.

Чутливість ембріонів великої рогатої худоби різних стадій розвитку до дії низьких температур: Автореф. дис… канд. с.-г. наук / Мауссе Франсіско Сало

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2858
Скачать документ

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА УААН

МАУССЕ ФРАНСІСКО САЛОМОН

УДК 636.22/.28:57.08

ЧУТЛИВІСТЬ ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ РІЗНИХ СТАДІЇ РОЗВИТКУ ДО ДІЇ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР

03.00.20  Біотехнологія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук

ХАРКІВ  1999

Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біотехнології відтворення і генної інженерії Інституту тваринництва УААН та в лабораторії трансплантації ембріонів АТЗТ “Світанок” Охтирського району Сумської області.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук
Безуглий Микола Дмитрович,
директор Харківського біотехнологічного
центру

Офіційні опоненти :
-доктор ветеринарних наук, професор, Харута Григорій Григорович, Білоцерківського державного аграрного університету зав. каф. ветеринарного акушерства і гінекології

-доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Вишневський Валентин Йосипович Інституту кріобіології та кріомедицини УААН

Провідна установа: Державний науково-дослідний інститут біотехнології
і штамів мікроорганізмів, м. Київ

Захист дисертації відбудеться ‘’29 ‘’ червня__ 1999 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д27.821.01 при Білоцерківському державному аграрному університеті, 256400, Київська обл., м. Біла Церква, пл. Волі, 8/1 корп. № , ауд. №

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Білоцерківського аграрного державного університету.
Автореферат розісланий ‘’ 25’’травня1999 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої Ради,
кандидат біологічних наук Розпутній О.І.

Загальна характеристика роботи
Актуальність теми.
Ефективність застосування найновіших методів біотехнології відтворення с.-г. тварин, таких як клонування, химеризація, виявлення статі ембріонів та ін. може зростати тільки при наявності банку ембріонів. Єдиним способом збереження ембріонів в зворотньому анабіозі є їх заморожування і тривале зберігання при низьких температурах.
Використання розроблених способів заморожування ембріонів корів на стадіях ранніх морул і бластоцист після вилуплення з зони пелюцида менш результативне, тобто дає низький рівень приживлення після пересадки реципієнтам. Очевидно, що для заморожування таких ембріонів необхідно або оптимізувати окремі технологічні параметри раніше розроблених способів заморожування, або розробити інші, більш ощадливі способи їх кріоконсервації для підвищення рівня збереженості і приживлення пересаджених ембріонів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Подана робота має зв’язок з такими науковими програмами як: створення нових режимів заморожування ембріонів ссавців з врахуванням їх стадій розвитку, класификація ембріонів корови для їх використання в різних біотехнологічнних методах а також пов’язана з програмою навчання студентів по спеціальностям біологічного профілю.
Мета і задачі досліджень.
У зв’язку з вищевказаним є актуальним встановити причини різної чутливості ембріонів корів різних стадій розвитку до дії низьких температур і розробити спосіб заморожування таких зародків. Для досягнення поставленої мети нами вирішувалися наступні задачі:
1. Отримати ембріони корів різних стадій розвитку від 8-ми клітинної до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида.
2. Вивчити стійкість до температурного шоку ембріонів різних стадій розвитку.
3. Вивчити морфологічні відмінності і особливості транспорту речовин для ембріонів різних стадій розвитку.
4. Порівняти здатність до виживання деконсервованих ембріонів на стадіях від ранньої морули до вилупленої бластоцисти, що заморожені стандартним методом.
5. Застосувати методи кріоконсервації органів і тканин ссавців для заморожування ембріонів на стадії вилупленої бластоцисти.
Наукова новизна одержаних результатів. Запропонована нова класифікація ембріонів у відповідності зі стадіями їх розвитку від 8-ми клітинної до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида;
показано що стійкість до температурного шоку ембріонів корів різних стадій розвитку зростає поступово по мірі зміни стадій розвитку. Встановлено, що стійкість зростає з 0% для 8-ми клітинних ембріонів до 55% для ранніх морул і досягає 100% для компактних морул бластоцист в зоні пелюцида, але падає до 63% для денудованих бластоцист;
встановлено, що на збереженість 8-ми клітинних ембріонів впливає тривалість експозиції при 00 С;
показано різницю протікання осмотичних процесів у ембріонів різних стадій розвитку ;
запропоновано спосіб кріоконсервації ембріонів на стадії пізньої бластоцисти без зони пелюцида, що забезпечує рівень приживлення в 2,4 рази вищий за результатами трансплантації, ніж при використанні стандартного методу заморожування.
Практичне значення одержаних результатів.
Дані, отримані в результаті різкого охолодження ембріонів корів різних стадій розвитку, з урахуванням характеру протікання осмотичних процесів, можуть бути застосовані для оптимізації і створення режимів заморожування відповідного віку ембріонів; в біологічних і ветеринарних вузах при складанні програм навчання студентів, в наукових і виробничих програмах.
Оптимізований нами режим заморожування ембріонів використовується при заморожуванні денудованих бластоцист в лабораторії трансплантації ембріонів АТЗТ ‘’Світанок’’ Охтирського р-ну Сумської області і в Харківському біотехнологічному центрі при виконанні наукових і виробничих програм.
Особистий внесок здобувача.
Більшість досліджень виконані автором самостійно. Методичні підходи і схеми дослідів відпрацьовані спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації.
Основні положення дисертації були представлені на розгляд вченої ради Харківського біотехнологічного центру та обговорені на міжнародній науково-виробничій конференції “Теорія та практика племінної справи у тваринництві” (Харків, 1996).
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результати досліджень, висновків та пропозиції виробництву. Містить 16 таблиць, 13 рисунків та 7 фотографій. Список літератури включає 206 найменуваннь, у тому числі 113 іноземною мовою.
Публікації.
Дисертантом опубліковано 5 наукових статей в журналах, що входять в перелік ВАК України, такими як ‘’Науково-технічний бюлетень’’ № 75 Інституту тваринництва УААН; ‘’Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини‘’ № 4, харківвского зооветеринарного інституту, ‘’Проблем Біології і Медицини‘’ № 8, полтавської медицинської академії. Крім того, ним був опублікований тезис для наукової конференцції, присвяченої 80-річчю з дня народження член-кореспондента ВАСГНІЛ Ф.Ф.Ейснера.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження.
Об’єктом досліджень були ембріони корів від 8-ми клітинної стадії розвитку до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида. Ембріони різних стадій розвитку отримували шляхом промивання яйцепроводів та рогів матки корів та телиць-донорів після попередньої обробки тварин з метою отримання реакції суперовуляції.
Оцінка життєздатності ембріонів проводилася морфологічно, за результатами культивування in vitro і шляхом пересадки ембріонів реципієнтам.Заморожування ембріонів проводилося стандартним методом за допомогою термоблоку, розміщеного у горловині посудини Дьюара.
Принцип дії цього пристрою заснований на пасивному охолодженні (Осташко Ф.І., Безуглий М.Д., 1989). Швидкість охолодження при цьому визначали за допомогою самопишучого потенціометра КСП-4.
Понашвидке охолодження проводилося шляхом прямого переносу дослідних біооб’єктів з 370С в танучий лід. Швидкість охолодження в цьому випадку була визначена за допомогою проведених нами математичних розрахунків.
Результати досліджень
Отримання ембріонів різних стадій розвитку.
В дослідах було використано 80 корів-донорів, які позитивно прореагували суперовуляцію (817 жовтих тіл), відповідно 10,21 жовтих тіл на кожного донора. Із результатів видно, що всього було отримано 665 біологічних об’єктів, серед яких 168 (25%) виявились яйцеклітинами, а 497 (75%) – ембріонами. Ці дані свідчать про високу ефективність обробки донорів з метою отримання реакції суперовуляції. Аналіз якості отриманих ембріонів та їх розподіл за стадіями розвитку наведені в таблиці 2. За даними цієї таблиці видно, що із 75% отриманих ембріонів 46% були відмінної якості, 27% – доброї, 14% – задовільної, а 13%- незадовільної. Ці результати свідчать про високу якість батьківських репродуктивних клітин. Присутність яйцеклітин пояснюється варіабельністю темпів овуляції. Як видно із результатів, ембріони однієї й тієї ж стадії розвитку можна вилучити на протязі декількох днів естрального циклу.
Так, 8-ми клітинні ембріони були вилучені не тільки на протязі 4-го дня статевого циклу, що відповідає їх фізіологічному вікові, але і на п’ятий день, коли, зазвичай, ембріони корови знаходяться на більш продвинутих стадіях розвитку. Результати отримання ембріонів подано в таблиці 1.
Таблиця 1.
Результати вилучення ембріонів корів різних стадій розвитку.
Результати суперовуляціі (на 1 донора)
День Кількість Кількість Кількість вилучених
полового донорів, жовтих яйцеклітин і ембріонів, шт. (%)
циклу гол. Тіл, шт. яйцеклітин ембріонів всього
4* 7 79 17(24) 53(76) 70
5* 6 66 14(25) 43(75) 57
6 23 221 45(26) 129(74) 174
7 18 174 36(26) 100(74) 136
8 10 121 27(25) 79(75) 106
9 10 105 23(26) 66(74) 89
10 6 51 6(18) 27(82) 33
всього 80
817
168(25)
497(75)
665

*- вилучення проводилося після забою тварин-донорів

До цієї стадії слід відносити всі зародки до моменту імплантації (14-17-й день після осіменіння), але в дослідах ми використовували лише 9-10-денні блас-тоцисти, хоча 3 з них були отримані вже на 8-ий день статевого циклу.
Відносно бластоцист після вилуплення цей висновок не дійсний, так як до цієї стадії розвитку ми відносили всі бластоцисти, що втратили зону пелюцида, без урахування кількості клітин в них і їх розмірів.

Таблиця 2.
Якість ембріонів різних стадій розвитку.
Кількість ембріонів, шт. (%)
Стадія всього у тому числі
розвитку відмін. добре задов. незад.
8-ми клітинний 56 21(37,5) 15(27) 11(19,6) 9(16,1)
Рання морула 93 33(35,4) 35(37,6) 12(13) 13(13,9)
Компактна морула 101 42(41,5) 25(24,7) 20(20) 14(13,8)
Рання бластоциста 41 21(51,2) 7(17,1) 6(14,6) 7(17,1)
Бластоциста,що розширюється 43 31(72,2) 3(6,9) 9(20,9) –
Розширена бластоциста 88 51(57,9) 20(23) 11(12,5) 6(6,8)
Бластоциста після вилупення 73 29(39,5) 27(37) – 17(23,3)
ВСЬОГО 497(75)
228(46)
132(27)
69(14)
66(13)

Гетерогенність розвитку ембріонів в статевих шляхах корів-донорів після гормональної обробки була підтверджена ще й тим, що на протязі одного й того ж дня статевого циклу були вилучені зародки різного віку.
На наш погляд, ембріони різних стадій розвитку, але вилучені із статевих шляхів донора на протязі одного й того ж дня статевого циклу мають різний вік, що пояснюється різноякісністю самих ембріонів, нерівномірністю процесу овуляції. Ці результати наведені на мал. 1.

Чутливість ембріонів корів до охолодження до 00С.
Отримані ембріони поміщали в термостат при температурі +370С, потім охолоджували з визначеною швидкістю до фіксованої температури, витримували визначений час і потім проводили короткочасне (24 год.) культивування in vitro.
На початку вивчення чутливості ембріонів корів різних стадій розвитку ми визначали технологічні параметри, що можуть впливати на збереженість ембріонів при охолодженні: кінцеву температуру охолодження, швидкість зниження температури, експозицію при кінцевій температурі та наявність кріопротектора.
На початку вивчення чутливості ембріонів до низьких температур ембріони (від 8-ми клітинних до бластоцист після вилуплення із зони пелюцида) охолоджували шляхом прямого переносу із термостатованої чашки Петрі при 370 С до кінцевої температури 00 С. При цьому охолодження проводилося з різною швидкістю не меншою 1600 0 С/с. Результати подані в таблиці 3.
. Таблиця 3.
Збереженість ембріонів корови при охолодженні до 00С

Кількість Кількість життєздатних ембріонів, шт./ %
Збере-
Стадія розвитку ембріонів
шт. за морфологічною оцінкою за результами культивування женість
%
8-ми дослід 6 4(67) 0(0)а 0a
клітинні контроль 4 – 3(75)b
Рання дослід 11 9(82) 5(46)b 55b
морула контроль 6 – 5(83)b
Компактна дослід 12 11(92) 9(75)b 87c
морула контроль 7 – 6(86)b
Рання дослід 10 8(80) 8(80)b 87c
бластоциста контроль 7 – 6(86)b
Бласт-та, що дослід 13 11(85) 10(77)b 100c
розширюється контроль 8 – 6(75)b
Розширена. дослід 12 10(83) 10(83)b 100c
бластоциста контроль 9 – 7 (87)b
Бластоциста дослід 6 5(83) 3(50)b 63d
після вилупл. контроль 5 4(80)b

Цифри з однаковим літерним індексом означають, що результати достовірні (P>0,95), цифри з різним літерним індексом означають, що результати не достовірні.
Для більш точного визначення температурного діапазону, в якому відбувається загибель ембріонів від температурного шоку, ми охолоджували ембріони від 8-ми клітин до компактної морули, з +370 С до +200 С (кімнатна температура). Отримані результати подані в таблиці 4.
Із даних таблиці випливає, що збереженість ембріонів всіх стадій достовірно не відрізнялась одна від одної і від контролю. Таким чином, критична температура охолодження, яка призводить до загибелі ембріонів, знаходиться в діапазоні від +20 до 00 С.
Причиною різниці в чутливості ембріонів різних стадій розвитку до різкого охолодження можуть бути фізіологічні і біохімічні відмінності ембріонів і, зокрема, відмінності в кількості та якості ліпідних компонентів цитоплазми і цитоплазматичних мембран бластомерів.
Далі ми вивчали вплив швидкості зниження температури на збереженість ембріонів.

Таблиця 4.
Збереженість ембріонів корови різних стадій при охолодженні до 200С

Стадія
Кількість Кількість життєздатних
ембріонів, шт. /% Збереженість
розвитку ембріонів, шт. за морфол
оцінкою за результатами культивування %
8-ми дослід 5 5 (100) 3 (60) 80 а
клітинний контроль 4 – 3 (75)
Рання дослід 7 7 (100) 5 (71) 86 а
морула контроль 6 – 5 (83)
Компактна дослід 8 8 (100) 7 (88) 100 а
морула контроль 7 – 6 (86)

Для дослідження цього фактору ембріони на стадіях від 8-ми клітин до компактної морули охолоджували від 370 С до 00 С з різною швидкістю (1, 10 і 30 хв.), витримували на протязі 1 хвилини при 00 С, переносили в середовище з температурою +370С, оцінювали морфологічно і культивували. Результати даного досліду подані в таблиці 5.
Таблиця 5.
Збереженість ембріонів корів різних стадій охолоджених до 00С з різною швидкістю.
Стадія розвитку Збереженість при швидкості охолодження, (%)
ембріонів 10С/ хв 100С/хв 960000/хв
8-ми дослід 17 (1/6) 0 (0/4) 0 (0/5)
клітинна контроль 75 (4/4) 75 (3/4) 75 (3/4)
Рання дослід 57 (4/7) 50 (3/6) 45 (5/11)
морула контроль 83 (5/6) 83 5/6 83 (5/6)
Компактна дослід 83 (5/6) 67 (4/6) 75 (9/12)
морула контроль 86 (6/7) 86 (6/7) 85 (6/7)

Із поданих результатів таблиці №5 випливає, що швидкість охолодження ембріонів до 00С не чинить істотного впливу на збереженість ембріонів від 8-ми клітин до компактних морул.
Наступним параметром, що може зумовлювати чутливість ембріонів, є їх експозиція при температурі 00 С. Вивчення впливу цього фактору проводилося шляхом переміщення ембріонів з фізіологічних умов у середовище з температурою 00С і експозиціях у ньому 7с., 1 та 30 хвилин, після чого ембріони оцінювали морфологічно та культивували. Результати подані в таблиці 6.
З таблиці видно, що для ембріонів на стадії компактної морули і розширеної бластоцисти рівень збереженості не залежить від експозиції. Тим часом, 8-ми клітинні ембріони витримують лише короткочасні експозиції в 33% випадках. Цей факт дозволяє припустити, що пошкоджуючу дію низьких температур на 8-ми клітинні ембріони частково зумовлює тривалість експозиції.
Таблиця 6.
Кількість життєздатних ембріонів після охолодження до 0оС при
різних експозиціях.
Стадія розвитку Збереженість ембріонів (%), при экспозиції:
ембріонів менше 7 с 1 хв 30 хв
8-ми дослід 33 (2/6) 0 (0/6) 0 (0/5)
клітин контроль 75 (3/4) 75 (3/4) 75 (3/4)
Компактна дослід 75 (6/8) 75 (9/12) 60 (6/10)
морула контроль 87 (6/7) 87 (6/7) 86 (6/7)
Розширена дослід 80 (8/10) 83 (10/12) 67 (6/9)
бластоциста контроль 78 (7/9) 78 (7/9) 78 (7/9)
Можливо, визначною умовою в цьому випадку є наявність фазових переходів складових компонентів цитоплазматичних мембран із рідкокристалічного в твердокристалічний стан. Нами була вивчена захисна дія гліцерину при різкому охолодженні ембріонів до 00 С. Ембріони на стадіях від компактної морули до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида насичували гліцерином в концентрації 1,2 М при +370 С, потім переносили в середовище з температурою танучого льоду, витримували на протязі однієї хвилини і повертали в фізіологічні умови. Після виведення гліцерину 0,5 М розчином сахарози ембріони відмивали і оцінювали якість як і в попередніх дослідах. Контрольну групу ембріонів піддавали аналогічному насиченню, однак охолодження їх не проводили (Таблиця 7).
Таблиця 7.
Збереженість ембріонів корів різних стадій насичених 1,2 М розчином
гліцерину, при охолодженні до 00С

Кількість Кількість життєздат-
них ембріонів, шт., % Збере-

Стадія розвитку ембріонів за морфолог. Оцінкою за результами культивування женість, %
Компактна дослід 10 9 (90) 7 (70) 99
морула контроль 7 6 (86) 5 (71)
Розширена дослід 9 6(100) 7 (78) 94
бластоциста контроль 6 6(100) 5 (83)
Бластоциста дослід 6 6 (100) 4 (67) 83
після вилупл. Контроль 5 5 (100) 4 (80)

Дані таблиці 7 показують, що при охолодженні ембріонів, які вивчалися, гліцерин не змінює їх збереженість на стадіях від компактної морули до стадії бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида.

Заморожування ембріонів різних стадій розвитку.
Експерименти по низькотемпературній консервації ми почали дослідом по заморожуванню ембріонів всіх стадій розвитку, що вивчалися нами, використовуючи стандартні методи. Як кріопротектор використовували гліцерин у концентрації 1,2 М. Насичення і видалення кріопротектору проводилося одноступінчато. Заморожування проводилось із використанням термоблоку, поміщеного в горловину судини Дюара. При цьому режим заморожування відповідав закону пасивного охолодження до кінцевої температури -30  2,40С.
Після видалення кріопротектору ембріони оцінювали морфологічно і поміщали на короткочасне культивування in vitro.
Ті ембріони, що зберегли життєздатність після заморожування-відтавання, пересаджувались коровам і телицям-реципієнтам нехірургічним методом. Результати досліду подані в таблиці 8.
Таблиця 8.
Збереженість ембріонів корів різних стадій після кріоконсервації.

Стадія
Кількість Кількість життєздатних
ембріонів, шт./%
розвитку ембріонів,
шт. за морфол. оцінками за результатами культивування
Рання морула 10 7 (70)а 3 (30)c
Компактна морула 12 10 (83)а 9 (75) d
Рання бластоциста 11 10 (91)а 8 (73) d
Розширена бластоциста 13 11 (85)а 10 (77) d
Бластоциста,що
розширюється 10 9 (90)а 8 (80) d
Блас-та після
вилуплення 7 3 (43)b -*

*- ембріони не культивували, а відразу пересадили реципієнтам.

Вони підтверджують, що стандартний метод заморожування є ефективним при заморожуванні ембріонів на стадіях від компактної морули до розширеної бластоцисти. Для успішного заморожування ранніх морул і далі продвинутих стадій розвитку ембріонів необхідно удосконалювати технологію кріоконсервації. В одній із спроб цього ми проводили досліди по заморожуванню ранніх морул і пізніх бластоцист корови з різною швидкістю з використанням в якості кріопротектору гліцерину в 1,2М концентрації. Різна швидкість охолодження досягалася шляхом відповідного регулювання пристрою для заморожування. Життєздатність розморожених ембріонів визначалася морфологічно та за результатами короткочасного культивування. Отримані результати наведені в таблиці 9.
Результати цього досліду свідчать про те, що швидкість охолодження не здійснює впливу на збереженість ранніх морул. Отже, для їх кріоконсервації слід шукати інші технологічні підходи. Для пізніх бластоцист спостерігається чітка тенденція підвищення збереженості при зниженні швидкості охолодження. Так, зниження швидкості заморожування до 0,150С/хв сприяло підвищенню збереженості ембріонів в 2,4 рази в порівнянні з стандартним режимом заморажування.
Таблиця 9.
Збереженість ембріонів корів при заморожуванні з різною швидкістю.

Стадія Кількість ембріонів життєздатних / заморожених, шт, охолоджених при швидкості: оС / хв
розвитку 0,6 0,3 0,15
Рання морула 2/9 (22)а  3/10 (30) а 2/8 (25) а
Бласт-та після вилупл. 0/5 (0) b 1/7 (14) b 2/6 (33) d
 в дужках вказана збереженість ембріонів, %.

Для вивчення впливу кріопротектора на збереженість цих ембріонів, ми використали гліцерин в концентраціях 1,2 М , 1,8 М і 2,4 М. Насичення кріопротектором у всіх трьох випадках проводили в один етап. Виведення гліцерину для перших двох випадків проводили в один етап у 0,5 М розчині сахарози, а для останнього випадку – в два етапа у 0,5 і 1,0 М розчинах сахарози. Заморожування проводили з середньою швидкістю 0,15 0 С / хв. Отримані результати наведені в таблиці 10.
Таблиця 10.
Вплив концентрації гліцерину на збереженість бластоцист після вилуплення при кріоконсервації.
Кількість ембріонів, шт. Кількість тільних
Концентра-
ція гліцерину, М заморо-
жених життєздат-
них після роз-ня* Збереже-
ність, % реципієтів, гол. (прижив-ть, %)
1,2 7 3 43а 0 b
1,8 7 4 57 а 1 (25) c
2,4 8 4 50 а 2 (50) d
 – всі ембріони були трансплантовані реципієнтам

Із даних таблиці 10 видно, що збільшення концентрації кріопротектора достовірно підвищує збереженість денудованих бластоцист. Звідси випливає висновок, що при використанні стандартного способу заморожування для підвищення збереженості 9-10 – денних ембріонів корів потрібно використовувати як підвищення концентрації гліцерину, так і повільні швидкості зниження температури.
Особливості транспорту води і розчинених речовин в ембріони різних стадій розвитку.
Більшість кріопротекторів, що забезпечують збереженість клітинних структур при зниженні температури, є проникаючими речовинами і для ефективного захисту ембріонів вони повинні бути присутніми в середині клітин. Неправильне використання кріопротекторів може призвести до загибелі ембріонів ще до заморожування в результаті осмотичного лізису.
У зв’язку з цим, проблема транспорту води і проникаючих речовин через цитоплазматичні мембрани ембріонів являють собою окрему і вельми важливу задачу для пояснення відмінності в чутливості до заморожування ембріонів різних стадій розвитку.
З огляду обмінних процесів бластомери 8-ми клітинних ембріонів корів знаходяться у рівноцінному становищі, тобто вся поверхня цитоплазматичної мембрани бластомера бере участь в обміні речовин .
Для багатоклітинних структур картина змінюється, так як в транспорті не задіяні міжклітинні контакти, а в клітини внутрішніх шарів таких структур речовини можуть проникати тільки через зовнішні шари. Така картина характерна для ембріонів ссавців, так як в період свого розвитку вони зазнають значних структурних змін: від одноклітинної зиготи до багатоклітинних і багатошарових денудованих бластоцист.
Ембріони до 8-ми клітинної стадії розвитку представляють собою сукупність бластомерів і всі вони знаходяться в однаковому становищі. Схематично така структура наведена на мал.2.
Дана стадія розвитку ембріонів є найсприятливішою для рівноцінного транспорту речовин до всіх бластомерів, і, очевидно, слід було б очікувати найкращих результатів при кріоконсервації таких ембріонів. Однак, як показують наші дослідження і дослідження інших авторів (Trouson A.O., Willadsen S.M., 1976), збереженість ембріонів ранніх стадій далеко не найкраща. На наш погляд це пояснюється наступним.
Зважаючи на достатньо рідкісне використання для практичного відтворення стада ранніх ембріонів корови, їх заморожують з використанням режимів, розроблених для пізніх морул і ранніх бластоцист, які, в свою чергу, широко ви
користовуються з даною метою.
Ранні стадії ембріонів істотно відрізняються від більш продвинутих стадій розвитку по проникності мембран . На стадії ранньої морули ембріони набувають двошарової структури, схематичне зображення якої наведене на мал.3.
Умови транспорту води і гліцерину для клітин зовнішнього і внутрішнього шарів істотно відрізняються. Щодо кріоконсервації це означає, що якщо режим зниження температури і спосіб застосування кріопротектора буде орієнтований на глибокорозміщені клітини, успіх при заморожуванні буде досягнутий.
На більш пізніх стадіях розвитку протікання обмінних процесів в ембріонах ще більш ускладнюється. Наявність декількох внутрішніх шарів і бластоцелі робить такий ембріон ще більш різнорідним і, очевидно, що клітини внутрішніх шарів приймають участь у транспорті речовин значно менше.
Схематично обмінні процеси протікають наступним чином:
1. Навколишнє середовище  зовнішні клітини  внутрішні бластомери.
2. Навколишнє середовище  трофобласт  бластоцель.
3. Бластоцель  внутрішні бластомери бластоцелю.
Схема будови ембріона такої стадії розвитку наведена на мал.4.
Щодо кріоконсервації це означає, що при стандартному режимі заморожування ці клітини можуть не встигнути позбутися внутріклітинної води до настання температури внутріклітинної кристалізації, що призводить до лізису в процесі розморожування.
Аналіз транспорту речовин у ембріонах був використаний нами для уточнення їх класифікації за стадіями розвитку.

Класифікація передімплантаційних ембріонів корів.
Як правило, кожна група дослідників використовує власну уточнену класифікацію. Наші дослідження проводилися на ембріонах корів, починаючи зі стадії 8 клітин до стадії вилуплення із зони пелюцида. Ці ембріони були розбиті на 7 груп.
В таблиці 11 приведена класифікація ембріонів у відповідності зі стадією розвитку, їх віком у годинах після запліднення, кількістю клітин і схемою будови. Із запропонованої нами схеми класифікації, ранні ембріони до стадії 8-ми бластомерів (рядок 1 таблиця 11) доцільно класифікувати за загальною кількістю клітин (1-клітинна – зигота; 2-х клітинна; 4-х і 8-ми клітинні ).
З огляду осмотичних процесів стадію морули доцільно розбити на дві стадії : ранної морули (16 клітин) і компактної морули (32 клітини).
У зв’язку з асинхронністю поділу клітин кількість бластомерів у зародку ми вказуємо приблизно, додержуючись точки зору, що на стадіях компактної морули і ранньої бластоцисти поділ бластомерів продовжує носити синхронний характер (рядки 3 і 4 стовпця 3, таблиця 11), щодо більш продвинутих стадій, поділ повністю носить асинхронний характер (рядки 5, 6 і 7 стовпця 3, таблиця 11.).

Стадію бластоцисти, що характеризується виникненням внутрішньої порожнини – бластоцелю, від моменту виникнення останньої до моменту вилуплення із зони пелюцида, ми розбили на 4 стадії.
Перші три з них характеризуються зміною самого бластоцелю: рання бластоциста, бластоциста, що розширюється і розширена бластоциста. Четверта зародок, що вилупився з зони пелюцида, характеризується наявністю великого розрослого трофобласту, що складається з крупних клітин, і компактного ембріобласту, із якого буде розвиватися в подальшому плід, і що складається з дрібних, щільно упакованих клітин.
Запропонована нами класифікація бластоцист, що знаходиться в зоні пелюцида, дещо відрізняється від запропонованої іншими
авторами (Schneider H.J.Jr., Castleberry R.S. Griffin J.L. 1980, Шихов І..Я. і Сергеєв І. І. 1981 ), які виділяють тільки стадію ранньої і пізньої бластоцист.
Висновки
1. Спостерігається висока вікова гетерогенність популяції ембріонів, отриманих із статевих шляхів корів, які суперовулювали на протязі одного і того ж дня статевого циклу, що пояснюється нерівномірністю процесу овуляції і різницею в часі запліднення яйцеклітин.
2. Запліднюваність яйцеклітин не залежить від дня статевого циклу донора і знаходиться в межах 74-82% , а вихід загальної кількості ембріонів достовірно не залежить від стадії розвитку, починаючи з 8-ми клітинної стадії, і коливається в межах 65-89%.
3. Чутливість ембріонів корів до різкого охолодження від 370 С до 00 С залежить від стадій їх розвитку: 8-ми клітинні ембріони не переносять швидкого охолодження. Ранні морули дуже чутливі, тому що гине більша половина зародків. Підвищеною чутливістю характеризуються і денудовані бластоцисти. Стійкість компактних морул і бластоцист в зоні пелюцида висока і достовірно не відрізняється від контролю.
4. Температура, при якій відбувається загибель ембріонів корів при різкому охолодженні і витримці на протязі 1 хв., знаходиться в диапазоні від 0 до 200 С.
5. Швидкість охолодження з 37 до 00 С в діапазоні від 10 С/хв до 960000С/хв не змінює збереженості ембріонів різних стадій розвитку.
6. Різна експозиція ембріонів при 00 С (від 7с до 30 хв), не змінює їх збереженості на стадіях від ранньої морули до розширеної бластоцисти.
7. Наявність в середовищі для заморожування кріопротектора (гліцерину) не змінює збереженість ембріонів різних стадій розвитку при різкому охолодженні.
8. При глибокому заморожуванні до температури рідкого азоту у стандартному режимі спостерігається залежність збереженості ембріонів від стадії розвитку. Зародки на стадіях від компактної морули до розширених бластоцист включно, мають однакову збереженість, яка коливається від 73 до 80%, денудовані бластоцисти не переносять стандартні режими заморожування.
9. Збільшення або зменшення швидкості заморожування в 2 рази у
порівнянні зі стандартним режимом достовірно не змінює збереженості ранніх морул. Спостерігається тенденція зростання збереженості денудованих бластоцист (від 0 до 33%) при зменшенні швидкості заморожування від 0,6 до 0,150 С / хв.
10. Збільшення концентрації гліцерину від 1,2 М до 2,4М призводить до підвищення збереженості денудованих бластоцист ( від 14 до 50%).
11. Звертаючи увагу на обмінні процеси, всі бластомери 8-ми клітинних ембріонів мають однакові умови для транспорту речовин.
12. Ембріони на стадії морули розділяють на дві стадії: ранньої і компактної морули, в залежності від кількості шарів і компактності, а на стадії бластоцисти- в залежності від розміру бластоцеля, наявності зони пелюцида і інтенсивності різноманітних обмінів речовин.
13. Всі ембріони до стадії 8-ми бластомерів включно доцільно називати за загальною кількістю клітин ( 1-клітинна-зигота; 2-х; 4-х; и 8-ми клітинні);
-стадію морули розбити на дві: рання и компактна морула;
-стадію бластоцисти розбити на стадії: ранньої бластоцисти, бластоцисти, що розширюється, розширеної бластоцисти, бластоцисти, що вилупляється із зони пелюцида, а також денудованої бластоцисти.

Пропозиції виробництву
1. Запропонована нами класифікація ембріонів корови різних стадій розвитку може бути використана у вузах для навчання студентів і підвищення кваліфікації спеціалістів, у виробничих, а також в наукових програмах.
2.При розробці методу заморожування ембріонів ссавців, режим зниження температури і спосіб застосування кріпротектору повинні бути орієнтовані на бластомери, що знаходяться в менш сприятливих умовах (глибокорозміщені), враховуючи обмінні процеси.
3. Оптимізований нами режим зниження температури (0,150 С / хв) і концентрація кріопротектора (2,4М.) можуть бути застосовані при створенні кріобанку ембріонів корів на стадії розвитку денудованих бластоцист з метою їх подальшого використання в біотехнології відтворення великої рогатої худоби.

Список опублікованих робіт по темі дисертації
1. Безуглый Н.Д. Мауссе Ф.С. Устойчивость эмбрионов коровы различных стадий развития к резкому охлаждению // Науково-технічний бюллетень №75, Харків, 1998. -C.166-170. Здобувач приймав участь у проведенні всієї експериментальної та розрахункової частини роботи, а гіпотези, що обгрунтовують одержані результати, були запропоновані науковим керівником.
2. Мауссе Ф.С. Особенности транспорта воды и растворенних веществ в и из эмбрионов коров различних стадий развития // Науково-технічний бюллетень №75, Харків. -1998. -C.171-174.
3. Мауссе Ф.С. Изменение сохранности эмбрионов коровы ранних стадий развития при разных скоростях охлаждения и временах их экспозиции при 00С // Проблеми Зооінженерії та Ветеринарної Медицини № 4, Харків. -1998. -С.68-70.
4. Мауссе Ф.С Медведовский А.В. Кисиль А.В. К вопросу о классификации предимплантационных эмбрионов коровы // Науково-технічний бюллетень №75, Харків. -1998. -C.175-178. Удосконалення принципа класифікації ембріонів корів було запропоновано автором особисто. А обговорення цього принципу проведено колективом співавторів.
5. Мауссе Ф.С. Кобринович Ф.Н. Замораживание эмбрионов коровы на стадиях ранних морул и денудированных бластоцист // ‘’Вісник Проблем Біології і Mедицини’’ № 10, Українська Медична Стоматологічна Академія.-1999. -C.24-28. Здобувачом та співавтором проведено заморажування ембріонів корів і обговорення іх результатів.
6. Мауссе Ф.С. Устойчивость эмбрионов крупного рогатого скота к воздействию низких температур // Теория и практика племеного дела в животноводстве. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения члена-корреспондента ВАСХНИЛ Эйснера Федора Федоровича, Харків. -1996. -С.70-71.

Annotation
Mausse Francisco Salomao. Cryosensitivity of bovine embryos on its different developmental stages. – Manuscript.
Thesis for a Ph.D. degree in agrarian sciences by speciality 03.00.20 – biotechnology – postgraduate of the institute of Animal Science of UAAS, Kharkov, 1999.
Dissertation work served the development of bovine embryos cryopreservation studies, creation of effective cryopreservative methods for embryos of later stages.
On the basis of obtained results was established, that after hormonal cow treatment for superovulation, its flushing results on high age embryos, disparity, which is probably caused by unsynchronized process of ovulation and different fertility length of cows. There was established too, that embryos, cryoresistance rises on the dependence of their age; the level of substance exchange between embryos and their surounding environment differs according to their age, fact which has to be taken under consideration by specialists.
There was optimized cryopreservative regimen for 9-10 days embryos. There was propoused a new system of embryos, classification according to their age and level of substance exchanges. Basic results of the work received practical attachment for the management in the above mentioned institution and in the Ahtirskii laboratory for embryo transplantation.
Key words: cow embryo, different developmental stages, cryopreservation.

АНОТАЦІЯ
Мауссе Франсіско Саломон. ‘’Чутливість ембріонів великої рогатої худоби різних стадій розвитку до дії низьких температур‘’. -Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20- біотехнологія. -Інститут тваринництва УААН, Харків, 1999. Дисертація присвячена вивченню чутливості до дії низьких температур ембріонів корів різних стадій розвитку і розробці режимів заморожування ембріонів пізніх стадій розвитку. Встановлено, що при вимиванні оброблених з метою отримання реакції суперовуляції корів, спостерігається висока вікова гетерогенність популяцій ембріонів, отриманих із статевих шляхів корів на протязі одного статевого циклу.
Стійкість ембріонів корів різних стадій розвитку до дії низьких температур з віком зростає. Рівень обміну води і розчинених в ній речовин різний для ембріонів корів різних стадій розвитку, що повино бути враховано біотехнологами. Були оптимізовані режими заморожування ембріонів на стадії денудованих бластоцист. Була запропонована нова класифікація ембріонів у залежністі від стадій розвитку і відповідного рівня обмінних процесів.
Результати роботи знайшли застосування у вищевказаному інституті і в Охтирській лабораторії трансплантації ембріонів.
Ключові слова: ембріони корів, різні стадії розвитку, заморожування.

АННОТАЦИЯ
Мауссе Франсиско Саломон. ‘’ Чувствительность эмбрионов крупного рогатого скота разных стадий развития к воздействию низких температур‘’. -Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20- биотехнология. – Институт Животноводства УААН, Харьков, 1998. Диссертация посвящена изучению чувствительности к воздействию низких температур эмбрионов коров разных стадий развития и усовершенствованию режимов замораживания эмбрионов на стадиях поздних морул ранних и бластоцист, для замораживания эмбрионов ранних морул и денудированных бластоцист, усовершенствованию системы классификации предимплантационных эмбрионов коров.
Данная работа основана на том факте, что современная биотехнология воспроизведения сельскохозяйственных животных предполагает использование эмбрионов коров различных стадий развития. Кроме того эффективность применения новейших методов размножения животных (определение пола, получение химер, эмбриональных клонов, традиционная трансплантация эмбрионов и др.) возрастает с учетом наличия банка замороженных эмбрионов.
Замораживание эмбрионов этого вида животных на стадиях ранних морул и денудированных бластоцист с использованием традиционных методов, было проведено разными авторами. Полученные ими результаты показали низкий уровень сохранности замороженно-оттаянных эмбрионов, по сравнению с таковыми, полученными при замораживании эмбрионов поздних морул и ранних бластоцист (6,5-8 суточные бластоцисты).
При замораживании эмбрионов на стадиях денудированных бластоцист с использованием стандартных методов, эмбрионы не успевают пройти процесс дегидратации к периоду формированию внутриклеточных кристаллов льда. Это явление приводит к образованию разных форм кристаллов льда внутри клеток, что приводит к лизису эмбриона во время оттаивания, так как при этом имеет место так называемый процесс рекристаллизации.
Причина низкой сохранности точно не определена, но предполагается, что биохимия, физиология и способности замораживаемых зародышей разных стадий развития к дегидратацию, играют существенную роль в их ответной реакции на воздействие низких температур. Данные гипотезы вытекают из-за того, что чувствительность эмбрионов разных стадий развития к охлаждению и замораживанию отличается.
Ранее разработанные методы замораживания эмбрионов млекопитающих эффективно применяются строго для замораживания эмбрионов определенных стадий развития.
В связи с тем, что в разных лабораториях, занимающихся манипуляцией с эмбрионами, используется определенная система классификации эмбрионов, возникла необходимость уточнить систему классификации, принимая за основу ранее проведенную другими авторами. Важно отметить, что проведена нами классификация была предполагаемая с учетом возраста эмбрионов и интенсивности протекания обмена воды и криопротектора. Классификация эмбрионов с учетом уровня протекания осмотических процессов имеет большое значение при проведении их замораживания, так как прогнозировать уровень сохранности и предлагать режимы их замораживания возможно только с учетом их возрастов.
Установлено, что при вымывании эмбрионов доноров, обработанных на суперовуляцию, наблюдается высокая возрастная гетерогенность популяции эмбрионов, полученных из половых путей коров на протяжении одного полового цикла; устойчивость эмбрионов разных стадий развития к воздействию низких температур возрастает с возрастом. Уровень протекания обмена воды и растворенных в ней веществ (криопротектор) разный для эмбрионов коров разных стадий развития, что должно быть учтено биотехнологами при предварительном прогнозировании результатов замораживания эмбрионов. Установлено, что замораживание эмбрионов на стадии денудированных бластоцист со скорость 0,150С/м и 2,4М глицерина в качестве криопротектора, может повысить уровень сохранности на 50%. Таким образом, этот режим замораживания является оптимальным для эмбрионов денудированных бластоцист. Была предложена новая классификация эмбрионов в зависимости от стадий развития и соответствующего уровня протекания осмотических процессов.
Замораживание эмбрионов на стадии ранних морул не результативно при всех попытках нами проведены: ни увеличение концентрации криопротектора (1,2М, 1,8М и 2,4М), ни снижение скоростей замораживания (0,60С/мин, 0,30С/мин и 0,150С/мин ) не привели к повышению уровня их сохранности. Очевидно, для результативного замораживания эмбрионов этих стадий развития необходимо применять другие нетрадиционные подходы.
Результаты работы нашли применение в вышеуказанном институте и в Ахтырской лаборатории трансплантации эмбрионов. Ключевые слова: эмбрионы коров, разные стадии развития, замораживание.
Анотація
Мауссе Франсиско Саломон. “Чутливість ембріонів великої рогатої худоби різних стадій розвитку до дії низьких температур. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступення кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут тваринництва УААН, Харків, 1999.
Дисертація писвячена вивчення чутливості до дії низьких температур ембріонів корів різних стадій розвитку і розробці режимів заморожування ембріонів різніх стадій розвитку. Встановлено, що при вимиванні опроблених з метою отримання реакції супервоуляції корів, спостеригаєтья висока віков гетерогенність популяцій ембріонів, отриманих із статевих шляхів корів на протязі одного статевого циклу.
Стійкість ембріонів різних стадій розвитку до дії низьких температур з виком зростає. Рівень обміну води і розчинених в ній речовин різний для ембріонів корів різних стадій розвитку, що повидно буті враховано біотехнологам. Були оптимізовані режими заморожування ембріонів на стадії денудованих бластоцист. Була запропонована нова класифікація ембріонів у залежністі від стадій розвитку і відповідного рівня обмінних процесів.
Результати роботи знашли застосування у вищевказаному інституті і в Охтирській лабораторії трансплантації ембріонів.
АННОТАЦИЯ
Мауссе Франсиско Саломон. “Чувствительность эмбрионов крупного рогатого скота разных стадий развития к воздействию низких температур”. -Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. – Институт животноводства УААН, Харьков, 1999. Дисссертация посвящена изучению чувствительности к воздействию низких температур эмбрионов коров разных стадий развития и усовершенстованию режимов замораживания эмбрионов на стадиях поздных морул и ранних бластоцист, для замораживания эмбрионов ранних морул и денудированных бластоцист; усовершенствование систему классификации предимплантационных эмбрионов коров.
Данная работа основана на том, что современная биотехнология воспроизведения сельскохозяйственных животных предполагает использование эмбрионов коров различных стадий развития. Кроме того эфективность применения новейших методов размножения животных (определение пола, получение химер, эмбриональных клонов, традицонная трансплантация эмбрионов и др.) возрастает с учетом наличия банка замороженных эмбрионов.
Замораживание эмбрионов этого вида животных на стадиях ранних морул и денудированных бластоцист с использованием традиционных методов, было проведено разными авторами. Полученные ими результаты показали низкий уровень сохранности замороженно-оттаянных эмбрионов, по сравнению с таковыми, полученными при замораживании эмбрионов поздных морул и ранних бластоцист (6,5 –8 суточные бластоцисты).
При замораживании эмбрионов на стадиях денудированных бластоцист с использованием стандартных методов, эмбрионы не успевают пройти процесс дегидратации к периоду формирования внутрикристаллов льда. Это явление приводит к формированию разных форм кристаллов льда внутри клеток, что заканчивается лизисом эмбриона во время оттаивания, так как при этом имеет место так называемый процесс рекристаллизации.
Причина получения низкой сохранности точно не определена, но предполагается, что биохимия, физиология и способности замораживаемых зародышей разных стадий развития к дегидратацию, играют существенную роль в их ответную реакцию на воздействие низких температур. Данные гипотезы вытекают из-за того, что чувствительность эмбрионов разных стадии развития к охлаждению и замораживанию отличается.
Ранее разработанные методы замораживания эмбрионов млекопитающих эффективно применяются строго для замораживания эмбрионов определенных стадий развития.
В связи с тем, что в разных лабораториях занимающихся манипуляцией с эмбрионами, используетия определенная система классификации эмбрионов, возникла необходимость уточнить систему классификации, принимая за основуранне проведенную другими авторами. Важно отметить, что проведена нами классификация была предполагаемая с учетом возраста эмбрионов, и интенцивности протекания обмена воды и криопротектора. Классификация эмбрионов с учетом уровня протекания осмотических процессов имеет большое значение при проведении их замораживания, так как прогнозировать уровень и предлагать режимы их замораживания возможно только с учетом этого параметра.
Установлено, что при вымывании эмбрионов доноров, обработанных на суперовуляцию, наблюдается высокая возрастная гетерогенность популяции эмбрионов, полученных из половых путей коров на протяжении одного полового цикла; устойчивость эмбрионов разных стадий развития к воздействию низких температур возрастает с возрастом. Уровень протекания обмена воды и растворенных в ней вешществ (криопротектор) разный для эмбрионов разных стадий развития, что должен быть учтено биотехнологами при предварительном прогнозировании результатов замораживании эмбрионов. Установлено, что замораживание эмбрионов на стадии денудированных бластоцист со скоростью 0,150С/мин и 2,4 М глицерина в качестве криопротектора может повысить уровня сохранности на 50%. Таким образом, этот режим замораживания явлается оптимальным для эмбрионов на стадии денудированных бластоцист.
Замораживание эмбрионов на стадии ранних морул не результативно при всех попытках нами проведены: ни увеличение концентрации криопротектора (1,2 М; 1,8М и 2,4М), ни снижение скоростей замораживания (0,60С/мин, 0,3С0/мин и 0,15С0/мин) не привели к повышению уровня их сохранности. Очевидно, что для результативного замораживания эмбрионов этих стадий развития необходимо применять другие нетрадиционные подходы.
Результаты работы нашли применение в вышеуказанном институте и в Ахтырской лаборатории по трансплантации эмбрионов.

ANNOTATION
Mausse Francisco Salomao. Cryosensitivityof bovine embryos on its different developmental stages. – Manuscript.
Thesis for a Ph.D. degree in agrarian sciences by speciality 03.00.20 – biotechnology – posgraduate of the institute of Animal Science under the power of UAAS, Kharkov, 1999.
Dissertation work served the development of bovine embryos cryopreservation studies, creation of effective cryopreservative methods for embryos of late stages.
On the basis of obtained results was established, that after hormonal cow treatment for superovulation, its flushing results on high age embryo disparity,which is probably caused by unsynchronized process of ovulation and diffrent fertility lenght of cows. There was established too, that embryos’ cryoresistance rises on the dependence of their age, the level of substance exchange between embryos and their sorounding environment differs according to their age, fact which has to be taken under consideration by specialists.
There was optimized cryopreservative regimen for days 9-10 embryos. There was propoused a new system of embryos’ classification according to their age and level of substance exchanges. Basic results of the work has recieved practical attachment for the management in the above mentioned institution and in the Ahtirskii laboratory for embryo transplantation.

Підписано до друку 12.05.1999
Обсяг1,0 д.а. Тираж 100 єкз.
Ротопринт Інституту тваринництва, Харьков, п/о Кулиничі, 312120
тел. 95-31-81

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020