Вплив іонізуючого випромінювання та протипухлинних препаратів на регуляторну систему трансформуючого фактора росту бета у клітинах карциноми молочної

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ЧОРНА ІННА ВАЛЕНТИНІВНА

УДК 577.391:615.277.3:577.17.087:616-006.6

Вплив іонізуючого випромінювання та протипухлинних препаратів на
регуляторну систему трансформуючого фактора росту бета у клітинах
карциноми молочної залози з різною резистентністю до доксорубіцину

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка МОН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин;

доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович,

Науково-дослідний інститут біотехнологічних

основ підвищення продуктивності тварин

Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З.
Гжицького,

директор, професор кафедри органічної і неорганічної хімії(

Провідна установа – Інститут експериментальної патології, онкології та
радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України,

відділ механізмів протипухлинної терапії, м. Київ.

Захист відбудеться “6” червня 2006 р. о 12 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН
за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “5” травня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що різні екстремальні чинники, у тім числі
іонізуюча радіація, індукують продукцію цитокінів клітинами-мішенями in
vitro (Goldberg Z. et al., 2002; Stoika R. et al., 2003; Teicher B.A.,
2001) та in vivo (Barcellos-Hoff M.H., 1998; Kim S.H. et al(, 2002)(
ТФР-? є цитокіном системної дії, що бере участь у сигнальних шляхах, які
контролюють ріст, диференціацію та апоптоз нормальних і пухлинних клітин
(Фильченков А.А. и др., 1994; Moustakas A. et al(, 2002; Souchelnytskyi
S., 2002)( Біологічна дія ТФР-? реалізується за участю трансмембранних
рецепторів ТФР-? та внутрішньоклітинних білків Smad (Dennler S. et al.,
2002; ten Dijke P. et al., 2004)( Однак, маловивченими залишаються
молекулярні механізми, які опосередковують дотичність шляхів передавання
регуляторного сигналу ТФР-? з механізмами стійкості злоякісних клітин до
дії стресових чинників(

Виникнення резистентності пухлинних клітин до дії протипухлинних
препаратів є серйозною перешкодою під час лікування онкологічних хворих(
Тому поєднання хіміо- та радіотерапії систематично застосовують у
клініці з метою подолання цієї проблеми( Незважаючи на те, що іонізуюче
випромінювання слугує ефективним засобом лікування низки злоякісних
новоутворень, суттєві відмінності існують у результатах
радіотерапевтичного лікування пухлин різного гістологічного походження
(Ross G.M. et al., 1999)( Окрім того, існує також можливість розвитку
перехресної резистентності злоякісних клітин до дії хіміопрепаратів та
радіації, однак механізми виникнення такої перехресної резистентності
недостатньо вивчені(

Отже, з’ясування ролі ТФР-? в опосередкуванні відповіді злоякісних
клітин на дію радіації та протипухлинних препаратів може забезпечити
основу для розробки нових підходів щодо підвищення ефективності радіо-
та хіміотерапії або для більш точного передбачення наслідків такого
лікування( У роботі використано клітини карциноми молочної залози
людини, що характеризуються різною чутливістю до протипухлинного
препарату доксорубіцину( Встановлено, що ці клітини також відрізняються
за чутливістю до рентгенівського випромінювання, зокрема за механізмами,
в яких бере участь ТФР-?( Ці механізми вивчено на клітинному та
молекулярному рівнях(

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами( Дисертаційна
робота виконана у межах держбюджетної теми Бх-02Ф кафедри біохімії
Львівського національного університету імені Івана Франка “Вплив
рентгенівського випромінювання на регуляторні системи, відповідальні за
апоптоз імунокомпетентних і пухлинних клітин” (№ державної реєстрації
0105U002211), в якій автор досліджувала експресію про- та антиапоптичних
білків в опромінених пухлинних клітинах. За угодою про наукову співпрацю
біологічного факультету Львівського національного університету імені
Івана Франка та Інституту біології клітини НАН України окремі
дослідження виконані у відділі регуляції проліферації клітин Інституту
біології клітини НАН України в межах теми відділу “Дослідження
молекулярних механізмів резистентності пухлинних клітин до дії
трансформуючого фактора росту бета 1” (№ державної реєстрації
0104U010049), в якій автор досліджувала продукцію ТФР-? та експресію
компонентів сигнального шляху цього цитокіна за умов дії екстремальних
чинників.

Мета і завдання дослідження( Мета роботи – з’ясувати роль сигнальної
системи трансформуючого фактора росту ? за умов дії іонізуючого
випромінювання та протипухлинних препаратів на клітини лінії MCF-7
карциноми молочної залози людини з різною стійкістю до доксорубіцину(

Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:

1) порівняти вплив іонізуючого випромінювання на ріст та виживання
клітин лінії MCF-7, чутливих та резистентних до цитотоксичної дії
доксорубіцину;

2) дослідити секрецію ТФР-? під впливом рентгенівського опромінення у
клітинах лінії MCF-7 з різною чутливістю до доксорубіцину;

3) визначити та порівняти вплив іонізуючого випромінювання та
протипухлинних препаратів доксорубіцину, цисплатину та метотрексату на
рівень мРНК ТФР-?1 і ТФР-?2 у клітинах лінії MCF-7, чутливих та
резистентних до доксорубіцину;

4) дослідити вплив іонізуючого випромінювання та протипухлинних
препаратів на експресію головних компонентів сигнального шляху ТФР-?,
таких як специфічні рецептори (на рівні мРНК) та білки Smad
(внутрішньоклітинні ефектори передавання регуляторного сигналу цього
цитокіну) у клітинах лінії MCF-7 з різною чутливістю до дії
доксорубіцину;

5) дослідити вплив іонізуючого опромінення та протипухлинних препаратів
на експресію про- та антиапоптичних білків у клітинах лінії MCF-7,
резистентних до дії доксорубіцину, порівняно з їхніми чутливими
попередниками;

6) визначити ступінь пошкоджень ДНК під впливом рентгенівського
опромінення та їхню репарацію у клітинах досліджуваних ліній(

Об’єкт дослідження. Регуляторна система трансформуючого фактора росту ?
у клітинах лінії MCF-7 карциноми молочної залози людини за умов дії
екстремальних чинників.

Предмет дослідження. Вплив рентгенівського випромінювання та
протипухлинних препаратів (цисплатин, доксорубіцин, метотрексат) на
експресію головних компонентів сигнального шляху трансформуючого фактора
росту ? у клітинах лінії MCF-7 (карцинома молочної залози людини) з
різною стійкістю до доксорубіцину.

Методи дослідження. Для досягнення мети та виконання завдань,
поставлених у дисертаційній роботі, було використано: електрофорез
білків у поліакриламідному гелі, імуноблот-аналіз білків, RT-PCR
(полімеразна ланцюгова реакція з використанням зворотної транскриптази),
спектрофотометрію, комет-аналіз ДНК, біотестування активності
трансформуючого фактора росту ?, цитоморфологічні методи дослідження та
статистичні методи обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що
резистентність клітин лінії MCF-7 карциноми молочної залози людини до
протипухлинного препарату доксорубіцину корелює з їхньою стійкістю до
інгібування росту та загибелі під дією рентгенівського випромінювання.

Виявлено здатність рентгенівського випромінювання індукувати експресію
ТФР-? на рівні мРНК, а також викликати зростання секреції цього цитокіна
клітинами лінії MCF-7 карциноми молочної залози людини, чутливими та
резистентними до доксорубіцину.

Вперше з’ясовано, що зниження чутливості до впливу випромінювання у
резистентних до доксорубіцину клітинах лінії MCF-7, принаймні частково,
спричинене зниженням під дією радіації рівня мРНК рецепторів ТФР-? І та
ІІ типів.

Протипухлинний препарат доксорубіцин викликав зниження рівня мРНК
рецепторів І та ІІ типів і посилення експресії інгібіторного білка Smad7
у резистентних до доксорубіцину клітинах лінії MCF-7, а також зниження
рівня мРНК рецептора ІІ типу у чутливих до доксорубіцину клітинах цієї
лінії(

Вперше досліджено, що порівняно з чутливими до доксорубіцину клітинами
лінії MCF-7, у резистентних клітинах рентгенівське випромінювання не
індукувало експресії проапоптичних білків р53, Bax, Bad( Виявлено
відмінності в електрофоретичній рухливості білка Bcl-2 між чутливими та
резистентними до доксорубіцину клітинами даної лінії(

Відзначено нижчий рівень пошкодження ДНК під впливом рентгенівського
випромінювання та швидшу репарацію цього пошкодження у клітинах лінії
MCF-7, резистентних до дії доксорубіцину(

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені у
дисертаційній роботі, дозволяють краще зрозуміти роль ТФР-? в
опосередкуванні впливу екстремальних чинників (рентгенівське
випромінювання та деякі протипухлинні препарати) на ракові клітини, що
відрізняються за стійкістю до протипухлинного препарату доксорубіцину.
Ці результати можуть бути корисними у з’ясуванні механізмів виникнення
перехресної резистентності злоякісних клітин до дії протипухлинних
препаратів і радіації( Вони можуть бути експериментальним підґрунтям для
розроблення більш ефективних схем радіо- та хіміотерапевтиного лікування
онкологічних хворих(

Одержані результати і узагальнення, що стосуються особливостей
проходження регуляторного сигналу ТФР-? у пухлинних клітинах за умов дії
рентгенівського випромінювання та протипухлинних препаратів,
використовують при викладанні спецкурсів “Молекулярні механізми
регуляції проліферації і диференціації клітин”, “Молекулярні механізми
трансдукції клітинних сигналів”, “Молекулярні механізми міжклітинної
комунікації”, “Радіаційна біохімія” на кафедрі біохімії біологічного
факультету Львівського національного університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацювала літературу
за темою дисертаційної роботи, виконала експериментальну частину і
статистично обробила отримані результати. Аналіз і обговорення отриманих
даних проведені спільно з науковим керівником, професором Стойкою Р.С.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблено
доповіді на Шостій конференції молодих онкологів України “Сучасні
проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2003 р.),
Першому (Установчому) з’їзді Українського товариства клітинної біології
(Львів, 2004 р.), засіданнях Наукового Товариства імені Т( Шевченка
(Львів, 2004 і 2005 рр.), П’ятій Парнасівській конференції “Молекулярні
механізми клітинного сигналювання” (Київ, 2005 р.), щорічних звітних
конференціях біологічного факультету Львівського національного
університету імені Івана Франка (2004, 2005 і 2006 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з
них 4 – у фахових періодичних виданнях, 1 – у тематичному збірнику
праць, 6 – у матеріалах конференцій(

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 4-х
розділів (огляд літератури, методи досліджень, результати досліджень,
аналіз і узагальнення результатів досліджень), висновків та списку
використаних джерел, який містить 294 найменування( Робота охоплює 153
сторінки, містить 40 рисунків (24 сторінки)(

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Описано молекулярні механізми, внаслідок порушення
яких відбувається трансформація нормальних клітин у пухлинні( Значну
увагу приділено розгляду структури, біосинтезу та сигнального шляху
ТФР-?( Проаналізовано сучасну інформацію про механізми дії на клітини
іонізуючого випромінювання та деяких протипухлинних препаратів, зокрема,
доксорубіцину, метотрексату, цисплатину( Висвітлено механізми індукції
апоптозу, порушення яких у ракових клітинах є однією з причин низької
ефективності радіо- та хіміотерапії(

Матеріали та методи досліджень( Дослідження проводили на клітинах лінії
MCF-7 аденокарциноми молочної залози людини, чутливих (MCF-7 (wt)) та
стійких (MCF-7 (DOX/R)) до дії доксорубіцину, які були отримані з
колекції клітинних культур Інституту онкології (Глівіце, Польща)(
Клітини вирощували в середовищі Ігла, модифікованому Дальбекко (DMEM,
“Sigma”, США), за присутності 10% декомплементованої ембріональної
сироватки великої рогатої худоби (FCS, “Sigma”, США) і 50 мкг/мл
гентаміцину (“Sigma”, США)( Клітини опромінювали на рентгенівській
установці “РУМ-17” (СРСР) або інкубували у присутності одного з
протипухлинних препаратів: доксорубіцину, цисплатину (“Ebewe”, Австрія)
чи метотрексату (“Leberle”, США)(

Вплив рентгенівського випромінювання на ріст і виживання клітин
визначали після їхнього фарбування 0,1% розчином трипанового синього та
підрахунку в камері Фукса-Розенталя зафарбованих (мертві) і
незафарбованих (живі) клітин( Зміни у морфології опромінених клітин
оцінювали шляхом їх прижиттєвого фарбування флюорохромним барвником
акридиновим оранжевим (3,6-диметиламіноакридин), а також зафарбовуванням
фіксованих препаратів клітин флюоресцентним барвником DAPI
(4,6-диамідино-2-феніліндол) (“Sigma”, США)(

Секрецію ТФР-( клітинами лінії MCF-7 визначали біологічним тестуванням,
використовуючи клітини лінії CCL-64 епітелію легені норки (Danielpour D.
et al., 1989; Garrigue-Antar L. et al., 1995) та застосовуючи
сульфородамін В (“Sigma”, США) (Skehan P. et al., 1990).

Для вивчення експресії ТФР-?1, ТФР-?2, рецепторів ТФР-? І та ІІ типів на
рівні мРНК, з клітин лінії MCF-7 виділяли сумарну РНК, використовуючи
реагент Trizol (“Life Technologies”, США) згідно з методикою,
рекомендованою виробником. Для отримання однониткової кДНК, придатної до
RT-PCR (полімеразна ланцюгова реакція з використанням зворотної
транскриптази) аналізу, здійснювали зворотну транскрипцію 5 мкг
препарату РНК з використанням набору “RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit” (“Fermentas”, Литва) за рекомендаціями виробника.
Відбирали рівні кількості (4 мкл) продуктів зворотної транскрипції і
проводили їх PCR-ампліфікацію із різними парами праймерів. Продукти PCR
візуалізували на 2% агарозному гелі за допомогою етидію броміду (0,5
мкг/мл). Кількісний аналіз проводили за допомогою програми Gel-Pro
Analyzer v3(1(00(00 (“Media Cybernetics”, CША)( Як стандарт для
нормалізації кількості РНК використовували рівень мРНК ?-актину.

Рівень експресії білків вивчали за допомогою електрофорезу в
поліакриламідному гелі та імуноблот-аналізу із використанням кролячих
поліклональних анти-Smad2, Smad3, Smad4, Smad7, Smad2-Р (Людвігівський
Інститут Ракових Досліджень, м( Уппсала, Швеція), кролячих
поліклональних анти-р53 (“Sigma”, США), анти-Bcl-2 (“Santa Cruz”, США),
мишачих моноклональних анти-Bad, anti-Bax (“Santa Cruz”, США) антитіл(
Кількісну обробку специфічних білкових смуг здійснювали за допомогою
комп’ютерної програми Gel-Pro Analyzer v3(1(00(00 (“Media Cybernetics”,
CША)( Рівень експресії специфічних білків визначали після нормалізації
даних за ?-актином(

Рівень пошкоджень ДНК клітин та їх репарації досліджували методом
електрофорезу одиничних клітин у гелі агарози (комет-аналіз ДНК) за умов
лужного (Palyvoda O. et al., 2003; Singh N.P. et al., 1988) та
нейтрального (Тронов В.А. и др., 1998) pH(

Статистичне опрацювання результатів проводили за допомогою комп’ютерної
програми “Microsoft Excel 2002”, використовуючи критерій Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив іонізуючого випромінювання на ріст та виживання клітин лінії
MCF-7. У дослідах, в яких клітини MCF-7(wt) та MCF-7(DOX(R) піддавали
дії різних доз рентгенівського опромінення (1,5, 3,0 та 4,5 Гр), було
встановлено дозозалежне інгібування росту клітин обох ліній на 48 год
після опромінення( Щоб з’ясувати, чим зумовлене затримання зростання
кількості клітин – припиненням проліферативної активності чи їхньою
загибеллю – вивчали життєздатність клітин шляхом підрахунку в
цитометричній камері живих і мертвих клітин( Встановлено, що зменшення
приросту кількості клітин обох ліній після опромінення зумовлене,
головним чином, припиненням їхньої проліферативної активності і лише в
незначній мірі (7 – 13%) – їхнім відмиранням( Порівняно з клітинами
MCF-7(wt), клітини MCF-7(DOX/R) виявляли більшу стійкість до інгібування
росту та цитодеструктивної дії рентгенівського опромінення( Так,
культивування клітин MCF-7(wt) протягом 96 год після опромінення дозою
3,0 Гр, супроводжувалось пригніченням клітинного росту на 70%, порівняно
з контролем, тоді як у клітинах MCF-7(DOX/R) за аналогічних умов
спостерігалось зменшення кількості живих клітин на 45%, порівняно з
контролем(

Треба зазначити, що неопромінені клітини MCF-7(DOX(R) росли повільніше,
порівняно з контрольними клітинами MCF-7(wt)( Тому однією з причин
підвищеної стійкості клітин MCF-7(DOX/R) до дії опромінення, порівняно з
клітинами MCF-7(wt), може бути повільніший час генерації та внаслідок
цього збільшена здатність до репарації пошкоджень ДНК(

Вплив іонізуючого випромінювання на секрецію ТФР-? клітинами лінії
MCF-7, чутливими та резистентними до дії доксорубіцину( Секрецію ТФР-?
досліджували шляхом тестування його біологічної активності( Виявлено, що
рівень ТФР-? у культуральному середовищі, кондиціонованому
неопроміненими клітинами лінії MCF-7(DOX(R) був вищим, ніж у середовищі,
кондиціонованому клітинами MCF-7(wt) і становив відповідно 0,410±0,028
нг(мл(450*103 клітин та 0,302±0,025 нг(мл(450*103 клітин(

Встановлено зростання рівня секреції інгібіторного цитокіна ТФР-? у
клітинах обох ліній на 48 год після впливу одноразового опромінення
(1,5, 3,0, 4,5 Гр), причому найвищий рівень ТФР-? у культуральному
середовищі, кондиціонованому клітинами MCF-7(wt), виявлено при дозі 4,5
Гр (у 3 рази більше порівняно з неопроміненими клітинами), а в клітинах
MCF-7(DOХ(R) – при дозі 3,0 Гр (у 2,5 раза більше порівняно з контролем)
(рис( 1)(

Клітини карциноми зазвичай продукують велику кількість ТФР-?, який може
підсилювати інвазію пухлинних клітин та пригнічувати ріст та
функціонування клітин імунної системи (Reiss M. et al., 1997)(
Підвищення рівня продукції ТФР-? сприятливе для більшості злоякісних
клітин лише за умови, коли такі клітини втрачають чутливість до дії
цього цитокіна, тобто набувають резистентності до ТФР-?-індукованого
інгібування росту та активації апоптозу (Stoika R. et al., 2003)(

Вплив екстремальних чинників на експресію мРНК ТФР-? у клітинах
карциноми молочної залози людини( Для дослідження експресії двох ізоформ
цитокіна – ТФР-?1 і ТФР-?2 на рівні мРНК у клітинах лінії MCF-7,
чутливих та резистентних до доксорубіцину, було використано
напівкількісний метод RT-PCR( Порівняння кількості продуктів реакції,
отриманих із парами праймерів, специфічних до кДНК генів ТФР-?1 і
ТФР-?2, та їхня нормалізація за рівнем мРНК ?-актину дали змогу
встановити, що в інтактних клітинах MCF-7(DOX(R) рівень мРНК ТФР-?1 і
ТФР-?2 був вищим, порівняно з клітинами MCF-7(wt) (рис( 2)(

Вплив одноразового рентгенівського опромінення (1,5, 3,0, 4,5 Гр)
призводив до зростання експресії ТФР-?1 на рівні мРНК в обох
досліджуваних лініях ракових клітин, причому у клітинах MCF-7(wt)
спостерігалось дозозалежне зростання рівня ТФР-?1, тоді як у клітинах
MCF-7(DOX(R) найвищий рівень даної ізоформи цитокіну було зафіксовано
після опромінення дозою 1,5 Гр (рис( 2)(

Виявлено зростання експресії ТФР-?2 на рівні мРНК у клітинах
MCF-7(DOX(R) під дією іонізуючого випромінювання (1,5, 3,0, 4,5 Гр), у
той час як у батьківських клітинах цієї лінії лише опромінення дозою 4,5
Гр викликало достовірні зміни у кількості мРНК ТФР-?2 (рис( 2)(

Досліджено взаємозв’язок між дією протипухлинних препаратів
(доксорубіцину, метотрексату, цисплатину) та експресією ТФР-?1 та ТФР-?2
на рівні мРНК( Показано, що під дією доксорубіцину (5 мкг(мл) не
відбувається суттєвого зростання мРНК ТФР-?1 у клітинах обох ліній, а
рівень мРНК ТФР-?2 зменшується у 1,4 та 2,3 раза під час дії цього
препарату на клітини MCF-7(wt) і MCF-7(DOX(R), відповідно(
Протипухлинний препарат меторексат (25 мкг(мл) індукував зниження в 1,3
раза експресії ТФР-?1 на рівні мРНК у клітинах MCF-7(DOX(R)( Обробка
клітин цисплатином (10 мкг/мл) не призводила до змін рівня мРНК ТФР-?1 у
клітинах обох ліній( Виявлено зростання мРНК ТФР-?2 у клітинах MCF-7(wt)
під впливом метотрексату та у клітинах MCF-7(DOX(R) – під впливом
метотрексату та цисплатину(

Вплив рентгенівського випромінювання на сигнальний шлях ТФР-? у клітинах
лінії MCF-7 з різною чутливістю до дії доксорубіцину( Після виявлення
зростання продукції ТФР-? у досліджуваних клітинах під впливом
іонізуючої радіації, було доцільно дослідити експресію компонентів
сигнального шляху цього цитокіна в опромінених клітинах( Відомо, що
взаємодія ТФР-? зі специфічним клітинним рецептором Т?RIІ, який є
конститутивно активною протеїнкіназою, призводить до фосфорилювання та
активації рецептора T?RI( Для дослідження експресії рецепторів ТФР-? І
та ІІ типу на рівні мРНК, із клітин ліній MCF-7(wt) та MCF-7(DOX(R)
після впливу на них одноразового рентгенівського опромінення (1,5, 3,0,
4,5 Гр), було виділено сумарну РНК і проаналізовано її за допомогою
напівкількісного методу RT-PCR( Показано, що клітини лінії MCF-7 з
різною чутливістю до дії доксорубіцину відрізняються за рівнем мРНК
рецепторів T?RI ? T?RI?( Так, у неопромінених клітинах MCF-7(DOX(R)
рівень мРНК T?RI ? T?RI? був вищим, ніж у інтактних клітинах MCF-7(wt)
(рис( 3)(

Виявлено дозозалежне зростання рівня мРНК T?RI ? T?RI? у клітинах лінії
MCF-7(wt), тоді як в опромінених (3,0, 4,5 Гр) клітинах сублінії
MCF-7(DOX(R) спостерігалось зниження експресії T?RI і T?RIІ на рівні
мРНК( Під дією іонізуючого випромінювання дозою 1,5 Гр у клітинах
MCF-7(DOX(R) рівень мРНК T?RI ? T?RI? суттєво не змінювався, порівняно з
контролем (рис( 3)(

Наведені результати показали, що під впливом рентгенівського
випромінювання може відбуватись інгібування передавання сигналу ТФР-? у
клітинах лінії MCF-7(DOX(R) внаслідок порушення відповідного сигнального
шляху на різних рівнях, зокрема, шляхом зниження експресії рецепторів
ТФР-?(

Від поверхневих рецепторів ТФР-? до ядра клітини-мішені сигнал
передається за допомогою білків Smad( Білки Smad2 і Smad3 безпосередньо
взаємодіють з активованими рецепторами та фосфорилюються ними( Білок
Smad4 взаємодіє з фосфорильованими білками Smad2 і Smad3, утворюючи
комплекс, який переноситься в ядро, де бере участь в активації
транскрипції( Білки Smad6 і Smad7 виконують функцію інгібіторів
регуляторного сигналу ТФР-? у клітині (Derynck R. et al., 2001;
Moustakas A. et al., 2001; Shi Y. et al., 2003; ten Dijke P. et al.,
2004).

Методом імуноблот-аналізу показано, що у клітинах лінії MCF-7(wt)
відбувається зростання рівня експресії білка Smad2, а також
фосфорильованої форми цього білка (Smad2Р) при дії рентгенівського
опромінення дозою 1,5 Гр, тоді як у разі вищих доз радіації (3,0 Гр, 4,5
Гр) не виявлено статистично достовірних змін експресії цих білків( У
резистентних до дії доксорубіцину клітинах лінії MCF-7 рівень білка
Smad2 і Smad2Р не змінювався під впливом опромінення, порівняно з
контрольними клітинами( Встановлено відсутність експресії білка Smad3 у
клітинах MCF-7(wt), у той час як цей білок добре виявляється у лізатах
клітин сублінії MCF-7(DOX(R)( Ми не виявили відмінностей в експресії
білків Smad4 та Smad7 під впливом опромінення у чутливих до
доксорубіцину клітинах MCF-7(wt) та в резистентних до цього препарату
клітинах MCF-7(DOX(R)(

Підсумовуючи, треба зазначити, що пухлинні клітини володіють високим
адаптаційним потенціалом( Хоча різні стресові чинники, зокрема
рентгенівське випромінювання, викликають зростання рівня секреції ТФР-?
у клітинах багатьох злоякісних пухлин, вони також індукують зміни у
регуляторній системі даного цитокіна, впливаючи на специфічні рецептори
цього цитокіна та пост-рецепторні сигнальні механізми(

Вплив протипухлинних препаратів на сигнальний шлях ТФР-? у клітинах
лінії MCF-7 з різною чутливістю до дії доксорубіцину( Для дослідження
експресії рецепторів ТФР-? І та ІІ типу на рівні мРНК, клітини ліній
MCF-7(wt) та MCF-7(DOX(R) інкубували протягом 24 год у присутності
протипухлинних препаратів (доксорубіцину, метотрексату, цисплатину),
після чого було виділено сумарну РНК і проаналізовано її за допомогою
напівкількісного методу RT-PCR(

Виявлено зростання у 2 рази рівня мРНК рецептора T?RI ? клітинах лінії
MCF-7(wt) під впливом цисплатину (10 нг/мл)( Обробка цих клітин
доксорубіцином (5 мкг(мл) та метотрексатом (25 мкг(мл) не призводила до
змін експресії T?RI на рівні мРНК( Дія доксорубіцину та метотрексату на
клітини лінії MCF-7(DOX/R) викликала зниження рівня мРНК T?RI у 2 та 1,4
раза, відповідно( Дія досліджуваних протипухлинних препаратів
супроводжувалась зниженням експресії мРНК рецептора T?RI? у клітинах
обох ліній, причому найбільший вплив на клітини MCF-7(wt) виявляв
цисплатин, а на клітини MCF-7(DOX/R) – доксорубіцин(

.

0

8

:

< >

V

X

Z

?

0

2

4

6

8

:

< ???????< >

X

?

: < ? i < ? ? ???????d f ? ? e i < F ¦ ? ? I I ? U Ue Oe O 0 oeaeaeaeaeUUE?ae®c–c–? „O d?th^„O „@ ^„@ „O d?th^„O „ d?th^„ A"?'Ae/a1^2†3?4P6o8?:¤;i

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *