КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ШУГАЙ МИРОСЛАВА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 578.81:637.13

Біологічні та фізико-хімічні властивості фагів молочнокислих бактерій,
виділених за умов виробництва молочних ферментованих продуктів

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006 Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету
Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник – академік УААН, доктор біологічних наук, професор

Бойко Анатолій Леонідович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка.

Офіційні опоненти – академік УААН, доктор біологічних наук, професор

Патика Володимир Пилипович,

Національний авіаційний університет Кабінету Міністрів України;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Товкач Федір Іванович,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,
завідувач відділом молекулярної біології вірусів.

Провідна установа – Інститут сільськогосподарської мікробіології ААН

України, м. Чернігів.

Захист дисертації відбудеться 21 березня 2006 р. о 14 годині на
засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка, за адресою:

03127, м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, корп. 12, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка: 01033, м. Київ, вул. Володимирська,
58.

Автореферат розісланий „ 20 ” лютого 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В.
Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтерес до фагів молочнокислих бактерій зумовлений
насамперед тим, що ці віруси мають надзвичайно важливе практичне
значення. Лізуючи клітини бактерій-хазяїв, фаги знижують активність
заквасок, збільшують тривалість вироблення продуктів та погіршують їх
якість, завдаючи цим серйозних економічних втрат. Незважаючи на значні
досягнення щодо вивчення механізмів захисту молочнокислих бактерій (МКБ)
від фагової інфекції, проблема боротьби з бактеріофагами залишається
однією з найактуальніших для молочної промисловості розвинених країн
світу (Brussov Н., 2001; Coffey A. and Ross R.P., 2002; McGrath S. et
al., 2002).

В Україні проблема фаголізису особливо гостро постала в останні
десятиліття, коли вітчизняні дослідження з ряду причин було практично
припинено, колекції фагів та чутливих до них культур втрачено, а тому,
роботи з виявлення та профілактики фаголізису на виробництві майже не
проводилися. Зрозуміло, що за цих умов кількість випадків порушень
ферментації значно зросла.

Вибір ефективних методів боротьби з бактеріофагами МКБ, без сумніву,
повинен базуватися на всебічному вивченні їх біологічних властивостей.
Аналіз літератури щодо лактофагів дозволяє зробити висновок: незважаючи
на великий інтерес зарубіжних дослідників до цієї групи бактеріальних
вірусів та велике число робіт, присвячених їм, виявляються все нові й
нові дані, які не тільки відкривають обнадійливі перспективи боротьби з
фаголізисом на виробництві, а й мають велику теоретичну цінність.
Зокрема, завдяки тому, що на даний час фаги МКБ – найдослідженіша на
генетичному рівні фагова система (Lucchini S. еt al., 1999; Proux C. et
al., 2003; Desiere F. et al., 2002), ця група вірусів стала цікавим
об’єктом для еволюційного дослідження. Дані, отримані завдяки
секвенуванню фагових геномів, розширюють наші уявлення про еволюцію
бактеріальних вірусів, допомагають з’ясувати особливості генетичної
структури світової популяції фагів, дозволяють по-новому оцінити роль
бактеріофагів як фактора еволюції їх хазяїв.

Мозаїчність фагових геномів свідчить про важливу роль горизонтального
обміну блоками генетичної інформації в еволюції бактеріофагів. Згідно з
Hendrix (2003), шляхом гомологічних та негомологічних рекомбінацій
відбувається інтенсивний обмін послідовностями геномів не лише між
фагами, активними до філогенетично близьких хазяїв, але й фагами, хазяї
яких займають спільну екологічну нішу, внаслідок чого виникає значна
розмаїтість локальних популяцій бактеріальних вірусів. Окрім того, з
огляду на порівняння фагових геномів ставиться питання про необхідність
перегляду існуючої таксономічної системи бактеріофагів та відкриваються
перспективи створення природної таксономії родини Siphoviridae – такої
систематики, яка б відображала філогенетичні зв’язки між вірусами
(Lawrence J.G. еt al., 2002; Proux С. еt al., 2002; Rohwer F. and
Edwards R., 2002).

Важливість та нагальна необхідність дослідження фагів МКБ, поширених на
підприємствах молочного профілю України, зумовлені насамперед
економічними чинниками. Моніторинг та вивчення властивостей фагів,
активних до промислових культур МКБ, сприятимуть розробці заходів,
спрямованих на профілактику ситуацій фаголізису на виробництві, а також
створенню ефективних програм селекції фагостійких штамів заквашувальних
культур і їх ротації. Ці дослідження мають і велику наукову цінність,
оскільки розширюють наші знання щодо різноманітності бактеріофагів такої
важливої у житті людини групи мікроорганізмів, як молочнокислі бактерії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалася відповідно до напрямку науково-дослідних робіт
кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за темою: „Моніторинг збудників
вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих
технологій вирощування сільськогосподарських рослин”, держбюджетна тема
01БФ036-076 (номер державної реєстрації 0101U005076).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити
біологічні та фізико-хімічні властивості фагів МКБ. Визначити роль
бактеріофагів у виробничих процесах і здійснити пошук тест-культур для
детекції фагів. Досягнення поставленої мети передбачало здійснення
таких завдань:

Провести виділення фагових ізолятів зі зразків продукції, сироватки,
ропи та змивів з обладнання підприємств молочного профілю різних
областей України.

Дослідити вплив фагового забруднення на якість отримуваного продукту.

Вивчити основні біологічні властивості ізольованих фагів – спектр
літичної активності та ефективність репродукції на чутливих культурах.

Провести дослідження штамів МКБ, які забезпечують найвищу ефективність
репродукції фагів, на лізогенність.

Вивчити морфолого-структурну організацію віріонів. Визначити і порівняти
поліпептидний склад вірусів.

Визначити серологічну спорідненість фагових ізолятів, які належать до
різних літичних груп.

Дослідити чутливість бактеріофагів до дії фізико-хімічних факторів:
підвищеної температури, цитрату натрію, осмотичного шоку, хлороформу, а
також інфекційність фагів при зберіганні.

На основі отриманих даних провести порівняльну характеристику фагів МКБ,
поширених у молочній галузі України.

Об’єкт дослідження – ізоляти фагів молочнокислих бактерій, виділені за
умов виробництва, промислові культури молочнокислих бактерій.

Предмет дослідження – біологічні властивості та фізико-хімічні
характеристики виробничих ізолятів фагів молочнокислих бактерій.

Методи дослідження. Очистку та концентрування вірусів проводили за
допомогою диференціального центрифугування. Біологічну активність фагів
визначали методом двошарового агару. Чисельність МКБ – методом граничних
розведень та за допомогою фотокалориметра. Для виявлення антигенної
спорідненості вірусів скористалися методом непрямого твердофазного
імуноферментного аналізу (ІФА) в гомо- та гетерологічних системах.
Морфолого-структурну організацію віріонів визначали за допомогою
електронної мікроскопії. Поліпептидний склад виділених фагів
досліджували з використанням методу електрофорезу в ПААГ.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні проведено
обстеження продукції підприємств молочного профілю на наявність фагів
МКБ та здійснено їх виділення. Показано, що фаголізис культур закваски
призводить до активного розвитку сторонньої мікрофлори, внаслідок чого
знижуються рівень епідеміологічної безпеки та якість продукції.
Встановлено, що проблема запобігання виникнення ситуації масового
фаголізису полягає у необхідністі зниження титру фага у цільовому
продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.

Вперше в Україні досліджено на фагочутливість культури термофільних
стрептококів, завдяки чому виявлено фаги, здатні репродукуватися у
штамах як мезофільних (Lactococcus lactis subsp. cremoris, L. lactis
subsp. lactis, L. lactis subsp. diacetilactis), так і термофільних
(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) МКБ. Визначено
систематичне положення ізольованих фагів: віруси належать до родини
Siphoviridae, порядку Caudovirales. Серед ізолятів домінують фаги
морфотипу В1, також виявлено фаги морфотипу В2 групи с2.

Показано, що процес термоінактивації фагів описується двокомпонентними
кривими, а фаги відрізняються термостійкістю. Досліджено чутливість
бактеріофагів до цитрату натрію та показано різну потребу вірусів у
іонах кальцію. Виявлено стійкість фагових часток до осмотичного шоку,
хлороформу та за умов тривалого зберігання в ропі.

Практичне значення роботи. Створено колекцію виробничих фагів (13
ізолятів), активних щодо штамів мезо- та термофільних МКБ. До виділених
фагів визначено чутливість 147 музейних культур МКБ колекції
Технологічного інституту молока та м’яса УААН (ТІММ). Фагостійкі штами в
майбутньому можуть використовуватися для створення заквашувальних
композицій. Серед чутливих штамів відібрано ті, які забезпечували
найвищий рівень репродукції бактеріофагів та не містили індуцибельних
профагів. Вони є перспективними кандидатами тест-культур для проведення
моніторингу лактофагів за умов виробництва.

Виявлено залежність репродукції фагів від наявності іонів Са2+, що
вказує на можливість розробки та застосування у маточному виробництві
безкальцієвих середовищ з метою запобігання фаголізису заквасок у
вітчизняній молокопереробній промисловості.

Встановлено, що жоден із режимів пастеризації, прийнятих на виробництві,
не гарантує повної інактивації фагів; лише за умов приготування закваски
100% вірусів утрачають інфекційність.

Показано, що в умовах виробництва ропа є вторинним джерелом фагової
інфекції, тому це слід брати до уваги на етапі розробки конструкції
сирзаводів та під час проведення ротації заквасок.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконано
літературний пошук та аналіз літературних джерел за темою дисертації,
підбір та модифікацію методів дослідження, планування та розробку схем
експериментів, отримання експериментальних даних та їх статистичне
опрацювання, аналіз отриманих результатів і оформлення роботи.
Дослідження антигенної спорідненості фагових ізолятів та їх
поліпептидного складу проводилися за сприяння к.б.н. Шевченко Т.П. – ас.
кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного
університету імені Тараса Шевченка, яка є співавтором відповідної
публікації. Постановка завдань і обґрунтування науково-практичних
висновків проводилися разом з науковим керівником – д.б.н., проф. Бойком
А.Л. Друковані роботи підготовлено автором особисто при безпосередній
участі наукового керівника. Дисертант висловлює щиру подяку д.т.н., зав.
відділом біотехнології ТІММ Кігель Н.Ф. та к.б.н., cт.н.с. Рожанській
О.М. за співпрацю та корисні поради.

Апробація результатів дисертації. Основні положення досліджень
доповідались на IV Всеукраїнській науковій конференції студентів та
аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ,
24–25 квітня 2004 р.), X з”їзді Товариства мікробіологів України
(Одеса,15–17 вересня 2004 р.), IV міжнародній конференції „Біоресурси та
віруси” (Київ, 27–30 вересня 2004 р.) та науковому семінарі кафедри
вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка
(2005 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлено у чотирьох
статтях, опублікованих у фахових наукових журналах, і трьох тезах,
виданих за матеріалами з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційну роботу викладено на 156
сторінках машинописного тексту, куди увійшли огляд літератури, матеріали
та методи досліджень, результати власних досліджень (4 розділи),
узагальнення, висновки, список використаних джерел. Список літератури
налічує 286 найменувань, з них 228 – іноземні. Робота містить 15 таблиць
та 27 рисунків.

ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. На основі робіт вітчизняних та зарубіжних авторів
висвітлено проблему фаголізису в молочній промисловості, дано аналіз
особливостей молекулярної структури та еволюції популяцій фагів МКБ.
Також представлено пропозиції дослідників щодо вдосконалення
класифікації фагів родини Siphoviridae та наведено останні наукові
розробки зарубіжних авторів, спрямовані на підвищення фагостійкості
штамів лактобактерій.

Матеріали та методи дослідження. У роботі використано музейні культури
молочнокислих бактерій колекції ТІММ УААН: Lactococcus lactis ssp.
lactis – 26 штамів, L. lactis ssp. diacetilactis – 17 штамів,
Lactococcus lactis ssp. cremoris – 34 штамів, Streptococcus salivarus
ssp. thermophilus – 68 штамів та 2 штами Enterococcus faecium.

Фаги виділяли зі зразків кисломолочної продукції, сироватки, ропи та
змивів з обладнання підприємств молочного профілю різних регіонів
України. Титр фагів визначали у бляшкоутворюючих одиницях на мл
(БУО/мл). Чисті лінії фагів отримували методом подвійного агару (Адамс
М., 1961) шляхом послідовних пасажів фагів з окремих морфологічно
однотипних негативних колоній на штамах чутливих бактерій. Для кожного
ізоляту проведено шість послідовних пасажів. Завдяки тому, що літична
дія бактеріофагів виявлялася на кількох культурах і ряд фагів мали
спільних бактерій-хазяїв, при виділенні чистих ліній обмежилися трьома
індикаторними культурами.

Загальну чисельність заквашувальної та сторонньої мікрофлори визначали:
кількість МКБ згідно з ГОСТ 10444.12, бактерій групи кишкових паличок
(БГКП) – ГОСТ 9225-84, дріжджів та плісняви – ГОСТ 10444.11, кількість
спороутворюючих бактерій за Банниковою (1987).

Препарати фагів високого титру отримували методом суцільного лізису на
агаризованому поживному середовищі (Девис Р. и др., 1984) та в рідкому
середовищі – гідролізованому молоці. Визначення кола бактерій-хазяїв
фагів проводили із залученням вище названих культур МКБ. Очистку і
концентрування фагів здійснювали двома циклами диференціального
центрифугування (90 000g, 3 год). Контроль чистоти вірусних препаратів
визначали спектрофотометрично та за допомогою електронної мікроскопії.
Електронно-мікроскопічний аналіз зразків проводили за
загальоноприйнятими методиками, а також методом теплового прикріплення
(Габрилович И.М., 1973).

Електрофоретичне дослідження поліпептидного складу фагів здійснювали за
методом Laemmli U.K. (1970) з використанням 5% концентруючого і 14%
розділяючого гелів та подальшим фарбуванням кумасі блакитним. Для
визначення молекулярних мас фагових білків скористалися набором
білків-маркерів фірми „Sigma”. Для проведення імунологічних досліджень
отримували вірусоспецифічні мишачі поліклональні сироватки. Серологічну
спорідненість вірусів вивчали, використовуючи метод непрямого
твердофазного імуноферментного аналізу (Кэтти Д., 1991), обчислювали
згідно з формулою Арчетті (Троценко Н.И. и др., 1989).

Чутливість фагів до нагрівання характеризували константою швидкості
інактивації (КТ) (Габрилович И.М., 1973). Вплив цитрату натрію на
репродукцію фагів на агаризованому середовищі визначали за зміною титру
фагів, у рідкому середовиші – шляхом моніторингу оптичної густини та рН
середовища. Чутливість до хлороформу і осмотичного шоку та стабільність
фагів за умов зберігання визначали титруванням методом подвійного агару.

Дослідження бактерій на лізогенність проводили шляхом УФ опромінення
культур з подальшим моніторингом оптичної густини, порівнюючи криві
росту опроміненої і неопроміненої культур.

Статистичне опрацювання результатів здійснювали за загальноприйнятими
методиками варіаційної статистики. Розрахунки проводили за допомогою
персонального комп’ютера та з використанням програми „Excel XP”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Моніторинг фагів молочнокислих бактерій на підприємствах молочного
профілю України та їх вплив на якість цільового продукту. Першу серію
експериментів було спрямовано на виявлення та виділення фагів зі зразків
кисломолочної продукції, підсирних сироватки та ропи, змивів з
обладнання підприємств молочного профілю різних областей України.
Базуючись на джерелі виділення та морфології негативних колоній з 12
досліджуваних зразків, було ізольовано 13 фагів молочнокислих бактерій.
Титри бактеріофагів становили від 102 до 109 БУО/мл (табл.1).

Величина титру фагів впливала на технологічні показники та смакові
характеристики отримуваного продукту. Зокрема, при виробництві
продукції, в якій титр фагів становив 104 БУО/мл та менше, не
спостерігалося суттєвих порушень технологічного циклу, що дало змогу
отримати якісний продукт. У разі зростання фагового титру до 106
відмічали уповільнення молочнокислої ферментації, а готовий продукт мав
невисокі смакові характеристики. Збільшення титру до 108–109 призводило
до зупинення виробництва. Таким чином, проблема запобігання виникнення
ситуації масового фаголізису полягає в необхідністі зниження титру фага
у цільовому продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.

Таблиця 1

Джерела виділення фагів та їх титри у продукції

Джерело виділення фага № зразка Фаг Титр фага

БУО/мл Примітки

м. Київ, завод А; кефір 1 1Ф 103

м. Київ, завод В; ряжанка 2 2Ф 104

м. Київ, завод С;

сир кисломолочний 3 3Ф

4Ф 109

108 зупинення виробництва

Київська обл., завод Д; ряжанка 4 5Ф 103

Київська обл., завод Е; ряжанка 5 6Ф 106 збільшення часу вироб-лення,
низькі смакові якості

Київська обл., завод К; ряжанка 6 7Ф 109 зупинення виробництва

Сумська обл., завод Л; -біокефір

— ряжанка

— змиви з обладнання (ряжанка) 7 8Ф 106 збільшення часу вироб-лення,
низькі смакові якості

8 8/1Ф 106

9 8/2Ф 105

Черкаська обл., сирзавод М;

— сироватка

— ропа 10 – –

11 9Ф

10Ф

11Ф 102

102

102

Полтавська обл., завод Н; ряжанка 12 – – зупинення виробництва

Для з’ясування впливу фага високого титру на якість продукції проведено
мікробіологічні дослідження зразків № 3 та № 6, у яких титр фага сягав
108–109 БУО/мл. Результати досліджень показали, що в цих зразках
спостерігалося зменшення чисельності МКБ відповідно до 7Ч106 та 6Ч107
КУО/мл, тоді як у продуктах, отриманих за умов стабільної ферментації,
кількість заквашувальної мікрофлори зазвичай становить 108–109 КУО/мл.
Чисельність бактерій групи кишкових паличок у зразку № 3 перевищувала
допустимий рівень, визначений діючими державними стандартами щодо
мікробіологічних та санітарно-гігієнічних показників для кисломолочних
продуктів, у 4 рази, а в зразку № 6 – у 1000 разів, окрім того,
спостерігався ріст спорових бактерій та плісняви (табл. 2).

Таблиця 2

Мікробіологічні дослідження зразків, що містили фаги високого титру

№ зразка Фаг Титр

фага, БУО/мл Кількість мікроорганізмів у зразку, КУО/мл

Загальна чисельність МКБ Спороутво-рюючі плісені та /дріжджі бактерії
групи кишкових паличок

3 3Ф

4Ф 109

108 7Ч106 3Ч103 6Ч101/0 4Ч104

6 7Ф 109 6Ч107 2Ч105 5Ч102/2Ч101 3Ч105

Електронна мікроскопія. Згідно з даними електронно-мікроскопічних
досліджень, усі фаги мали довгі нескоротливі хвостові відростки (рис.1),
а отже, відповідно до рекомендацій Міжнародного комітету з таксономії
вірусів (Maniloff J., Ackermann H.-W., 1998), належали до порядку
Caudovirales, родини Siphoviridae. Виявлено фаги з ікосаедричними
голівками морфотипу В1 та фаги з пролатними голівками морфотипу В2.
Згідно з сучасною класифікацією бактеріальних вірусів, лактококові фаги
морфотипу В2 віднесено до с2-подібних лактококових фагів (Jarvis A.W. et
al., 1991; Moineau S. et al., 2002). Таким чином, ізоляти 2Ф, 3Ф, 9Ф та
11Ф належать до групи с2 (табл. 3).

Таблиця 3

Морфологія віріонів фагів молочнокислих бактерій

Фаги Розмір віріонів, нм Морфотип Група

голівка хвостовий відросток

1Ф 47±1 135±2 В1

2Ф, 3Ф, 11Ф 41±1Ч56±1 110±2 В2 с2

4Ф, 5Ф, 10Ф 46±1 103±2 В1

6Ф, 7Ф, 8Ф, 8/1Ф,8/2Ф 47±1 135±2 В1

9Ф 41±1Ч45±1 64±2 В2 с2

Літична активність і видова специфічність фагів. Дослідження спектру
літичної дії фагів дало змогу виділити 4 фагогрупи та визначити індекси
їх літичної активності (табл. 4).

Таблиця 4

Літична активність та видова специфічність фагів молочнокислих бактерій

Гру-па Фаги Чутливі штами МКБ, % Iл*

L. cremoris L. lactis L. diacetilactis S. thermophilus

1 6Ф, 7Ф, 8Ф,

8/1Ф, 8/2Ф 5,9 7,7 35,3 26,5 0,19

2 4Ф, 5Ф, 10Ф 2,9 7,7 29,4 25,0 0,18

3 9Ф 2,9 7,7 – – 0,02

4 2Ф, 3Ф, 11Ф – 7,7 – – 0,01

Примітка. *Іл – індекс літичної активності

Фаги 1-ї та 2-ї груп мали дуже подібні спектри літичної активності,
лізували найбільшу кількість випробуваних культур і відповідно
характеризувалися найвищими індексами літичної ативності – близькими до
0,2. Згідно з даними літератури, такі величини індексів не є високими,
але широка географія розповсюдження та значний відсоток технологічних
відхилень, спричинених бактеріофагами, свідчать, що навіть при таких
низьких індексах ці фаги представляють велику проблему для молочної
галузі України.

Цікавим і несподіваним фактом стало те, що віруси 1-ї та 2-ї літичних
груп, які становлять переважну більшість колекційних ізолятів (67%),
лізували штами як мезофільних лактококів, так і термофільних
стрептококів. Хоча в літературі ми не знайшли повідомлень про здатність
фагів до перехресного інфікування мезо- та термофільних МКБ, така
„поведінка” досліджуваних фагів цілком відповідає сучасній теорії
модульної еволюції бактеріальних вірусів (Hendrix R.W. et al., 1999;
Hendrix R.W., 2003).

8

< 4 8 t x : < O 4 6 8 : E t v x x z \„`‡?‹ueoeueiaeUeaeOaeIOIaeAE1/4AEue¶¬c¶aeAEue›ue›ue›ue›ue›ue›ueAEue’ueO ueOueaeOueAEI‹Iueaeue –>– –¤–?–¬–°–?–X?Z?`?b?t?N™P™`™b™O™d?f?l?n?~???uoeuoeioeuoeuoeuoeuoeaeOa
eioeOoeOoeuoeuoeuoeuoeuoeuoeOoeuoeOoeuoeOoeuoeuoeOoeuoeuoeuoeuoeuoeIAIAI
?????oe

hUB›@?thy

O

B*ph8зували невелике число штамів. Фагів, активних лише до однієї
бактеріальної культури виявлено не було.

Подальші дослідження проводили з використанням ізолятів 3Ф, 8Ф і 9Ф, які
представляли різні літичні групи і відрізнялися морфологією часток.

Визначення поліпептидного складу досліджуваних фагів. Здійснено
порівняльне вивчення поліпептидного складу вірусів. Як видно з фореграми
(рис. 2), між 3Ф і 9Ф (група с2) спостерігали значну подібність щодо
вмісту деяких поліпептидів, зокрема, чотирьох мажорних білків (72,5; 54;
43 і 29 кДа) та одного мінорного (63 кДа). Фаг 8Ф за поліпептидним
складом суттєво відрізнявся від 3Ф та 9Ф, щоправда, цей ізолят також
містив мажорний поліпептид масою 29 кДа.

Згідно з даними літератури, фаги МКБ дуже гетерогенні за ознакою
білкового складу. Проте, в поліпептидних профілях с2-подібних фагів
виявлено декілька мажорних білків, причому серед них неодмінно є
поліпептиди з порівняно великою молекулярною масою (Moineau S. et al.,
1992; Azaпez S.R.C. et al., 1998), що пов’язано з формуванням ковалентно
зв’язаних мультимерних білків голівки (Lubbers M.W. et al., 1995). Отже,
результати досліджень підтвердили належність 3Ф і 9Ф до с2-подібних
фагів.

Серологічна спорідненість. Визначення серологічних властивостей фагів
проводили з використанням мишачих поліклональних сироваток у трьох
розведеннях, що дозволило оцінити ступінь вираженості імунологічних
реакцій.

Як видно з рисунка 3, ізоляти 3Ф та 9Ф у перехресних реакціях з
антисироватками до 9Ф та 3Ф показали досить високі значення оптичної
густини, порівняно з тими, що отримано у реакціях з гомологічними
антисироватками. Це свідчить про наявність спільних для цих вірусів
антигенних детермінант. Серологічна спорідненість фагів 3Ф та 9Ф
становила 93,2%, на підставі чого їх віднесено до одного серотипу (1). В
гетерологічних системах фагів 3Ф та 9Ф з сироваткою до 8Ф отримано
значення оптичної густини, що знаходяться нижче порогового рівня
чутливості даного методу. Аналогічні результати спостерігали за умов
взаємодії фага 8Ф з антисироватками до 3Ф та 9Ф – вищеназваний фаг дав
позитивну реакцію лише з гомологічною антисироваткою (рис. 3). Тому
ізолят 8Ф віднесено до окремого серотипу (2).

За даними літератури (Geller B.L. et al., 1998), слабка нейтралізація
фагів МКБ у гетерологічних системах чи її відсутність корелює з фаговими
групами. Тому, очевидно, що бактеріофаги серотипів 1 та 2 належать до
різних груп. Отже, отримані дані підтвердили належність 3Ф та 9Ф до
однієї групи, а ізолята 8Ф – до іншої групи фагів МКБ.

Чутливість фагів молочнокислих бактерій до фізичних та хімічних
факторів.

Чутливість до дії температури. Проводили термоінактивацію в бульйоні та
знежиреному молоці за різних температур. Процес термо-інактивації фагів
описувався двокомпонентними кривими: під час першої фази (І)
спостерігали швидке, а під час другої (ІІ) – повільніше падіння
інфекційності вірусів. Найшвидше інактивувався фаг 3Ф, константа
інактивації якого у молоці при 60°С для фракції I становила
65,5Ч10-2Чхв-1, а найстабільнішим був фаг 9Ф, який за цих умов практично
не втрачав інфекційності, тоді як при 70°С його константа інактивації
чисельно дорівнювала 126,9Ч10-2Чхв-1. Фаг 8Ф виявився чутливішим до
температури, ніж 9Ф, про що свідчить майже удвічі більша константа
інактивації при 70°С. Важливо відмітити, що термостійкість фагів
залежала від середовища, зокрема, у молоці вона була дещо вищою, ніж за
тієї ж температури у бульйоні (табл.5).

Таблиця 5

Константи теплової інактивації фагів у молоці та бульйоні

Фаг Т, °С Середовище КТ, хв-1Ч10-2 для фракції I КТ, хв-1Ч10-2 для
фракції II

3Ф 57 молоко 13,8 8,4

бульйон 26,4 10,8

60 молоко 65,5 16,2

бульйон 74,8 19,8

8Ф 65 молоко 13,8 6,9

бульйон 23,0 8,0

70 молоко 239,2 30,6

бульйон 248,4 39,2

9Ф 67 молоко 26,6 12,1

бульйон 37,3 16,6

70 молоко 126,9 21,9

бульйон 147,2 25,2

Вивчали вплив на інфекційність фагів режимів пастеризації молока,
прийнятих для вироблення різноманітних кисломолочних продуктів та для
приготування виробничої закваски. Встановлено, що залежно від рівня
терморезистентності фаги у більшому чи меншому титрі виявлялися за всіх
режимів пастеризації, за винятком режиму, прийнятого для приготування
виробничої закваски (рис. 4).

Отримані результати збігаються з даними подібних досліджень, які
проводилися стосовно фагів, активних щодо мезофільних лактококів,
термофільних стрептококів та лактобацил (Binetti A.G., Reinheimer J.A.,
2000; HYPERLINK
«http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term
=%22Chopin+MC%22%5BAuthor%5D» \o «Click to search for citations by this
author.» Chopin M.C ., 1980; Madera C. et al., 2004; Suarez V.B.,
Reinheimer J.A., 2002).

Чутливість фагів до цитрату натрію. Як відомо (Габрилович И.М., 1973),
двовалентні іони, зокрема кальцію, можуть впливати на репродукцію
бактеріофагів. Оскільки молоко та отриманий на його основі
гідролізований бульйон містять іони кальцію, для їх зв’язування у
середовище додавали цитрат натрію. Таким чином, чутливість до цитрату
може вказувати на потребу фагів у іонах кальцію.

Результати досліджень свідчать про різну потребу вірусів в іонах
кальцію. Зокрема, 3Ф та 9Ф лізували чутливі до них штами навіть у
середовищі з 4% цитрату натрію. Тоді як титр 8Ф у середовищі з 1%
цитрату знизився майже на 2, а в середовищі з 1,5% – більш як на 4
логарифмічні одиниці. За наявності 2% цитрату натрію 8Ф повністю втрачав
здатність до утворення негативних колоній (рис.5).

Оскільки за умов виробництва репродукція як бактерій, так і фагів
відбувається в рідкому середовищі, важливо дослідити чутливість до
цитрату натрію за цих умов. З огляду на дані, отримані при дослідженні
репродукції бактеріофагів на агаризованому середовищі, тестування
проводили за таких умов: 8Ф – за концентрацій 1%, 1,5% та 2%, а ізолятів
3Ф і 9Ф – 2% цитрату. Результати визначали, спостерігаючи за значеннями
оптичної густини та рН середовища. Як видно з рисунків 6, 7 і 8,
отримані дані підтвердили результати тестування фагів 8Ф, 3Ф та 9Ф на
агаризованому середовищі.

Важливо зазначити, що цитрат натрію, поряд з інгібуючою дією на
репродукцію фага 8Ф, також виявив стимулюючий вплив на ріст популяцій
бактерій-хазяїв. Про це свідчить збільшення майже удвічі оптичної
густини зразків, які містили 1,5% та 2% цитрату (К+1,5%ц; К+2%ц),
порівняно з оптичною густиною культури без цитрату (К) (рис. 6, 8).

Таким чином, з огляду на широке розповсюдження в молочній галузі України
фагів, для репродукції яких необхідні іони Са2+, одним із дієвих
заходів, спрямованих на обмеження фаголізису заквасок, може бути
створення та запровадження у маточне виробництво безкальцієвих
середовищ, у тому числі із залученням цитратів.

Стабільність фагів за умов зберігання. Інформація щодо здатності
бактеріофагів зберігати чи втрачати інфекційність за умов, у яких вони
знаходяться на виробництві, є важливою для виявлення джерел фагового
забруднення та розробки рекомендацій, спрямованих на запобігання
контамінації.

Під час проведення моніторингу в ропі з-під сичужного сиру було виявлено
три фагові ізоляти, тоді як у сироватці – жодного (див. табл. 1).
Встановлення цього факту дозволило припустити, що віруси можуть
зберігати активність у ропі. Результати досліджень (рис. 8) підтвердили
досить високу стабільність бактеріофагів за умов, у яких відбувається
соління сичужного сиру (рН~5,5; температура 10°С; концентрація хлориду
натрію 20%).

Отже, зважаючи на здатність фагів зберігати інфекційність у ропі та з
огляду на те, що, відповідно до технологічних вимог, її слід міняти не
рідше, ніж раз на рік і пастеризувати не рідше, ніж раз на місяць, можна
зробити висновок: ропа – джерело фагової інфекції на сироварних заводах.

Відбір та перспективи використання чутливих до фагів тест-культур
молочнокислих бактерій. За умов, коли дослідження з бактеріофагії у
молочній промисловості тривалий час не проводилися та за ситуації втрати
колекції індикаторних до фагів штамів, актуальним завданням є пошук
нових тест-культур, які були б максимально чутливими до розповсюджених
на виробництві бактеріофагів.

Отже, за результатами дослідження літичної активності фагів було
визначено коло їх хазяїв. Подальшими етапами створення колекції
індикаторних культур стали виявлення та відбір штамів, які
найефективніше підтримували репродукцію фагів, та дослідження цих
культур на лізогенність.

За результатами досліджень вище названі вимоги задовольняли три штами:
S. salivarus ssp. thermophilus 2152, L. lactis ssp. lactis 1100 та L.
lactis ssp. lactis 1112, тому їх і рекомендовано використовувати як
тест-культури для проведення фагового моніторингу на виробництві.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено експериментальні та теоретичні
узагальнення наукового завдання, яке полягало у дослідженні біологічних
та фізико-хімічних властивостей фагів молочнокислих бактерій.
Запропоновано ряд практичних рекомендацій щодо вирішення проблеми
фаголізису в молочній промисловості України. У ході роботи було зроблено
такі висновки:

1. За умов виробництва молочних ферментованих продуктів на підприємствах
України виділено 13 фагових ізолятів молочнокислих бактерій. Наявність
фагів невисокого титру суттєво не впливала на показники якості
продукції, тоді як зростання їх титру призводило до збоїв у
технологічному циклі і навіть до зупинення виробництва. При цьому,
внаслідок фаголізису культур закваски, спостерігали активний ріст
сторонньої мікрофлори, що суттєво погіршувало якість продукту та
знижувало рівень його епідеміологічної безпеки. Проблема запобігання
виникнення ситуації масового фаголізису в умовах виробництва полягає в
необхідності зниження титру фага у цільовому продукті до значень, нижчих
від 106 БУО/мл.

2. Серед виділених фагів домінували ізоляти, здатні лізувати штами
мезофільних (Lactococcus lactis) та термофільних (Streptococcus
salivarіus ssp. thermophilus) молочнокислих бактерій.

3. За даними електронно-мікроскопічних досліджень, усі фаги мали довгі
нескоротливі хвостові відростки, що є ознакою родини Siphoviridae,
порядку Caudovirales. За наявністю ізометричної голівки дев’ять ізолятів
віднесено до морфотипу В1; за ознакою видовженої голівки чотири ізоляти
віднесено до с2-подібних лактококових фагів морфотипу В2.

4. Білковий склад фагів представлений набором мажорних та мінорних
поліпептидів. Значення молекулярних мас знаходилися в межах 21,5–87 кДа.
Фаги морфотипу В2 характеризувалися чотирма мажорними поліпептидами з
молекулярними масами 72,5; 54; 43 і 29 кДа; фаг морфотипу В1 мав один
мажорний поліпептид молекулярною масою 29 кДа.

5. Встановлено високий ступінь серологічної спорідненості с2-подібних
фагів; між ізолятами морфотипів В1 та В2 спільних антигенних
детермінант не виявлено.

6. Досліджено чутливість фагів до фізико-хімічних факторів:

Процес термоінактивації описувався двокомпонентними кривими, фаги
відрізнялися термостійкістю: константа термоінактивації найчутливішого
до температури фага у молоці при 60°С для фракції I становила
65,5Ч10-2Чхв-1, а найстійкішого при 70°С – 126,9Ч10-2Чхв-1. Встановлено,
що жоден із режимів пастеризації молока, які використовуються для
виробництва кисломолочних продуктів, не забезпечує повної інактивації
фагів. Віруси втрачали інфекційність лише за режиму пастеризації,
прийнятого для приготування закваски.

Для репродукції переважної більшості виділених фагів необхідні іони
кальцію. Це вказує на можливість розробки та використання в маточному
виробництві декальцинованих середовищ (у тому числі із залученням
цитрату натрію) для запобігання фаголізису заквасок у вітчизняній
молокопереробній галузі.

Фаги здатні зберігати інфекційність за умов знаходження у ропі, яку слід
вважати джерелом фагового забруднення на сироварних заводах та брати до
уваги на етапі проектування заводу та проводячи ротації заквасок.

7. Для виявлення фагів молочнокислих бактерій за умов виробництва як
тест-культури запропоновано використовувати три штами молочнокислих
бактерій, які забезпечували найвищий рівень репродукції досліджуваних
фагів та не містили індуцибельних профагів.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Шугай М.О., Бойко А.Л., Рожанська О.М., Кігель Н.Ф. Виявлення фагів
молочнокислих бактерій в умовах виробництва // Агроекологічний журнал. –
2004. – № 3. – С. 69–71.

Шугай М.О., Бойко А.Л. Термоінактивація фагів молочнокислих бактерій //
Вісник КНУ ім. Т. Шевченка. – 2004. – № 42–43. – С. 109–110.

Шугай М.О., Шевченко Т.П., Бойко А.Л. Серологічні властивості фагів
молочнокислих бактерій // Вісник КНУ ім. Т. Шевченка. – 2005. – № 44, С.
34–35.

Бойко А.Л., Шугай М.О. Виділення та характеристика фагів молочнокислих
бактерій // Доповіді НАН України. – 2005. – № 8. – С. 157–162.

Шугай М.О., Бойко А.Л. Виявлення лактофагів на молокозаводах України //
IV Всеукраїнська наукова конференція студентів та аспірантів „Біологічні
дослідження молодих вчених на Україні”. 24–25 квітня. – Київ, 2004. – С.
64–65.

Шугай М.О., Бойко А.Л. Чутливість фагів молочнокислих бактерій до дії
температури // Х з’їзд Товариства мікробіологів України. 15–17 вересня.
– Одеса, 2004. – С. 373.

Шугай М.О., Бойко А.Л. Біологічні властивості фагів молочнокислих
бактерій // IV Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”, 27–30
вересня. – Київ, 2004. – С. 28.

АНОТАЦІЯ

Шугай М.О. Біологічні та фізико-хімічні властивості фагів молочнокислих
бактерій, виділених за умов виробництва молочних ферментованих
продуктів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. – Київський національний
університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.

Роботу присвячено вивченню біологічних та фізико-хімічних властивостей
фагів молочнокислих бактерій (МКБ), поширених на підприємствах молочного
профілю України. Простежено негативний вплив фагів високого титру на
якість та рівень епідеміологічної безпеки цільового продукту.
Встановлено, що проблема запобігання виникнення ситуації масового
фаголізису полягає у необхідністі зниження фагового титру в цільовому
продукті до значень, нижчих від 106 БУО/мл.

Уперше в Україні досліджено на фагочутливість культури термофільних
стрептококів та показано здатність фагів перехресно лізувати штами
мезофільних (Lactococcus lactis) та термофільних (Streptococcus
salivarіus ssp. thermophilus) МКБ.

Досліджено морфолого-структурну організацію фагових часток та їх
поліпептидний склад. Встановлено високий ступінь серологічної
спорідненості с2-подібних фагів; між ізолятами морфотипів В1 та В2
спільних антигенних детермінант не виявлено.

Досліджено чутливість фагів до фізико-хімічних факторів та стабільність
вірусів за різних умов зберігання.

Ключові слова: фаги молочнокислих бактерій, літична активність,
термоінактивація, інгібування репродукції фагів, джерела фагової
інфекції.

АННОТАЦИЯ

Шугай М.А. Биологические и физико-химические свойства фагов
молочнокислых бактерий, выделенных в условиях производства молочных
ферментированных продуктов. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.06 – вирусология. Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению биологических и физико-химических свойств
фагов молочнокислых бактерий (МКБ), распространенных на предприятиях
молочной промышленности Украины. Фаги выделяли из образцов кисломолочных
продуктов, смывов с оборудования, а также подсырних сыворотки и рассола.
Титры бактериофагов составляли 102–109 БОЕ/мл. Изучено влияние титра
фагов на технологический процесс и качество получаемого продукта.
Показано, что проблема предупреждения возникновения ситуации массового
фаголизиса состоит в необходимости снижения фагового титра в целевом
продукте к уровню ниже 106 БОЕ/мл.

Впервые в Украине исследованы на фагочувствительность культуры
термофильных стрептококков и впервые показано способность фагов
перекрестно лизировать штаммы мезофильных (Lactococcus lactis) и
термофильных (Streptococcus salivarіus ssp. thermophilus) МКБ. Индексы
литической активности бактериофагов находились в пределах 0,02–0,2.

Изучена морфолого-структурная организация фаговых частиц. Вирусы
характеризовались наличием длинного несокращающегося отростка, что,
согласно современной классификации бактериальных вирусов, является
признаком порядка Caudovirales, семейства Siphoviridae. Соответственно
морфологии головки девять изолятов отнесено к к морфотипу В1, четыре – к
морфотипу В2, группе с2.

Белковый состав фагов представлен набором мажорных и минорных
полипептидов. Значения молекулярных масс находились в пределах 21,5–87
кДа. Фаги группы с2, морфотипа В2 характеризовались четырьмя мажорными
полипептидами молекулярных масс 72,5; 54; 43 и 29 кДа; у фага морфотипа
В1 обнаружен один мажорный полипептид молекулярной массой 29 кДа.

С использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа
установлено высокое серологическое сродство с2-подобных фагов; между
изолятами морфотипов В1 и В2 общие антигенные детерминанты не
обнаружены.

Исследована чувствительность фагов к физико-химическим факторам. Процесс
термоинактивации фагов описан двухкомпонентными кривыми – во время
первой фазы (I) наблюдали быстрое, а во время второй (II) – более
медленное снижение инфекционности вирусов. Исследуемые изоляты
отличались термоустойчивостью: константа инактивации наиболее
чувствительного к температуре фага при 60°С для фракции I составляла
65,5Ч10-2Чмин-1, а наиболее устойчивого – 126,9Ч10-2Чмин-1 при 70°С.
Показано, что в большей или меньшей степени вирусы могут “выживать”
(сохранять инфекционность) при всех режимах пастеризации молока,
используемых на производстве для получения кисломолочных продуктов.
Полную инактивацию фагов гарантирует только режим пастеризации, принятый
для приготовления производственной закваски.

На основании экспериментальных данных о потребности ионов Са2+ для
репродукции большинства исследуемых фагов рассматривается возможность
разработки и использования в маточном производстве декальцинированных
сред с целью предупреждения вспышек фаголизиса на предприятиях
отечественной молочной промышленности.

Показано, что бактериофаги способны сохранять инфекционность находясь в
рассоле, применяемом для соления сычужных сыров. Поэтому рассол является
одним из источников фаговой инфекции на производстве, на что следует
обратить внимание на этапе проектирования завода и во время ротации
заквасок.

Для проведения фагового мониторинга на предприятиях молочной
промышленности в качестве тест-культур предложено использовать три
штамма МКБ, которые обеспечивают самый высокий уровень репродукции
исследуемых фагов и не содержат индуцибельных профагов.

Ключевые слова: фаги молочнокислых бактерий, литическая активность,
термоинактивация, ингибирование репродукции фагов, источники фаговой
инфекции.

SUMMARY

Shuhai M. А. Biological and physico-chemical properties of phages of
lactic acid bacteria isolated during the manufacture of fermented dairy
products. – Manuscript.

The dissertation on a scientific degree of the candidate of biological
sciences on a speciality 03.00.06. – virology. Taras Shevchenko’ Kyiv
National University, Kyiv, 2006.

The thesis examines biological properties of the phages active to meso-
and thermophilic lactic acid bacteria (LAB) and widespread at the dairy
plants of Ukraine. The negative influence of high-titre phages on
quality and level of epidemiological security of the end product was
researched. It was established that the problem of preventing mass
phagolysis lies in the necessity of decreasing the phage titre in the
end product to values below 106 PFU/ml.

For the first time in Ukraine cultures of the thermophilic streptococci
were examined for their phage sensitivity and was shown the ability of
phages to cross lyse cultures of mesophilic (Lactococcus lactis) and
thermophilic (Streptococcus salivarius ssp. thermophilus) LAB.

The morphologico-structural organization of the phages and structure of
phages proteins was studied. A high level of serological affinity of
c2-like phages was established; common antigenic determinants between
isolates of B1 and B2 morphotypes were not found.

Investigated was the sensitivity of phages to physico-chemical factors
and stability of viruses during preservation in different conditions.

Key words: phages of lactic acid bacteria, phagolysis,
thermo-inactivation, inhibition of phage reproduction, sources of phage
infection.

PAGE 14

Рис. 1. Електронограма фагів: а – 1Ф; б – 3Ф; в – 9Ф; г – 4Ф; д – 8Ф;

інструментальне збільшення 40 000

Тестування 9Ф

Тестування 3Ф

Тестування 8Ф

Рис. 3. Серологічна спорідненість фагових ізолятів у гомо- та
гетерологічних системах

Рис. 4. Ефективність режимів заводської пастеризації молока

Примітка. Початкові титри фагів становили 9Ч107 БУО/мл

1. 74–76єС, витримка 15–20 с (сир сичужний);

2. 85–87єС, витримка 10 хв

(сир кисломолочний, кефір);

3. 92єС, витримка 3 хв (йогурт);

4. 93–95єС, витримка 20 хв (закваска);

Рис. 5. Інгібування репродукції фага 8Ф залежно від концентрації цитрату
натрію в агаризованому середовищі

Рис. 6. Моніторинг (за оптичною густиною) репродукції фага 8Ф у
гідролізованому молоці з різним вмістом цитрату натрію та без нього

Примітка. Початковий титр фага 9Ч107 БУО/мл

Рис. 7. Моніторинг (за рН) репродукції фага 8Ф у гідролізованому молоці
з різним вмістом цитрату натрію

Примітка. Початковий титр фага 9Ч107 БУО/мл

Рис. 8. Моніторинг (за оптичною густиною) репродукції фагів 3Ф та 9Ф у
гідролізованому молоці з цитратом натрію та без нього

Примітка. Початковий титр фагів 9Ч107 БУО/мл

Рис. 9. Інфекційність фагів при зберіганні у ропі:

а – приготовленій на основі водопровідної води;

б – приготовленій на основі сироватки

Похожие записи