Особливості функціонування асоціативної системи: шовковиця – азотфіксуючі бактерії роду azospirillum (автореферат)

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Гончар Юлія Олександрівна

УДК 631.461.5:576.851:155

Особливості функціонування асоціативної системи: шовковиця –
азотфіксуючі бактерії роду azospirillum

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у лабораторії біологічного азоту Інституту
сільськогосподарської мікробіології УААН

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Надкернична Олена Володимирівна,

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН,

завідувач лабораторії біологічного азоту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Курдиш Іван
Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім.. Д.К. Заболотного
НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих
поверхнях

доктор біологічних наук, професор Паршикова

Тетяна Вікторівна, Київський національний

університет імені Тараса Шевченка, завідувач

кафедри фізіології та екології рослин

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

м. Київ

Захист відбудеться “19” жовтня 2005 р. о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143,
вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “10”вересня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М. ЗАГАЛЬНА
ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фіксація молекулярного азоту є важливим біологічним
процесом, який поряд з фотосинтезом забезпечує існування життя на нашій
планеті. Незаперечну роль в цьому процесі відіграють азотфіксуючі
мікроорганізми, взаємовідносини яких з рослинами настільки різноманітні,
що продовжують залишатися пріоритетним напрямком досліджень сучасної
мікробіології, генетики, біохімії і фізіології рослин [Manguiat I.,
1985, Anderson A., 1986, Gough C., 1997].

Найбільш ефективним механізмом забезпечення рослин зв’язаним азотом є
симбіотична азотфіксація бобовими культурами, що дозволяє без втрат
залучати фіксований азот до складу рослини-живителя.

Останні 20 років дослідники багатьох країн світу приділяють велику увагу
вивченню асоціативної азотфіксації в кореневій зоні небобових рослин та
мікроорганізмам, які здійснюють даний процес. Початок цьому напрямку
поклали праці Dobereiner (1972, 1976, 1978). На основі азотфіксуючих
мікроорганізмів розроблено біопрепарати, що широко застосовуються у
сільськогосподарському виробництві для інокуляції рослин з метою
підвищення їх продуктивності та якості врожаю [Skipper H.D., 1980,
Антипчук А.Ф., 1997, Іутинська Г.О., 2000, Курдиш І.К., 2001].

На сьогодні не існує єдиної думки відносно просторової локалізації
діазотрофів в кореневій зоні рослин [Dobereiner J., 1978, Емцев В. и
Чумаков М., 1998]. Найбільш перспективним, на наш погляд, є застосування
для інокуляції рослин діазотрофів, що здатні до ендофітії. Така
асоціація забезпечує більш тісну, а тому, і більш ефективну взаємодію
бактерій з рослиною та більшу стійкість щодо несприятливих умов
навколишнього середовища. Відомо, що бактерії родів Azospirillum [Bashan
Y., 1986, Bashan B.Y., 1986, Magalhaes F.M., 1979], Bacillus [Klukcas
R.V., 1981], Clostridium [Чумаков М.И., 1987], Azotobacter [Sharma S.,
1985], Pseudomonas [Lynch J.M., 1983] здатні проникати в зону
гістосфери, розмножуватись там і фіксувати атмосферний азот.

Показано, що деякі небобові рослини утворюють на коренях бульбочки під
впливом різних факторів і в більшості випадків їх поява зв’язана з
проникненням в кореневу систему мікроорганізмів-азотфіксаторів [Родынюк
И.С., 1982, Шапошников Г.Л., 1995, Boivin-Masson, 2001, Mattsson U. і
Sellstedt A., 2002]. Значний інтерес викликає здатність до формування
штучного азотфіксуючого симбіозу різноманітними сільськогосподарськими
культурами під впливом біогенних і абіогенних факторів нодуляції
[Krol M.J., 1997, Надкерничная Е.В., 1989, Ковальская Н.Ю., 2002].
Розповсюдження можливостей симбіотичної азотфіксації на небобові рослини
– важливий спосіб підвищення ефективності біологічної фіксації азота.

Більшість робіт, присвячених асоціативній азотфіксації, проведено зі
злаковими та овочевими культурами, в той час як взаємодія діазотрофів з
багаторічними дерев’янистими рослинами не вивчалася.

Таким чином, вивчення асоціативної взаємодії мікроорганізмів з
багаторічними плодовими рослинами та здатності діазотрофів викликати
утворення на коренях даних культур азотфіксуючих бульбочок є незаперечно
необхідним і актуальним, оскільки розширює наші уявлення про механізми
функціонування мікробно-рослинних асоціацій та може бути основою
підвищення родючості ґрунтів, продуктивності сільськогосподарських
культур, покращення якості продукції і збереження навколишнього
середовища від забруднень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у відповідності з НТП УААН: “Наукові основи стійких агроекосистем”,
підпрограмою: “Сільськогосподарська мікробіологія”, завданням: “Вивчити
взаємодію мікро- та макросимбіонтів при ефективному функціонуванні
системи: азотфіксуючі мікроорганізми – рослина” (№ 0101U003749).

Мета і задачі досліджень. Мета роботи – вивчити взаємодію представників
роду Azospirillum з рослинами шовковиці у процесі формування ефективних
асоціацій; з’ясувати можливість утворення на коренях шовковиці
парабульбочок з високою нітрогеназною активністю, а також вивчити вплив
інтродукованих мікроорганізмів на продуктивність та якість листя
шовковиці.

Відповідно до поставленої мети було сформовано такі завдання:

? вивчити якісний і чисельний склад та нітрогеназну активність
азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці;

? провести скринінг мікроорганізмів, здатних утворювати ефективні
асоціації з рослинами даної культури;

? встановити здатність азоспірил заселяти внутрішні тканини коренів;

? вивчити явище паранодуляції на коренях шовковиці під впливом біогенних
та абіогенних факторів нодуляції;

? дослідити вплив азоспірил на продуктивність та якість листя шовковиці;

? розробити на основі ефективного штаму азоспірил препарат для
підвищення врожаю та покращення якості листової продукції рослин
шовковиці.

Об’єктом досліджень був мікробний ценоз кореневої зони шовковиці,
бактерії, виділені з бульбочок “гігантської” шовковиці (Agrobacterium
radiobacter 51, A. radiobacter C7, Alcaligenes paradoxus 5, Azospirillum
brasilense 53, A. brasilense 54 и A. brasilense 61), шовковиця (Morus
alba L.) сортів Українська-5, Українська-6, Українська-7 та гібридні
рослини даної культури.

Предметом дослідження була взаємодія азоспірил і рослин шовковиці в
процесі формування та функціонування ефективних асоціацій.

Методи досліджень: мікробіологічні – для виділення діазотрофів з
мікробних ценозів; фізіолого-біохімічні та культурально-морфологічні –
для ідентифікації діазотрофів; генетичного маркування мікроорганізмів,
імунологічні та імунохімічні – для ідентифікації ізолятів із внутрішніх
тканин шовковиці; газохроматографічний – для визначення азотфіксуючої
активності мікроорганізмів і парабульбочок шовковиці; біохімічні – для
визначення вмісту в листі мікро- та мікроелементів, органічних речовин,
пігментів, вітамінів; вегетаційних та польових дослідів – для визначення
ефективності застосування діазотрофів; математично-статистичні – для
оцінки вірогідності отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено якісний склад і
нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці.

Вперше розроблена модифікована схема імунізації кролів для отримання
штамоспецифічної антисироватки до бактерій A. brasilense 54 з метою
ідентифікації ізолятів, виділених із внутрішніх тканин коренів
шовковиці. За допомогою генетичного маркування мікроорганізмів,
імунологічних та імунохімічних методів доведена здатність азоспірил
проникати у внутрішні тканини коренів шовковиці і утворювати стійку
асоціацію з рослинами, що ефективно функціонує протягом 16 місяців після
інокуляції.

Вперше отримані парабульбочки на коренях стерильних проростків шовковиці
та на коренях сіянців, вирощених на нестерильному ґрунті в умовах
вегетаційного досліду. Встановлено позитивний вплив 2,4-Д на розвиток
кореневої системи шовковиці за одночасної інокуляції азоспірилами
проростків та сіянців даної культури.

Вперше показано, що азоспірили здатні підвищувати врожай шовковиці і
вміст в листі макро- та мікроелементів, органічних речовин, пігментів і
вітамінів.

Розроблено новий біопрепарат ризобразін, діючою основою якого є бактерії
A. brasilense 54, а також засоби його застосування на рослинах шовковиці
різного віку.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано штамоспецифічну
антисироватку до бактерій роду Azospirillum, яка дозволяє проводити
надійну та швидку ідентифікацію ізолятів, виділених з внутрішніх тканин
коренів сільськогосподарських культур.

Для підвищення біометричних показників, продуктивності та якості листя
шовковиці рекомендовано біопрепарат різобразін. Розроблені,
експериментально перевірені і захищені патентом України способи
обробітку рослин шовковиці даним препаратом.

Розроблено спосіб обробітку рослин шовковиці 2,4-діхлорофеноксіацетатом
за одночасною їх інокуляцією азоспірилами. Застосування даного прийому
сприяє більш інтенсивному розвитку кореневої системи рослин та утворенню
парабульбочок на коренях шовковиці.

Особистий внесок здобувача. Виділення мікроорганізмів з кореневої зони
шовковиці, вивчення їх властивостей, розробка способів штучного
індукування утворення парабульбочок на коренях шовковиці, визначення їх
структури проведено дисертантом особисто. Здобувач самостійно проводила
лабораторні, вегетаційні та польові дослідження. Облік показників
продуктивності рослин в умовах польових дослідів на базі Інституту
шовківництва УААН проводили за консультативної підтримки кандидата с.-г.
наук Н.О. Олексійченко.

Штами бактерій, використані в роботі, були отримані з колекції корисних
ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології
УААН.

Проведення імунологічних та імунохімічних досліджень проводили сумісно з
науковим співробітником відділу фітовірусології та біотехнології
Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН І.В. Волковою.

Аналіз і теоретичне обґрунтування отриманих результатів, їх
узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і
висновків дисертації, підготовку до друку наукових статей здобувачем
проведено особисто під керівництвом наукового керівника дисертаційної
роботи д.б.н. О.В. Надкерничної.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на
конференції молодих вчених “Досягнення і перспективи розвитку
агробіотехнології на Україні” (Київ, 2001), ХI міжнародному симпозіумі
“Нетрадиційне рослинництво. Эніологія. Екологія і здоров’я” (Алушта,
2002), міжнародній науковій конференції “Стійкий розвиток агроекосистем”
(Вінниця 2002), конференції молодих дослідників “Сільськогосподарська
мікробіологія: досягнення і проблеми” (Чернігів, 2002), конкурсі робіт
молодих вчених (Київ, 2002), конференції молодих вчених “Біологічні
науки і проблеми рослинництва” (Умань, 2003), II конференції молодих
вчених “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми”
(Чернігів, 2003), X з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса,
2004), Міжнародній науково-практичній конференції присвяченій 100-річчю
з дня народження В.Ю. Казакова (Одеса, 2004), конкурсі експериментальних
робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2005), IX конференції молодих
дослідників, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка АН УРСР і
ВАСГНІЛ П.А. Власюка (Київ, 2005), конкурсі експериментальних робіт
молодих дослідників – учасників ІІІ конференції “Сільськогосподарська
мікробіологія: здобутки і проблеми” (Чернігів, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць (5
статей, з них 3 – у фахових журналах; один патент, методичні
рекомендації, 4 – тези доповідей).

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг дисертації становить 146
сторінок машинописного тексту. Робота складається зі вступу, огляду
літератури, 4 розділів експериментальної частини, обговорення
результатів, висновків та списку використаної літератури, який містить
298 першоджерел (з них 149 – англійською мовою). Робота ілюстрована 27
рисунками і 32 таблицями.

Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури розглянуто асоціативні взаємовідносини діазотрофів з
небобовими рослинами, механізми позитивного впливу бактерій на
сільськогосподарські культури, а також сучасні погляди на роль
ендофітних мікроорганізмів. Показано можливість створення штучного
симбіозу (утворення парабульбочок) під впливом абіогенних і біогенних
факторів нодуляції.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об’єктами досліджень були: діазотрофи, виділені з кореневої зони
шовковиці та з бульбочок, що спонтанно утворилися на коренях
“гігантської” шовковиці (Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter
C7, Alcaligenes paradoxus 5, Azospirillum brasilense 53, A. brasilense
54 и A. brasilense 61); рослини шовковиці (Morus alba L.) сортів:
Українська-5, Українська-6, Українська-7 і гібридні насадження
шовковиці.

Досліджували чисельність діазотрофів в ризосфері, ризоплані та
гістосфері рослин шовковиці. Визначення чисельності та виділення
азотофіксуючих бактерій проводили за методами, загальноприйнятими у
ґрунтовій мікробіології та з використанням методик, що описані в
оригінальних роботах авторів: сімбіотрофні асоціації досліджували
методом граничних розведень на рідкому глюкозо-автолізатному середовищі
Федорова в модифікації Калінінської, олігонітрофілы – на напіврідкому
середовищі Ешбі, клостридії — на середовищі Виноградського [Калінінська
Т. А., 1981]. Чисельність флюоресцируючих псевдомонад визначали на
середовищі з гліцерином (0,1%), лактатом аммонію (0,025%) та глутаматом
натрію (0,05%) [Iizuka H., 1963]. Бактерії роду Azospirillum вивчали на
середовищі Доберейнер модифікованого складу [Калінінська Т. А., 1981] та
на агаризованому середовищі з конго червоним [Caceras S. A. R., 1982],
Азотобактер – на діагностичному середовищі [Fenglerowa W., 1965].
Виділення діазотрофів, вивчення їх морфологічних та
фізіолого-біохімічних властивостей проводилось загальноприйнятими у
ґрунтовій мікробіології методами [Методы культивирования азотфиксирующих
бактерий, 1991, Звягинцев Д.Г., 1980].

Нітрогеназну активність бактерій у чистій культурі та азотофіксуючу
здатність парабульбочок визначали ацетиленовим методом на газовому
хроматогрфі Chrom – 4 з полум’яно-іонізаційнимм детектором на колонці з
в – в-діоксіпропіонітрилом [Умаров – 1976 г.]. Температура термостату
50оС. Витрата газів: водню – 30 мл/хв, азоту – 100 мл/хв, повітря – 500
мл/хв.

Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні властивості
діазотрофів вивчали загальноприйнятими у мікробіології методами, а також
з використанням методів світлової та електронної мікроскопії [Г.
Шиммель, 1972].

В лабораторних дослідах вивчали вплив діазотрофів на схожість, дружність
та швидкість проростання насіння шовковиці [Гродзинский А. М., 1973].

Початкові етапи взаємодії штамів азоспірил з рослинами шовковиці вивчали
в умовах лабораторних дослідів. Простерилізоване насіння інокулювали
бактеріальною суспензією A. brasіlense 54, з титром 200 тис. клітин на
одну насінину. Через 5-10 діб після інокуляції коріння проростків
довжиною 1 см мікроскопіювали і підраховували кількість морфологічно
змінених кореневих волосків [Коннова С.А., 2003].

Визначали здатність бактерій проникати у внутрішні тканини коренів
шовковиці, використовуючи метод генетичного маркуваня
популяцій [Елементи регуляції в рослинництві: Зб. наук. пр., 1998].
Антибіотикостійкі мутанты отримували за методом Зибальського [Методы
общей бактериологии, 1984], використовуючи градієнт концентрації
стрептоміцину в агарі.

Дослідження взаємодії діазотрофів з рослинами шовковиці проводили також
за допомогою імунологічних методів [Ouchterlony O., 1953, Никитин В.М.,
1982]. Тварин імунізували відмитою фізіологічним розчином бактеріальною
суспензією з оптичною густиною Д660нм=1,3, що відповідає концентрації
3х1010 кл/мл. Як адьювант використовували мантанід ISA 25. Нами
запропонована модифікована схема імунізації, за якою була отримана
штамоспецифічна антисироватка з титром 1:32 в реакції преципітації і
4х105 в реакції твердофазного імуноферментного аналіза.

Явище паранодуляції вивчали лабораторними методами. Стерильні
життєздатні проростки шовковиці, які вирощували в пробірках з
напіврідким середовищем інокулювали азоспіриллами при одночасній обробці
їх 2,4-дихлорофеноксіацетатом в концентрації 5х10-6 г діючої речовини на
10 мл середовища. Явище паранодуляції вивчали також в умовах
вегетаційного досліду на нестерильному ґрунті. В ємкості з проростками
на стадії появи бокових коренів вносили 2,4-Д в концентрації 5х10-4 г
діючої речовини на 1 кг ґрунту за одночасної інокуляції азоспіриллами
(бактеріальне навантаження – 2-4х105 клітин на 1 рослину шовковиці).
Структуру парабульбочок вивчали під світловим мікроскопом.

Через 4 та 16 місяців після інокуляції рослин шовковиці визначали вміст
в листі калію [ГОСТ 30504-97.], кальцію [ГОСТ 26570-95], магнію [Лебедев
П.Т., Усович А.Т., 1976.], марганцю [ГОСТ 27997-88.], міді [ГОСТ
27995-88.], цинку [ГОСТ 27996-88.], заліза [ГОСТ 27998-88.], сирого жиру
[ГОСТ 13496. 15-97], розчинних вуглеводнів [Ермаков А.И., 1987],
загального азоту і білку [ГОСТ 13496.4-93], вітамінів [Нестеров Е.А.,
1976, Лебедев П.Т., Усович А.Т., 1976.], хлорофілу [Гродзинский А.М.,
Гродзинский Д.М., 1973] та каротину [ГОСТ 13496.17-95].

В умовах вегетаційних і польових дослідів вивчали вплив інокуляції
азоспіриллами на біометричні показники та продуктивність шовковиці.
Планування, проведення польових дослідів, нагляд і облік проводили за
методиками польового досліда [Доспехов Б.А., 1985] та методикою
державного сортодослідження сільськогосподарських культур (1983).
Обробку отриманих даних проводили, користуючись методами математичної
статистики [Доспехов Б.А., 1985].

Розділ 3. Відбір азотофіксуючих мікроорганізмів, що здатні утворювати
ефективні асоціації з рослинами шовковиці

Вивчено якісний склад і нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій
кореневої зони шовковиці. З різоплани, ризосфери та гістосфери рослин на
різних середовищах було виділено 87 чистих культур азотфіксуючих
бактерій. Їх здатність засвоювати молекулярний азот коливалась в межах
від 0,5 до 140 нмоль етилену на посудину (табл. 1). Високою здатністю до
азотфіксації характеризувалися представники родів Azotobacter, Bacillus,
Enterobacter, Azospirillum, Pseudomonas.

Таблиця 1

Нітрогеназна активність чистих культур діазотрофів, виділених з
кореневої зони і бульбочкоподібних структур шовковиці, що відрізнялась
гігантизмом

Штами Джерело виділення нмоль С2Н4/посудина за 24 години

Azotobacter sp. 12М Ризосфера 139,5

Azotobacter sp. 14М Ризосфера 116,5

Azotobacter sp. 15М Ризосфера 112,5

Bacillus sp. 5Ч Ризосфера 36,5

Bacillus sp. 9Ч Ризосфера 26,5

Azospirillum sp. 11М Ризоплана 10,0

Azospirillum sp. 2Ч Ризосфера 46,0

Enterobacter sp. 2М Ризосфера 98,0

Enterobacter sp. 3М Ризосфера 72,0

Enterobacter sp. 17М Ризосфера 94,5

Pseudomonas sp. 4М Ризоплана 112,0

Pseudomonas sp. 6М Ризосфера 12,9

A. brasilense 53 Бульбочкоподібні структури 91,50

A. brasilense 54 Бульбочкоподібні структури 206,50

A. brasilense 61 Бульбочкоподібні структури 278,00

A. radiobacter 51 Бульбочкоподібні структури 0,40

A. radiobacter C7 Бульбочкоподібні структури 6,15

НСР05 — 33,0

Нітрогеназна активність азоспірилл, виділених з ризосферного грунту і
різоплани шовковиці була в 6 – 9 раз нижче, ніж у штамів даного роду,
виділених з бульбочкоподібних структур шовковиці.

Визначали вплив інокуляції шовковиці активними штамами діазотрофів.
Показано, що азоспірили на відміну від інших азотфіксуючих бактерій
здатні здійснювати пролонговану дію на продуктивність насаджень
шовковиці.

Інтродукція бактерій роду Azospirillum в кореневу зону шовковиці
забезпечила через 4 місяці прибавку урожаю листя – 30-48%, а через 16
місяців – 50-53% (табл. 2, 3).

Таблиця 2

Вплив азоспірил на врожай листя гібридних насаджень шовковиці (польові
досліди, чорноземний грунт, 2001-2002 рр.)

Варіанти досліду Вік дерев Рік внесення препарата і обліку врожаю Врожай
листя з одного дерева, кг Прибавка врожаю

кг

%

Контроль (без обробки)

Інокуляція

А. brаsilense 53

Інокуляція

А. brаsilense 54

3 роки Не вносили

0,51?0,10

2001

0,70?0,10

0,19

40,00

0,73?0,20

0,22

43,14

Контроль (без обробки)

Інокуляція

A. brasilense 53

Інокуляція

А. brаsilense 54

4 роки Не вносили

0,79?0,04

2002

1,17?0,09

0,38

48,10

1,09?0,10

0,30

30,38

Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.

Таблиця 3

Пролонгований вплив азоспірил на врожай листя гібридних насаджень
шовковиці (польовий дослід, чорноземний грунт, 2001-2002 рр.)

Варіанти досліду Вік дерев Рік внесення препарата Врожай листя з одного
дерева, кг (2002 р) Прибавка врожаю

кг

%

Контроль (без обробки)

Інокуляція А. brаsilense 53

ІнокуляціяА. brаsilense 54

4 роки Не вносили

0,79?0,04

2001

1,19?0,14

0,40

50,63

1,21?0,13

0,42

53,16

Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.

Таким чином, прибавка урожаю листя через 16 місяців після інтродукції
штамів А. brаsilense 53 і А. brаsilense 54 перевищувала аналогічну
прибавку, отриману в рік інтродукції даних штамів в кореневу зону рослин
шовковиці, що свідчить про можливу здатність діазотрофів А. brаsilense
53 та А. brаsilense 54 проникати у внутрішні тканини кореня і, тим
самим, здійснювати пролонговану позитивну дію на рослину протягом
декількох вегетаційних періодів, що забезпечує не тільки більш тривале
існування ефективної асоціації мікро- та макроорганізма, але й більш
тісну їх взаємодію, а тому і більш інтенсивний обмін метаболітами.

Одним з показників виділення мікроорганізмами біологічно активних
речовин є збільшення кореневої поверхні рослин. В результаті інокуляції
насіння штамами A. brasilensе 53 и A. brasilensе 54 довжина кореневої
системи рослин шовковиці підвищувалась в 2, а маса – в 3 рази. Таке
значне підвищення параметрів кореневої системи рослин шовковиці
пояснюється виділенням азоспіриллами біологічно активних речовин. Як
наслідок ми спостерігали достовірне підвищення вмісту в листі шовковиці
вітамінів на 8-16% через 16 місяців після інокуляції.

Таким чином, пролонгована позитивна дія азоспірил на урожай листя
шовковиці та підвищення вмісту в ньому вітамінів, свідчить на користь
можливості досліджуваних бактерій проникати у внутрішні тканини кореня
рослин шовковиці, розмножуватись там і зберігати життєздатність протягом
двох вегетаційних періодів після інокуляції.

Розділ 4. Вивчення здатності A. brasilense вступати в ендоризосферні
асоціації з рослинами шовковиці

Характер взаємодії Azospіrіllum brasіlense з рослинами шовковиці при
утворенні ефективних асоціацій вивчали з перших етапів розвитку
мікробно-рослинних взаємовідносин.

Вивчення зміни морфології кореневих волосків під впливом інокуляції
проростків шовковиці штамами азоспірил показало, що дані бактерії здатні
викликати деформації кореневих волосків. Ми спостерігали прямі кореневі
волоски в контролі (без інокуляції) (рис. 1) і деформовані: скручені у
вигляді спіралі, гачковидно зігнуті та булавовидні кореневі волоски
(рис. 2, 3) в результаті інокуляції проростків азоспірилами, що свідчить
про здатність бактерій викликати зворотну реакцію рослин шовковиці
[Егоренкова И.В., 2000, Федоненко Ю.П., 2001].

Визначали вплив інокуляції азоспірилами насіння шовковиці на кількість
деформацій кореневих волосків проростків даної культури. Штами A.
brasіlense 53, A. brasіlense 54 и A. brasіlense 61 забезпечили
достовірне підвищення кількості морфологічних змін кореневих волосків в
порівнянні з контролем в 6,6 – 7,8 разів.

Рис. 1. Недеформовані кореневі волоски контрольних рослин

Рис. 2. Гачковидні та спіралевидні кореневі волоски при інокуляції
проростків шовковиці A. brasіlense 54.

Рис. 3. Булавовидні кореневі волоски при інокуляції проростків шовковиці
A. brasіlense 54.

З метою визначення здатності азоспірил проникати у внутрішні тканини
кореня шовковиці було отримано стрептоміцинстійкий штам A. brasіlense
54, який не відрізнявся від вихідного штаму по
культурально-морфологічним і фізіологічним ознакам і належав до S-типу.
Не змінилась також нітрогеназна активність мутантної культури та її
здатність позитивно впливати на продуктивність сіянців шовковиці.

4 ¬ i 3/4

a

oueoe?oeea*oeueoe?oe?oe?oe?oe?oe?oeCoeue?oeAoeAoeAoeAoeAoe?oe?oeAoeAoeAo
eAoeAoeAoe?oeAoeAoe?oeAoe?oe?oe?oe?oeueoeue?oe

EH

D

? o b

1/4

3/4

O

O

i

i

O

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

?™

i

i

i

i

?#

i

i

?e

i

i

»

O

°¬°I°O°o°(?H?N?uouiuouiueissiueissiussiuiuUiuouiueIeCIeCIeCeueieiuiuouiu
ouiueIeCeussiussiueuououou

A u

A u

A u

A u

O

O

tuo?e?e?a?e?ouououoaTHaouoaTHaUea?Oe?e?aTHaoaTHaTHaIaIaIaoIaTHaTHaTHaoaT
HaTHaTHae?e?e?e?e?eueuoe

?????????ції з поверхнево стерилізованого коріння були виділені
реізоляти стрептоміцинстійких мутантів, що доводить здатність азоспірил
проникати у внутрішні тканини рослин шовковиці.

Для підтвердження здатності досліджуваного штаму проникати в тканини
коренів рослин шовковиці паралельно з методом генетичного маркування ми
використовували імунологічні методи. Застосовуючи модифіковану нами
схему імунізації кролів, була отримана штамоспецифічна антисироватка з
титром 1:32 в реакції преципітації і 4х105 в реакції твердофазного
імуноферментного аналізу, що дозволило використати її для дослідження
можливості проникнення штаму Azospіrіllum brasіlense 54 у внутрішні
тканини коренів шовковиці. З поверхнево стерилізованих коренів через 16
місяців після інокуляції були виділені ізоляти №1, 2, 3, 4, 5, з коренів
рослин шовковиці через 4 місяці після інокуляції – ізоляти №6, 7, 8.
Ізоляти №1, 2, 6 утворювали смуги преципітації зі штамоспецифічною
антисироваткою.

Твердофазний імуноферментний аналіз (ТІФА) проводили на полістиролових
планшетах в непрямому варианті. (табл. 4). Аналіз представлених даних
дозволяє зробити висновок, що ізоляти №1, 2, 6 відповідають штаму A.
brasіlense 54.

Таблиця 4.

Результати імуноферментного аналізу ізолятів бактерій, виділених з
коренів дерев шовковиці.

Зразки ТІФА

ОГ, 492 нм

ОГзразка/ОГ(-)*

Позитивний контроль (A.brasilense 54) 2,984 4,76

Негативний контроль (A.brasilense Sp7) 0,627 1,0

Іолят №1 2,859 4,56

Ізолят №2 2,947 4,70

Ізолят №3 0,622 0,99

Ізолят №4 0,531 0,85

Ізолят №5 0,645 1,03

Ізолят №6 2,937 4,68

Ізолят №7 0,492 0,78

Ізолят №8 0,528 0,84

Ізолят №9 0,486 0,78

— Співвідношення ОГ досліджуваного зразка до ОГ негативного контролю.

Таким чином, результати ТІФА свідчать про те, що азоспірили здатні
проникати в корені рослин шовковиці та зберігати життєздатність протягом
16 місяців після інтродукції бактерій в кореневу зону цієї культури.

Розділ 5. Утворення парабульбочок на коренях шовковиці під впливом
абіогенних та біогенних факторів нодуляції

Вивчали явище паранодуляції на коренях шовковиці під впливом абіогенного
фактора нодуляції – 2,4-діхлорофеноксіацетата (2,4-Д), біогенного –
бактерій Azospirillum brasilense 54, а також при одночасній обробці
рослин 2,4-Д та інокуляції азоспіриллами.

Обробка 2,4-Д проростків шовковиці в стерильних умовах і сіянців,
вирощених на нестерильному грунті сприяла утворенню дрібних
парабульбочок на коренях даної культури, при цьому не спостерігалося
збільшення висоти рослин та маси листя, але маса коренів достовірно
підвищувалась у порівнянні з контролем на 56%.

При одночасній обробці сіянців шовковиці 2,4-Д і інокуляції їх A.
brasilense 54 на 10 – 14 добу утворюються парабульбочки округлої форми
(рис. 4).

Парабульбочки діаметром 2-5 мм утворювались переважно нижче кореневої
шийки та вздовж головного кореня. Дрібніші парабульбочки ми спостерігали
на нижній частині молодих коренів.

а) б)

Рис. 4. Парабульбочки на коренях сіянців шовковиці

а) 1 – контрольна рослина, 2 – рослина шовковиці, коренева система якої
була оброблена 2,4-Д за одночасної інокуляції штамом A. brasilense 54;
б) Збільшений фрагмент кореня сіянця шовковиці з парабульбочками.

В нестерильному ґрунті, де бактерії інокулюму конкурують з
мікроорганізмами природного мікробного ценозу, в парабульбочки можуть
проникати різні мікроорганізми. За використання методів отримання
стрептоміцин стійких мутантів, імунологічних та імунохімічних методів
нами було показано, що азоспірилли здатні заселяти парабульбочки
шовковиці, штучно утворені на коренях даної культури в результаті
обробки її 2,4-Д (табл. 5).

Таблиця 5

Результати імуноферментного аналізу ізолятів бактерій, виділених з
парабульбочок сіянців шовковиці.

Зразки ТІФА

ОГ, 492 нм

ОГзразка/ОГ(-)*

Позитивний контроль (A.brasilense 54) 2,984 4,76

Негативний контроль (A.brasilense Sp7) 0,627 1,0

Ізолят №1 2,791 4,45

Ізолят №2 2,847 4,54

Ізолят №3 2,096 3,34

— Співвідношення оптичної густини (ОГ) досліджуваного зразка до ОГ
негативного контролю.

Таким чином, ми встановили, що мікрофлора парабульбочок менш
різноманітна, ніж мікрофлора коренів. Вірогідно, застосування одночасної
обробки рослин 2,4-Д і інокуляції A. brasilense 54 сприяє заселенню
новоутворень на коренях шовковиці досліджуваним штамом. Значну роль в
цьому процесі відіграє також здатність азоспірил до ендофітії. Заселивши
парабульбочки на коренях шовковиці, азоспірили попереджують проникнення
в дані структури інших мікроорганізмів, в тому числі і патогенних.

Нітрогеназна активність парабульбочок, отриманих при інокуляції рослин
штамами азоспірил значно перевищувала (в 15 – 19 разів) активність
парабульбочок, що з’явилися на коренях сіянців в результаті обробки їх
лише 2,4-Д (табл. 6).

Слід відмітити, що обробка сіянців 2,4-Д з одночасною інокуляцією A.
brasilense 54 забезпечила достовірне підвищення показника маси коренів
(в 2,6 разів в порівнянні з контролем), який перевищував аналогічний
показник, отриманий при інокуляції рослин A. brasilense 54.

Структура парабульбочок шовковиці схожа зі структурою “кореневих”
бульбочок актінорізних рослин, які розвиваються з примордієв бокових
коренів і характеризуються центральним розташуванням провідних пучків
(рис. 5).

Таблиця 6

Утворення парабульбочок на коренях сіянців шовковиці в результаті
обробки кореневої системи 2,4-діхлорофеноксіацетатом і азоспірилами.

Варіанти досліду Кількість парабульбочок на 1 рослині, одиниці Середня
маса 1 парабульбочки, мг Нітрогеназна активність парабульбочок, мкг N на
1 рослину за годину

Обробка 2,4-Д 12,00 3,25 0,22

Обробка 2,4-Д і A. brasilense 53 16,50 3,97 4,19

Обробка 2,4-Д і A. brasilense 54 13,30 4,25 3,79

Обробка 2,4-Д і A. brasilense 61 12,83 4,23 3,30

НСР05 3,30 1,01 0,58

Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом

Рис. 5. Схематичне зображення структури парабульбочок шовковиці.

1 – меристема; 2 – провідні пучки; 3 – паренхіма; 4 – перидерма.

Розділ 6. Ефективність застосування препарату ризобразіну на основі
Azospirillum brasilense 54

На основі ендофітного штама А. brаsilense 54 розроблено бактеріальний
препарат для інокуляції насіння, однорічних саджанців і дорослих рослин
шовковиці, а також вивчено його ефективність. Препарат ризобразін
виготовляли у двох формах: торф’яній і рідкого концентрату.
Рекомендовано використовувати рідкій концентрат для інокуляції насіння і
однорічних саджанців. Так, інокуляція насіння рідкою формою ризобразіну
сприяла збільшенню діаметра стовбура сіянців на 33, маси рослин – на 65,
маси листя – на 67, площі листової пластинки – на 51%, замочування
кореневої системи однорічних саджанців шовковиці в рідкому концентраті
ризобразіна забезпечило підвищення висоти рослин – на 12, площі листової
пластинки – на 40 і маси листя – на 36%. З метою інтродукції азоспірил в
кореневу зону 3 – 5-річних насаджень шовковиці доцільно обробляти
рослини торф’яною формою ризобразіна. Такий прийом сприяв підвищенню
показників довжини та діаметра стовбура трьохрічних дерев на 11 і 9%
відповідно, кількості пагонів на кущі – на 29 і врожаю листя — на 43% в
порівнянні з контролем.

Результати внесення торф’яного препарату в кореневу зону рослин
шовковиці п’ятирічного віку свідчать про його позитивний вплив на
біометричні показники сортів: Українська-5, Українська-6, Українська-7
та гібридних насаджень шовковиці. Слід відмітити, що рослини даних
сортів більшою мірою відзиваються на інокуляцію бактеріальним
препаратом, ніж гібридні насадження. Так, довжина однорічних пагонів
сортових насаджень шовковиці достовірно підвищилась на 10-15, а
гібридних – на 7% в порівнянні з контролем. Прибавка урожаю листя
гібридних рослин шовковиці складала 23%, в той час як сортових – 35-41%
в порівнянні з контролем (рис. 6).

Рис. 6. Вплив обробки рослин шовковиці торфяним препаратом ризобразіном
на врожай листя з одного куща: 1 – гібридні насадження; 2 – сорт
Українська-5; 3 – Українська-6; 4 – Українська – 7.

В умовах виробничого досліду показана здатність азоспірил сприяти
підвищенню врожаю листя гібридних 12-тирічних насаджень шовковиці на 24%
(табл. 7).

Таблиця 7.

Вплив торф’яного препарату ризобразіну на врожай листя дванадцятирічних
рослин шовковиці (виробничий дослід, Миргородський гренажний завод,
Полтавська обл.), (2004).

Варіанти досліда Площа, га Врожай листя з одного куща, кг

Контроль (без інокуляції) 0,4 1,78±0,03

Інокуляція A. brasilense 54 0,4 2,21±0,04

З метою дослідження впливу ризобразіну на якість листової продукції
шовковиці визначали вміст в листі рослин макро- і мікроелементів,
органічних речовин і пігментів. Обробка торф’яним препаратом
ризобразіном рослин шовковиці через 4 місяця забезпечила підвищення
вмісту цинка в листі на 15, заліза – на 65%. Через 16 місяців після
інтродукції біоагента препарату в кореневу зону насаджень шовковиці в
листі даної культури прибавка вмісту кальцію складала – 20, марганцю –
55, цинку – 23, міді – 50 і заліза – 46%. Підвищення вмісту в листі
шовковиці мікроелементів позитивно впливає на активність процесу
фотосинтезу.

Одним з основних показників активності фотосинтетичного апарату є вміст
хлорофілу в листі рослин. Обробка рослин шовковиці торф’яним препаратом
ризобразіном сприяла достовірному підвищенню в листі хлорофілу а та
хлорофілу в через 4 місяці на 15 і 19% відповідно, а через 16 місяців –
на 12 і 33% (табл. 8). Показано достовірне підвищення каротину в листі
шовковиці через 4 місяці після внесення ризобразіну в кореневу зону
насаджень шовковиці на 46% і через 16 місяців – на 67%.

Таблиця 8

Вплив торф’яного препарату ризобразіну на вміст фотосинтетичних
пігментів в листі шовковиці (мг/100г сирої речовини), (2004 р.)

Варіанти досліду Рік внесення препарату Строк після інокуляції Хлорофіл
а Хлорофіл в а/в Каротин с

Контроль (без інокуляції) — — 188,32 60,64 3,10 9,60

Інокуляція

A. brasilense 54 2003 16 місяців 210,88 80,80 2,61 16,0

Інокуляція

A. brasilense 54 2004 4 місяця 215,68 72,32 2,98 14,0

НІР05 — — 2,24 2,40 – 1,20

Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.

Обробка рослин торф’яним препаратом ризобразіном на основі бактерій
A. brasilense 54 сприяла збільшенню вмісту розчинних цукрів (глюкози,
фруктози и сахарози) в 2,25 рази (табл. 9), що можна пояснити
підсиленням активності фотосинтетичного апарату рослин в результаті
інтродукції азоспірил в кореневу зону насаджень шовковиці. Через 4
місяці після обробки рослин біопрепаратом прибавка вмісту ліпідів
складала 47, а через 16 місяців – 7%. Однак, обидві ці прибавки
виявились достовірними в порівняні з контролем.

Таблиця 9.

Післядія препарату ризобразіну на біохімічний склад листя гібридних
насаджень шовковиці (в абсолютно сухій речовині, %) (2003 р.)

Варіанти досліду Рік внесення препарату Строк після інокуляції Моно- і
дисахариди Ліпіди Білок

Контроль (без інокуляції) — — 6,0 3,42 13,74

Інокуляція A. brasilense 54 2002 16 місяців 13,5 3,67 14,54

Інокуляція A. brasilense 54 2003 4 місяця 9,0 5,03 12,12

НІР05 — — 0,13 0,13 0,74

Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.

Як було показано раніше, штам А. brаsilense 54 активно фіксує азот в
чистій культурі, тому вивчали вміст білку в листі шовковиці. Обробка
насаджень шовковиці торф’яним препаратом ризбразіном через 4 місяці не
забезпечила підвищення вмісту білку. Однак через 16 місяців після
інокуляції прибавка вмісту білку в листі в порівнянні з контролем
складала 6%.

ВИСНОВКИ

1. Вперше вивчено якісний і чисельний склад та нітрогеназну активність
азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці. З ризосферного грунту,
ризоплани та гістосфери даної культури виділено 87 штамів діазотрофів,
представників родів Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum,
Pseudomonas, які характеризуються високою нітрогеназною активністю.

2. Розроблено методику одержання штамоспецифічної антисироватки, що
включає модифіковану схему імунізації кролів клітинами бактерій
Azospіrіllum brasіlense 54.

3. За допомогою стрептоміцин стійких мутантів, а також імунологічних та
імунохімічних методів показана здатність азоспірил проникати у внутрішні
тканини коренів рослин шовковиці і зберігати там життєдіяльність
протягом 16 місяців після інокуляції.

4. Встановлена можливість штучного індукування утворення парабульбочок
на коренях рослин шовковиці за допомогою абіогенного фактора нодуляції –
2,4-діхлорофеноксіацетата. Сумісне застосування 2,4-Д та інокуляції A.
brasіlense 54 сприяло підвищенню нітрогеназної активності парабульбочок
– в 17 разів і маси кореневої системи рослин – в 2,6 разів.

5. Встановлено, що внутрішня структура парабульбочок шовковиці
відповідає “кореневому” типу і найбільш схожа зі структурою бульбочок
дерев’янистих рослин, що утворюються при інфікуванні рослин
мікроорганізмами роду Frankia.

6. Вперше показана пролонгована позитивна дія бактерій А. brаsilense 54
на врожай листя шовковиці та вміст в них вітамінів. Так, через 16
місяців після інокуляції урожай листя шовковиці підвищився на 53,2%,
вміст в них вітамінів В1 и В2 – на 8, вітаміна РР – на 11 і вітаміна Е –
на 16%.

7. На основі азотфіксуючих бактерій роду Azospirillum створено новий
біопрепарат ризобразін. Розроблені, експериментально перевірені та
захищені патентом України способи інокуляції рослин шовковиці різного
віку бактеріальним препаратом ризобразіном.

8. Показано, що застосування ризобразіну на гібридних і сортових
насадженнях шовковиці сприяло істотному підвищенню врожаю листя
шовковиці на 23-67% та поліпшенню їх якості: вміст макро- и
мікроелементів підвищився на 20-55, органічних речовин – на 6-123,
фотосинтетичних пігментів – на 12-67%.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. *Булатова Ю.О., Надкернична О.В., Ушакова М.А., Олексійченко Н.О.
Вплив азотфіксуючих бактерій на біометричні показники сіянців і
гібридних насаджень шовковиці // Агроекологічний журнал. – 2003. — №1. –
С. 57–59. (Здобувачем самостійно проведено експериментальні дослідження
по вивченню впливу діазотрофів на біометричні показники сіянців і
дорослих рослин шовковиці).

Гончар Ю.А., Алексейченко Н.А. Увеличение продуктивности растений
шелковицы в результате интродукции штаммов азоспирилл в корневую зону //
Аграрний вісник причорномор’я: Зб. наук. пр. – Одеса, 2004. – Вип. 26,
Ч. 2. – С. 18–22. (Здобувачем особисто проведені експериментальні
дослідження по вивченню здатності азоспірил індукувати морфологічні
зміни кореневих волосків проростків шовковиці, здійснено аналіз
отриманих результатів).

Alekseychenko N.A., Galanova A.V., Ananyev P.P., Nadkernichnaya E.V.,
Gonchar Y.A. The increase of productivity of mulberry plantations as a
result of using bacterial fertilizers // Sericologia. – 2004. – Vol. 44,
№3. – P. 387–392. (Здобувач брала участь у проведенні польових дослідів,
аналізі одержаних результатів та написанні статті).

Пат. 48835 Україна, A01G29/00. Спосіб підвищення урожайності листової
маси шовковиці; Надкернична О.В., Олексійченко Н.О., Ушакова М.А.,
*Булатова Ю.О. – Заявл. 19.12.01; Опубл. 15.08.02., Бюл. № 8. – 3 с.
(Здобувач особисто приймала участь у розробці способу інокуляції
насаджень шовковиці).

Застосування бактеріальних препаратів на основі азоспірил для підвищення
продуктивності шовковиці. Методичні рекомендації / О.В. Надкернична,
Ю.О. Гончар, М.А. Ушакова та інш. – Чернігів: ІСГМ УААН, 2004. – 16 с.
(Здобувач безпосередньо брала участь у проведенні польових дослідів по
вивченню впливу азоспірил на продуктивність шовковиці та у підготовці
методичних рекомендацій до друку).

Гончар Ю.А., Надкерничная Е.В., Алексейченко Н.А. Влияние азоспирилл на
качество листовой продукции растений шелковицы // Живлення рослин:
теорія і практика: Зб. наук. пр. – К.: Логос, 2005. – 294–305. (Здобувач
провів аналіз та інтерпретацію одержаних даних).

Гончар Ю.А. Структура азотфиксирующего микробного комплекса корневой
зоны шелковицы // Біологічні науки і проблеми рослинництва: Зб. наук.
пр. – Умань, 2003. – С. 298–302.

*Булатова Ю.А. Влияние диазотрофов, выделенных из клубеньков шелковицы,
на всхожесть, дружность и скорость прорастания семян этой культуры //
Сталий розвиток агроекосистем. Матеріали міжнародної конференції 17-20
вересня 2002 р. – Вінниця, 2002. – С. 115–117.

*Булатова Ю.А., Надкерничная Е.В., Ушакова М.А. Влияние азотфиксирующих
бактерий на биометрические показатели растений шелковицы //
Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье.
Материалы IX Международного симпозиума. 9-16 июня 2002 г. – Симферополь,
2002. – С. 577–579. (Здобувачем самостійно розроблено схему досліду).

Надкернична О.В., Гончар Ю.О., Волкова І.В. Імунологічні методи
дослідження взаємодії азоспірил з рослинами шовковиці // Х з’їзд
Товариства мікробіологів України: Тези доповідей. – Одеса: Астропринт,
2004. – С. 245. (Здобувач безпосередньо брала участь у розробці схеми
імунізації кролів азоспіриллами, самостійно здійснила аналіз отриманих
результатів).

Гончар Ю.А. Влияние эндофитных бактерий рода Azospirillum на
биохимический состав листа шелковицы // Актуальні проблеми фізіології,
генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів: Тези
доповідей ІХ конференції молодих дослідників. – Київ, 2005. – С. 79.

* — прізвище Булатова змінено на прізвище Гончар.

АНОТАЦІЯ

Гончар Ю.О. Особливості функціонування асоціативної системи: шовковиці –
азотфіксуючі бактерії роду Azospirillum. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07. – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболтного НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню функціонування асоціативної системи:
шовковиця – азотфіксуючі бактерії роду Azospirillum, можливості
проникнення даних бактерій у внутрішні тканини коренів шовковиці і
здатності азоспірил здійснювати пролонговану дію на продуктивність та
якість листової продукції шовковиці.

В роботі представлено результати скринінгу діазотрофів, виділених з
кореневої зони шовковиці та з бульбочок, що спонтанно утворилися на
коренях “гігантської” рослини шовковиці.

Показана здатність азоспірил індукувати морфологічні зміни кореневих
волосків.

Вперше розроблено модифіковану схему імунізації кролів клітинами
азоспірил, що дозволило отримати штамоспецифічну антисироватку до штаму
A. brasilense 54. Виявлено здатність азоспірил проникати у внутрішні
тканини коренів дорослих рослин шовковиці.

Показано можливість штучного індукування парабульбочок на коренях
шовковиці та заселення даних новоутворень азоспірилами.

На основі штаму A. brasilense 54 розроблено бактеріальний препарат
ризобразін та способи інокуляції їм рослин шовковиці різного віку, що
сприяє підвищенню біометричних показників і продуктивності шовковиці на
23 – 67%, а також покращенню якості листової продукції даної культури.

Ключові слова: діазотрофи, асоціативна азотфіксація, Azospirillum
brasilense, ендофіти, імунологічні методи, паранодуляція, листова
продуктивність шовковиці.

АННОТАЦИЯ

Гончар Ю.А. Особенности функционирования ассоциативной системы:
шелковица – азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07. – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена исследованию функционирования ассоциативной
системы: шелковица – азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum,
возможности проникновения данных бактерий во внутренние ткани корней
шелковицы и способности азоспирилл оказывать пролонгированное действие
на продуктивность и качество листовой продукции шелковицы.

В работе представлены результаты скрининга диазотрофов, выделенных из
корневой зоны шелковицы и из клубеньков, спонтанно образовавшихся на
корнях “гигантского” растения шелковицы. Из ризосферной почвы, ризопланы
и гистосферы данной культуры выделено 87 штаммов диазотрофов,
представителей родов Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum,
Pseudomonas, которые характеризуются высокой нитрогеназной активностью.

Показана способность азоспирилл, выделенных из клубеньков “гигиантскогй”
шелковицы, индуцировать морфологические изменения (крючковидные,
спиралевидные, булавовидные) корневых волосков проростков, что
подтверждает способность данных бактерий вызывать ответную реакцию
растений на инокуляцию.

Впервые разработана модифицированная схема иммунизации кролей клетками
азоспирилл, позволяющая получить штаммоспецифичную антисывортку к штамму
A. brasilense 54 с титром 1:32 в реакции преципитации и 4х105 в реакции
твердофазного имуноферментного анализа. С помощью стрептомицинустойчивых
мутантов, а также иммунологических и иммунохимических методов показана
способность азоспирилл проникать во внутренние ткани корней растений
шелковицы и сохранять там жизнедеятельность в течение 16 месяцев после
инокуляции.

Установлена возможность искусственного индуцирования параклубеньков на
корнях растений шелковицы, выращенных в стерильных условиях и на
нестерильной почве под воздействием абиогенного агента нодуляции –
2,4-дихлорофеноксиацетата. Паказана способность азоспирилл заселять
параклубеньки на корнях шелковицы. Установлена нитрогеназная активность
данных структур. Абиогенный нодулирующий агент –
2,4-дихлорофеноксиацетат способствует обазованию параклубеньков на
корнях сеянцев шелковицы и увеличению параметров корневой системы
растений. Установлено, что внутренняя структура параклубеньков шелковицы
соответствует “корневому” типу и наиболее схожа со структурой клубеньков
деревянистых растений, образованных микроорганизмами рода Frankia.
Параклубеньки на корнях шелковицы развиваются из примордиев боковых
корней. То есть их можно рассматривать, как модифицированные корни.

На основе штамма A. brasilense 54 разработан бактериальный препарат
ризобразин и способы инокуляции им растений шелковицы разного возраста.
Показано, что обработка насаждений данным препаратом способствует
увеличению биометрических показателей и продуктивности растений
шелковицы. Урожай листовой продукции сортовых насаждений шелковицы в
результате инокуляции увеличивается на 35-41% по сравнению с вариантом
без инокуляции. Интродукция азоспирилл в корневую зону шелковицы
способствует улучшению качества листовой продукции растений. Так,
содержание макро- и микроэлементов возросло на 20-55, органических
веществ – на 7-123, фотосинтетических пигментов – на 12-67, содержание
витаминов на 8 – 16%.

Ключевые слова: диазотрофы, ассоциативная азотфиксация, Azospirillum
brasilense, эндофиты, иммунологические методы, паранодуляция, листовая
продуктивность шелковицы.

THE SUMMARY

Gonchar Y.A. The feature of functioning of associative system: a
mulberry — nitrogenfixing bacteria of sort Azospirillum. — A manuscript.

Thesis for a candidate’s degree in biology speciality 03.00.07. —
microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National
Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2005.

Candidat’s thesis is dedicated to investigation of associative system:
the mulberry — nitrogenfixing bacteria of sort Azospirillum, the
possibility of penetrating of the given bacteria into inner zone of
roots of a mulberry and the ability of Azospirillum to make a prolonged
effect on productivity and quality of sheet production of a mulberry.

In the work the results of screening of diazotrophs, allocated of a root
zone of a mulberry and from nodules, spontaneously formed on roots of a
«huge» plant of a mulberry are submitted.

The ability of A. brasilense 54 to induce morphological changes of root
is shown.

The application of the modified scheme of the immunization and
reimmunization of animals that allowes to receive the antiserum to the
strain Azospirillum brasilense 54. It is established, that
nitrogenfixing bacteria of sort Azospirillum are capable to penetrate
into internal tissues of roots of wood plants.

The opportunity of artificial formation of paranodules on roots of the
mulberry and settling of the data structures of Azospirillum is shown.

The bacterial preparation of rizobrasin on a basis of the strain A.
brasilense 54 and the ways of inoculation of plants of a mulberry of
different age by it is developed. The introduction of Azospirillum in a
root zone of the mulberry promotes the prolonged increase of a crop of
the given culture on 23 – 67% and the improving of a quality of leaves
of a mulberry.

Key words: diazotrophs, associative nitrogenfixation, Azospirillum
brasilense, endophites, immunological methods, paranodulation, sheet
efficiency of a mulberry.

PAGE \* Arabic 24

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *