Поліаміни – маркери злоякісного росту і мішень для протипухлинної терапії (автореферат)

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ.
Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ЗАЛЄТОК СОФІЯ ПЕТРІВНА

УДК: 616-006. 04:577.218: 616-085

Поліаміни – маркери злоякісного росту і мішень для протипухлинної
терапії

14.01.07 ? онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ ? 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Науковий консультант ? доктор медичних наук, професор

Бердинських Ніна
Констянтинівна,

провідний науковий
співробітник відділу біохімії

пухлин Інституту
експериментальної патології,

онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН

України.

Офіційні опоненти: ? доктор біологічних наук

Кудрявець Юрій
Йосипович,

завідувач відділу
експериментальних клітинних систем

Інституту
експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є.
Кавецького НАН України;

? доктор медичних наук

Колесник Олена
Олександрівна,

провідний науковий
співробітник відділу бдомінальної

онкології Інституту
онкології АМН України;

? доктор біологічних наук,
професор

Матишевська Ольга
Павлівна,

професор кафедри біохімії
біологічного факультету

Київського національного
університету ім.Тараса

Шевченка.

Провідна установа ? Львівський національний медичний
університет

ім. Данила Галицького
МОЗ України, кафедра

онкології та медичної
радіології, м. Львів.

Захист відбудеться “28” березня 2007 р. о 13 годині 30 хвилин на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ, вул.Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького
НАН України.

Автореферат розісланий “27” лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук
Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Злоякісна трансформація пов’язана з порушенням
таких фундаментальних біологічних процесів як ріст, диференціювання та
запрограмована загибель клітин. Важливу роль у контролюванні цих
процесів відіграють низькомолекулярні ендогенні регулятори, особливе
місце серед яких належить поліамінам (ПА), низькомолекулярним
органічним полікатіонам, які відіграють унікальну роль в живих
організмах. За останні три десятиліття інтенсивного дослідження ПА
багато їх функцій в процесах нормального і злоякісного росту було
вивчено і розкрито. Встановлено, що ПА регулюють найважливіші
метаболічні процеси в клітині, зокрема, такі, як синтез нуклеїнових
кислот і білків, модифікують структуру мембран, впливають на
функціонування мембранозв’язаних ферментів (Tabor, Tabor, 1984; Cohen,
1998), а, згідно сучасних даних, беруть участь у передачі регуляторних
сигналів (Bachrach et al., 2001; Gerner, Meyskens, 2004).

Роль ПА в злоякісному рості інтенсивно досліджується в багатьох
провідних лабораторіях світу. Однак, багато питань щодо особливостей
метаболізму ПА та молекулярних механізмів їх дії при пухлинному рості ще
не розкриті і потребують подальшого детального вивчення. Конкретні
відповіді на ці питання мають важливе значення не тільки для розуміння
фундаментальних механізмів злоякісного росту, оскільки ПА абсолютно
необхідні для росту і проліферації клітин, але і тому, що агенти, які
регулюють метаболізм ПА можуть бути використані в клінічній онкології в
якості протипухлинних препаратів “таргетної” дії. Необхідно зазначити,
що в останні роки синтезовані різноманітні аналоги ПА і інгібітори
ферментів обміну ПА, частина з яких вже випробовується в онкологічних
клініках США, Японії, Франції і отримані обнадійливі результати
(Thomas, Thomas, 2001; Casero et al., 2005; Basuroj, Gerner, 2006). Але
проблема застосування інгібіторів/регуляторів метаболізму ПА ще далека
від вирішення, і потребує детального вивчення.

Відомо, що злоякісний ріст супроводжується накопиченням ПА не тільки в
пухлинах, а і в тканинах і біологічних рідинах організму, в якому
розвивається пухлина. Існує низка робіт, присвячених вивченню ПА як
діагностичних маркерів злоякісного росту (Russell et al., 1971; Russell,
1984; Залеток С.П., 1977; Bergeron et al., 1997; Yamaguchi et al., 2005;
Kawakita, Hiramatsu, 2006). Але питання щодо використання ПА як маркерів
ефективності терапії і прогнозу перебігу злоякісного процесу у
онкологічних хворих вивчено недостатньо. У світовій літературі є лише
поодинокі роботи, в яких представлено результати дослідження вмісту ПА
в біологічних рідинах онкологічних хворих в різні періоди розвитку
злоякісних пухлин (при прогресії, ремісії, рецидиві хвороби) (Балицька
О.В., 1992; Leveque et al., 2000; Hiramatsu et al., 2005), але і вони не
дали вичерпної відповіді на питання, наскільки доцільним може бути
використання показників вмісту ПА в сечі та крові в якості маркерів
ефективності традиційної хіміотерапії та для прогнозу перебігу
злоякісного процесу у онкологічних хворих.

Упродовж останніх років значна увага приділяється участі ПА у регуляції
процесів проліферації, росту та диференціювання клітин (Bachrach, 1996;
Cohen, 1998; Сяткін С.П., 1998; Morgan, 1999). Але молекулярні механізми
їх участі в цих процесах, зокрема, вплив ПА на експресію певних генів ще
залишаються в значній мірі нерозкритими. На цей час виявлено
взаємозв’язок між інтенсивністю метаболізму ПА в клітині і експресією
окремих онкогенів, наприклад, с-myc, c-jun (Tabib, Bachrach, 1999;
Bachrach et al., 2001; Jдnne et al., 2005; Hu et al., 2005), однак вплив
ПА на функціонування факторів транскрипції онкогенів вивчений дуже мало.
Це стосується, зокрема, і впливу ПА на функціонування ядерного фактора
транскрипції NF-кB, який, згідно сучасних уявлень, відіграє важливу роль
не тільки в процесах запалення і імунної відповіді, а і в розвитку
злоякісних пухлин, оскільки експресія багатьох клітинних генів, зокрема
онкогенів, залежить від активності цього фактора (Dejardin et al.,
1999; Karin et al., 2002). Механізми регуляції активності NF-кВ при
неопластичному рості вивчені недостатньо; практично нерозкритим
залишається зв’язок між метаболізмом ПА і активністю фактора
транскрипції NF-кВ в злоякісних клітинах, є лише поодинокі роботи,
присвячені вивченню цих питань (Shah et al., 1999; Shah et al., 2001).

Таким чином, дослідження особливостей метаболізму та молекулярних
механізмів участі ПА в неопластичному рості є важливим напрямком
сучасної фундаментальної онкології. Результати таких досліджень можуть
знайти застосування в практичній онкології, зокрема для розробки
протипухлинних препаратів “таргетної” дії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Роботу
виконано в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України у відділі біохімії пухлин в
рамках планових науково-дослідних робіт (номери держреєстрації:
№01.88.0008001; №А01004449Р; №0100U00652; №0103U000786; шифр 2.2.5.206,
№0194017036; шифр 2.2.5.218; №0197U006233; шифр 2.2.5.232, №0103U000786
). Частину роботи виконано за підтримки фонду CRDF (США), грант
UВ1-2446-КV-02; МОН України, грант №Ф7/428-2001; гранту НАН України
(програма “Дослідження у галузі сенсорних систем і
технологій”);Українського науково-технологічного центру , грант Gr-122j.

Мета дослідження: Встановити особливості метаболізму та молекулярні
механізми дії ПА при канцерогенезі і пухлинному рості, з’ясувати
прогностичну значимість показників обміну ПА та обгрунтувати доцільність
використання інгібіторів метаболізму ПА для протипухлинної терапії.

Задачі дослідження:

Дослідити особливості метаболізму ПА при хімічному гепатоканцерогенезі,
індукованному N-нітрозодиетиламіном (N-НДЕА), і канцерогенезі кишковика,
індукованному 1,2-диметилгідразином (1,2-ДМГ), у експериментальних
тварин.

Визначити вміст ПА та активність ключового ферменту їх біосинтезу ?
орнітиндекарбоксилази (ОДК) в пухлинах шлунково-кишкового тракту людини.

Визначити вміст ПА та активність ключового ферменту їх біосинтезу ? ОДК
в пухлинах грудної залози людини.

Визначити вміст ПА в сечі та їх концентрацію в сироватці крові хворих на
злоякісні лімфоми, рак яєчника та рак грудної залози в динаміці
захворювання (в активну фазу, при ремісії та при рецидиві захворювання).

Довести можливість застосування показників вмісту ПА в біологічних
рідинах онкологічних хворих (ПА-тесту) для оцінки ефективності терапії і
прогнозу перебігу пухлинного процесу.

З’ясувати молекулярні механізми дії ПА при пухлинному рості: їх вплив
на активність фактора транскрипції NF-кB.

Дослідити вплив модуляції метаболізму ПА в пухлинах на експресію
білкових продуктів генів, які регулюються NF-кB.

Визначити показники обміну ПА в експериментальних пухлинах при
формуванні резистентності до цисплатину.

B експериментах in vivo дослідити протипухлинну дію інгібіторів синтезу
ПА та обгрунтувати перспективність їх використання для терапії
онкологічних хворих.

Об’єкт дослідження: перещеплювані асцитні і солідні пухлини щурів і
мишей (карцинома молочної залози Са 755, карциносаркома Уокер
(Walker–256), карцинома Л’юїс, гепатома Г-27, чутливі і резистентні до
дії доксорубіцину і цисплатину субштами карциноми Герена, асцитний рак
Ерліха, лімфолейкоз L1210, лімфома Nk/ly), клітинна лінія раку грудної
залози людини MCF-7; печінка і слизова оболонка кишковика та індуковані
N-нітрозодиетиламіном (N-НДЕА) і 1,2-диметилгідразином (1,2-ДМГ) пухлини
печінки і кишковика щурів; операційний матеріал (пухлини та
макроскопічно незмінена тканина грудної залози; пухлини і макроскопічно
незмінена слизова оболонка шлунково-кишкового тракту); кров і сеча
хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника, рак і доброякісні пухлини
грудної залози та практично здорових людей.

Предмет дослідження – вміст ПА і активність ферментів їх метаболізму в
екпериментальних пухлинах і пухлинах людини, вміст ПА в сечі і крові
онкологічних хворих та практично здорових людей; протипухлинна
активність інгібіторів метаболізму ПА; вплив ПА на активність класичного
фактора транскрипції NF-кB (р50/р65) та на взаємодію фактора
транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК(NRE); експресія
білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, в експериментальних
пухлинах молочної залози в умовах модуляції метаболізму ПА .

Методи дослідження: в роботі використані методи експериментальної
онкології (індукція пухлин хімічними канцерогенами; оцінка швидкості
росту пухлин і тривалості життя експериментальних тварин; отримання
резистентних до хіміопрепаратів штамів пухлин); методи виділення ядер та
плазматичних мембран; методи препаративної біохімії: екстракція, діаліз,
ультрацентрифугування; для визначення вмісту ПА використовували методи
тонкошарової (ТШК), рідинної хроматографії високого тиску (РХВТ) та
методи електрофорезу на папері; для визначення активності ферментів
метаболізму ПА використано біохімічні і радіоізотопні методи; для
теоретичного обгрунтування впливу ПА на процес транскрипції застосовано
методи комп’ютерного моделювання і молекулярного докінгу; для оцінки
впливу ПА на зв’язування фактора транскрипції NF-кB з

відповідними послідовностями ДНК використано метод поверхневого
плазмонного резонансу (ППР) і флюоресцентний метод безвипромінювального
переносу енергії (FRET); для оцінки активності фактора транскрипції
NF-кB використано метод трансфекції; для оцінки експресії білків NF-кB і
білкових продуктів генів, залежних від NF-кB, застосовано методи ППР,
гель-електрофорезу, Вестерн-блот аналіз.

Наукова новизна. В результаті комплексних досліджень отримані нові дані
про особливості метаболізму ПА при хімічному канцерогенезі, які
показують, що процесу малігнізації передують глибокі зміни метаболізму
ПА, котрі проявляються в різкому зростанні активності ОДК (ключового
фермента біосинтезу ПА), зниженні активності фермента катаболізму ПА
(диаміноксидази (ДАО) і значному збільшенні вмісту ПА (путресцину і
спермідину) в тканинах-мішенях. Вперше виявлено, що при
N-НДЕА-гепатоканцерогенезі та при 1,2-ДМГ канцерогенезі кишковика має
місце двофазна інтенсифікація синтезу і накопичення ПА в тканині та
субклітинних фракціях (плазматичних мембранах і ядрах) органів-мішеней:
в ранню (1-4 тижні) і пізню (5-6 місяці) стадії, що свідчить про участь
ПА в ініціації злоякісного росту і неопластичній трансформації клітин
печінки та кишковика. Виявлено, що високий рівень ПА зберігається і в
сформованих пухлинах.

Вперше виявлено зворотню залежність між величиною активності ОДК і
ступенем диференціювання аденокарцином шлунково-кишкового тракту людини.

Проведена оцінка довготривалої (до 4-х років) динаміки вмісту ПА
(ПА-тест) в сечі та сироватці крові у хворих на рак грудної залози,
злоякісні лімфоми та пухлини яєчника. Виявлено, що ПА-тест відображає
перебіг пухлинного процесу: при ремісії спостерігається нормалізація
рівнів ПА в біологічних рідинах, а їх підвищення передує клінічним
проявам рецидиву захворювання.

Виявлено, що введення тваринам з екпериментальними пухлинами синтетичних
(б-дифторметилорнітину, б-ДФМО і полігексаметиленгуанідину, ПМГ) і
природних (поліфенолів зеленого чаю) інгібіторів ОДК призводить до
зниження вмісту ПА в пухлинах, що супроводжується значним гальмуванням
росту пухлин і істотним збільшенням тривалості життя тварин. Показано,
що ПМГ має потужні протилейкозні властивості і, в залежності від дози і
схеми його введення, призводить до значного збільшення тривалості життя
тварин з лімфолейкозом L 1210. Встановлено, що механізм дії ПМГ
пов’язаний не тільки з його прямою інгібіторною дією на ОДК, а і з
впливом на (-глутамілтранспептидазу ? фермент, який бере участь в
регуляції ОДК.

Доведено, що одним із механізмів дії ПА при пухлинному рості є їх
регулюючий вплив на активацію фактора транскрипції NF–кB і експресію
білкових продуктів NF–кB-залежних генів, залучених в пухлинний процес
(c–myc, Bcl–Xl, ОДК). Вперше показано, що за присутності ПА підвищується
спорідненність білка р50 (субодиниці NF-кB) до специфічної послідовності
ДНК за рахунок утворення додаткових електростатичних і водневих
зв’язків, що підтвердило можливість регуляції ПА транскрипції,
контрольованої NF-кB. В експериментах in vitro продемонстровано, що ПА
підвищують зв’язування фактора транскрипції NF-кB з відповідними
ДНК-послідовностями; в дослідах in vivo показано, що в умовах деплеції
ПА активність фактора NF-кB в пухлинних клітинах молочної залози,
знижується. Виявлено, що механізм протипухлинної дії поліфенолів
зеленого чаю пов’язаний з його гальмівною дією на синтез ПА і активацію
фактора транскрипції NF-кB.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про багаторазове
підвищення активності ОДК і вмісту ПА в пухлинах шлунково-кишкового
тракту і грудної залози людини свідчать, що інтермедіанти обміну ПА
можуть бути мішенню для терапії злоякісних пухлин. Ці дані, поряд з
результатами експериментальних досліджень про протипухлинну дію
синтетичних та природних інгібіторів метаболізму ПА, стали основою для
обґрунтування можливості використання досліджуваних інгібіторів
метаболізму ПА для „таргетної” терапії онкологічних хворих.

Встановлена в аденокарциномах шлунково-кишкового тракту залежність між
рівнем активності ОДК і ступенем їх диференціювання може бути
використана як один із маркерів ступеня злоякісності пухлин травного
тракту людини.

На основі тривалих (в різні фази захворювання) досліджень вмісту ПА в
сечі і крові хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника і грудної залози
розроблено і клінічно апробовано поліамінний тест (ПА-тест), чутливість
якого становить 80-90%. Встановлена кореляція між результатами ПА-тесту
і активністю пухлинного процесу та ефективністю терапії, свідчить про
перспективність практичного використання тесту у хворих на злоякісні
пухлини яєчника, грудної залози та злоякісні лімфоми. Цей тест
рекомендовано в практику онкологічних установ.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом обґрунтовано мету і сплановано
завдання дисертаційної роботи, запропоновано підходи до їх виконання.
Автором особисто проведено експерименти по індукції та перещепленню
пухлин, проведено забір біологічного матеріалу у тварин; збір
післяопераційних зразків пухлин та зразків крові і сечі у онкологічних
хворих; автором особисто проведено визначення вмісту ПА та активності
ферментів їх метаболізму в зразках експериментального та клінічного
матеріалу. Автором модифіковано метод визначення ПА в сечі і крові,
розроблено і апробовано на великому контингенті онкологічних і
неонкологічних хворих ПА-тест. Автору належить ідея про залучення ПА в
процес експресії онкогенів шляхом прямого впливу на зв’язування фактора
транскрипції NF-кB з відповідними послідовностями ДНК. Автор брала
участь у розробці способів імобілізації біологічних молекул на поверхні
сенсорних чіпів спектрометра ППР для дослідження впливу ПА на
міжмолекулярну взаємодію NF-кB~ДНК. Автором особисто проведено
дослідження активності NF-кB за допомогою метода трансфекції. Автором
самостійно проведено аналіз отриманих результатів, сформульовано усі
положення та висновки дисертаційної роботи, самостійно підготовлені до
друку публікації, що відображають результати дисертації.

Апробація роботи. Матеріали роботи були представлені та обговорені на:
Міжн. конф. “Polyamines in Life Sciences” (Токіо, 1986); Міжн. конф.
“Пухлинні маркери в онкології” (Київ, 1990); Міжн. конф. “Polyamines in
Molecular and Medical Biology” (Кіото, 1990); ІІ з’їзді онкологів СНД з
участю вчених Європи, Азії, Америки (Київ, 2000); Х з’їзді онкологів
України (Ялта, 2001); 28-му з’їзді Федерації європейських біохімічних
товариств (Стамбул, 2002); III з’їзді онкологів і радіологів СНД
(Мінськ, 2004); І-му Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004); конференції ”Дослідження у галузі
сенсорних систем та технологій” (Київ, 2005); Міжн. конф. “Food,
Nutrition and Cancer” (Вашингтон, 2005); ХІ з’їзді онкологів України
(Судак, 2006); Міжн. конф. “Role of Polyamines and their Analogs in
Cancer and other Diseases” (Рим, 2006).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено в 40
публікаціях, в тому числі 1 монографії, 23 статтях у провідних фахових
виданнях, 1 методичних рекомендаціях, 1 деклараційному патенті на
винахід та у 14 тезах доповідей у матеріалах вітчизняних та міжнародних
конгресів, з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 269 сторінках
машинописного тексту. Дисертаційна робота складається із вступу, 2
розділів огляду літератури, розділу матеріалу і методів дослідження, 5
розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень,
висновків та списку літературних джерел (345 посилань), з них 28 на
українській та російській мовах, 317 на англійській та німецькій мовах.
Дисертація містить 52 таблиці та 47 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана
на 1500 експериментальних тваринах (білих нелінійних щурах та щурах
лінії Wistar, віком 2?3 місяці, масою 80-150г; нелінійних мишах, мишах
лінії С57Вl та мишах-гібридах BDF1, віком 2-2,5 міс, масою 18-20г)
розводки віварію Інституту експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, керуючись міжнародно
прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.

Використовували такі моделі хімічного канцерогененезу: канцерогенез
печінки, викликаний N-НДЕА, і канцерогенез кишковика, викликаний
1,2-ДМГ. Індукцію гепатом проведено на білих нелінійних щурах-самцях 2-х
місячного віку, масою 80-100г, які отримували з питною водою N-НДЕА в
концентрації 0,025%. Контрольні тварини того ж віку і статі ?
неканцерогений аналог диетиламін (ДЕА) в концентрації 0,025%.
Дослідження проводили в ранній період гепатоканцерогенезу (1-4 тижні) та
через 2, 3, 4, 5, 6 місяців. З тканини печінки і пухлин одержували
субклітинні фракції (ядерну, плазматичних мембран і цитозольну).
Виділення фракції плазматичних мембран виконували у градієнті сахарози
за методом Neville (1960), для виділення фракції ядер використовували
метод Рennial et al. (1964).

Канцерогенез кишковика. Дослідження проведені на білих нелінійних
щурах-самцях, масою 80-100г. Для індукції пухлин кишковика тваринам один
раз на тиждень протягом 6 місяців підшкірно вводили 1,2-ДМГ в дозі 20
мг/кг маси (Пожарисский, 1972). Дослідження проводили в процесі індукції
пухлин (через 1, 2, 3, 4, 5 місяців після початку введення канцерогена)
та в індукованих пухлинах. Об’єктом дослідження були гомогенат і
цитозоль слизової оболонки тонкого та товстого кишковика.

Моделі експериментальних пухлин: перещеплювані асцитна карцинома Ерліха
(АРЕ), лімфома NK/ly, лімфолейкоз L1210, а також їх резистентні до
цисплатину субштами, які отримували шляхом багаторазового введення
тваринам з перещепленими пухлинами цисплатину (ЦсП), (ЕБЕВЕ,
Арцнайміттель, Унтерах, Австрія); вихідні та резистентні до цисплатину і
доксорубіцину субштами карциноми Герена (резистентні субштами карциноми
Герена були люб‘язно надані канд. біол. наук І.М.Тодором (відділ
механізмів протипухлинної терапії); карциносаркома Уокер, аденокарцинома
Са755, карцинома Л’юїс, гепатома Г-27.

Протипухлинну дію інгібіторів обміну ПА досліджували у тварин з
перещепленими асцитними (рак Ерліха, лімфолейкоз L1210, лімфома NK/ly та
їх резистентні до цисплатину субштами) і солідними пухлинами
(карциносаркома Уокер, карцинома Л’юїс, гепатома Г-27). В якості
синтетичних інгібіторів біосинтезу ПА використовували: б-ДФМО (”Serva”,
USA) та ПМГ, синтезований в Інституті органічного синтезу АН Латвії і
люб’язно наданий академіком АН Латвії М.Лідаком; в якості природних
інгібіторів ? суміш поліфенолів зеленого чаю, вироблену в Інституті
біохімії і біотехнології ім.С. Дурмішидзе АН Грузії.

Для теоретичного обгрунтування можливості впливу ПА на процес
транскрипції використано методи комп’ютерного моделювання. Пошук
потенційних сайтів зв’язування NF-кВ з ПА проводили методом гнучкого
молекулярного докінгу за допомогою програми «Аutodock vЗ.5″ та ригідного
докінгу (програма НЕХ 2.4). Просторові структури ПА будували за
допомогою програми АgrusLab 1.0. Структуру NF-кВ одержали із
брукхенівської бази даних білків (Рrоtein Data Ваnк). Моделювання
механізму впливу ПА на функціонування NF-кВ проводили згідно програми
МОІL2000. На всіх етапах, як допоміжна, використовувалась програма
АgrusLab.

Для оцінки впливу ПА на зв’язування фактора транскрипції NF-кB з
відповідними послідовностями ДНК застосовано метод поверхневого
плазмонного резонансу (ППР) і метод флюоресцентного безвипромінювального
переносу енергії (FRET). Метод ППР. Використано спектрометри ППР
„Biosuplar-5″ та “Plasmon SPR-05” і супутнє обладнання (сенсорні чіпи,
проточні кювети), розроблені в Інституті фізики напівпровідників НАН
України. Сенсорні чіпи піддавали спеціальній обробці, яка включала
нанесення на чіп проміжного шару (соєвого інгібітора трипсину, СІТ). На
проміжний шар іммобілізували р50-субодиницю; для блокування залишкових
альдегідних груп використовували етаноламін; послідовності ДНК вносили
до кювети в буфері Дігнама (Dignam, 1983).

Метод FRЕТ. У якості донора та акцептора використовували флуоресцентні
барвники родамін В (RВ) і Техаs Red (ТR), відповідно. Перший був
ковалентно приєднаний до білка р50, другий ? до 3′-кінця одного з
ланцюгів штучно синтезованих дволанцюгових олігонуклеотидів NRE:
(послідовність одного з комплементарних ланцюгів:
5′-АСGGСАGGGGАТТСССТСТ-3′). Олігонуклеотиди одержано в Інституті
молекулярної біології Російської академії наук (комерційний препарат).
Ефективність FRЕТ визначали за співвідношенням інтегральних
інтенсивностей піків емісії TR (615 нм) та RВ (575 нм), які було
визначено після розкладання спектрів на компоненти за допомогою програми
„Siano».

Дослідження впливу ПА на активність фактора транскрипції NF-кB та
експресію білкових продуктів генів, залежних від NF-кB проведено на
перещеплюваних пухлинах молочної залози (карциносаркомі Уокер і
карциномі Са755) та на клітинній лінії раку грудної залози людини
MCF-7. Для виснаження пулу ПА в пухлинах використовували інгібітори ОДК
? б-ДФМО та ПМГ. Інгібітори вводили тваринам внутрішньоочеревинно в
дозі: 500 — 1000 мг/кг маси (б-ДФМО) та 10-15 мг/кг маси (ПМГ) на 1
ін’єкцію, виконували 2-5 ін’єкцій. Через добу після останньої ін’єкції
тварин забивали під ефірним наркозом, пухлини видаляли, зважували та
використовували для досліджень. Клітини MCF-7 культивували на середовищі
Dulbecco-ISCOV (“Sigma”, USA) з додаванням 10% ембріональної телячої
сироватки («Сяйво”, Львів, Україна) та антибіотикa гентаміцину (в
концентрації 40 мкг/мл) при температурі 370С та при насиченні повітря 5%
СО2 в культуральних флаконах об’ємом 150 см2 (“Sigma”, USA), що містили
20 мл середовища. Для виснаження/накопичення пулу ПА в клітинах MCF-7 в
культуральне середовище вносили б-ДФМО (5мМ) або б-ДФМО (5мМ) +
путресцин (5Ч10-7M). З цими агентами клітини культивували протягом 72
годин, потім клітини механічно збирали, двічі промивали ізотонічним
розчином NaCl і використовували для приготування ядерних та клітинних
екстрактів, які готували за методом Sovak et al.(1997).

Для оцінки експресії білків NF-кB і білкових продуктів генів, залежних
від NF-кB, застосовано методи ППР, гель-електрофорезу та Вестерн-блот
аналіз.

При використанні методу ППР на нанесений на сенсорний чіп проміжний шар
(СТІ), іммобілізували моноклональні антитіла мишей проти досліджуваного
білка (Santa Cruz Biotech., СА, USA) в концентрації 2 мкг/мл у 0,01М
натрій-ацетатному буфері, рН 5,5, після іммобілізації антитіл кювету
промивали цим же буфером, Для блокування залишкових альдегідних груп до
кювети ППР вносили 0,1М розчин етаноламіну в 0,05М натрій-фосфатному
буфері, рН 7,3; надалі в кювету вводили ядерний (або клітинний)
екстракт, який містив 10-100 мкг загального білка в буфері 10мМ НЕРЕS,
150мМ NaС1, 0,1% Tween-20. При інтерпретації даних, одержаних методом
ППР, вважали, що зміна кута ППР («відгук ППР») прямо пропорційна
поверхневій концентрації білка.

Аналітичний гель-електрофорез (SDS-PAGE) виконували за модифікованою
методикою Леммлі (1970). Використовували такі буферні розчини: анодний
буфер: 0,2М трис-НС1, рН 8,9; катодний буфер: 0,1М трис, 0,1М трицин, рН
8,25; буфер для концентруючого гелю: 0,71М трис-НСІ, рН 8,45, 0,1% SDS;
буфер для розділяючого гелю: 1М трис-НСІ рН 8,45, 0,1% SDS; акриламід та
метилен-біс-акриламід — у вигляді „Асrуl/Віs 37,5: 1 Sоlution 30%»
(«Аnachem», USA). Смуги білків забарвлювали Кумасі блакитним R-250
(„Sigma», USA). Використовували маркери молекулярної маси «Ultra–low
Range Molecular Weight Маrkеr (1,06-26,6)» («Sigma», USA).

Вестерн-блот аналіз проводили за методом Tsang et al (1983), білки після
електрофорезу переносили на нітроцелюлозну мембрану Нуbond ECL
(Аmersham Pharmacia Biotech, Швеція). Після блокування вільних місць
зв’язування за допомогою знежиреного молока, мембрану поміщали на 4
години при 370С у розчин моноклональних антитіл миші проти досліджуваних
білків (Santa Cruz Biotech., СА, USA), а потім у розчин вторинних lgG
кози проти антитіл миші, кон’югованих з пероксидазою хріну (Santa Cruz
Biotech., СА, USA). Після цього мембрану інкубували в системі детекції
ЕСL (Santa Cruz Biotech., СА, USA) (0,125 мл кожного реагенту ЕСL на
1см2 мембрани). Після 2-хв інкубації рентгенівську плівку („Фотон»,
Україна) прикладали до мембрани. Дані Вестерн-блотингу було
проаналізовано за допомогою комп’ютерної програми TotalLab.

Для оцінки активності фактора транскрипції NF-кB в пухлинах молочної
залози використано метод трансфекції. В клітини MCF-7 трансфектували
1мкг NF-кB–люциферазної плазміди (LipofectAMINE, USA) згідно протоколу
виробника (Invitrogen, USA).? Для контролю ефективності до кожної
трансфекції була включена рCMV-в-gal плазміда (0,4мкг). Через добу після
трансфекції середовище видаляли, клітини відмивали і інкубували в
свіжому середовищі з або без 5мМ б-ДФМО на протязі 24 год. Активність
в-галактозидази визначали згідно протоколу виробника (Invitrogen, USA).

Клінічний матеріал. Зразки пухлин грудної залози та пухлин
шлунково-кишкового тракту було отримано у відділеннях пухлин молочної
залози та абдомінальної онкології Інституту онкології АМН України. Всі
хворі були проінформовані про дослідження і дали згоду на їх проведення.

Досліджено післяопераційний матеріал 52 хворих з пухлинами грудної
залози: 36 хворих на рак грудної залози (у 26 хворих була встановлена
ІІ-а стадія захворювання; у 10 – ІІІ-я стадія), 9 хворих на фіброаденоми
та 7?на локалізований вузловий фіброаденоматоз. Досліджено
післяопераційний матеріал 95 хворих з пухлинами шлунково-кишкового
тракту: 36 хворих з пухлинами шлунка (ІІІ стадія ?30 чол., IV стадія ?6
чол); 25 хворих з пухлинами ободової кишки (ІІІ стадія ?18 чол., IV
стадія ?7 чол.); 34 хворих –з пухлинами прямої кишки (ІІІ стадія ?20
чол., IV стадія ?14 чол.). За гістологічними ознаками пухлини
шлунково-кишкового тракту віднесені до аденокарцином. За ступенем
диференціювання аденокарциноми були розділені на високо-, помірно- і
малодиференційовані.

Для визначення біохімічних показників зразки операційного матеріалу
швидко заморожували у рідкому азоті. У зразках пухлинної тканини,
тканини, що межує з пухлиною та макроскопічно незміненій тканині
визначали активність ОДК, ДАО та вміст ПА.

Дослідження щодо інформативності ПА-тесту як маркера ефективності
лікування хворих і прогнозу перебігу злоякісного процесу було проведено
на зразках крові і сечі 158 хворих з пухлинами грудної залози (118
хворих на рак грудної залози і 40 ? з доброякісними пухлинами грудної
залози), 140 хворих на рак яєчника і 167 хворих на лімфоми. В якості
контролю досліджено екскрецію ПА з сечею та їх концентрацію у сироватці
крові практично здорових людей (90 чол.). Обстежені хворі знаходились на
лікуванні у відділеннях пухлин молочної залози, онкогінекології та
відділенні системних захворювань Інституту онкології АМН України. Всі
хворі були проінформовані про дослідження і дали згоду на їх проведення.

Екскрецію поліамінів (вміст ПА у сечі за добу) та їх концентрацію у
сироватці крові визначали у хворих до, під час і після лікування
(хіміотерапії чи після хірургічного видалення пухлин), при
профілактичних обстеженнях, при появі рецидиву захворювання.

Визначення вмісту поліамінів в гомогенатах пухлин та нормальних тканин,
субклітинних фракціях, ядерних і клітинних екстрактах пухлин і сироватці
крові виконано за допомогою методів тонкошарової хроматографії
(Abdel-Monem, Ohno, 1975) та високоефективної рідинної хроматографії
високого тиску (Seiler, Knodgen, 1980), в сечі ? методами хроматографії
на папері (Raina, 1967) та тонкошарової хроматографії (Abdel-Monem,
Ohno, 1975). В якості стандартів використовували гідрохлориди ПА:
спермін 4НCl; спермідин 3НCl; путресцин 2НCl („Serva”, USA).

Визначення активності ОДК в зразках експериментальних пухлин
(субклітинних фракціях, ядерних і клітинних екстрактах) та
післяопераційних зразках пухлин і макроскопічно незмінених тканин людини
проводили радіометричним методом (Russell, Snyder, 1968) та методом
Сяткіна С.П., Березова Т.Т. (1980); активність ДАО визначали за методом
Aarsen, Kemp (1964). Активність ферментів виражали у одиницях активності
на 1 мг білка.

Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за допомогою методів
Braddford (1976) та Greenberg і Craddock (1982).

Для статистичної обробки результатів дослідження використано методи
варіаційної статистики (Лакін, 1990) та непараметричні методи оцінки
(Гублер, Генкин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження показників обміну ПА при хімічному канцерогенезі у щурів.
Дослідження виконані на 2 моделях канцерогенезу:
N-НДЕА-гепатоканцерогенезі та канцерогенезі кишковика, індукованого
1,2-ДМГ. При гепатоканцерогенезі вміст поліамінів визначали в
гомогенатах печінки, цитозолі та субклітинних фракціях, ядрах та
плазматичних мембранах, активність ОДК – в цитозолі та ядрах.

Найбільш виражені зміни вмісту ПА і активності ОДК в печінці
спостерігались в ранній період канцерогенезу (протягом І-го місяця) і в
індукованих N-НДЕА пухлинах печінки. Так, у цитозольній фракції клітин
печінки вже через І тиждень виявлено зростання активності ОДК,
максимальних значень активність ОДК досягала через 2 тижні, надалі цей
показник знижувався, але залишався вищим, ніж в контролі (табл.1).

Таблиця 1

Активність ОДК (нмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг
білка)

у цитозолі печінки щурів в ранній період N-НДЕА-гепатоканцерогенезу,
(М ( m).

Об’єкт Термін

(тижні) Активність ОДК Вміст ПА

Путресцин Спермідин Спермін

Печінка тварин, що отримували канцероген 1 1,10 ( 0,20* 3,20 ( 1,0*
15,60 ( 0,50* 3,30 ( 0,70

2 1,62 ( 0,06* 4,65 (1,26* 25,50 ( 2,95* 2,00 ( 0,63

3 1,48 ( 0,11* 4,40 (0,57* 17,70 ( 0,68* 1,93 ( 0,01

4 0,95 ( 0,08* 3,20(0,05* 12,23 ( 2,23* 1,57 ( 0,11*

Печінка контрольних тварин 0,63 ( 0,09 1,6 ( 0,15 6,60 ( 0,82 2,20 (
0,30

*P < 0,05 порівняно з показниками у контрольних тварин; n = 5-8 Протягом перших 2-х тижнів в цитозольній фракції значно зростав також вміст спермідину і путресцину. На 3-4-му тижні їх вміст знижувався, хоча і перевищував (за виключенням сперміну) відповідні величини в контролі. Особливо високих значень активність ОДК досягала у ядерній фракції ? вже через І тиждень цей показник в 11?12 разів перевищував середні величини в нормі. Одночасно у ядерній фракції відбувалось зростання вмісту ПА (10-кратно збільшувався вміст путресцину, 5-кратно ? спермідину, і дещо менше, у 1,5 рази, сперміну (табл.2). На 4-му тижні ці показники знижувалися, але перевищували величини у контрольних тварин. Таблиця 2 Активність ОДК (нмоль путресцину/109ядер за год) і вміст ПА (нмоль/109ядер) у ядерній фракції клітин печінки щурів в ранній період N-НДЕА-гепатоканцерогенезу та сформованих гепатом, (М ( m). Об’єкт Термін (тижні) Активність ОДК Вміст ПА Путресцин Спермідин Спермін Печінка тварин, що отримували канцероген 1 3,30(0,44* 30,32(4,50* 29,00(4,89* 4,10 ( 0,60* 2 3,75(0,25* 30,72(4,50* 29,80(1,67* 6,20 ( 1,80* 3 2,33(0,17* 17,30(4,91* 20,00(3,21* 6,00 ( ,20* 4 2,03(0,18* 19,30(2,37* 13,43(1,28* 4,37 ( 0,82 Гепатома 22-26 4,32(1,14* 14,0(1,85* 11,4 ( 1,43* 2,41 ( 0,61 Печінка контрольних тварин 0,30(0,18 2,80 ( 0,40 5,60 ( 0,25 2,80 ( 0,34 *P < 0,05 порівняно з показниками у контрольних тварин; n = 5-8 В ранній період гепатоканцерогенезу виявлено значне збільшення вмісту ПА і у фракції плазматичних мембран клітин печінки ? на 2-й тиждень гепатоканцерогенезу рівень путресцину у 8, а спермідину у 10 разів перевищував значення у контролі. Через І місяць ці показники знижувались, але рівень спермідину залишався в 2 рази вищим ніж у контролі. Як відомо, у ранній період канцерогенезу особливого значення набувають зміни, що реєструються в плазматичних мембранах клітин. Оскільки ПА виконують роль структурних компонентів мембран, впливають на в’язкість та проникність мембран, беруть участь у регуляції активності мембранозв’язаних ферментів, таке значне зростання їх вмісту в плазматичних мембранах в гостротоксичну фазу канцерогенезу в ПМ може мати істотне значення для ініціації трансформації клітин під впливом канцерогену. Протягом подальшого періоду гепатоканцерогенезу (2-3 місяці) активність ОДК і вміст ПА в клітинах печінки знижувались і наближались до значень у контрольних тварин (табл.3). Таблиця 3 Активність ОДК (нмоль путресцину/мг білка за год) і вміст поліамінів (нмоль/мг білка) в цитозольній фракції клітин печінки щурів в процесі N-НДЕА-гепатоканце-рогенезу та в цитозольній фракції клітин сформованих гепатом (М ( m) Об’єкт Термін (місяці) Активність ОДК Вміст ПА Путресцин Спермідин Спермін Печінка тварин, що отримували канцероген 1 0,95 ( 0,08* 3,20 (0,50* 12,23(2,23* 1,57 ( ,11* 2 0,48 ( 0,05 1,80 ( 0,50 8,60 ( 0,45 2,80 ( 0,26 3 0,52 ( 0,03 1,90 ( 0,45 8,90 ( 0,50 2,95 ( 0,32 4 0,90 ( 0,06* 2,00 ( 0,30 11,50(0,90* 2,60 ( 0,50 5 0,98 ( 0,08* 4,30 (0,30* 12,20(0,25* 2,80 ( 0,32 Гепатома 6 1,26 ( 0,26* 5,26 (0,84* 13,25(0,39* 3,47 ( 0,50 Печінка контрольних тварин 0,63 ( 0,09 1,6 ( 0,15 6,60 ( 0,82 2,20 ( 0,30 *P < 0,05? порівняно з показниками у контрольних тварин; n =5-8 Проте через 4 місяці, і, особливо в період формування гепатом (через 5 місяців), в клітинах печінки спостерігалась друга фаза підвищення активності ОДК і збільшення вмісту ПА. Таке ж підвищення спостерігали і в індукованих гепатомах: так, активність ОДК і загальний вміст ПА в цитозольній фракції клітин гепатоми в 2 рази перевищував ці показники в цитозольній фракції клітин печінки контрольних тварин. При цьому кількість путресцину більш ніж в 3 рази перевищувала контрольні величини, спермідину ? вдвічі, кількість сперміну також була збільшена (див. табл.3). Значні зміни ОДК і вмісту ПА виявлені і в ядерній фракції та фракції плазматичних мембран клітин гепатоми: активність ОДК в ядерній фракції в 14 разів перевищувала контрольні значення (4,32(1,14 нмоль путресцину/мг білка за год проти 0,30(0,18 нмоль путресцину/мг білка за год); вміст ПА також значно збільшений. Рівень путресцину в 5 разів (14,0(1,85 нмоль/мг білка проти 2,80(0,40 нмоль/мг білка), а спермідину в 2 рази вищий (11,4 ( 1,43 нмоль/мг білка проти 5,60 ( 0,25 нмоль/мг білка) ніж в ядерній фракції клітин печінки інтактних щурів. У фракції плазматичних мембран гепатом виявлено 2-разове збільшення вмісту путресцину і спермідину порівняно з показниками у контрольних тварин. На іншій моделі хімічного канцерогенезу, канцерогенезі кишковика, індукованого 1,2-ДМГ, в слизовій оболонці кишковика щурів через місяць після початку введення канцерогену також виявлено значне зростання активності ОДК в порівнянні з величиною цього показника у контрольних тварин: 12-разове ? в тонкому кишковику і 10-разове ( в товстому (рис.1). Рис.1. Активність ОДК в слизовій оболонці кишковика щурів в процесі канцерогенезу, індукованого 1,2-ДМГ. В подальшому (через 2 місяці) активність ферменту падала, а потім поступово знову зростала, і досягала максимальних значень в сформованих пухлинах. При аналізі складу ПА в слизовій оболонці тонкого кишковика в процесі канцерогенезу встановлено, що концентрація путресцину і спермідину, а також сумарний вміст ПА протягом всього досліджуваного періоду достовірно вищий за норму. Вміст сперміну, за винятком 3-го місяця, навпаки, знижений, що вказує на розвиток процесу дисдиференціювання тканини. В слизовій оболонці товстого кишковика концентрація путресцину вища за норму тільки на 1-му і 5-му місяцях канцерогенезу. У пухлинній тканині загальна кількість ПА підвищена в порівнянні з нормою в середньому в 1,8 рази, що пов'язано із збільшенням всіх фракцій ПА і, особливо, путресцину. Виявлено також, що активність фермента катаболізму ПА ? диаміноксидази (ДАО) в пухлинах кишковика в середньому в 9 разів нижча, ніж в слизовій оболонці контрольних тварин. Це свідчить, що підвищення вмісту ПА в пухлинній тканині пов'язано не тільки з активацією їх синтезу, але і з ослабленням катаболізму. Таким чином, дослідження вмісту ПА і активності ферментів їх обміну при канцерогенезі кишковика показали, що динаміка змін досліджуваних показників аналогічна змінам, які спостерігаються при гепатоканцерогенезі. Як при НДЕА-індукованому канцерогенезі печінки, так і при 1,2-ДМГ-індукованому канцерогенезі кишковика спостерігалась двофазна активація біосинтезу ПА (в ранню стадію ? протягом 1-го місяця та пізню стадію, в період формування пухлин), що проявлялось в підвищенні активності ОДК, зниженні активності ДАО і збільшенні внутріклітинного вмісту ПА. Накопичення ПА в тканинах–мішенях на ранній стадії канцерогенезу, з одного боку, може бути пов'язане із захисно-компенсаторними процесами, і активація синтезу ПА може бути направлена на відновлення порушеної структури і функцій клітин, що розвинулися внаслідок токсичного пошкодження їх канцерогеном, З іншого боку, активація біосинтезу і накопичення біологічно-активних ПА на ранній стадії канцерогенезу в таких клітинних структурах як плазматичні мембрани і ядра клітин, може призводити до активації різних сигнальних шляхів, залучених до регуляції експресії онкогенів, що беруть участь в ініціації неопластичного процесу. Накопичення ПА в пізній фазі пов’язане з підвищеною проліферативною активністю і неконтрольованим ростом трансформованих клітин. Наступним завданням роботи було дослідити показники обміну ПА в пухлинах та макроскопічно незміненій слизовій оболонці різних відділів шлунково-кишкового тракту людини і співставити результати біохімічних досліджень з клінічними та морфологічними даними. Дослідження показали, що активність ОДК в пухлинах шлунку в середньому в 4,8 рази вища, ніж в макроскопічно незміненій слизовій оболонці, і в 3,2 рази вища, ніж в слизовій оболонці на межі з пухлиною (табл.4). Загальний вміст ПА в пухлинах шлунку підвищений порівняно з макроскопічно незміненою слизовою оболонкою в середньому в 1,6 рази. В пухлинній тканині змінювалось також і кількісне співвідношення окремих ПА, що призводило до підвищення величини молярного співвідношення спермідин/спермін з 1,92(0,10 до 2,59 (0,20 (Р<0,01), яке свідчить про інтенсифікацію проліферативних процесів. Таблиця 4 Активність ОДК (пмоль 14СО2/мг білка за год) в слизовій оболонці і пухлинах шлунка людини, (М ( m). Тип тканини Кількість зразків Активність ОДК Слизова оболонка (1) 36 6,57 ( 0,77 Слизова оболонка на межі з пухлиною (2) 23 9,98 ( 1,34* Пухлинна тканина (3) 36 31,44 ( 3,49* *P<0,05 – між (1) та (2); *P < 0,001– між (2) та (3); *P < 0,001– між (1)та (3) При прогресуванні захворювання активність ОДК і вміст ПА збільшувались як в пухлині, так і в прилеглій до неї слизовій оболонці і навіть в макроскопічно незміненій тканині шлунка. Виявлено чітку (r=0,9; Р<0,001) обернену залежність між величиною активності ОДК і ступенем диференціювання пухлин (рис.2). Рис.2. Активність ОДК в макроскопічно незміненій слизовій оболонці, слизовій оболонці на межі з пухлиною та в аденокарциномах шлунка людини різного ступеня диференціювання. При дослідженні показників обміну ПА у пухлинах товстого кишковика людини нами виявлена аналогічна направленність їх змін: значне збільшення активності ОДК (в середньому в 5 разів) і підвищення вмісту ПА (в 1,6-2 рази) в порівнянні з цими показниками в неураженій слизовій оболонці. Найбільш суттєво змінювався вміст путресцину, дещо менше ? спермідину. Вміст сперміну практично не змінювався, що призводило до підвищення величини молярного співвідношення путресцин/спермідин і спермідин/спермін, Рівень активності ОДК в макроскопічно незміненій слизовій оболонці товстого кишковика у хворих з пухлинами цих локалізацій зростав з прогресуванням захворювання. Як і в аденокарциномах шлунка, в аденокарциномах товстого кишковика виявлено обернену залежність між величиною активності ОДК в аденокарциномах і ступенем їх диференціювання. Аналіз результатів щодо активності ОДК та вмісту ПА, одержаних при хімічному канцерогенезі кишковика щурів і в пухлинах шлунково-кишкового тракту людини показав, що підвищення активності ОДК і збільшення вмісту ПА є характерною рисою процесу малігнізації в органах шлунково-кишкового тракту. Показники обміну ПА в пухлинах грудної залози людини. Виявлено, що рівень активності ОДК в тканині злоякісних пухлин грудної залози в 5,5 рази вищий порівняно з таким у макроскопічно незміненій тканині грудної залози і в 2 рази вищий порівняно з тканиною, що межує з пухлиною. В доброякісних пухлинах грудної залози активність ОДК значно нижча (в 3,7 рази), ніж у злоякісних пухлинах, але вища, ніж в макроскопічно незміненій тканині. Вміст ПА в злоякісних пухлинах в декілька разів перевищував такий у макроскопічно незміненій тканині і значно вищий, ніж в прилеглій до пухлини тканині (табл.5). Таблиця 5 Активність ОДК (пмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг білка) у макроскопічно незміненій тканині грудної залози (а), тканині, прилеглій до пухлини (б), пухлинах (в) грудної залози людини, (М(m). Тип пухлин Вид тканини Вміст ПА Активність ОДК путресцин спермідин спермін Злоякісні пухлини, n=36 а б в 4,8(1,8 8,3(1,7 17,3(3,2( 7,2(1,6 15,7(3,1( 28,9(4,1( 4,8(1,4 12,8(2,8( 23,4(4,5( 4,1(0,9 8,3(2,5( 22,5(5,3( Доброякісні пухлини, n=9 а б в 3,7(0,6 4,7(1,2 6,0(0,3 7,6(0,8 6,4(0,5 8,5(0,5 3,9(0,5 3,8(0,3 8,8(1,2 3,1(0,3 4,8(0,6 6,1(0,6 (Р( 0,05 ? порівняно з відповідними показниками в макроскопічно незміненій тканині грудної залози Концентрація путресцину і сперміну в доброякісних пухлинах дещо вища, ніж в макроскопічно незміненій тканині, але як сумарна концентрація ПА, так і вміст їх окремих фракцій значно менші від такого в злоякісних пухлинах. Аналіз рівнів активності ОДК в пухлинах в залежності від стадії захворювання (II і III стадія) виявив лише тенденцію до підвищення активності ОДК при поширенні пухлинного процесу (табл.6). Таблиця 6 Активність ОДК (пмоль путресцину/мг білка за год) і вміст ПА (нмоль/мг білка) у макроскопічно незміненій тканині (а), тканині, прилеглій до пухлини (б), злоякісних пухлинах(в) грудної залози людини залежно від клінічної стадії,(М(m). Стадія Вид тканини Вміст ПА Активність ОДК путресцин спермідин спермін ІІ стадія, n=26 а б в 4,2(1,5 8,1(1,9 16,6(3,8* 7,0(1,8 15,4(3,4* 28,5(4,5* 5,3(1,6 13,0(2,5* 21,8(3,4* 4,1(1,2 10,2(2,3* 21,2(3,6* ІІІ стадія, n=10 а б в 5,9(2,1 8,9(1,8 18,7(2,5* 7,6(1,4 16,4(2,5* 29,9(3,8* 3,7(1,3 12,2(3,4* 27,1(5,4* 4,1(0,8 6,8(1,5 24,0(4,2* *Р<0,01 – порівняно з макроскопічно незміненою тканиною Таким чином, проведені дослідження виявили значне підвищення активності ОДК і вмісту поліамінів в злоякісних пухлинах шлунково-кишкового тракту і грудної залози людини. Ці дані можуть служити науковим підгрунтям для розробки нових хіміотерапевтичних підходів до лікування злоякісних пухлин цих локалізацій з залученням інгібіторів біосинтезу ПА та їх аналогів. Наступною задачею було дослідити вміст ПА в біологічних рідинах (сечі та сироватці крові) хворих на злоякісні пухлини і проаналізувати можливість застосування ПА-тесту для оцінки ефективності терапії і прогнозу перебігу пухлинного процесу. ПА в біологічних рідинах у хворих на злоякісні лімфоми (ЗЛ). Виявлено, що у 82% хворих на неходжкинські лімфоми рівень екскреції ПА з сечею та концентрація їх у сироватці крові в кілька разів перевищував ці показники у практично здорових людей і становив, відповідно: 32,07±2,94 мг/добу і 8,97±0,74 мкг/мл. Збільшення вмісту ПА в сечі, в основному, відбувалось за рахунок спермідину і путресцину, в крові ? за рахунок спермідину. У практично здорових людей добова екскреція ПА в сумі складала 7?8 мг, а концентрація ПА в сироватці крові ? від 0,1 до 3,0 мкг/мл. У хворих на лімфогрануломатоз (ЛГМ) встановлено значне, порівняно з нормою, підвищення екскреції ПА з сечею (табл. 7) та їх концентрації у сироватці крові. Кореляції між рівнями ПА в добовій сечі і сироватці крові та клінічною стадією злоякісного процесу не виявлено. Найвищі рівні ПА в сечі спостерігали при II Б, IV А і IV Б стадії. Таблиця 7 Екскреція поліамінів з сечею (мг за добу) у хворих лімфогрануломатозом в залежності від стадії захворювання при активному процесі, (M ±m). ? i ? Oe O L ? ‚ „ † † ?   c ¤ O ? ? 6 Ue ?? h ???????¤???? & F 1/4 ”y§ i ”y§ i ”y§ i ”y§ i ”y§ i ”yi ?? ?? ?kde ??????? | ??? h H h H h ?? ???? ?А IV Б Спермін 4,92±1,14 1,72±0,35 1,96±0,87 4,24±2,23 3,90±1,70 4,34±2,8 Спермідин 9,92 ±1,34 12,92±1,32 7,24±1,55 11,41±1,5 11,90±0,99 13,19±2,0 Путресцин 7,56 ±1,77 14,08±0,75 8,40±1,65 6,39±1,56 11,56±1,56 13,39±3,5 Кадаверин 0,75 ± 0,50 2,0 ± 0,58 ? 1,33 ± 0,76 3,36 ± 1,78 0,63±0,63 ? ПА* 23,15±1,99 30,7±3,85 17,6 ±3,38 23,37±3,2 30,72 ±3,84 31,55±4,8 Примітка. *? ПА ? сумарна кількість поліамінів в сечі за добу При ефективному лікуванні кількість ПА в сечі і сироватці крові у хворих на злоякісні лімфоми в перші дні лікування зростала (що, згідно сучасних поглядів, свідчить про загибель пухлинних клітин і виділення з них ПА), а потім істотно знижувалась. Якщо лікування було неефективним, зберігався початковий (виявлений до лікування) рівень ПА. Встановлено, що у більшості хворих на злоякісні лімфоми в стані ремісії вміст ПА в сечі і сироватці крові був суттєво знижений, а при рецидиві захворювання ? підвищений. Отримані дані підтверджують доцільність використання показників вмісту ПА в біологічних рідинах для оцінки ефективності лікування і прогнозу захворювання у хворих на злоякісні лімфоми. ПА в біологічних рідинах у хворих на пухлини яєчника. Встановлено, що сумарна кількість ПА в сечі за добу (?ПА) у хворих на рак яєчника в 3,2 рази вища, в порівнянні з показниками у практично здорових жінок (?ПА=20,52(1,62 і 6,48(0,53 мг/добу, відповідно). Найвищу кількість ПА в сечі виявлено у хворих на первинно множинний рак яєчника (?ПА=26,72(3,54 мг/добу). У тих випадках, коли перебіг захворювання ускладнювався накопиченням асцитної рідини, показники екскреції ПА з сечею у таких хворих були невисокі (?ПА=11,34 (0,83 мг/добу). Об'єм сечі за добу у цих хворих складав 200-350 мл, а об’єм асцитної рідини ? 2-6 л. Аналіз зразків асцитної рідини показав, що концентрація ПА в ній висока. Так, концентрація спермідину в окремих випадках досягала 8,7 мкг/мл, що свідчить про гіперпродукцію ПА і накопичення їх в асцитній рідині. Окрім цього, відмінності у концентрації спермідину в сироватці крові у хворих на рак яєчника з асцитом і без нього були незначні. Це свідчить про те, що в тих випадках, коли перебіг захворювання супроводжується накопиченням асцитної рідини, концентрація спермідину в сироватці крові несе більш об'єктивну інформацію ніж вміст ПА у сечі. Встановлено, що у хворих на рак яєчника, як і у хворих на злоякісні лімфоми екскреція ПА з сечею та концентрація їх у крові корелюють з ефективністю лікування. При ефективній хіміотерапії, в перші 48?72 години після її початку спостерігали значне збільшення екскреції ПА з сечею та концентрації їх у крові (що свідчить про загибель пухлинних клітин і виділення з них ПА), надалі ці показники знижувались. При відсутності ефекту лікування екскреція ПА з сечею та їх концентрація в сироватці крові в ці терміни не знижувались, а, навпаки, підвищувались. Збереження початкового рівня ПА або його зниження в цей період указує на те, що пухлина нечутлива до хіміопрепарата. Виявлено, що більш інформативним для оцінки ефективності лікування є величина співвідношення спд2/пут2 спд1/пут1 , де спд1 і пут1 ? рівні спермідину і путресцину в сечі до лікування; спд2 і пут2 ? через 48 годин після початку лікування. При успішній терапії величина цього співвідношення (індексу) вища за 1,25; а при неефективній – нижча (рис.3). При обстеженні хворих на рак яєчника в процесі лікування виявлено пряму залежність між величиною цього індексу і клінічною оцінкою стану хворих: у 78% випадків встановлена повна відповідність між передбачуваним (на підставі величини даного індексу) результатом лікування і клінічною оцінкою ефективності проведеного курсу лікування. Результати дослідження вмісту ПА в сечі хворих на протязі 1?4 років показали, що зміни в екскреції ПА корелюють з перебігом пухлинного процесу: при ремісії вміст ПА в сечі хворих на рак яєчника значно нижчий, ніж при прогресуванні, рецидиві або генералізації процесу. Рис.3. Величина співвідношення спд2/пут2 спд1/пут1 у хворих з пухлинами яєчника в залежності від ефективності лікування. У ряді випадків, на фоні уявного “клінічного благополуч-чя”, результати ПА?тесту дозволили при-пустити наявність прогресії захворювання до його клінічних проявів. ПА сечі у хворих на пухлини грудної залози. Результати дослідження вмісту ПА у сечі хворих на рак грудної залози показали, що існує залежність між цим показником і ефективністю лікування. При променевій і хіміотерапії виділення ПА з сечею в перші дні лікування збільшувалось, а при досягненні терапевтичного ефекту знижувалось, у деяких хворих навіть до нормальних величин. Визначення вмісту ПА в сечі хворих на протязі 1,5?2 років показало, що при ремісії рівні ПА в сечі були значно нижчі порівняно з такими при прогресії захворювання (рис.4). Рис. 4. Екскреція ПА у хворих на рак грудної залози при прогресуванні захворювання і ремісії (а – І стадія; б – ІІ стадія; в – ІІІ стадія; г – IV стадія); по осі ординат – екскреція ПА з сечею; (на осі ординат ? ?ПА, мг/24 год); *Р<0,001. Індивідуальні коливання вмісту ПА в сечі відображали перебіг захворювання: після ефективного лікування вміст ПА в сечі суттєво знижувався, при появі рецидиву ? різко зростав. Отримані результати свідчать про доцільність залучення ПА-тесту до методів оцінки перебігу захворювання. Визначення вмісту ПА в сечі у хворих в інтеркурентний період буде сприяти ранньому виявленню рецидиву захворювання і допоможе своєчасно розпочати лікування. Наступним нашим завданням було дослідження молекулярно-біологічних механізмів дії ПА при злоякісному рості, зокрема, їх участі у регуляції фактора транскрипції NF-кB. Насамперед, ми спробували з’ясувати, чи можуть ПА безпосередньо впливати на процес зв'язування NF-кB з ДНК чи лише опосередковано ? через різні шляхи сигнальної трансдукції. Для цього нами були застосовані методи комп'ютерного моделювання (ці дослідження виконані спільно зі співробітниками Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України і Київського національного університету імені Т.Г.Шевченка Яковенко О.Я. і Голуб А.Г.) та проведена серія модельних дослідів з застосуванням методів ППР і FRET. При моделюванні впливу ПА на активність NF-кB ми вирішували дві задачі: знайти потенціальний сайт зв'язування ПА на р50-субодиниці NF-кB і приблизно оцінити константи дисоціації для комплексу р50~ДНК в присутності та за відсутності окремих ПА (сперміну, спермідину і путресцину). Результати комп'ютерного моделювання показали, що найбільш вірогідний сайт зв'язування ПА на поверхні NF-кB розташований в зоні міждоменного інтерфейсу білкової молекули. Встановлено, що зв'язування сперміну в цьому сайті може виникати за рахунок формування чотирьох водневих зв'язків з амінокислотними залишками Ser297, Asp298, Ser170, Asp298, Arg295 і однієї Ван-дер-Ваальсової взаємодії з Tyr200. Більша афінність до знайденого на поверхні р50 сайту властива сперміну (Kd=1,88Ч10-3) та спермідину (Kd=1,82Ч10-3), менша ? путресцину (Kd=1,06Ч10-2). Встановлено, що афінність р50 до ДНК в присутності сперміну зростає в 2,6 рази. Таким чином, теоретично було доведено, що ПА, і, в найбільшій мірі спермін, сприяли стабілізації міждоменного інтерфейсу білка р50, стабілізують комплекс р50~ДНК і зменшують вірогідність його спонтанної дисоціації . Результати комп'ютерного моделювання були підтверджені в модельних експериментах. Дослідження впливу ПА на зв'язування білка р50 з ДНК проводили методом ППР як у варіанті зв'язування вільних специфічних до NF-кB послідовностей ДНК (NRE) з іммобілізованим на сенсорному чіпі білком р50, так і в зворотному варіанті. Показано, що спермін значно підвищував зв'язування р50 з NRE-фрагментами в обох варіантах досліду (табл. 8). Таблиця 8 Вплив сперміну на зв’язування специфічних послідовностей ДНК (NRE) з іммобілізованою субодиницею р50 фактора транскрипції NF-кB. Умови досліду Відгук ППР на зв’язування NRE# з іммобілізованою на сенсорному чіпі субодиницею NF-кB, білком р50; кут.хв. Поверхневі концентрації NRE, нг/мм2 Контроль (без ПА) 0,18 ( 0,04 0,011 + 1мМ сперміну 0,38 ( 0,09* 0,024* # NRE – специфічні послідовності ДНК; *Р(0,05 порівняно з контролем Позитивний вплив ПА на зв'язування NF-кB з ДНК був підтверджений також за допомогою метода FRET. Ефективність переносу енергії між двома флюорофорами (Texas Red та родаміном В), якими були мічені послідовності ДНК та р50-субодиниця NF-кB, зростала за наявності в середовищі ПА (сперміну і путресцину) (рис.5). Рис. 5. Вплив ПА на ефективність переносу енергії від p50–RB до ДНК–TR (A – спермін, B –путресцин). Виявлено, що в разі преінкубації сперміну з ДНК перед додаванням р50, позитивний ефект сперміну на утворення комплексу ДНК~р50 більш виражений, ніж при додаванні сперміну до суміші ДНК з р50. Отримані результати вказують на адекватність даних комп'ютерного моделювання процесу. Таким чином, узагальнюючи отримані дані, можна зробити висновок, що одним з молекулярних механізмів дії ПА може бути їх участь в регуляції процесу транскрипції, опосередкованої фактором NF-кB. Наступне наше завдання полягало у дослідженні впливу ПА на активацію NF-кB в експериментальних пухлинах молочної залози. Ці дослідження проводили в умовах виснаження і акумуляції ПА в пухлинах як непрямим, так і прямим методами. У першому випадку виходили з відомого факту, що з цитоплазми в ядро NF-кB транспортується тільки після його активації, тобто після вивільнення з комплексу з інгібіторними білками. Тому вміст білків р50 і р65 визначали в клітинних і ядерних екстрактах пухлинних клітин. Прямі вимірювання були виконані з використанням метода трансфекції. Дослідження проведені на трьох моделях пухлин: клітинній лінії раку грудної залози людини MCF-7, карциносаркомі Уокер (W-256) щурів та карциномі Са755 мишей. Для інгібування синтезу ПА застосовували інгібітори ОДК ? бДФМО та ПМГ. Встановлено, що б-ДФМО і ПМГ, а також суміш поліфенолів зеленого чаю призводять до значного зниження вмісту всіх трьох ПА в пухлинних клітинах і, зокрема, в ядрах клітин. Виявлено, що ці речовини в застосованих дозах призводили до суттєвого пригнічення росту карциноми Са755 і карциносаркоми Уокер; індекс гальмування складав від 25% до 58%. Дослідження, проведені за допомогою методів ППР і Вестерн-блотингу показали, що на фоні індукованого б-ДФМО і ПМГ зниження ПА в клітинах цих пухлин відбувається транслокація білків NF-кB з цитоплазми в ядро, внаслідок чого в ядрах значно зростає вміст білка р50 ? одної з субодиниць NF-кB. Разом з тим, б-ДФМО значно слабше впливав на транслокацію другої субодиниці фактора NF-кB, білка р65. При дослідженні клітинної лінії MCF-7 виявлено, що б-ДФМО впливав на білки NF-кB в цих клітинах аналогічним чином. Так, при введенні б-ДФМО в культуральне середовище клітин MCF-7, вміст р50 в ядрах зростав на 75%, тоді як р65 на 32,5% (в 2,3 рази менше, ніж р50). При додаванні до культурального середовища разом з б-ДФМО путресцину вміст білків р50 і р65 виявився навіть нижчим, ніж в ядрах контрольних клітин (табл.9 і рис.6). Таблиця 9 Експресія білків NF-кВ (р50/р65) в ядрах клітин MCF-7 в умовах введення (-ДФМО та (-ДФМО + путресцин, (M(m). Поверхневі концентрації білків, що зв’яза-лись із специфічними антитілами, іммобі-зованими на сенсорних чіпах, нг/мм2 Контроль 5 мM (-ДФМО 5 мM (-ДФМО + 10 мкМ пут Білок р50 0,12(0,01 0,21(0,03* 0,10(0,01 Білок р65 0,27(0,03 0,36(0,04 0,15(0,01* *- Р(0,05? порівняно з показниками у контролі; n=5 Рис.6. Вплив (-ДФМО на експресію білків p50 і p65 в ядрах клітин MCF-7. Повне нівелювання впливу б-ДФМО путресцином, свідчить про те, що транслокація білків класичного фактора NF-кB в досліджуваних пухлинних клітинах залежить від змін в метаболізмі ПА, і не обумовлена побічними ефектами б-ДФМО. Встановлено, що введення тваринам б-ДФМО і ПМГ призводить до значного зростання в ядрах експресії інгібіторних білків NF-кB (IкарраB-б) (рис.7). Локалізуючись в ядрах, інгібіторні білки можуть пригнічувати транскрипційну активність NF-кB шляхом зіштовхування його з сайтів зв’язування. Рис.7. Експресія IкB-б в клітинних та ядерних екстрактах карцино-саркоми Уокер в умовах дії інгібіторів метаболізму ПА. Транслокація NF-кB в ядро (в літературі цей процес називають активація) ще не свідчить про його функціональну активність. Для того, щоб дізнатись чи залежить активність фактора в ядрі від рівня ПА, ми застосували метод швидкоплинної трансфекції. В клітини MCF-7 вводили конструкцію, що містила елемент відповіді NF-кB, субклонований у люциферазний вектор (NF-кB-люцифераза). Виявлено, що інкубація клітин з б-ДФМО призводить до зниження активності елементу відповіді. Це свідчить про те, що активність NF-кB при зменшенні в клітині ПА знижується (Рис.8). Рис. 8. Активність NF-кB в клітинах MCF-7, контрольних та після інкубації з б-ДФМО. Щоб довідатись, як впливають зміни метаболізму ПА на функціонування NF-кB в пухлинних клітинах ми дослідили рівень експресії білків – продуктів NF-кB ? залежних генів c-myc, bcl-xl, odc. Ці гени, як відомо, залучені в процеси проліферації та апоптозу. За допомогою метода ППР і Вестерн-блот аналізу на всіх трьох досліджених моделях пухлин молочної залози було продемонстровано, що в умовах дії б-ДФМО вміст білків с-Мyc i Вcl-XL в пухлинних клітинах знижується. На рис.9 представлені дані, отримані при дослідженні клітин карциносаркоми Уокер. Рис. 9. Вплив бДФМО на експресію білків Bcl-XL та c-myc в клітинах карциносаркоми Уокер. Знижувалась і експресія ОДК. Згідно даним, отриманим методом імуноблотингу після застосування б-ДФМО рівень білка Bcl-XL зменшувався в клітинах карциносаркоми Уокер приблизно на 43% у порівнянні з контролем, експресія білка c-myc знижувалась вдвічі, ОДК ? на 50-70%. На нашу думку, однією з причин такої ситуації може бути наступне: при виснаженні в клітинах ПА фактор транскрипції NF-кB, який формується в ядрі, не здатний ефективно впливати на транскрипцію генів odc, c-myc і bcl-XL. Можливо, це є наслідком формування в ядрі не класичного NF-кB (гетеродимера р50/р65), а гомодимера р50/р50. З літературних даних відомо, що існує певна спорідненність гомодимерів і гетеродимерів NF-кB до ДНК- послідовностей окремих генів. Як показано (Udalova et al., 2002), р50/р65–гетеродимер здатний зв'язуватись з ДНК-послідовностями окремих генів і сприяти транскрипції. В той же час, гомодимер р50/р50 також може приєднуватись до специфічних послідовностей і займати місця класичного NF-кB (p50/p65), і, тим самим, перешкоджати ефективній транскрипції (Urban, Baeuerle, 1991). Окрім цього, згідно даним Urban i Baeuerle (1991), як р50/р50, так і р50/р65 з високою афінністю зв'язуються з мотивом дикого типу (11-мерною послідовністю, 5’-ggggattcccc-3’). Але для ефективного розпізнавання мотиву і подальшого впливу на транскрипцію р50/р65, на відміну від р50/р50, має меншу потребу в 11-й його парі. А гомодимер р50/р50, навіть при умові його зв’язування з „урізаним” 10-мерним мотивом, здатний ефективно впливати на транскрипцію лише при наявності сперміну. Так як in vivo часто трапляються мотиви, змінені в положеннях 1 або 11, то гомодимер р50/р50, навіть при умові його зв'язування з послідовностями ДНК, через недостатність ПА не може повноцінно впливати на транскрипцію. Отримані дані дозволяють зробити припущення, що при виснаженні в клітинах ПА, в ядрах в більшій мірі формується не класичний фактор NF-кB (гетеродимер р50/р65), а гомодимер р50/р50. Комплекс гомодимеру з ДНК (р50/р50~ДНК) в умовах дефіциту ПА нестабільний і схильний до дисоціації. Це може бути однією з причин зниження транскрипції генів c-myc i bcl-XL і odc, що, в свою чергу, призводить до зниження рівнів їх білкових продуктів. Свій вклад в зниження транскрипції досліджуваних генів шляхом зіштовхування NF-кB з сайтів зв’язування можуть вносити і інгібіторні білки, зокрема, IкBб, наявність в ядрах яких продемонстрована в нашій роботі. Окрім цього, згідно даних літератури (Таnnіnі, 2004), при б-ДФМО-індукованому виснаженні ПА пригнічується фосфорилювання мітоген-активованих протеїнкіназ (МАРК), що, в свою чергу, може призводити до зменшення фосфорилювання в ядрі субодиниці NF-кB, білка р65, що також може бути однією з причин зниження транскрипції генів, залежних від класичного (р50/р65) фактора NF-кB. Необхідність ПА для проліферації клітин і дані про значне підвищення синтезу та вмісту ПА в пухлинних клітинах порівняно з нормальними незаперечно вказують на те, що як ферменти метаболізму ПА, так і самі ПА є перспективними мішенями для протипухлинної терапії, спрямованої на пригнічення проліферації злоякісних клітин. Більш того, відомо, що існує зв’язок між формуванням лікарської резистентності пухлин і якісною зміною реакції їх проліферативного режиму на цитостатичні препарати. Це свідчить про перспективність застосування модуляторів метаболізму ПА і як засобів подолання лікарської резистентності. Для з’ясування можливостей використання інгібіторів метаболізму ПА для протипухлинної терапії було досліджено вплив синтетичних і природних інгібіторів ОДК ((-ДМФО, ПМГ і поліфенолів зеленого чаю) на показники обміну ПА в експериментальних пухлинах, їх ріст та тривалість життя тварин з різними перещепленими пухлинами. Проаналізовано зв’язок між показниками метаболізму ПА і лікарською резистентністю стійких до цисплатину субштамів АРЕ, L 1210 і NK/ly та стійких до цисплатину і доксорубіцину субштамів карциноми Герена , а також досліджено вплив інгібіторів ОДК на ріст стійких до цисплатину субштамів АРЕ, лімфолейкозу L1210 і лімфоми NK/ly. Встановлено, що (-ДМФО і ПМГ ефективно впливають на метаболізм поліамінів в клітинах АРЕ, L 1210, гепатоми Г-27 та карциноми Льюїс: призводять до зменшення вмісту путресцину і спермідину, зменшення молярного співвідношення спд/спн, пригнічення активності ОДК, підвищення активності (-глутамілтранспептидази, збільшення рівня сперміну і ацетильованих форм ПА. Особливість дії ПМГ полягала в його здатності пригнічувати не лише синтез ПА за рахунок інгібіції ОДК, але й їх інтерконверсію за рахунок інгібування поліаміноксидази. Ці зміни в обміні ПА супроводжувались вираженим протипухлинним ефектом. Так, показано, що ПМГ (в дозі 1,5 мг/кг маси) і б-ДФМО (в дозі 200 мг/кг маси) після 2?5 введень їх тваринам значно пригнічували ріст клітин лімфолейкозу L1210. При цьому протипухлинний ефект ПМГ був значно сильніший ніж б-ДФМО (рис.10). Рис. 10. Вплив ПМГ і б-ДФМО на ріст клітин лімфолейкозу L1210. ПМГ, в залежності від дози та режиму його введення, також суттєво гальмував ріст клітин АРЕ. Терапевтичний індекс ПМГ (за показником середнього числа пухлинних клітин в асцитній рідині) становив від 27 до 97% (рис.11). Рис.11. Гальмування росту клітин АРЕ в залежності від дози і кількості введень тваринам ПМГ. Протипухлинна дія ПМГ супроводжувалась значним збільшенням тривалості життя піддослідних тварин (табл.11). Досліджено вплив екстракту зеленого чаю (18-23% суміш поліфенолів) на ріст карциносаркоми Уокер у щурів. Встановлено, що споживання тваринами 0,1% розчину цього екстракту призводить до зниження експресії ОДК, зменшення рівнів ПА в пухлинних клітинах та зниження експресії в ядрах пухлинних клітин білків фактора транскрипції NF-кB. Ці зміни супроводжувались суттєвим гальмуванням росту пухлин. Таким чином, отримані дані свідчать, що досліджувані інгібітори метаболізму поліамінів істотно гальмують ріст експериментальних пухлин і значно підвищують середню тривалість життя тварин. Таблиця 11 Вплив ПМГ на тривалість життя мишей з лімфолейкозом L 1210 та асцитним раком Ерліха (АРЕ). Моделі пухлин Групи тварин Тривалість життя (дні) L 1210 Контроль 19,3 ± 2,55 ПМГ 71,7 ± 17,50* АРЕ Контроль 20,0 ± 1,56 ПМГ 30,7 ± 3,50* *Р(0,05 ? порівняно з показниками у контрольних тварин. В резистентних до цитостатиків пухлинах виявлено низку характерних змін в системі метаболізму ПА та відповідні ефекти інгібіторів метаболізму ПА на показники лікарської резистентності. В процесі формування резистентності до цисплатину в пухлинних клітинах асцитного раку Ерліха, лейкозу L1210 та лімфоми NK/ly відбувались характерні зміни в метаболізмі ПА, які зберігались і в резистентних до цисплатину пухлинах. А саме, мало місце підвищення концентрації путресцину і збільшення питомої частки сперміну в загальній кількості ПА, зниження активності ДАО і (-глутамілтранспептидази. Введення цисплатину тваринам з резистентними до цього цитостатика штамами пухлин, на відміну від чутливих, призводило до ще більшого зростання вмісту ПА в пухлинних клітинах. В резистентних до доксорубіцину і цисплатину карциномах Герена мало місце суттєве збільшення концентрації путресцину, активності ОДК, зниження активності ДАО, вмісту ацетилспермідину і (-глутамілтранспептидази. В плазматичних мембранах клітин карциноми Герена, резистентних до цисплатину і доксорубіцину, виявлено значне збільшення кислоторозчинних і кислотоосаджуваних форм ПА, що може впливати на їх мікров’язкість і трансмембранний транспорт як цитостатиків, так і самих ПА. Встановлено, що інгібітори синтезу ПА (-ДФМО і ПМГ in vivo гальмують ріст резистентних до цисплатину пухлин, і значно підвищують середню тривалість життя тварин. Спільне використання ПМГ і цисплатину має адитивний ефект. Отримані результати свідчать про перспективність застосування інгібіторів обміну ПА для комбінованого лікування хворих із резистентними до цитостатиків пухлинами. Узагальнюючи одержані дані, можна зробити висновок про важливу роль ПА у розвитку злоякісних пухлин і перспективність використання інгібіторів обміну ПА як протипухлинних агентів. ВИСНОВКИ Робота присвячена дослідженню особливостей метаболізму і молекулярних механізмів дії ПА при канцерогенезі і пухлинному рості. Встановлено, що при N-НДЕА?гепатоканцерогенезі і при 1,2-ДМГ канцерогенезі кишковика у щурів відбуваються характерні зміни в метаболізмі ПА. Має місце двофазна інтенсифікація синтезу і накопичення ПА в органах-мішенях: в ранню (1-4 тижні) та пізню (5-6 місяці) стадії, що дозволяє зробити припущення про участь ПА в ініціації злоякісного росту. Виявлено, що в злоякісних пухлинах шлунка і товстого кишковика людини величина активності ОДК в середньому в 5 разів, а загальний вміст ПА – в 1,6 -2 рази вищі ніж в макроскопічно незміненій слизовій оболонці. Найбільш суттєво змінювався вміст путресцину, дещо менше ? спермідину. Вміст сперміну практично не змінювався, що призводило до підвищення величини молярного співвідношення путресцин/спермідин і спермідин/спермін. Виявлено зворотню залежність між величиною активності ОДК в аденокарциномах шлунково-кишкового тракту людини і ступенем їх диференціювання. В злоякісних пухлинах грудної залози величина активності ОДК в 5,5 рази, а вміст путресцину, спермідину і сперміну, відповідно, в 3,6; 4,0 і 4,9 разів вищі порівняно з показниками у макроскопічно незміненій тканині грудної залози. Виявлено, що рівні екскреції ПА з сечею та концентрація їх у сироватці крові у хворих на злоякісні лімфоми та рак яєчника при ефективному лікуванні в перші (1-3) доби підвищуються, а потім знижуються; при неефективному лікуванні таких змін не виявлено. Виявлено, що більш інформативним для оцінки ефективності лікування є величина співвідношення спд2:пут2 /спд1:пут1 , де спд1 і пут1 ? рівні спермідину і путресцину в сечі до лікування; спд2 і пут2 ? через 48 годин після початку лікування. При успішній терапії величина цього співвідношення (індексу) вища за 1,25; а при неефективній – нижча. В результаті довготривалих (на протязі 1?4 років) досліджень вмісту ПА в сечі та сироватці крові хворих на злоякісні лімфоми, рак яєчника та рак грудної залози встановлено, що дані ПА-тесту відображають перебіг пухлинного процесу: при ремісії спостерігається нормалізація рівнів ПА в біологічних рідинах, а підвищення концентрації ПА передує клінічним проявам рецидиву захворювання. ПА сприяють утворенню комплексу NF–кB з відповідними послідовностями ДНК (NRE), що є одним із важливих доказів участі ПА в регуляції транскрипції. Встановлено, що активність фактора транскрипції NF–кB в клітинах експериментального раку молочної залози залежить від метаболізму ПА. Виявлено, що гальмування росту експериментальних пухлин молочної залози інгібіторами біосинтезу ПА супроводжується зниженням експресії білків, продуктів NF–кB-залежних генів c–myc, bcl–xl, odc. Встановлено, що в процесі формування резистентності до цисплатину в пухлинних клітинах відбуваються характерні зміни в метаболізмі ПА, які зберігаються і в резистентних до цисплатину пухлинах. Виявлено підвищення концентрації путресцину і збільшення питомої частки сперміну в загальній кількості ПА, зниження активності ДАО і (-глутаміл-транспептидази. Встановлено, що досліджувані інгібітори метаболізму ПА істотно гальмують ріст експериментальних пухлин, значно підвищують середню тривалість життя тварин і можуть бути запропоновані для подальшої розробки в якості агентів для “таргетної терапії” онкологічних хворих. ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Бердинских Н.К., Залеток С.П. Полиамины и опухолевый рост. Киев, “Наукова думка”, 1987. – 141 с. (Автором проведено огляд та аналіз літератури по темі та разом із співавтором підготовлено монографію до друку). Залеток С.П., Бердинских Н.К, Драга Н.В. Некоторые аспекты биологической роли полиаминов при нормальном и неопластическом росте //Экспериментальная онкология. – 1984. – Т. 6, № 4. – С. 10-17. (Автором проведено огляд та аналіз літератури і підготовлено статтю до друку). Драга Н. В., Бердинских Н.К., Залеток С.П., Винницкая В.К., Евтушенко Г.В. Диагностическое и прогностическое значение полиаминного теста у больных с опухолями яичников //Вопросы онкологии. – 1987.– Т. 33, № 4. – C. 52-57. (Автором проведено аналіз діагностичної і прогностичної цінності ПА-тесту, підготовлено статтю до друку). Бердинских Н.К., Залеток С.П., Игнатенко Н.А., Драга Н.В. Увеличение активности орнитиндекарбоксилазы и содержания полиаминов в печени крыс в ранний период гепатоканцерогенеза //Украинский биохимический журнал. – 1988. – Т.60, № 1. – С 94-97. (Автором проведені дослідження активності ОДК та вмісту поліамінів в субклітинних фракціях печінки в процесі НДЕА-канцерогенезу, проаналізовано результати та підготовлено статтю до друку). Бердинских Н.К., Игнатенко Н.А., Залеток С.П., Бобро Л.И. Активность орнитиндекарбоксилазы и содержание полиаминов в опухолях желудочно-кишечного тракта человека //Экспериментальная онкология. – 1988. – Т. 10, № 6. – С. 39-41. (Автор приймала участь у визначенні поліамінів в пухлинах та готувала статтю до друку). Залеток С.П., Исмайлова И.М., Бердинских Н.К. Полиамины в лимфоцитах животных при экспериментальном опухолевом процессе //Вопросы медицинской химии. – 1989. – № 1. – С. 22-26. (Автором проведено дослідження поліамінів у лімфоцитах мишей в процесі росту карциноми легені Льюїс, підготовлено статтю до друку). Лидак М.Ю., Бауманис Э.А., Зидермане А.А., Каган Т.И., Закенфельд Г.К., Лисяный Н.И., Веровский В.Н., Бирска И.А., Залеток С.П., Брамберга В.М. Об антибластическом действии поликатиона полигексаметиленгуанидина (ПМГ)– представителя нового класса противоопухолевых препаратов //Вопросы онкологии . –1990. – Т. 36, № 3. – С. 269-276. (Автором проведено дослідження впливу ПМГ на ріст перещеплених пухлин , приймала участь у підготовці статті до друку). Уманский В.Ю., Хадуев С.Х., Залеток С.П., Балицкий К.П., Бердинских Н.К., Березов Т.Т. Антиметастатический эффект L-лизин-(-оксидазы //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1990. – № 5.– С. 458-459. (Автором проведено визначення поліамінів в крові тварин в умовах дії L-лізин-(-оксидази, приймала участь у підготовці статті до друку). Бердинских Н.К., Игнатенко Н.А., Залеток С.П., Активность орнитиндекарбоксилазы и содержание полиаминов в опухолях кишечника при канцерогенезе индуцированном 1,2-диметилгидразином у крыс //Экспериментальная онкология. – 1990. – Т.12, № 6. – С. 34-36. (Автор приймала участь у дослідженні поліамінів в слизовій оболонці кишковика щурів в процесі 1,2-ДМГ-канцерогенезу у щурів, підготовлено статтю до друку). Berdinskikch N.K., Ignatenko N.A., S.Zaletok, Ganina K.P., Chornij V.A. Ornithine decarboxylase activity and polyamine content in adenocarcinomas of human stomach and large intestine //Intеrnational Journal of Cancer. – 1991. – Vol. 47, N2. – P. 496-498. (Автор приймала участь у дослідженні поліамінів в пухлинах шлунково-кишкового тракту людини та готувала статтю до друку). Залеток С.П., Лялюшко Н.М., Бердинских Н.К., Игнатенко Н.А., Лидак М.Ю., Бауманис Э.А., Бирска И.А. Влияние полигексаметиленгуанидина на метаболизм полиаминов у беспородных крыс, рост и метастазирование перевивной карциномы Льюис у мышей //Экспериментальная онкология. – 1993. – Т.15, № 6. – С. 36-40. (Автором проведено визначення активності ОДК і вмісту поліамінів в печінці, нирках, сечі і крові щурів в умовах впливу полігексаметиленгуанідину (ПМГ) та досліджено вплив ПМГ на ріст і метастазування карциноми Льюїс у мишей, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Залеток С.П., Бердинских Н.К., Игнатенко Н.А., Бауманис Э.А., Лидак М.Ю., Лялюшко Н.М. Влияние полигексаметиленгуанидина на некоторые показатели метаболизма полиаминов у крыс с перевивной гепатомой Г-27 //Экспериментальная онкология – 1994. – Т. 16, № 2-3. – С. 136-139. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення активності ОДК, г-ГТ і вмісту поліамінів в тканині і плазматичних мембранах гепатоми Г-27 та печінки тварин-пухлиноносіїв, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Залєток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М., Тарутінов В.І., Скляр С.Ю., Александрова Н.О. Дослідження показників метаболізму поліамінів в пухлинах та фізіологічних рідинах у хворих з новоутвореннями грудної залози //Онкологія. – 2000. – Т. 2, № 4. – С. 250-252. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення вмісту поліамінів в сечі хворих на рак грудної залози в різні фази перебігу хвороби, проаналізовано результати і зроблено висновок про зв’язок між показниками ПА-тесту і активністю пухлинного процесу, підготовлено статтю до друку). Залєток С.П., Яковенко О.Я., Александрова Н.О. Голуб А.Г., Чехун В.Ф. Дослідження взаємодії поліамінів з ядерним фактором транскрипції NF- kappaB методами комп’ютерного моделювання //Український біохімічний журнал – 2002. – Т.74, № 5.– С. 133-138. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено огляд і аналіз літератури, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). S.Zaletok, N. Aleksandrova, N. Berdynskykh, N. Ignatenko, S. Gogol, A. Orlovsky, N.Tregubova, E. Gerner, V. Chekhun. Role of polyamines in the function of nuclear transcription factor NF-(B in breast cancer cells //Экспериментальная онкология. –2004. – Т.26, №3. – P.221-225. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено огляд і аналіз літератури по темі, проведено визначення поліамінів в клітинних та ядерних екстрактах пухлин, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Александрова Н.О., Залєток С.П., Скляр С.Ю., Тарутінов В.І. Застосування статистичного аналізу для визначення цінності поліамінного тесту в прогнозуванні тривалості життя хворих раком грудної залози //Вісник проблем біології і медицини. – 2004. – Вип. 4. – С.108-114. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення поліамінів в сечі хворих на рак грудної залози, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Александрова Н.О., Авілов С.В., Залєток С.П. Вплив сперміну та путресцину на зв’язування фактора транскрипції NF-кB зі специфічними послідовностями ДНК //Український біохімічний журнал. – 2004. – Т.76, № 6. –С.76-83. (Автором сформульовано задачі дослідження, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Залеток С.П., Бердинских Н.К., Лялюшко Н.М., Кленов О.А., Самойленко Е.А., Лидак М.Ю. Влияние ингибиторов синтеза полиаминов б-дифторметилорнитина и полигексаметиленгуанидина на кинетику роста лейкоза L1210 и продолжительность жизни животных опухоленосителей //Врачебное дело. – 2005. – № 8. – С.76-83. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення вмісту поліамінів в клітинах лейкозу L1210, проведено аналіз взаємозв’язку між показниками метаболізму поліамінів та кінетикою росту пухлинних клітин, підготовлено статтю до друку). Залєток С.П., Орловський А.А., Гоголь С.В., Самойленко Е.А., Гулуа Л., Квеситатзе Г.І. Вплив рослинних біоконцентратів на основі чаїв Грузії per se та в комбінації з цисплатином на ріст карциносаркоми Уокер W-256 та карциноми Герена щурів //Лікарська справа. – 2006. – № 8. –С.89-93. (Автором сформульовано задачі дослідження, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Александрова Н.О., Авілов С.В., Верьовка С.В., Костюкевич К.В., Залєток С.П., Ширшов Ю.М. Спосіб модифікації поверхні золота для імобілізації біологічних молекул. Деклараційний патент на винахід № 48537А, 15.08.2002, Бюл. №8. (Автором сформульовано задачі дослідження, проаналізовано результати, приймала участь у підготовці матеріалів до патентування). Berdinskikh N.K., Zaletok S.P., Draga N.V. Determination of polyamine excretion in diagnosis of malignant tumors and in assessment of therapy efficacy in oncologic patients. //”Recent Progress in Polyamine Research”, eds. Selmeci L., Brosnan M., Seiler N. /Acad. Press, NewYork, 1985. – P. 449-457. (Автором проведено частину досліджень поліамінів в сечі хворих на рак та у неонкологічних хворих, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку). Залеток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М., Гоголь С.В., Александрова Н.О., Лидак М.Ю., Придатко О.Е. Исследование влияния синтетических ингибиторов и физиологических регуляторов биосинтеза полиаминов на показатели метаболизма полиаминов в клетках экспериментальных опухолей и продолжительность жизни животных– опухоленосителей //Актуальные проблемы медицины и биологии. – 2003.–№ 1.–С.92-103. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення активності г-ГТП, вмісту поліамінів в пухлинних клітинах в різні періоди їх росту в умовах дії б-ДФМО, ПМГ і вітаміну А, проаналізовано результати, підготовлено до друку статтю). Залєток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М., Триндяк В.П., Орловский О.А. Дослідження поліамінів в пухлинах, що резистентні до хіміотерапії //Актуальные проблемы медицины и биологии. – 2003.–№ 1. –С. 73-85. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення активності ОДК, вмісту поліамінів і їх ацетильованих форм в пухлинних клітинах АРЕ, NK/ly та карциноми Герена в процесі формуванні резистентності до цитостатиків, проаналізовано результати, підготовлено до друку статтю). Александрова Н.О., Залєток С.П., Скляр С.Ю., Тарутінов В.І., Самойленко О.О. Концентрація поліамінів у сечі хворих, прооперованих з приводу раку грудної залози та їх виживаність //Актуальные проблемы медицины и биологии.– 2004.– №.1.– С.238-252. (Автором сформульовано задачі дослідження, проведено визначення вмісту поліамінів в сечі хворих на рак грудної залози, проаналізовано результати, підготовлено до друку статтю). Бердинських Н.К., Залєток С.П., Казьмін С.Д., Лялюшко Н.М. Поліаміни в експериментальній і клінічній онкології //В кн. “Шляхи та перспективи розвитку екпериментальної онкології в Україні” під ред Чехуна В.Ф. /Київ, “ДІА”, 2001. – C.61-67. (Автором проведено огляд і аналіз літературних даних та аналіз результатів досліджень поліамінів, проведених в відділі біохімії пухлин, підготовлено статтю до друку). Бердинских Н.К., Залеток С.П., Зиневич А.К., Драга Н.В., Евтушенко Г.В. Определение экскреции полиаминов в диагностике злокачественных опухолей и для оценки эффективности лечения онкологических больных //Методические рекомендации. – Москва, 1985.– 15 с. (Автором розроблено метод визначення ПА в сечі та крові, проведені дослідження поліамінів в сечі хворих з різними локалізаціями пухлин, підготовлено методичні рекомендації до друку). Berdinskikh N.K., Zaletok S.P. Polyamines and ornithinedecarboxylase (ODC) activity in rat liver subcellular fractions in early period of NDEA-induced hepatocarcinogenesis //Тези “International Conference on Polyamines in Life Sciences”. – Токіо, Japan, 1986. – С. 137-138. Berdinskikch N.K., S.Zaletok, Draga N.V. Polyamines and their use in clinical oncology //Тези “7th Internatational Conference on Human Tumor Marker”.– Київ, 1990 // Journal of Tumor Marker Oncology. – 1990.– Vol.5, № 3. – Р. 217. Berdinskikch N.K., Ignatenko N.A., S.Zaletok. Ornithine decarboxylase activity and polyamine level in human gastrointestinal adenocarcinomas //Тези „International symposium “Polyamines in Molecular and Medical Biology”. – Kyoto, Japan, 1990.– P.138. Berdinskikh N.K., Draga N.V., S.Zaletok, Eutushenko J.V. Predicting the treatment officiency of patients with malignant tumours of ovaries with the help of polyamine test //Тези „International symposium “Polyamines in Molecular and Medical Biology”. – Kyoto, Japan, 1990. – P. 140. Залеток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М. Влияние полигексаметиленгуанидина на некоторые показатели обмена полиаминов и его противоопухолевое действие //Тези ІІ з’їзду онкологів СНД з участю вчених Європи, Азії, Америки. – Київ, 2000. – С. 257. Залєток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М., Александрова Н.О., Скляр С.Ю., Носа П.П. Вміст поліамінів та активність орнітин-декарбоксилази в пухлинних тканинах та фізіологічних рідинах хворих на новоутворення грудної залози //Тези Х з’їзду онкологів України. – Ялта, 2001. – С. 39. Alexandrova N.O., Zaletok S.P. Nuclear transcriptional factor NF kappaB–DNA interaction. Influence of polyamines //Тези 28-Meeting FEBS, Стамбул, 2002// The FEBS Journal. – 2002. – Vol. 269, №1. – Р.108 (PS5-142). Залеток С.П., Бердинских Н.К., Александрова Н.А., Триндяк В.П., Орловский О.А. Исследование метаболизма полиаминов в экспериментальных опухолях, резистентных к химиотерапии //Тезисы III Съезда онкологов и радиологов СНГ. –Мінськ, 2004.– С.331. S.Zaletok, Alexandrova N.A, Berdynskikh N.K., Gogol S.V.Orlovsky O.A., Chekhun V.F. The study of polyamines role in the regulation of oncogene expression by transcription factor NF-kappa B in tumor growth //Тези “First Ukrainian Congress for Cell Biology”. – Львів, 2004. – Р. 113. S.Zaletok, L.Gulua, A.Orlovsky, S.Gogol, N.Omiadze, N.Mchedlishvilli. Effect of green tea extract on the growth of experimental breast tumors //Тези Міжнар конф. “Food, Nutrition and Cancer”. – Вашингтон, США, 2005. – Р.48. Залеток С.П., Гулуа Л. Орловский А.А. Гоголь С.В., Самойленко Е.А., Чехун В.Ф. Противоопухолевая и антитоксическая активность биоконцентратов на основе грузинского чая //Тези ХІ з’їзду онкологів України. – Судак, 2006 – C.26. Залєток С.П., Гоголь С.В., Орловський О.А., Кленов О.О., Самойленко О.А. Роль поліамінів в регуляції експресії онкогенів фактором транскрипції NF-кB при пухлинному рості //Тези ХІ з’їзду онкологів України. – Судак, 2006. – C.27. S.Zaletok, S. Gogol, O. Orlovsky, N. Aleksandrova, O. Samoilenko, N. Ignatenko, E. Gerner. Role of polyamines in the function of nuclear transcription factor NF-(B in breast cancer cells. //Тези Міжн. конф. “Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases”. – Рим, 2006. – Р.157. S.Zaletok, L. Gulua, O. Orlovskiy, S. Gogol, O. Samoylenko. Antitumor effect of plant bioconcentrates may be mediated by polyamines and NF-кB-dependent signal pathways //Тези Міжн. конф. “Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases”. – Рим, 2006. – Р.253. АНОТАЦІЯ Залєток С.П. Поліаміни – маркери злоякісного росту і мішень для протипухлинної терапії. ? Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 – онкологія. ? Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2007. Дисертація присвячена дослідженню особливостей метаболізму поліамінів (ПА) при пухлинному рості; вивченню інгібіторів обміну ПА як протипухлинних агентів та дослідженню взаємозв'язку між метаболізмом ПА в пухлинах та процесом транскрипції, опосередкованим фактором NF-кВ. Встановлено, що характерним для експериментальних пухлин різного гістогенезу та пухлин людини є активація синтезу та закономірне підвищення вмісту окремих фракцій ПА. Виявлено, що ПА–тест може бути адекватним критерієм ефективності лікування та прогнозу перебігу захворювання у хворих на рак яєчника, грудної залози та злоякісні лімфоми. В експериментах in vivo встановлено, що перспективними мішенями для протипухлинної терапії є інтермедіанти обміну ПА. Встановлено, що інгібітори метаболізму поліамінів істотно гальмують ріст експериментальних пухлин, значно підвищують середню тривалість життя тварин і можуть бути запропоновані для подальшої розробки в якості агентів для “таргетної терапії” онкологічних хворих. Отримано важливі докази того, що однією з молекулярних функцій ПА при пухлинному рості є їх участь в регуляції активності фактора транскрипції NF-(B. Доведено, що протипухлинна дія інгібіторів метаболізму ПА пов’язана з сигнальними шляхами фактора транскрипції NF-кB. Ключові слова: поліаміни, ПА-тест, інгібітори біосинтезу поліамінів, протипухлинний ефект, фактор транскрипції NF-кB, онкогени. АННОТАЦИЯ Залеток С.П. Полиамины – маркеры злокачественного роста и мишень для противоопухолевой терапии. ? Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.01.07 – онкология. ? Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2007. Диссертация посвящена исследованию особенностей метаболизма полиаминов (ПА) при опухолевом росте; изучению ингибиторов обмена ПА как противоопухолевых агентов и исследованию взаимосвязи между метаболизмом ПА в опухолях и процессом транскрипции, опосредствованным фактором транскрипции NF-кВ. Установлено, что характерным для экспериментальных опухолей различного гистогенеза и опухолей человека является активация синтеза и закономерное повышение содержания отдельных фракций ПА. Установлено, что при химическом канцерогенезе процессу малигнизации предшествуют глубокие изменения в метаболизме ПА, которые проявляются в значительном увеличении активности ключевого фермента биосинтеза ПА ( орнитиндекарбоксилазы (ОДК), снижении активности фермента катаболизма ПА ( диаминоксидазы (ДАО) и значительном увеличении содержания ПА (путресцина, спермидина и спермина) в тканях-мишенях. Установлено, что при НДЭА-гепатоканцерогенезе и при 1,2-ДМГ канцерогенезе кишечника имеет место двухфазная интенсификация синтеза и накопления ПА в тканях и субклеточных фракциях (плазматических мембранах и ядрах) органов-мишеней: в раннюю (1-4 недели) и позднюю (5-6 месяцев) стадии, что свидельствует об участии ПА в инициации злокачественного роста. Установлено, что высокие уровни ПА сохраняются и в сформированных опухолях. Установлено, что в процессе формирования резистентности к цисплатину в опухолевых клетках происходят характерные изменения в метаболизме ПА, которые сохраняются и в резистентных к цисплатину опухолях. Выявлено повышение концентрации путресцина и увеличение удельного веса спермина в общем количестве ПА, снижение активности ДАО и (-глутамилтранспептидазы. Установлено, что в злокачественных опухолях желудка, толстого кишечника и грудной железы человека величина активности ОДК и содержание ПА значительно превышают соответствующие показатели в макроскопически неизмененной слизистой оболочке и неизмененной ткани грудной железы. Установлено обратную зависимость между величиной активности ОДК в аденокарциномах желудочно-кишечного тракта человека и степенью их дифференциации. На основании длительных (на протяжении 1?4 лет) исследований экскреции ПА с мочой и концентрации их в сыворотке крови у больных злокачественными лимфомами, новообразованиями яичника и раком грудной железы разработано и клинически апробировано полиаминный тест (ПА-тест), чувствительность которого составляет 80-90%. Установлено, что уровни экскреции ПА с мочой и их концентрация в сыворотке крови у больных злокачественными лимфомами и новообразованиями яичника при эффективном лечении в первые (1-3) сутки повышаются, а затем снижаются, при неэффективном лечении таких изменений не наблюдалось. Установлено, что более информативной для оценки эффективности лечения является величина соотношения спд2:пут2 /спд1:пут1 , где спд1 и пут1 ? уровни спермидина и путресцина в моче до лечения; спд2 и пут2 ? через 48 часов после начала лечения. При эффективной терапии величина этого соотношения (индекса) выше 1,25; а при неэффективной – ниже. Установлено, что данные ПА-теста отражают течение опухолевого процесса : при ремиссии наблюдается нормализация уровней ПА в биологических жидкостях, а повышение концентрации ПА предшествует клиническим проявлениям рецидива заболевания. В экспериментах in vivo установлено, что перспективными мишенями для противоопухолевой терапии являются интермедианты обмена ПА. Показано, что введение животным с экпериментальными опухолями синтетических (б-дифторметилорнитина, б-ДФМО, и полигексаметиленгуанидина, ПМГ) и природных (полифенолов зеленого чая и витамина А) ингибиторов ОДК приводит к снижению содержания ПА в опухолях, что сопровождается значительным угнетением роста опухолей и существенным увеличением продолжительности жизни животных. Установлено, что механизм действия ПМГ связан не только с его прямым ингибиторным действием на ОДК, но и с влиянием на (-глутамилтранспептидазу, фермент, который принимает участие в регуляции ОДК. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования ингибиторов метаболизма ПА в качестве агентов для “таргетной терапии” онкологических больных. Получены важные доказательства того, что одной из молекулярных функций ПА при опухолевом росте является их участие в регуляции активности фактора транскрипции NF-(B. Установлено, что ПА способствуют образованию комплекса NF–кB с ответными последовательностями ДНК (NRE). Выявлено, что активность фактора транскрипции NF–кB в клетках рака молочной железы зависит от метаболизма ПА. Полученные данные позволяли сделать предположение, что при истощении в клетках ПА, в ядрах в большей мере формируется не классический фактор NF-кB (гетеродимер р50/р65), а гомодимер р50/р50. Комплекс гомодимера с ДНК (р50/р50~ДНК) в условиях дефицита ПА нестабилен и склонен к диссоциации. Это может быть одной из причин снижения транскрипции генов c-myc и bcl-XL и odc, что, в свою очередь, приводит к снижению уровней их белковых продуктов. Свой вклад в снижение транскрипции исследуемых генов, путем сталкивания NF-кB из сайтов связывания, могут вносить и ингибиторные белки, в частности, б-IкарраB, наличие в ядрах которых продемонстрировано в настоящей работе. Показано, что противоопухолевое действие ингибиторов метаболизма ПА связано с сигнальными путями фактора транскрипции NF-кB. Угнетение роста экспериментальных опухолей молочной железы ингибиторами биосинтеза ПА сопровождалось снижением экспрессии белков, продуктов NF–кB-зависимых генов c–myc, bcl–xl, odc. Ключевые слова: полиамины, ПА-тест, ингибиторы биосинтеза полиаминов, противоопухолевый эффект, фактор транскрипции NF-кB, онкогены. ANNOTATION Zaletok S.P. Polyamines – markers of tumor growth and targets for anticancer therapy. – A manuscript. Dissertation for the Doctor of Biological sciences in speciality 14.01.07 – Oncology. – R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv. – 2007. Dissertation was covers to study the peculiarities of polyamines metabolism (PA) during tumor growth; to investigate the inhibitors of PA metabolism as an anticancer agents, and to evaluate the interrelationship between PA metabolism in tumors and transcription mediated by NF-кB. It was shown that the activation of synthesis and regular increase of individual fraction of PA is a characteristic features for experimental tumors and human malignant neoplasms with different histological genesis. It was detected that PA-test may be used as acceptable criteria of the therapy efficacy as well as prognostic factor of clinical outcome in patients with ovarian cancer, breast cancer and malignant lymphoma. Experiments in vivo have allowed to shown that promising targets for anticancer therapy are the intermediate of PA metabolism. It was found that the inhibitors of PA metabolism have significantly inhibited the growth of experimental tumors, prolonged the mean survival time of tumor-bearing animals, and may be recommented for the further creation as a means for target therapy of oncological patients. The significant evidences were obtained that PA participation in the regulation of activity of NF-кB transcription factor is one of the molecular functions of PA by tumor growth. It was found that antitumor action of inhibitors of PA metabolism is linked with of NF-кB signaling pathway. Key words: polyamines, PA-test, inhibitors of PA biosynthesis, antitumor effect, NF-кB transcription factor, oncogenes.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *