БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КУШНІР ІГОР МИХАЙЛОВИЧ

УДК 575:577:619

Біотехнологія отримання пробіотика споробак та його застосування при
відлучці поросят

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Біла Церква – 2004 Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Державному науково-дослідному контрольному інституті
ветеринарних препаратів та кормових добавок (ДНДКІ ветпрепаратів та
кормових добавок) Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук Коцюмбас Ігор Ярословович,
Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів
та кормових добавок, директор

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Рухляда Валентин Васильович, Білоцерківський державний аграрний
університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та зоології,
дійсний член Нью-Йоркської АН

доктор сільськогосподарських наук

Шаловило Степан Григорович, Інститут біології тварин, головний науковий
співробітник лабораторії біології відтворення

Провідна установа – Державний науково-дослідний контрольний інститут

біотехнології штамів мікроорганізмів

Захист відбудеться 02.06.2004 року о 13 год на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 27.821.01 у Білоцерківському державному
аграрному університеті за адресою:

Соборна площа, 8/1, м. Біла Церква, Київська область, Україна 09117

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Білоцерківського
державного аграрного університету за адресою: Соборна площа, 8/1, м.
Біла Церква, Київська область, 09117.

Автореферат розісланий 30.04.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.В. Малина

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Головним напрямком розвитку біотехнології в
сільському господарстві є створення за допомогою мікробіологічних,
біохімічних, молекулярно-генетичних методів технологічних процесів для
одержання нових мікроорганізмів, лікувально-профілактичних препаратів,
добрив тощо. За прогнозами спеціалістів ООН до 2010 року світовий ринок
біотехнологічної продукції в грошовому еквіваленті становитиме близько
350 млрд доларів, із них 12,2 % продукція сільськогосподарського
призначення.

Інфекційні хвороби молодняку сільськогосподарських тварин знижують
продуктивність галузі і значно збільшують собівартість продукції.
(Смирнов В.В., Підгорський В.С., Іутинська Г.О., 2002).

Незважаючи на те, що зусилля спеціалістів ветеринарної медицини
спрямовані на проведення вакцинацій тварин проти збудників кишкових
інфекцій, вдосконалення схем застосування відомих і пошук нових
антибіотиків, захворюваність та загибель молодняку, від
шлунково-кишкових інфекцій залишаються високими (Малик Н.И., Панин А.Н.,
2001).

Застосування антибіотиків та хіміопрепаратів для лікування та
профілактики шлунково-кишкових захворювань у багатьох випадках не дає
позитивних результатів, а в окремих навпаки — породжує ряд проблем. Це,
в першу чергу, поява антибіотико-резистентних штамів та порушення
кишкового мікробного балансу, вироблення у тварин стійкого
імунодефіциту, який знижує ефективність імунізації. Антибіотикотерапія
часто є безсилою при ліквідації збудників кишкових інфекцій, що
призводить до появи великої кількості бактеріоносіїв, виникнення
клінічних і субклінічних форм захворювання (Панин А.Н., Малик Н.И.,
1995).

Розлади шлунково-кишкового тракту поросят зумовлені багатьма чинниками
як інфекційного, так і неінфекційного характеру. Проте, головною
причиною цих розладів є відлучення поросят і переведення їх на
самостійну годівлю, особливо при висококонцентратних раціонах, в
результаті чого розвивається коліінфекція у ентеротоксемічній формі
(Євтушенко А.Ф., 2002), яка супроводжується змінами кількісного та
видового складу мікрофлори травного тракту. В першу чергу, зменшується
чисельність облігатних видів мікроорганізмів, а також збільшується
кількість умовно-патогенних бактерій родів (протей, клостридії,
клебсіели, ешерихії), які є етіологічними чинниками при ентеритах
молодняку (Москаленко О.І, 1997), причому особливе місце займають
лактозонегативні, з пониженою ферментативною здатністю, штами кишкової
палички (Бовкун В.Ф., Семенихина В.Ф., Ткачев Н.Д., 1999).

Тому питання пошуку нових ефективних шляхів лікування носіїв патогенних
мікроорганізмів одне з найважливих у сучасній ветеринарній медицині.
Найбільш виправданим, з екологічних позицій, методом санації
бактеріоносіїв та збудників кишкових інфекцій є застосування
бактеріальних препаратів з живих мікроорганізмів, здатних проявляти
антагоністичну і конкурентну дію по відношенню до патогенних мікробів
(Е.М. Горская, 1983). Основне призначення пробіотичних препаратів –
захист нормальної кишкової мікрофлори через стимуляцію росту ендогенної
популяції корисних бактерій, або через внесення в кишечник ряду корисних
бактерій, шляхом регулярного застосування. Проте, на сьогодні
використання в лікувальній практиці різних препаратів з живих мікробів
не забезпечує достатнього профілактичного і лікувального ефекту та
нерідко проявляється лише в стабілізації нормальної мікрофлори кишечнику
без витіснення патогенних представників (В.В. Поспелов, 1983). Тому,
селекція, розробка і впровадження пробіотичних препаратів є
пріоритетними напрямками у ветеринарії всіх високорозвинених країн з
промисловим веденням тваринництва.

Пробіотичні препарати є одними з найбільш екологічно чистих. Вони не
викликають привикання зі сторони патогенної мікрофлори і не
нагромаджуються в органах та тканинах, не дають побічних ефектів, не
шкідливі для людини і навколишнього середовища.

Проте, для більш успішної роботи, з метою профілактики і лікування
кишкових захворювань, необхідний пошук і виділення мікроорганізмів, які
здатні не тільки відновити нормальну мікрофлору, але й пригнітити ріст
патогенних ентеробактерій. Найбільш придатні для цієї мети
спороутворюючі аеробні мікроорганізми, які є продуцентами
біологічно-активних речовин. Ці мікроорганізми, завдяки високим
адаптивним можливостям, широко розповсюджені у природі та в значній
кількості надходять до макроорганізму, а оскільки вони стійкі до
літичних та травних ферментів, зберігають життєздатність у
шлунково-кишковому тракті (Смирнов В.В., 1982).

Виділення і селекція спороутворюючих мікроорганізмів роду Bacillus з
кишечнику здорових поросят, придатних для боротьби з персистуючою
патогенною ентеробактеріальною флорою, а також розробка нових
пробіотичних препаратів є перспективним напрямом наукових досліджень
сьогодення.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота є частиною наукової тематики сектору бактеріологічного контролю
ветпрепаратів та кормових добавок ДНДКІ ветпрепаратів та кормових
добавок: “Розробити та впровадити методи контролю при виробництві
препаратів на основі спороутворюючих аеробних бактерій із роду Bacillus
(держреєстрація №1 А 01002790) впродовж 1992–2002 років.

Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи була розробка пробіотичного
препарату на основі аеробних спороутворюючих мікроорганізмів для
профілактики та лікування дисбактеріозів поросят у період відлучки та
розробка технічних умов і настанови щодо його застосування.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

— виділити із кишечнику здорових поросят аеробні спороутворюючі
мікроорганізми роду Bacillus;

— виявити найбільш ефективний штам, придатний для розробки пробіотика;

— розробити соляно-сироваткове середовище для промислового культивування
штаму;

— розробити новий пробіотичний препарат „Споробак”;

— вивчити нешкідливість споробаку;

— встановити ефективність споробаку;

— розробити нормативну документацію на споробак.

Об`єкт дослідження – технологія отримання та використання споробаку як
засобу для профілактики та лікування розладів шлунково-кишкового тракту
у період відлучки поросят.

Предмет дослідження – споробак, встановлення оптимальних доз, визначення
нешкідливості, технологія виготовлення, лабораторні тварини, музейні та
польові штами мікроорганізмів, поросята.

Методи дослідження – мікробіологічні, гематологічні, імунологічні,
математично-статистичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично обґрунтовано та
експериментально доведено доцільність створення нових пробіотиків на
основі аеробних спороутворюючих мікроорганізмів. Вперше в Україні
розроблено пробіотик на основі Bac. maсquariensis. Для культивування
пробіотика запропоновано нове соляно-сироваткове середовище з внесенням
у його склад сульфату марганцю, що збільшує вихід біомаси. Встановлено
ефективність препарату при лікуванні розладів шлунково-кишкового тракту
у поєднананому застосуванні з антибіотиком. Розроблено технологію
застосування даного препарату. Встановлено ефективність споробаку з
профілактичною метою в період відлучки поросят, позитивний вплив його на
відновлення мікрофлори кишечнику після застосування антибіотиків.
Вивчений вплив споробаку на гематологічні, імунологічні показники крові
та прирости поросят.

Практичне значення одержаних результатів. На основі отриманих
результатів розроблені та затверджені технічні умови на виготовлення
споробаку, де подані єдині норми та вимоги до показників якості
препарату, а також методи дослідження цих показників, вимоги до
маркування, пакування, транспортування, зберігання. Розроблено настанову
з його застосування, де подається опис фармакологічних властивостей,
дозування, протипоказання, застереження до застосування. Результатами
дослідженнями доведено позитивний вплив споробаку на стабілізацію
мікрофлори кишечнику, гематологічні та імунологічні показники крові;
встановлено ефективність споробаку при відлученні поросят, а також після
антибіотикотерапії з метою відновлення нормофлори кишечнику.

Особистий внесок здобувача. Весь обсяг робіт за темою дисертаційної
роботи, а саме: аналіз літературних джерел, підбір методів та методик,
експериментальні дослідження, статистична обробка, обґрунтування та
аналіз отриманих результатів, проводився здобувачем особисто. Програма
наукових досліджень розроблялася разом з науковим керівником. Здобувач
брав безпосередню участь у розробці технічних умов, методичних
рекомендацій по виготовленню споробаку та настанови з його застосування.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на річних
звітах Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних
препаратів та кормових добавок (1992–2002 рр.), на заключних звітах
засіданнях науково-методичної ради Державного департаменту ветеринарної
медицини Міністерства аграрної політики України (1995 р.), міжнародній
науково-практичній конференції “Актуальні проблеми ветеринарної медицини
в умовах сучасного ведення тваринництва” (Феодосія, 2003), міжнародній
науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Молоді
вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2003),
міжнародній науково-практичній конференції за участю України, Румунії,
Молдови з питання прикордонного співробітництва ”Стан та розвиток
агропромислового виробництва в межах Єврорегіону Верхній Прут”
(Чернівці, 2003), науково-практичній конференції молодих вчених і
спеціалістів ”Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем
тваринництва” (Львів, 2003).

Публікації. Основні положення і результати досліджень опубліковані у 8
наукових працях, з них 5 у фахових виданнях. За результатами роботи
розроблені та затверджені технічні умови України, настанова по
застосуванню та методичні рекомендації з виготовлення споробаку.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, загальної методики та основних методів дослідження,
результатів досліджень, узагальнення результатів досліджень, висновків,
пропозицій виробництву, списку використаної літератури та додатків.

Робота викладена на 140 сторінках комп’ютерного набору. Список
літератури включає 279 джерел. Дисертація містить 39 таблиць, 6 рисунків
та 4 додатки.

ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальна частина роботи виконана в лабораторіях ДНДКІ
ветпрепаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики
України, акредитованих у системі УкрСЕПРО як Випробувальний Центр.
Науково-господарські досліди та виробничі випробування проведені у
господарствах Львівської області.

Виділення та ідентифікацію спороутворюючих аеробних мікроорганізмів
здійснювали за багатоступеневою схемою, яка включала початкові посіви на
середовища для виділення аеробів із наступним висівом на селективні
поживні середовища. Ідентифікацію бактерій проводили згідно методичних
рекомендацій з виділення та ідентифікації бактерій роду Bacillus із
організму людини і тварини (Смирнов В.В. із співавт., 1983), а також
визначника бактерій Берджі (1997).

Визначення патогенності мікроорганізмів проводили за показниками
вірулентності, токсигенності, гемолітичної активністі, фібринолітичних
властивостей, а також вивчали властивість до персистенції на білих мишах
за методикою Биргер М.О. (1982).

Для визначення антагоністичної активності бактерій застосовували метод
дифузії в агарі з використанням циліндриків (Егоров Н. С., 1965). Для
цього досліджуваний штам вирощували на МПБ протягом 3 діб при
температурі 370 С, після чого МПБ вивільняли від мікроорганізмів шляхом
фільтрації.

До 10 мл 1,5% охолодженого до 450С МПА вносили 1 мл одномільярдної
суспензії тест-мікроба і розливали в чашки Петрі. Після застигання агару
на підсушену поверхню викладали стерильні циліндрики, куди вносили по
0,1 мл фільтрату 3 добової культури досліджуваного штаму – антагоніста.
Чашки Петрі інкубували в термостаті при температурі 370С протягом доби.

Визначення чутливості бактерій до антибактеріальних препаратів проводили
методом дисків, просякнутих антибіотиками (Биргер М.О., 1982).

Визначення антилізоцимної активності мікроорганізмів проводили за
методикою Бухаріна О.В. із співавт (1984).

Адгезивні властивості мікроорганізмів визначали за методикою Брілліс
В.І. (1986).

Нешкідливість споробаку визначали за галузевим стандартом ГСТУ
46.024-2002 „Препарати ветеринарні. Методи визначення нешкідливості”.

Дослідження з вивчення ефективності застосування споробаку з
терапевтичною метою проводили на відлучених поросятах 1,5-місячного віку
живою масою близько 13 кг в господарствах Львівської області. Дослідні
тварини, в яких відмічалися розлади шлунково-кишкового тракту розділили
на 4 групи – контрольну та 3 дослідні.

Тварини всіх груп отримували раціон, збалансований згідно норм годівлі з
урахуванням їхнього віку та маси. Тваринам першої контрольної групи
ніяких препаратів не застосовували. Поросятам другої групи застосовували
споробак у концентрації 2 млрд м.т./мл у дозі 10 мл/кг живої маси,
кратність застосування 2 рази на добу протягом 10 діб, тваринам третьої
групи вводили одночасно тетрациклін у дозі 15 тис. од. на 1 кг живої
маси (5 діб) та споробак у дозі 10 мл/кг живої маси (2 млрд м.т./мл),
кратність застосування 2 рази на добу протягом 10 діб, тваринам
четвертої групи – тетрациклін в дозі 15 тис. од. на 1 кг живої маси.

Тваринам всіх дослідних груп препарат вводили разом з кормом.
Спостереження за тваринами проводили протягом 10 діб. Показником
ефективності застосування споробаку з терапевтичною метою була кількість
поросят, що вижила у всіх групах.

Вивчення ефективності застосування препарату з профілактичною метою в
період відлучки поросят, були проведені на тваринах 1,5-місячного віку,
розділених на 4 групи – контрольну та 3 дослідні.

Тваринам першої контрольної групи споробак не застосовували, а в
дослідних групах його застосовували в концентрації 2 млрд м. т./мл у
різних дозах: поросятам другої групи у дозі 1 мл/кг, третьої – 5 мл/кг
та четвертої – 10 мл/кг живої маси двічі на день, протягом 10 діб. При
проведенні дослідів враховували живу масу, середньодобові прирости та
кількість тварин, що захворіли. Зважування поросят проводили на початку
досліду та через місяць.

При визначенні ефективності застосування споробаку у тварин дослідних та
контрольних груп відбирали кров. Гемоглобін визначали
гемоглобін-ціанідним методом (з ацетонціангідрином), підрахунок
еритроцитів та лейкоцитів проводили в камері Горяєва (Кондрахін І.П. із
співав., 1985)

Бактерицидну, лізоцимну активність сироватки крові, фагоцитарне число та
фагоцитарний індекс визначали згідно методичних рекомендацій з
імунологічного контролю ветеринарних лікарських засобів (Косенко М.В. із
співав., 2002).

Визначення економічної ефективності застосування споробаку проводили
згідно методики Левківського Д.М., Олексюка І.І., Грицика Т.М. (1996).

Отримані цифрові дані результатів досліджень обробляли статистично
згідно методики КононенкаВ.К., Ібатуліна І.І., Патрова В.С. (2000).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення мікробіологічних параметрів конструювання споробаку

Головна вимога до пробіотиків при їх конструюванні проявляти виражену
антагоністичну дію до патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів та
не впливати негативно на нормальну мікрофлору кишечнику, зберігати
життєздатність при проходженні шлунково-кишкового тракту, не проявляти
токсигенних властивостей, зокрема, при введенні великих доз мікробних
клітин. Тому, особливу увагу ми приділили мікробіологічним параметрам
безпечності штаму, відібраного у склад споробаку.

На першому етапі роботи було виділено із кишечнику здорових поросят 74
штами аеробних спороутворюючих мікроорганізмів роду Bacillus. Виділення
та ідентифікацію проводили за багатоступеневою схемою, включаючи
початкові посіви на середовища для виділення аеробів із наступним
пересівом на селективні поживні середовища. За видовою належностю
виділені спороутворюючі мікроорганізми представлені на рис. 1.

Рис.1 Видова належність спороутворюючих мікроорганізмів, виділених із
кишечнику здорових поросят

Як видно з рис. 1, видовий склад спороутворюючих мікроорганізмів,
виділених з кишечнику здорових поросят, різноманітний, проте, найбільш
чисельною була група Bac. subtilis. Лише одним видом представлені
наступні бактерії: Bac. firmus, Bac. macquariensis, Bac. psycrophilus.

З метою виявлення найбільш ефективного штаму, придатного для
конструювання пробіотика ми провели вивчення антагоністичної,
антилізоцимної, протективної, адгезивної властивостей виділених штамів.

Вивчення антагоністичних властивостей виділених аеробних спороутворюючих
мікроорганізмів проводили відносно грамнегативних та грампозитивних
мікроорганізмів. Визначення антагоністичної активності відносно
грамнегативних ентеробактерій, проводили на музейних та польових штамах:
E. coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniаe, Enterobacter
cloacаe. Результати досліджень показали, що дослідні спороутворюючі
мікроорганізми антагоністично впливали на ентеробактерії. Проте,
відсоток антагоністично-активних бактерій по відношенню до тест-мікробів
складав всього 1,8–7,8%.

При вивченні антагоністичної дії спороутворюючих аеробних
мікроорганізмів на грампозитивну кокову мікрофлору (St. aureus,
Streptococcus hаemolyticus, Streptococcus pyogenes) встановили, що вона
була незначною.

Із високоактивних аеробних спороутворюючих штамів були відібрані два:
Bac. macquariensis та Bac. subtilis, які виявились найбільш активними
відносно досліджуваних тест-мікробів. При вивченні порівняльної
антагоністичної дії даних штамів та пробіотиків колібактерину,
лактобактерину і бактисубтилу було встановлено, що антагоністична
активність Bac. macquariensis виявилась вищою, ніж у досліджуваних
пробіотиків та штаму Bac. subtilis.

На наступному етапі вивчили антилізоцимну активність мікроорганізмів.
Вона є „малим фактором” патогенності і відображає персистентні
властивості мікроорганізмів. Проведені нами дослідження при спільному
культивуванні Bac. macquariensis із ентеробактеріями виявили здатність
до зменшення антилізоцимної активності у останніх. Зокрема, через 48
годин спільного культивування антилізоцимна активність у S. enteritidis
зменшилась у 2,2 рази, S. typhimurium 005 – у 2,3рази, Klebsiella
pneumoniаe – у 1,7рази, S. typhimurium 110 – у 1,7 рази, E. coli O8 –
1,7 рази, Р < 0,001. Враховуючи, що антилізоцимна активність визначає персистентні властивості мікроорганізмів, ми встановили вплив Bacillus macquariensis на терміни перебування сальмонел у організмі мишей, експериментально заражених Salmonella typhimurium штам 110. Результати досліджень подано на рис. 2. Рис. 2 Вплив Bac. macquariensis на терміни перебування S. typhimurium в організмі білих мишей Матеріали рисунку 2 свідчать про те, що S. typhimurium штам 110 до спільного культивування з культурою Bac. macquariensis мав високий рівень антилізоцимної активності (8 мкг) і тривалий час висівався з органів мишей: із вмістимого кишечнику– до 35 діб, печінки – до 21 доби, селезінки і нирок – до 14 діб, крові – до 3 діб. Після спільного культивування штам S. typhіmurium з антилізоцимною активністю 4,6 мкг, висівався з органів інфікованих тварин: вмістимого кишечнику – до 21 доби, печінки – до 14 діб, селезінки і нирок– 7діб, із крові висівався протягом доби. При вивченні адгезивних властивостей досліджуваного штаму Bac. macquariensis та пробіотиків бактисубтилу, колібактерину було встановлено, що ступінь пригнічення адгезивної здатності під час спільного культивування з ентеробактеріями більш виражений у Bac. macquariensis. Так, при культивуванні з Klebsiella pneumoniаe її адгезивна здатність зменшується у 1,3 рази (Р < 0,01), із S. typhimurium – у 1,3 рази (Р < 0,001), із E. coli O8 у – 1,2 рази (Р < 0,01). Таким чином встановлено, що штам Bac. macquariensis при спільному культивуванні з ентеробактеріями здатний пригнічувати адгезивну властивість, та знижувати здатність ентеробактерій фіксуватися до клітин кишечнику макроорганізму. Не менш важлива увага приділяється визначенню протективної дії виділених аеробних спороутворюючих мікроорганізмів. З цією метою було проведено експериментальне зараження білих мишей культурою E. coli O8. Із проективною метою мишам вводили культури Bac. macquariensis, Bac. subtilis та пробіотики лактобактерин і бактисубтил. Найбільш виражений протективний ефект проявляла Bac. macquariensis – відсоток виживання білих мишей становив 70%, при застосуванні Bac. subtilis – 60%, пробіотика бактисубтил – 65%. Пробіотик лактобактерин мав найменший вплив на перебіг експериментальної інфекції при зараженні E. coli O8, відсоток виживання білих мишей становив 53%. Виділений з кишечнику поросят штам Bac. macquariensis, проявляв високу антагоністичну активність, здатність знижувати антилізоцимну активність у ентеробактерій, зменшувати їх термін перебування в організмі, пригнічувати адгезивну властивість при спільному культивуванні та проявляти протективну дію при експериментальному зараженні білих мишей. При вивченні у цього штаму вірулентності, токсигенності, гемолітичних та фібринолітичних властивостей встановлено, що Bac. macquariensis ними не володіє. Таким чином, Bacillus macquariensis найбільш придатний для конструювання пробіотичного препарату – споробаку. Технологія розробки середовища для промислового культивування штаму Bac. maсquariensis З метою промислового культивування штаму Bac. maсquariensis використали соляно-сироватковий бульйон. Свіжу молочну сироватку відстоювали протягом 24–28 годин при температурі 10–150С. Потім знімали шар жиру, знежирену сироватку фільтрували через подвійний марлевий фільтр, розливали у флакони і стерилізували при 0,5 атм протягом 30 хв. Термін придатності стерильної молочної сироватки при зберіганні за температури + 4 + 100С – 2 місяці з дня виготовлення. Для приготування соляно-сироваткового бульйону брали рівну кількість молочної сироватки і питної води, додавали 0,5% кристалічної глюкози, 3% автолізату пивних дріжджів і 1% хлористого натрію. Після розчинення компонентів середовище розливали в чисто вимитий посуд, закривали ватно-марлевими корками і автоклавували при 0,5 атм протягом 50 хвилин. Після стерилізації середовище ставили в термостат при температурі 370С на 48 годин для контролю на стерильність. h ? A o A AE o AE# d d f h Ae AE ////o///////eeeeUUIAAA „O d ^„O d „O d ^„O d d d oeUoUeOeeeeeeeeeeeIAA d d d d d „O d ^„O h~ ???-?????? h~ hE DBтивність, перспективність, конкурентноздатність і рентабельність технологічного процесу. В зв’язку з цим велика роль належить використанню мікроелементів, які стимулюють біосинтетичну активність мікроорганізмів, що сприяє інтенсифікації нагромадження біомаси. При внесенні в середовище окремо взятих солей мікроелементів цинку, міді, заліза, кобальту та марганцю у різних концентраціях ми встановили, що найбільш значущий мікроелемент для Bac. macquariensis – сульфат марганцю. Тому, ми ввели 0,005% сульфат марганцю в середовище для регенерації штаму Bac. macquariensis, що дало можливість збільшити вихід біомаси у 1,2 рази. Технологічні принципи виготовлення споробаку, розробка методів контролю та визначення його стабільності Результати попередніх досліджень показали, що виділений штам Bac. macquariensis найбільш активний, тому на його основі розробили новий пробіотичний препарат – споробак, який призначений для профілактики та лікування розладів шлунково-кишкового тракту поросят після їх відлучки. Технологія виготовлення споробаку подана на схемі: ТЕХНОЛОГІЯ ВИГОТОВЛЕННЯ ПРОБІОТИКУ СПОРОБАК Технологічна схема виробництва споробаку включала такі основні стадії: одержання маточних культур, накопичення нативної біомаси, приготування препарату, контроль готового препарату, пакування та маркування. На кожному етапі технологічного процесу передбачено точки контролю. Виробничий штам Bac. maсquariensis знаходиться у ліофілізованому стані і служить для виробництва препарату. При посіві ліофілізованих культур із ампул для повного відновлення енергії росту проводили два пересіви. Завись Bac. maсquariensis переносили із ампули у 2–3 пробірки з рідким середовищем Гаузе та ставили у термостат при температурі 36±10 С протягом 24 годин, попередньо перевіряли її на чистоту культури. Чисту культуру пересівали у пробірки або флакони з рідким середовищем Гаузе чи соляно-сироватковим бульйоном, вносячи по 10% посівного матеріалу до об`єму середовища. Посіви витримували у термостаті при аерації протягом 48 годин. Другу генерацію культур використовували як виробничу для отримання наступних розплодок, попередньо перевіряючи її на відсутність контамінації сторонньою мікрофлорою та типовість. З метою збільшення накопичення біомаси у середовище, в якому вирощували другу та третю генерацію культур, які використовували для виготовлення споробаку, вносили сульфат марганцю. Допускається не більше трьох генерацій розплоду від вихідної культури. Для виробничих потреб використовували культури другої та третьої генерації. Культури другої генерації, які використовували для подальшої роботи зберігали в холодильнику при температурі 2–40 С не більше 10 діб. При використанні у роботі нативних культур другої та третьої генерації, що виросли на рідкому поживному середовищі та зберігалися в холодильнику, витримували протягом 2–3 годин в термостаті при температурі 36±10 С з наступним пересівом на поживні середовища. Культури другої генерації висівали у бутлі та ставили в термостат за температури 36 ± 10 С і витримували 48–72 години при аерації. Перед посівом у бутлі культуру виробничого штаму перевіряли на чистоту та типовість. Для виготовлення споробаку використовували соляно-сироватковий бульйон. Контроль якості кожної серії отриманого препарату визначали за такими показниками: зовнішній вигляд, наявність сторонніх домішок, контамінація сторонньою мікрофлорою, кількість живих клітин (КУО) в 1см3 препарату, нешкідливість. Визначення нешкідливості споробаку проводили за показником „токсичність”. Дослідження проводили на 5 білих мишах масою 19–21 г. Нативний препарат підігрівали до температури +37 о С та вводили білим мишам до годівлі у шлунок за допомогою металевого зонда у дозі 0,5 мл 4 рази з інтервалом в 3 години. Спостереження за тваринами проводили протягом 72 годин. Після введення препарату всі миші залишилися живими без видимих змін клінічних ознак. У виготовленому препараті визначали кількість життєздатних мікроорганізмів, що містяться у середовищі. Визначення титрів мікроорганізмів у процесі зберігання препарату проводили протягом шести місяців, у перші три місяці перевіряли через кожні 10 діб, а в подальшому через місяць. Показники титрів споробаку визначали при зберіганні за різними температурними режимами: +4 о С, +10 о С та за кімнатної температури. Результати досліджень показали, що при температурних режимах +4 о С та +10 о С протягом усього періоду досліджень, рівень титрів не змінювався. Контроль за рівнем титрів проводили протягом шести місяців. Впродовж п’яти місяців титри мікроорганізмів не змінювалися, вони були стабільні і становили 2,2±0,2 млрд КУО в 1 см3 препарату. Проте, через шість місяців зберігання було встановлено незначне зменшення титрів мікроорганізмів, які становили 2,0±0,3 млрд. КУО в 1 см3. При зберіганні препарату споробак за кімнатної температурі протягом місяця титр мікроорганізмів не змінився, проте, через два місяці зберігання він знизився у 1,7 рази і становив 1,3±0,5 млрд КУО в 1 см3. Тому, оптимальними температурними режимами зберігання споробаку є +4 та+10 о С протягом шести місяців. Вивчення ефективності застосування споробаку з терапевтичною метою Визначення ефективності застосування споробаку з терапевтичною метою проводилось у два етапи. На першому етапі в експерименті після застосування тетрацикліну на білих мишах, встановили вплив споробаку на відновлення мікрофлори білих мишей після проведеної антибіотикотерапії. З цією метою було відібрано дві групи мишей по 5 голів у кожній. Першій групі протягом 5 діб вводили тетрациклін у дозі 50 мг/кг, а потім 10 діб споробак у дозі 108 мікробних клітин. Другій групі одночасно – тетрациклін та споробак у цих же дозах протягом 5 діб, після цього ще 5 діб самостійно споробак у дозі 108 мікробних клітин. У першій групі тварин через 10 діб після закінчення застосування споробаку кількість лактобактерій та кишкової палички приходить до норми. У другій групі тварин, яким поєднано застосовували споробак та тетрациклін кількість мікроорганізмів відновлювалась до норми вже на 8 добу застосування, але спостерігалося зменшення кількості стафілококів та мікроорганізмів роду Proteus, їх кількість після 10 добового застосування є нижча, ніж до початку проведення дослідження. Отримані результати дозволяють зробити висновок про те, що поєднане застосування антибіотика та споробаку запобігає розвитку дисбактеріозу. З метою виключення негативного впливу споробаку на нормальну мікрофлору кишечнику поросят ми провели визначення його кількісного складу. Поросятам 1,5 місячного віку застосовували споробак в дозі 20 млрд мікробних клітин на 1 кг маси протягом 5 діб. Бактеріологічному дослідженню піддавались фекальні маси до початку та після введення препарату через 5, 10, 15 і 20 діб. Загальна кількість E. coli та Lactoacillus spp до проведення досліду становила відповідно 3,2±0,5·108 та 1,0±0,4·104 КУО. Після 20 добового спостереження нормальна мікрофлора кількісно не змінилася. Проте, необхідно відмітити, що на 20 добу спостереження висівались аеробні спороутворюючі мікроорганізми Bac. macquariensis, що свідчить про їх здатність до персистенції в організмі тварин. Таким чином, склад мікрофлори кишечнику поросят під впливом застосування споробаку не змінюється. Для встановлення стабільності штаму Bac. macquariensis проводили 5-разові пасажі через організм поросят. Виділений після 5-разових пасажів штам Bac. maсquariensis не змінив своїх культуральних, морфологічних та біохімічних властивостей. При зараженні білих мишей штам не проявив вірулентних властивостей. На другому етапі було визначено ефективність застосування споробаку поросятам з терапевтичною метою. При поєднаному застосуванні споробаку з тетрацикліном терапевтичний ефект був вищий порівняно з окремим їх застосуванням. Терапевтична ефективність застосування споробаку становить – 67%, тетрацикліну – 71%, при спільному ж застосуванні – 82% у порівнянні з контролем. Вивчення ефективності застосування споробаку з профілактичною метою при відлучці поросят При відлучці поросят та переведенні їх на самостійну годівлю часто відмічаються розлади шлунково-кишкового тракту. Тому, з метою запобігання розладів травного тракту, ми розробили схему застосування споробаку з профілактичною метою в період відлучки поросят. Таблиця 1 Середньодобові прирости поросят (г) при застосуванні споробаку з профілактичною метою (M±m, n=12) Показник Групи тварин 1 група 2 група 1 мл/кг 3 група 5 мл/кг 4 група 10 мл/кг Жива маса на початку досліду, кг 13,1±0,20 12,9± 0,20 12,8±0,17 13,2±0,19 Жива маса через місяць, кг 23,0±0,50 23,1±0,40 23,3±0,18 23,7±0,17 Прирости живої маси за період досліду, кг 9,9 10,2 10,5 10,5 Середньодобовий приріст живої маси за період досліду, г 330 340 350 350 Аналіз даних таблиці 1 свідчить про тенденцію до збільшення приросту живої маси тіла поросят третьої та четвертої груп. Застосування споробаку з профілактичною метою при відлучці поросят сприяє підвищенню біоконверсії поживних речовин раціону, так загальний приріст живої маси другої, третьої та четвертої дослідної групи був вищим порівняно з контролем на 340–350 г. Необхідно відмітити, що у трьох поросят першої та двох другої дослідної групи відмічалися розлади шлунково-кишкового тракту. Оптимальна профілактична доза – 5 мл /кг живої маси. Крім цього, застосування споробаку дозволило отримати додатковий прибуток. Позитивні зміни відмічені при вивченні бактерицидної та лізоцимної активності сироватки крові тварин дослідних груп, яким з профілактичною метою в період відлучки застосовували споробак. Так, на 10 добу після початку застосування споробаку спостерігали тенденцію до зростання лізоцимної активності сироватки крові, достовірне зростання в порівнянні з контрольною групою у 1,2 рази бактерицидної активності сироватки крові, фагоцитарної активності нейтрофілів та фагоцитарного числа (Р<0,05), а також достовірне підвищення рівня гемоглобіну та еритроцитів (Р<0,05), тоді як у тварин контрольної групи дані показники істотно не змінювалися. Таким чином, застосування споробаку після відлучки поросят з профілактичною метою позитивно впливає на показники неспецифічної резистентності. Економічна ефективність застосування споробаку Основними умовами, що враховувалися при визначенні економічної ефективності при вирощуванні та відлученні молодняку свиней, було отримання оптимальних приростів живої маси тварин та збереженість поголів’я. Економічну ефективність обраховували як вартість додаткової маси тіла тварин, одержаної в дослідних групах, у порівнянні з контрольною. При обраховуванні економічної ефективності за основу брали закупівельну ціну 1 кг живої маси свиней, яка становила 5,60 грн. Розрахунки економічної ефективності проводили на групах поросят, в яких визначали середньодобові прирости при застосуванні споробаку з профілактичною метою. При застосуванні споробаку у дозі 5 мл/кг живої маси, додатковий прибуток порівняно з контролем становив 2,80 грн на 1 голову, у дозі – 10 мл/кг –2,25 грн Застосування 1 мл /кг живої маси недостатньо впливає на продуктивність тварин. Проведені дослідження показали досить високу терапевтичну ефективність застосування споробаку при розладах шлунково-кишкового тракту у поєднаному застосуванні з тетрацикліном. Економічний ефект на 1 грн затрат при поєднаному застосуванні споробаку та тетрацикліну становить 1,87 грн, а лише споробаку – 1,63 грн. Розробка нормативної документації: технічних умов та настанови щодо застосування споробаку На основі одержаних результатів досліджень, розробки технології застосування та ефективності застосування споробаку як з терапевтичною, так із профілактичною метою в період відлучки поросят, було розроблено нормативну документацію: Технічні умови України ТУ У 24.4.00485670.022-2002 “Споробак”, затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України 16.12.2002 р., “Настанова по застосуванню препарату „Споробак”, затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України № 15-14/522 від 20.12.2002 р. та Методичні рекомендації по виготовленню та застосуванню споробаку, розглянуті та схвалені ТК 132 Держстандарту України “Засоби захисту тварин та кормові добавки” протокол № 4 від 5. 09. 2003 р; науково-технічною радою (секція “Ветеринарна медицина”) Міністерства аграрної політики України, протокол № 12 від 9.12. 2003 р. ВИСНОВКИ 1. З кишечнику здорових поросят виділено спороутворюючий мікроорганізм Bacillus macquariensis. Встановлена його антагоністична дія по відношенню до ентеробактерій. На основі одержаних результатів виготовлено пробіотик нового покоління – споробак, який корегує склад мікрофлори кишечнику поросят після застосування антибіотикотерапії. 2. Із 74 досліджених штамів аеробних спороутворюючих бактерій, які виділені із кишечнику здорових поросят, для подальших досліджень відібрано Bac. macquariensis, який проявляє високу антагоністичну дію до умовно-патогенних та патогенних грамнегативних мікроорганізмів і сприяє розвитку нормальної мікрофлори кишечнику. 3. Встановлено, що штам Bac. macquariensis при спільному культивуванні з різними ентеробактеріями зменшує їх антилізоцимну активність у 1,7–2,3 та адгезивну властивість у 1,2–1,3 рази, що сприяє зниженню вірулентності останніх. 4. Запропоновано соляно-сироваткове середовище для промислового культивування Bac. macquariensis, яке за рахунок внесення сульфату марганцю (5мг/100мл середовища) на стадії регенерації штаму збільшує вихід біомаси у 1,2 рази. 5. Дослідженнями доведено, що стабільність споробаку за температури +4 о С та +10 о С становить 6 місяців з часу його виготовлення. 6. Встановлено позитивний і корегуючий вплив споробаку на склад мікрофлори кишечнику при застосуванні антибіотикотерапії. При його поєднаному застосуванні з тетрацикліном мікрофлора відновлюється у 1,3 рази швидше, ніж при використанні споробаку після антибіотикотерапії. 7. Оптимальна профілактична доза споробаку в період відлучення поросят становить 5 мл/кг живої маси і сприяє збільшенню бактерицидної та фагоцитарної активності нейтрофілів і фагоцитарного індексу у 1,2 рази порівняно з тваринами контрольної групи. 8. Терапевтична ефективність застосування споробаку становила – 67%, тетрацикліну – 71%, а при поєднаному їх застосуванні підвищувалась до – 82%. 9. Економічний ефект на 1 грн затрат при поєднаному застосуванні споробаку та тетрацикліну з терапевтичною метою становить 1,87 грн, а лише споробаку – 1,63 грн. ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ 1. В результаті проведених досліджень розроблено і затверджено технічні умови України ТУ У 24.4.0048 5670.0022-2002 “Споробак” та “Настанову по застосуванню препарату „Споробак” № 15-14/522 від 20.12.2002 р. 2. Препарат рекомендовано застосовувати з терапевтичною метою при розладах шлунково-кишкового тракту поросят у поєднанні з антибіотиком, а з профілактичною метою – при відлученні поросят.. СПИСОК, ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Косенко М.В., Рожко М.С. Кушнір І.М. Антагоністична дія // Збірник праць співробітників інституту. – Львів, 1996. – С. 56. (Дисертант брав участь у експериментальних дослідженнях, підготовка матеріалів до публікації). 2. Рожко М.С., Кушнір І.М. Аеробні спороутворюючі бактерії, як основа для створення пробіотичних препаратів // Збірник праць співробітників інституту. – Львів, 1996. – С. 57–58. (Дисертант брав участь у експериментальних дослідженнях, підготовка матеріалів до публікації). 3. Кушнір І.М. Вплив бактерій антагоністів із роду Bacillus на ентеробактерії // Бюлетень інституту біології тварин. – 2002. – № 1. – С. 89–91. 4. Кушнір І.М., Коцюмбас І.Я. Вплив спороутворюючих бактерій на адгезію ентеробактерій // Ветеринарна медицина: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – Харків, 2003. – С. 344–345. (Дисертант брав участь у експериментальних дослідженнях, підготовка матеріалів до публікації). 5. Кушнір І.М. Протективна дія аеробних спороутворюючих бактерій // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – Львів, 2003. – Т. 5 (№ 2). – С. 107–109. 6. Кушнір І.М. Вплив споробаку на відновлення мікрофлори кишечнику мишей при застосуванні антибіотиків // Матеріали Першої Міжнародної науково-практичної конференції. – Чернівці, 2003.– С.17. 7. Коцюмбас І.Я., Рожко М.С., Кушнір І.М. Застосування пробіотиків у ветеринарній медицині // Ветеринарна медицина України. – 2003. – № 10. – С. 15–17. (Дисертант брав участь у експериментальних дослідженнях, підготовка матеріалів до публікації). 8. Кушнір І.М. Застосування пробіотика споробак для лікування розладів травного тракту поросят // Аграрні вісті. – 2004. – № 1. – С. 26–27. Кушнір І.М. Біотехнологія отримання пробіотика споробак та його застосування у ветеринарній медицині. ( Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. Білоцерківський державний аграрний університет. ( Біла Церква, 2004. Дисертація присвячена вивченню та науковому обґрунтуванню біотехнології отримання та використання споробаку у ветеринарній медицині. Розроблена та науково обґрунтована технологія застосування споробаку при лікуванні розладів шлунково-кишкового тракту поросят та з профілактичною метою при відлучці. На основі мікробіологічних досліджень, визначення ефективності та технології застосування споробаку при профілактиці та лікуванні розладів шлунково-кишкового тракту поросят розроблено та затверджено у встановленому порядку нормативну документацію: Технічні умови України ТУ У 24.4.00485670.022-2002 “Споробак”, затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України 16.12.2002 р., “Настанова по застосуванню препарату Споробак”, затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України № 15-14/522 від 20.12.2002 р.” та “Методичні рекомендації по виготовленню та застосуванню споробаку”. Ключові слова: антагоністична активність, токсичність, мікрофлора, аеробні спороутворюючі мікроорганізми, поросята, поживні середовища. Кушнир И.М. Биотехнология получения пробиотика споробак и его использования при отъеме поросят. ( Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. Белоцерковский государственный аграрный университет. ( Белая Церковь, 2004. Диссертация посвящена изучению та научному обоснованию биотехнологии получения та использовании споробака при отъеме поросят. Разработана и научно обоснована технология применения споробака при лечении расстройств желудочно-кишечного тракта поросят и с профилактической целью при их отъеме. На основании микробиологических исследований, изучения эффективности и технологии применения споробака при профилактике и лечении расстройств желудочно-кишечного тракта, разработано и утверждено в установленном порядке нормативную документацию: Технические условия Украины ТУ У 24.4.00485670.022–2002 “Споробак”, утвержденные Госсударственным департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины 16.12.2002 г., “Наставление по применению препарата “Споробак”, утверждено Госсударственным департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины № 15-14/522 от 20.12.2002 г.” и “Методические рекомендации по изготовлению та применению споробака”. Ключевые слова: антагонистическая активность, токсичность, микрофлора, аэробные спорообразующие микроорганизмы, поросята, питательные среды. Kushnir I. Biotechnology of probiotic sporobac manufacture and its use for shoats. - Manuscript. The dissertation is for obtaining scientific degree of the candidate of agricultural sciences on acquiring the specialty 03.00.20 – biotechnology. Bila Tserkva State Agrarian University, Bila Tserkva, 2004. The dissertation deals with a research and a scientific substantiation of biotechnology probiotic sporobac manufacture and its use for shoats. The technology of sporobac application for treatment and prophylaxis for indigestion of piglets was developed and scientifically proved. The further research was defined by the isolation of aerobic spore generating microorganisms from gastrointestinal tract of healthy piglets. Therefore the antagonistic, adhesive, anti-lysozyme and protective effect of these microorganisms were under research for selection of the most effective and suitable culture for probiotic development. There were investigated antagonistic properties of 74 aerobic spore-generating cultures. Not all of them had the same properties. Only 1,8–7,8 % of the investigated cultures were highly active to enterobacteria. Bac. macquariensis was selected from these cultures as it showed the most antagonistic properties regarding to enterobacteria. A combined cultivation of Bac. macquariensis and enterobacteria showed the ability of Bac. macquariensis to reduce the anti-lysozyme and adhesive activities of enterobacteria in 1,7–2,3 times and 1,2–1,3 times respectively. At experimental reproduction of an infection with the help of E. Coli O8 Bac. macquariensis had the most expressed protective effect in comparison with other cultures and probiotics. Probiotic sporobac was developed on the basis of spore generating culture of Bac. macquariensis, selected from gastrointestinal tract of healthy piglets. There were developed optimal in point of technological and economic aspects hydrochloric-serum medium for industrial cultivation of Bac. macquariensis culture. The entering of manganese sulfate into its structure (5 mg per 100 ml) promotes increase of biomass accumulation in 1,2 times. The investigation of harmlessness and negative influence of sporobac on normal microflora showed its harmless and correct properties. There were established that combined use of sporobac and tetracycline generate faster restoration of gastrointestinal microflora and higher therapeutic effect of treatment for indigestion of piglets. The therapeutic effect of sporobac application average 67 %, tetracycline – 71 %, sporobac and tetracycline combined – 82 % respectively. There were investigated that prophylactic use of sporobac for shoats caused positive changes in bactericidal and lysozyme activity of blood serum. For example, on the 10 day of sporobac application for piglets there were observed the tendency of lysozyme activity increasing. Also, during that period, there were registered increases of bactericidal activity (in 1,2 times) and phagocytic activity of neutrophiles in comparison with animals of control group. Thus, the prophylactic application of sporobac for shoats had positive effect on nonspecific resistibility. On the basis of microbiological researches, efficiency and application technology of sporobac for shoats investigations there was developed and authorized such normative documentation: technical conditions (TУ У 24.4.00485670.022–2002 “Споробак”), authorized by State department of veterinary medicine of the Ministry of agrarian policy of Ukraine (16.12.2002), directions for preparation sporobac use, authorized by State department of veterinary medicine of the Ministry of agrarian policy of Ukraine (№ 15-14/522; 16.12.2002), methodical recommendations for sporobac manufacture and application. Key words: antagonistic activity, toxicity, microflora, aerobic spore-generating microorganisms, piglets, culture medium. PAGE 19 PAGE 1 Штам Bacillus macquariensis (ліофілізат) Перша регенерація: пересів на рідке середовище Гаузе за температури 37±10 С, протягом 24 годин Контроль на контамінацію сторонньою мікрофлорою Друга регенерація: посів на соляно-сироваткового середовище або на рідке середовище Гаузе з додаванням марганцю. Інкубування за температури 37±10 С, протягом 48 годин Контроль на контамінацію сторонньою мікрофлорою Контроль на контамінацію сторонньою мікрофлорою та типовість Посів на соляно-сироваткове середовище з метою виготовлення споробаку. Інкубування за температури 37±10 С, протягом 48-72 годин. Фасування пробіотику споробак Контроль якості препарату згідно ТУ У 24.00485670.022-2002 за показниками: зовнішній вигляд, контамінація сторонньою мікрофлорою, кількість живих КУО в 1 см3 препарату, нешкідливість.

Похожие записи