in 55% of the connections and posttetanic potentiation (PTP) in 45% of the connections. PTD was accompanied by changes in IPSC coefficient of variation (CV) and changes of a paired pulse depression (PPD). These results indicate that at least in part PTD is due to a presynaptic mechanism(s). To reveal possible reasons for the differential effect of the tetanization quantal parameters of the connections belonging to ‘PTP’ and ‘PTD’ groups were compared. It was found that a background release probability (P) is substantially lower in the ‘PTP connections’ (P=0.5) then in the ‘PTD’ connections (P=0.9) and suggested that this difference underlies the differential effect of the tetanization. It was shown that prolonged TTX pretreatment significantly decreased the amplitude of evoked IPSCs. This decrease was accompanied by an increase of IPSC coefficient of variation which is suggestive of a presynaptic mechanism. In contrast to TTX pretreatment, pretreatment with bicuculline which enhances neuronal firing, resulted in an enhancement of IPSCs amplitude. This enhancement, however was not accompanied by changes of IPSC coefficient of variation suggesting its postsynaptic mechanism. It was concluded that alteration of GABAergic synaptic transmission contributes to homeostatic plasticity in hippocampal neuronal networks and, in general, both pre- and postsynaptic changes are likely to be involved. Key words: GABAergic transmission, posttetanic depression, homeostatic plasticity. - PAGE 18 -

Похожие записи