Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Пензенский государственный педагогический университет

им. В. Г. Белинского

Факультет Естественно-географический

Кафедра биохимии

Дипломная работа

Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в
сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом
воздействии

Студент

_____________________ Лобзина Е. С.

Руководитель

______________________ Сметанин В. А.

К защите допустить.

Протокол № от « _ » 200 г

Зав. кафедрой

____________________________ Генгин М.Т.

Пенза, 2009 г.

Содержание

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Противоопухолевая химиотерапия

1.1.1. Механизм действия противоопухолевых препаратов

1.1.2. Осложнения химиотерапии

1.2. Пептидергическая система

1.2.1. Механизм образования активных форм регуляторных пептидов

1.2.2. Роль биологически активных пептидов

1.2.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов

1.2.3.1. Ангиотензинпревращающий фермент

1.2.3.2. Карбоксипептидаза N

1.3. Функционирование пептидергической системы при онкологических
заболеваниях

1.4. Роль оксида азота (II) в онкогенезе

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материал исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы N

2.2.2. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

2.2.3. Метод определения содержания белка

2.2.4. Метод количественного определения оксида азота (II) в сыворотке
крови

2.3. Статистическая обработка результатов исследования

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови
онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

3.2. Исследование ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови
онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

3.3. Исследование содержания нитрит–иона в сыворотке крови у
онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

Выводы

Список литературы

Список сокращений

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

ККС – калликреин-кининовая система

КПN – карбоксипептидаза N

ЛАП – лейцин-аминопептидаза

ММП – матриксные металлопротеазы

РААС – ренин-ангиотензин-альдостероновая система

РЩЖ – рак щитовидной железы

iNOS – индуцибельная NO-синтаза

NO – оксид азота II

TNFa – фактор некроза опухолей

Введение

В структуре заболеваемости и смертности онкологическая патология
занимает одно из ведущих мест. С каждым годом число людей, страдающих
этим заболеванием, растет [2,34,49].

Развитие опухоли в организме приводит посредством различных механизмов к
глубоким физико-химическим, нейрогуморальным и ферментативным сдвигам.
Опухоли паразитируют в организме, извлекая необходимые для роста
вещества из здоровых клеток и секретируя токсины локально или в
системный кровоток [5,18,30,38,49].

Существует три направления лечения раковых заболеваний: хирургическое,
радиологическое и химиотерапевтическое. Химиотерапия злокачественных
опухолей – это использование лекарственных веществ, тормозящих
пролиферацию или необратимо повреждающих опухолевые клетки [10,30,43].
Главной причиной, послужившей стимулом к развитию лекарственной терапии
злокачественных опухолей, явилась неудовлетворенность результатами
хирургического и лучевого лечения [7].

Особенность применения химиопрепаратов заключается в близкой
сопряженности лечебного и токсического эффекта. К побочным действиям
относят проявления нейро-, гепато-, кардиотоксичности, нарушения системы
свертывания крови и эндокринных органов [15,25,32,37]. Итогом побочных
действий являются, в том числе, нарушения в функционировании
калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем, важными
компонентами которых являются ангиотензинпревращающий фермент и
карбоксипептидаза N [52]. Кроме того, эти ферменты влияют на уровень
брадикинина, стимулирующего продукцию оксида азота (II), который, в свою
очередь, являясь мультифункциональной молекулой, может регулировать
пролиферативную активность и апоптоз опухолевых клеток [28].

Целью настоящей работы было изучение роли карбоксипептидазы N и
ангиотензинпревращающего фермента в период химиотерапии у онкологических
больных.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить активность ангиотензинпревращающего фермента,
карбоксипептидазы N и концентрацию оксида азота (II) у здоровых людей.

2. Изучить активность ангиотензинпревращающего фермента,
карбоксипептидазы N и концентрацию оксида азота (II) у онкологических
больных до химиотерапии.

3. Изучить активность ангиотензинпревращающего фермента,
карбоксипептидазы N и концентрацию оксида азота (II) у онкологических
больных после химиотерапии.

4. Установить корреляционные взаимосвязи между активностью ферментов и
концентрацией оксида азота (II) в сыворотке крови у онкологических
больных до и после химиотерапии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Изучена активность
карбоксипептидазы N, ангиотензинпревращающего фермента и концентрация
оксида азота (II) в сыворотке крови у онкологических больных в период
химиотерапии. Установлены корреляционные взаимосвязи между активностью
исследуемых ферментов и уровнем оксида азота (II) при
химиотерапевтическом воздействии.

Полученные результаты позволяют расширить наши представления о
биологической роли карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего
фермента, а также получить более полную картину о влиянии
химиопрепаратов на организм при онкологических заболеваниях и могут быть
использованы для коррекции терапии, оценки его эффективности и контроля
больных после окончания курса лечения.

Апробация работы Материалы данной работы представлены на 58 научной
конференции студентов ПГПУ, на XVI Международной научно-практической
конференции «Экология и жизнь» (24-25 апреля 2009 г.).

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Противоопухолевая химиотерапия

Химиотерапия злокачественных опухолей предполагает применение
лекарственных веществ избирательно действующих на рост опухоли и
опухолевую ткань. Противоопухолевый эффект определяется соотношением
действия вещества или продуктов его превращения в организме
непосредственно на опухолевые клетки и организм в целом [9,10,40,43].

Основные принципы химиотерапии опухолей:

1. Подбор препарата соответственно спектру его противоопухолевого
действия.

2. Выбор оптимальной дозы и режима введения препарата, обеспечивающих
лечебный эффект без побочных явлений.

3. Учет факторов, требующих коррекции доз и режимов во избежание тяжелых
осложнений химиотерапии [17,25].

Существует прямая зависимость между разовой и суммарной дозой и
терапевтическим эффектом. Доза препаратов должна быть максимально
переносимой и вызывать максимальный противоопухолевый эффект
[9,37,43,44].

Химиопрепараты обладают определенной специфичностью на различные виды
злокачественных новообразований. Быстро растущие опухоли более
чувствительны к химиотерапии, чем медленно растущие. Метастазы опухолей
более чувствительны к химиопрепаратам, чем первичные новообразования.
Эффективность химиотерапии обратно пропорциональна массе опухоли, при
которой начинают лечение. Чем больше опухоль, тем меньше эффект, и
наоборот [25,46,55].

Современная химиотерапия – это комбинированная химиотерапия, когда
используются одновременно от 2 до 6 цитостатиков с разным механизмом
действия. При этом исходят из представления о том, что нарушения
различных биохимических реакций в опухолевой клетке уменьшают шансы на
то, что уцелеют резистентные клоны опухоли. Обычно в эти комбинации
включают препараты с разной токсичностью, что может увеличить
противоопухолевый эффект без увеличения общей токсичности [10,37].

Основной проблемой химиотерапии является неспособность цитостатиков
полностью уничтожить опухоль в большинстве случаев. Клеточная популяция
опухоли весьма гетерогенна, что делает вероятным существование клеточных
линий, резистентных к химиотерапии. По мере гибели чувствительных к
цитостатикам клеток химиорезистентные штаммы получают избирательное
преимущество в росте [7,25,45].

1.1.1 Механизм действия противоопухолевых препаратов

По своему происхождению и механизму действия существующие
противоопухолевые препараты делятся на следующие группы:

1. Алкилирующие агенты: хлорбутин, эмбихин, допан, ломустин.

2. Антиметаболиты: метотрексат, меркаптопурин, фторурацил, фторафур.

3. Антибиотики: дактиномицин, блеомицин, рубомицин, адриамицин.

4. Алкалоиды растительного происхождения: винбластин, винкристин, таксол
[10,25,30].

По происхождению химиопрепараты можно разделить на синтетические и
природные. К синтетическим препаратам относятся алкилирующие агенты и
антиметаболиты. К продуктам природного происхождения относят антибиотики
и алкалоиды. Противоопухолевые средства способны уничтожать опухолевую
клетку (цитотоксический эффект) или угнетать их пролиферативную
активность (цитостатический эффект) [43,51]. Механизм действия
цитостатических веществ основан на их реагировании с молекулами жизненно
важных химических соединений, составляющих субстрат клеток (белками,
нуклеиновыми кислотами, ферментами), вследствие чего наступает изменение
структуры и физико-химических свойств внутриклеточных компонентов,
подавление биокаталитических процессов, лежащих в основе обмена веществ,
нарушение митотического процесса и гибель клеток [51].

Вещества алкилирующего действия взаимодействуют с нуклеиновыми
основаниями двойной спирали ДНК. Они присоединяются к ДНК путем реакции
алкилирования – замещения атома водорода нуклеинового основания на
метильную группу цитостатика. В результате образуются аномальные пары
оснований. Это приводит к прямому подавлению транскрипции либо к
образованию дефектной РНК и синтезу аномальных белков.

Антиметаболиты. Структурная или функциональная схожесть с молекулами-
метаболитами позволяет им блокировать синтез нуклеотидов и тем самым
угнетать синтез ДНК или РНК либо напрямую встраиваться в структуры ДНК и
РНК, блокируя процессы репликации и синтеза белков.

Антибиотики. Непосредственно воздействуют на ДНК путем интеркаляции,
запускают механизм свободно-радикального окисления с повреждением
мембран клеток и внутриклеточных структур, а также ДНК. Нарушение
структуры ДНК ведет к нарушению процессов репликации и транскрипции.

Алкалоиды растительного происхождения. Цитостатический эффект
винка-алколоидов обусловлен деполимеризацией тубулина. Процесс
клеточного деления останавливается в фазе митоза. Другие препараты
способствуют полимеризацию тубулина, вызывая образование дефектных
микротрубочек и необратимую остановку клеточного деления. По-видимому,
противоопухолевый эффект проявляемый некоторыми алкалоидами зависит
также от подавления ими некоторых других биохимических процессов
[10,22,25,30,40,43].

1.1.2 Осложнения химиотерапии

Одна из проблем химиотерапии – токсичность цитостатических препаратов
[25]. Применяемые даже в терапевтических дозах химиопрепараты вызывают
целый ряд побочных явлений, что связано с их повреждающим действием на
ряд органов и систем организма. Невысокая избирательность действия
противоопухолевых препаратов объясняется отсутствием качественных
отличий в биохимии, темпе роста, способности к репарации после
повреждения между опухолевыми и нормальными клетками. Наряду с
подавлением ими различных этапов обмена нуклеиновых кислот в опухолевых
клетках, они оказывают влияние и на обмен нуклеиновых кислот быстро
размножающихся популяций нормальных клеток – иммунокомпетентных,
костного мозга, желудочно-кишечного тракта, репродуктивных органов
[15,17,25,29,41].

Ряд побочных эффектов сравнительно специфичен для отдельных
цитостатиков. К таким побочным действиям относят проявления нейро-,
гепато-, кардиотоксичности, нарушения системы свертывания крови,
эндокринных органов. Подобные специфические осложнения химиотерапии
опухолевых заболеваний зависят от особенностей фармакологических свойств
цитостатиков и их метаболизма [15,37].

Нейротоксичность обнаруживается лишь у некоторых противоопухолевых
препаратов независимо от их способности проникать через ГЭБ. Проявляется
в слабости скелетной мускулатуры, судорожных мышечных сокращений,
развитии глаукомы. Имеются данные о нарушениях обмена аланина, лейцина и
серина в синапсах [15,17].

Гепатотоксическое действие цитостатиков выражается в разной степени.
Наибольшую часть осложнений составляют гепатопатии, не выходящие за
пределы отклонений в показателях лабораторных тестов. При длительной
цитостатической терапии наблюдаются гипербилирубинемия и
гиперхолестеринемия, снижение уровня протромбина и коагуляционных
факторов крови. При лечении производными платины гепатотоксичность
проявляется в обратимом повышении аминотрансфераз. Антиметаболиты
вызывают изменение отдельных функций печени вплоть до желтухи [15,44].

Кардиотоксическое побочное действие в основном присуще противоопухолевым
антибиотикам. Отмечают боли в области сердца и нарушение ритма
[15,44,49].

Нефротоксичность (характерно для производных платины) зависит от дозы
введенного препарата и проявляется повышением содержания мочевины,
мочевой кислоты и креатинина в плазме, снижением креатинового клиренса
[44].

Алкалоиды наряду с общетоксическим действием влияют на утилизацию
глутаминовой кислоты и аргинина, определенным образом действуют на обмен
пролина, глутамина, триптофана. Усиливают отдачу гипоксантина, но не
тормозят утилизацию клетками аденина. Не вызывают существенных нарушений
со стороны печени за исключением уменьшения содержания альбуминов крови.
Со стороны почек отмечают уменьшение содержания натрия [44].

Антиметаболиты угнетают гемопоэз, обладают антикоагулянтными свойствами,
что проявляется в нарушении свертываемости крови.

Проявление токсичности лимитирует использование противоопухолевых
агентов. Развитие осложнений приводит к необходимости снижения дозы
цитостатиков или увеличению интервалов между курсами [25,40,43].

1.2 Пептидергическая система организма

1.2.1 Механизм образования активных форм регуляторных пептидов

Активные формы пептидов представляют собой полифункциональную группу
веществ, которым отводится важная роль природных биорегуляторов. Это
природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из
остатков ?-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными)
связями C(O)–NH. Большинство регуляторных пептидов образуется из
физиологически неактивных белков-предшественников, путем
посттрансляционного процессинга [32]. Секретируемые белково-пептидные
продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР. Благодаря
наличию на N-конце сигнальной последовательности, состоящей из остатков
гидрофобных аминокислот, обеспечивается транслокация пептида через
мембраны ЭПР. В полости ЭПР отщепление этой последовательности
осуществляется при участии сигнальной пептидазы. Далее процессинг
осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному
ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [14,61].

Сначала под действием эндопептидаз образуются неактивные пептиды,
содержащие со стороны С- или N-конца “лишние” остатки аминокислот,
которые затем удаляются экзопептидазами с карбоксипептидазо-B- и
аминопептидазо-B-подобной активностью [4].

Уровень биологически активных пептидов в организме в значительной
степени определяется активностью ферментов их обмена, к которым в
частности принадлежат АПФ и КПN [13,27,32].

В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности данных
ферментов у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии,
которое прямо или косвенно влияет на какую-либо систему организма.

1.2.2 Роль биологически активных пептидов

Область биологической активности пептидов чрезвычайно широка. Они влияют
на состояние сердечно-сосудистой, иммунной, половой, эндокринной,
пищеварительной и других систем, изменяют энергетический обмен в
организме, участвуют в регуляции работы центральной нервной системы. КПN
и АПФ играют важную роль в обмене ангиотензина и брадикинина [31,54].

Ангиотензины – пептиды, образующиеся в организме из белка плазмы
ангиотензиногена. Почечный фермент ренин отщепляет от молекулы
ангиотензиногена неактивный декапептид ангиотензин I. Другой фермент
крови – АПФ – преимущественно в ткани легких отщепляет с карбоксильного
конца молекулы ангиотензина I дипептид с образованием ангиотензина II.
Ангиотезин II является физиологическим фактором роста клеток, обладает
митогенными (учащающими деление) свойствами и, тем самым, стимулирует
гиперплазию и пролиферацию клеток. Пептид повышает активность
симпатоадреналовой системы, увеличивая синтез адреналина и обусловливая
высвобождение норадреналина из окончаний симпатических нервов, что
стимулирует гипертрофию сердца и сосудов. Ангиотензин II оказывает
сильное сосудосуживающее действие, вызывает быстрое и длительное
повышение артериального давления. Кроме того, он увеличивает синтез
альдостерона, что сопровождается реабсорбцией натрия и воды. В
надпочечниках из ангиотензина II образуется ангиотензин III, обладающий
положительной инотропной активностью. Далее при участии аминопептидазы N
образуется ангиотензин IV, предположительно, участвующий в регуляции
гемостаза [31,36,41,54].

Брадикинин – полипептид, состоящий из 9 аминокислот. Брадикинин способен
расширять просвет периферических и коронарных сосудов, снижать
артериальное давление, способствует синтезу NО в эндотелии. Пептид
повышает проницаемость капилляров, сокращает гладкую мускулатуру бронхов
и других органов, вызывает болевой эффект. Он стимулирует синтез и
освобождение простагландинов и фактора некроза опухолей ( TNFa ) в
различных тканях, освобождение ряда интерлейкинов, способствует
процессам репарации и обладает инсулиноподобным действием, стимулируя
захват глюкозы периферическими тканями, модулирует передачу нервных
импульсов в ЦНС и периферической нервной системе, изменяет состояние
гематоэнцефалического барьера [13,52,63]. Брадикинин участвует в широком
спектре физиологических и патофизиологических эффектов, и особенно в
развитии воспаления [52].

Разрушение брадикинина обусловлено наличием в крови и тканях
высокоактивных ферментов – кининаз, осуществляющих физиологический
контроль уровня кининов. Наиболее важную роль в метаболизме брадикинина
играют два фермента – кининаза I (Карбоксипептидаза N), и кининаза II
(ангиотензинпревращающий фермент).

1.2.3 Ферменты обмена вазоактивных пептидов

1.2.3.1 Ангиотензинпревращающий фермент. Ангиотензинпревращающий фермент
(КФ3.4.15.1, АПФ, ангиотензин – конвертирующий фермент, кининаза II,
дипептидилкарбоксипептидаза I,) является ключевым ферментом, связывающим
между собой ренин – ангиотензиновую и калликреин – кининовую системы.
Фермент присутствует в плазме крови, нервных клетках, клетках почечных
канальцев, сердечной мышце, матке, слюнных железах. Основная локализация
в организме человека – эндотелий сосудистой стенки [3]. По структуре АПФ
представляет собой гликопротеин, существующий в виде мембрано- связанной
формы и являющийся интегральным белком. Молекула фермента,
представляющая собой одну полипептидную цепь, локализована
экстрацеллюлярно, гидрофобный трансмембранный участок включает 17
аминокислотных остатков и находится в положении 1230-1247, а
внутриклеточный гидрофильный участок состоит из 30 остатков. Имеется и
растворимая форма АПФ отличающаяся от мембраносвязанной отсутствием
трансмембранного и внутриклеточного участков. Мембраносвязанная форма
имеет молекулярную массу 170кДа и включает С- и- N-гомологичные домены,
обладающие энзиматической активностью. Предполагается, что домены АПФ
могут иметь разные функции в организме. Возможно, между N- и C-доменами
имеется участок, доступный для ферментативного расщепления. Таким
образом, N-домен может освобождаться или из находящегося в растворе
полноразмерного фермента, или из мембраносвязанной формы, составляя
С-домен на мембране [21]. В принципе такой процесс может происходить где
угодно в организме. Вопрос о функциональной роли доменов до сих пор
остается неясным. Однако полученные к настоящему времени данные об
обнаружении эндогенных субстратов, специфичных для N-домена, и о разном
взаимодействии ингибиторов АПФ с доменами, а также присутствие в
организме однодоменных форм фермента свидетельствуют в пользу
физиологической значимости доменов. Каждый из доменов содержит активный
центр, которые отличаются по скорости гидролиза пептидов, по степени
торможения специфичными ингибиторами АПФ [54,56].

АПФ – металлопротеиназа, которая содержит в активном центре ион цинка и
активируется ионами Сl-, NO3- ,SO42-, ингибируется соединениями,
содержащими SH-группу, хелаторами (ЭДТА, о-фенантролин),
брадикининпотенциирующим фактором (Ki = 40 нм), 2-меркаптоэтанолом.
Кроме того, существуют специфические ингибиторы АПФ – каптоприл
(Кpicscalex1000100090000039d00000002001c00000000000500000009020000000005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 = 20
нм), лизиноприл
(Кpicscalex1000100090000039d00000002001c00000000000500000009020000000005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= 3-10
нм), и эналаприл
(Кpicscalex1000100090000039d00000002001c00000000000500000009020000000005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=25-35 нм) [4,20].

рН-Оптимум действия АПФ составляет 7,2-7,6. Препараты АПФ, выделенные из
различных органов человека (легких, сердца, печени, мозга, плазмы крови)
существенно не различались по следующим физико-химическим параметрам:
молекулярной массе, изоэлектрической точке, рН-оптимуму, константе
ингибирования известными ингибиторами АПФ. При этом их иммунологические
и каталитические свойства могут быть различными [21].

При действии на физиологические субстраты АПФ может вызывать либо
превращение неактивной формы в активную, инактивацию биологически
активного пептида, либо трансформацию его активности. Так, участвуя в
отщеплении С-концевого гистидиллейцина от ангиотензина I, он превращает
его в физиологически активный ангиотензин II, инактивирует брадикинин
путем последовательного удаления двух С-концевых дипептидов, расщепляет
такие функционально активные пептиды, как мет-энкефалин, нейротензин,
эндорфин, вещество Р, (действуя в этих превращениях как эндопептидаза),
играя роль одного из регулирующих факторов в обмене этих биологически
активных веществ [20,36,41]. АПФ принимает участие в процессинге
энкефалинов, гидролизуя энкефалинсодержащие пептиды –
Met-энкефалин-Arg6-Phe7 в мет-энкефалин и Met-энкефалин- Arg 6-Glu7-Leu8
в Met-энкефалин-Arg6 [4].

АПФ является физиологическим регулятором концентрации в плазме пептида
AcSDKP (N-AcSer-Asp-Lys-Pro), влияющего на пролиферацию гемопоэтических
и других клеток.

Фермент участвует в регуляции артериального давления. Кроме того, он
вовлечен в реализацию таких функций как репродуктивные процессы,
защитные и иммунные реакции организма. Участие фермента в том или ином
процессе определяется как его локализацией, так и особенностью действия
на регуляторные пептиды [20,56]. Являясь фактором, связывающим ККС и
РААС – систем, вовлеченных в регуляцию большинства функций организма,
реагирует на изменения, возникающие при патологических процессах. В
связи с этим представляет интерес изучение активности фермента у
онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.

1.2.3.2 Карбоксипептидаза N. Карбоксипептидаза N (КФ 3.4.12.7. КП N,
аргинин-карбоксипептидаза, кининаза I) обнаружена Erdos и соавт. в
плазме крови человека в 1962 году. Названа так потому, что по свойствам
и специфичности он близок к панкреатической карбоксипептидазе B, но
отличается от нее тем, что не имеет неактивного предшественника.
Относится к ферментам вневизикулярной локализации – внеклеточной
жидкости и внешней поверхности цитоплазматических мембран. Фермент
локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов,
слизистой оболочке носа, моче [13].

Фермент имеет Mr 280 кДа и состоит из четырёх субъединиц трёх типов:
двух с Mr 88 кДа и по одной с Mr 55 кДа и 48 кДа. Субъединицы с Mr 88
кДа гликозилированы (на долю углеводов приходится 29% массы), не
обладают ферментативной активностью и, по-видимому, стабилизируют
фермент в плазме крови [61]. Субъединицы с Mr 48 кДа и 55 кДа обладают
ферментативной активностью и не содержат в своём составе углеводных
остатков [13,58].

КП N относится к металлокарбоксипептидазам. Активный центр фермента
имеет форму кармана, в полости которого находится ион Zn2+. В цельной
сыворотке крови человека фермент активируется ионами Co2+ и в меньшей
степени Ni2+, инактивируется ионами тяжелых металлов,
бензоилом–L-аргинином, и хелатными соединениями. Тормозящее действие
ингибиторов КП N проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo.
При внутривенном введении ингибитора (2-меркаптоэтанол, ЭДТА)
усиливалось гипотензивное действие брадикинина. Каталитическая
активность фермента оптимальна при pH 7,0 – 7,8, и зависит от природы
буферной смеси. В фосфатном буфере максимум активности находится при pH
7,5; в зоне pH 7,0 – 6,0 наблюдается резкое падение активности; в
трис-буфере pH – оптимум составляет 7,0. Фермент чувствителен к кислой
среде. При pH среды 2,0 – 3,0 он инактивируется необратимо, а при pH 6,5
– 5,0 – обратимо. Трапезникова С.С. и Пасхина Т.С. провели работу по
изучению свойств карбоксипептидазы N из сыворотки крови человека,
очищенного в 273 раза. Полученные препараты, по данным
ультрацентрифугирования, состояли из двух компонентов с константой
седиментации 5,3S и 6,5S. Отмечена четко выраженная зависимость фермента
от температуры: максимальная активность проявляется при 37°С, при 30°С
она снижается наполовину. Лиофилизированные препараты сохраняют свою
активность в течение 6 месяцев [4,13].

Помимо способности отщеплять С-концевой аргинин в брадикинине (истинная
кининазная активность) и Met5-энкефалин-Arg6, лизин в
Met5-энкефалина-Lys6, карбоксипептидаза N гидролизует более простые
синтетические субстраты: гиппурил-L-аргинин, гиппурил–орнитин
(пептидазная активность), а также расщепляет эфиры
гиппурил-L-аргининовой кислоты [27]. При этом скорость расщепления
субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем
соответствующих пептидов с C-концевым аргинином. Скорость расщепления
гиппурил-аргининовой кислоты в несколько раз выше, чем
гиппурил-аргинина. Эстеразная активность фермента угнетается ионами
тяжелых металлов, в особенности Cd2+ , а также аргининовой кислотой и
ЭДТА [13].

Биологическая роль КП N во многом остаётся неясной. Инактивируя
брадикинин, она способна вовлекаться в регуляцию артериального давления
и тонуса кровеносных сосудов. Однако реальный вклад фермента в
инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Некоторые авторы
предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина
[57,62].

Активность КПN изменяется при воспалительных и аллергических реакциях,
так как подкисление реакции среды в тканях будет способствовать
накоплению кининов из-за торможения кининазной активности фермента.
Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии
воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в
крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1, вероятно,
что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [52,63].

Фермент участвует не только в процессинге энкефалинов, но и в их
инактивации. Являясь основным ферментом ККС, он участвует в морфогенезе
клеток, увеличении проницаемости сосудистой стенки, регуляции активности
каскадных протеолитических систем плазмы крови: гемокоагуляции,
фибринолиза, комплемента, развитии злокачественных новообразований
[13,52].

Таким образом, КП N вносит вклад в регуляцию многих физиологических
процессов и развитие патологических состояний. Поэтому, представляет
интерес исследование активности фермента при онкологических заболеваниях
в период химиотерапии.

1.3 Функционирование пептидергической системы при онкологических
заболеваниях

Злокачественный рост характеризуется изменением активности и спектра
ферментов. Ферментный спектр обусловлен локализацией, гистоцитогенезом и
степенью дифференцировки опухоли. Если в дифференцированной опухоли
ферменты соответствуют таковым данного органа или ткани, то при низкой
степени дифференцировки активность и спектр ферментов значительно
изменены. Большое значение придается ферментам в инвазии опухолевых
клеток. В трансформированных клетках протеиназ синтезируется заметно
больше, чем в нормальных клетках. При ряде злокачественных
новообразований наблюдается выход пептидаз в межклеточное пространство и
увеличение их активности. В сыворотке больных со злокачественными
опухолями можно часто обнаружить увеличение активности одних ферментов и
уменьшение других. Источником увеличения активности ферментов в
сыворотке может являться усиленное выделение его опухолью в кровяное
русло. При изучении локализации пептидазной активности в опухолях
человека высокая пептидазная активность была выявлена в периферических
отделах инвазивно растущих опухолей [19,26,27,41,59].

В процессе онкогенеза участвуют матриксные металлопротеазы (ММП).
Транскрипция этих ферментов зависит от целого ряда факторов: цитокинов,
факторов роста и некроза опухолей, химических агентов. Участие ММП в
опухолевой трансформации, а также в процессах инвазии и метастазирования
хорошо доказано in vitro и in vivo. Установлено, что экспрессия ММП
коррелирует с деструктивными изменениями в матриксе и с туморогенным
фенотипом клеток, а также зависит от вида опухоли и ткани. ММП могут
участвовать в процессе канцерогенеза, воздействуя на различные пути
передачи сигнала в клетке, основные компоненты соединительнотканного
матрикса, на межклеточные взаимодействия, а также продуцируя различные
биологически активные молекулы [35]. В опухолевых клетках может
образовываться большое количество коллагеназы (представитель семейства
ММП), мишенью действия которой является коллаген, представляющий собой
барьер для распространения опухолевого процесса. Ингибитор её активности
способен ограничивать инвазивность опухолевых клеток. Таким образом,
коллагеназы ассоциированы с возникновением метастазирующего фенотипа
клеток и играют ключевую роль в процессах инвазии и метастазирования. В
процесс неопластической трансформации вовлечены лизосомные цистеиновые
протеиназы. Ферменты деградируют многие белки и компоненты внеклеточного
матрикса, осуществляют деструкцию ткани. Эти протеиназы осуществляют
протеолиз короткоживущих белков, которые регулируют злокачественный рост
[29,33,35,55,60].

При раке молочной железы, раке легкого и раке толстой кишки увеличенный
уровень коллагеназы типа IV (матриксной металлопротеиназы типа 2,
желатиназы A) – один из признаков высокого риска метастазов.

При раке мочевого пузыря повышение уровня коллагеназы типа IV в крови
соответствует увеличению массы опухоли [33].

Многие опухоли характеризуются повышенной продукцией коллагеназы I типа,
гидролизующей основные компоненты экстрацеллюлярного матрикса и
соединительной ткани [35].

Отмечено изменение изоферментного спектра аминопептидазы. При раке
легких исчезает изофермент I растворимой аминопептидазы. При
злокачественных опухолях печени и желудка появляется новый пик
активности фермента [18]. В лейкозных клетках, полученных от больных
разными формами лимфопролиферативных заболеваний, обнаружены
аминопептидазы по крайней мере двух видов: металло- и SH-зависимые
ферменты. В кроветворных клетках была обнаружена аминопептидаза N,
главным образом, в популяциях миелоидно-моноцитарного ряда, находящихся
на разных стадиях дифференцировки, и рассматривалась как маркер этих
клеток. Активность лейцил-аминопептидазы (ЛАП) усиливается в ранние
сроки после наступления холестаза (механическая желтуха, вызванная
злокачественными новообразованиями). Наибольшее усиление активности
фермента при закупорке общего желчного протока опухолью, раке
поджелудочной железы [1,8,12]. При новообразованиях печени, наблюдается
увеличение активности лейцил–аминопептидазы сыворотки. В меньшей степени
активность ЛАП увеличивается при метастатических поражениях печени. У 46
% больных с опухолями описано увеличение активности фермента в моче. Но
его исследование не имеет диагностического значения при новообразованиях
ротовой полости и области шеи [1,26].

На поздних стадиях рака легких может быть выявлено снижение активности
АПФ[47,48].

При раке щитовидной железы (РЩЖ) в ткани (операционный материал)
наблюдался значительный рост активности сериновых и цистеиновых
протеолитических ферментов. Активность сериновых протеиназ при РЩЖ в 6
раз превышала таковую в контрольной ткани. Активность цистеиновых
протеиназ при РЩЖ в 6 раз была выше, чем в контрольной ткани. Это
послужило основанием для использования данных показателей как
дополнительных критериев РЩЖ [35,39].

У женщин со II стадией злокачественного поражения эндометрия
исследовалась пептидгидролазная активность сыворотки крови.
Исследования, проведенные в разновозрастных группах доноров, не выявили
достоверных изменений в активности изучаемых протеиназ. Активность
трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови достоверно увеличивалась у
онкобольных женщин и имела тенденцию к увеличению с возрастом.
Активность лизосомных катепсиноподобных протеиназ в сыворотке крови
онкологических больных в 2,5-2,7 раза выше по сравнению с аналогичными
показателями здоровых женщин, что может свидетельствовать об инвазивной
стадии данного процесса, который характеризуется нарушением целостности
здоровой ткани и стабильности клеточных мембран. С другой стороны данный
процесс может сопровождаться усилением биосинтеза изучаемых протеиназ
или снижением биосинтеза их эндогенных ингибиторов [19,35].

В облученной опухолевой ткани при раке почки было обнаружено, повышение
активности ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ в 4 и 5,5 раз,
и снижение ферментативной активности на 74% и 45% для сериновых и
цистеиновых протеиназ, соответственно. При сопоставлении активности
протеолиза в опухолевой ткани после лучевой терапии и в необлученной
опухолевой ткани обнаружено снижение ферментативной активности сериновых
и цистеиновых протеиназ. Их активность под влиянием лучевой терапии
уменьшалась, составляя всего 7% и 20% от активности до облучения, и
после облучения не изменялась, а активность ингибитора цистеиновых
протеиназ – увеличивалась в 2 раза [35,59,60].

При злокачественных образованиях толстой кишки активность нейтральных и
кислых протеиназ в опухолевой ткани в 1,76 – 2 раза выше, чем в
неизмененной ткани кишки. После предоперационного облучения прямой кишки
активность протеиназ в облученной опухоли оказывается в 2,8 – 3,58 раза
ниже, чем в опухоли не подвергнутой облучению [1,11].

В сыворотке крови онкологических больных (рак легкого, рак молочной
железы) исследовали некоторые компоненты калликреин-кининовой системы, а
также активность “нейтральных” и “кислых” протеаз и их ингибиторов до и
после терапевтического нейтронного облучения. Исследования показали, что
предоперационное облучение быстрыми нейтронами на область первичного
очага тормозит процессы кининообразования в крови онкологических
больных: на 20% снижается уровень калликреина на фоне увеличения
содержания неактивного профермента. Общая активность сериновых протеиназ
остается неизменной, однако отмечается уменьшение концентрации основного
ингибитора калликреина – a2-макроглобулина. На этом фоне повышается
активность кининоразрушающего фермента карбоксипептидазы N. Вместе с
тем, активность “нейтральных” и “кислых” протеаз после облучения имеет
четко выраженную тенденцию к уменьшению, а уровень общей
антипротеолитической активности остается практически неизменным. При
этом отмечается стабилизация состояния клеточных мембран. Между степенью
торможения образования протеолитических ферментов и клинически
определяемой регрессией размеров опухоли существует достоверная
корреляционная зависимость [35,62].

1.4 Роль оксида азота (II) в онкогенезе

Оксид азота II обладает мультипотентными свойствами, определяемые как
цитотоксичностью радикала, так и его коммуникативной активностью. При
онкологических заболеваниях эта молекула может проявлять и
противоопухолевые свойства, и участвовать в патогенезе неоплазий. NO
необходим для обеспечения цитотоксического действия макрофагов на
опухолевые клетки [23,42]. Выделяемый макрофагами, NO подавляет
опухолевые клетки либо блокируя их железосодержащие ферменты, либо
повреждая их клеточные структуры. Вызывая повреждение ДНК, NO включается
в модуляцию апоптоза: активирует экспрессию p53, который вызывает
задержку деления клеток в фазе G1. В то же время p53 по принципу
обратной отрицательной связи подавляет синтез iNOS и таким образом
предохраняет трансформированные клетки от гибели. Установлено, что
синтез iNOS индуцируется TNFa. Уже через 6 – 12 ч. после действия
индуктора NO достигает уровня, при котором начинает сказываться его
влияние на опухолевые клетки [24,28]. NO участвует в образовании новых
сосудов, что необходимо для удовлетворения потребностей раковых клеток в
питании. С другой стороны, вследствие этого улучшается доставка оксида
азота в опухолевые клетки. NO, выделяемая эндотелиальными или
опухолевыми клетками, может стимулировать процесс инвазии в стенку
сосуда, поскольку прикрепление к эндотелию сосудов необходимое звено
метастазирования. Радикал обладает дезагрергирующим действием. Поэтому
следует ожидать, что усиленный синтез NO подавляет межклеточное
сцепление клеток в опухоли и облегчает их распространение по организму.
Клеткам с минимальной продукцией NO будет труднее отделяться от
первичной опухоли и образовывать метастазы. [42].

Таким образом, существуют механизмы поддерживающие баланс между участием
NO как в прометастатических, так и в антиопухолевых реакциях [42].

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1 Материал исследования

Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических
больных. Кровь брали из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут
при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000 g и
получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептидазы N
и ангиотензинпревращающего фермента.

Изучение активности ферментов было проведено у 24 мужчин в возрасте от
49 до 70 лет с опухолями легких, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой
системы. Больные подвергались химиотерапевтическому воздействию. Они
составили две экспериментальные группы. Первая группа – больные до
начала проведения им химиотерапии (12 человек); вторая – те же больные,
но после окончания курса лечения (12 человек). В качестве контроля
выступала группа из 13 здоровых мужчин такого же возраста.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N

Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [61].

Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO4, приготовленного на
100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные
пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата
фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, реакцию начинали
прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100
мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ).
Реакцию проводили 120 мин при 37oC и останавливали прибавлением 30 мкл
10 % трихлоруксусной кислоты.

Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл
надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее
пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли
оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H2O.

Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и
контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин
инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.

2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по
образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность,
ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл
35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мкл буфера и
преинкубировали 8 мин при 37?С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл
раствора кбз-гли-гли-арг в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в
пробе 5 мкМ). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл
10% раствора трихлоруксусной кислоты [59]. Пробы центрифугировали 30 мин
при 4000 об/ мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли
количество образовавшегося гли-арг нингидриновым методом [61]. Пробы
колориметрировали на КФК-2 при =590 нм. Активность АПФ определяли как
разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих
каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль гли-арг, образовавшегося
за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Концентрацию белка
определяли биуретовым методом.

2.2.3 Метод определения содержания белка

Содержание общего белка определяли биуретовым методом. Принцип метода
основан на том, что ионы меди в щелочной среде взаимодействуют с
пептидными связями белков сыворотки крови с образованием комплекса
красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна
концентрации общего белка.

Опытные пробы содержали 50 мкл сыворотки крови и 2,5 мл рабочего
раствора биуретового реагента (концентрат биуретового реагента развести
дистиллированной водой в соотношении 1:19). Контрольные пробы содержали
50 мкл дистиллированной воды и 2,5 мл рабочего раствора биуретового
реагента. В калибровочную пробу добавляли 50 мкл калибровочного раствора
общего белка (раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 60
г/л с добавлением хлористого натрия 9 г/л и азида натрия 1 г/л).

Содержимое пробирок тщательно перемешивали, избегая образования пены,
инкубировали при комнатной температуре (+ 18 –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С) в
течение 30 минут, после чего измеряли величину оптической плотности
калибровочной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны
540 нм.

Концентрацию общего белка рассчитывали, как отношение оптической
плотности опытной пробы к оптической плотности калибровочной пробы
умноженная на концентрацию общего белка в калибровочном растворе (60
г/л).

2.2.4 Метод количественного определения NO в сыворотке крови

Для определения концентрации NO 0,5 мл сыворотки депротеинизировали
добавлением 1 мл 0,5 н. раствора NaOH и 10 % раствора ZnSO4 для
осаждения белковых компонентов. Пробы центрифугировали при 5000 об/мин.
30 мин. К 1мл надосадочной жидкости добавляли равное количество 1 %
раствора реактива Грисса и инкубировали в течение 10 мин. при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С.
Затем колориметрировали при 540 нм против контрольной пробы. Содержание
NO оценивали по количеству конченого стабильного метаболита оксида азота
(II) – нитрит иона. Суммарную концентрацию нитрит-иона определяли
колориметрически по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом
сульфаниламида, входящего в реактив Грисса. Количество нитрит-иона
выражали в мкг на мл.

2.3 Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием
t-критерия Стьюдента [16]. Корреляционный анализ проводили с помощью
программы «Статистика» (версия 6.0).

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1 Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови
онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

Результаты исследования показали увеличение активности КПN у
онкологических больных в период до проведения химиотерапии по сравнению
с контрольной группой в 2 раза, и уменьшение активности фермента после
проведения химиотерапии, по отношению к периоду до начала лечения в 2,6
раза (рис.1).
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Рис.1. Активность КПN у онкологических больных при химиотерапевтическом
воздействии (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг
белка, Mm, n=1218; достоверность отличий: * – p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter