Дослідження антивірусної активності гетерополіядерних координаційних сполук перехідних металів на різних рівнях взаємодії вірус-рослина (автореферат)

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ХАРІНА АЛЛА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 578.85/.86

Дослідження антивірусної активності гетерополіядерних координаційних
сполук перехідних металів на різних рівнях взаємодії вірус-рослина

03.00.06 — вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Поліщук Валерій Петрович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач
кафедри вірусології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Карпов Олександр Вікторович,

Національний університет харчових технологій, доцент кафедри
біотехнології мікробного синтезу.

кандидат біологічних наук, доцент

Мельничук Максим Дмитрович,

Національний аграрний університет, декан факультету захисту рослин та
біотехнології.

Провідна організація: Київська медична академія післядипломної освіти
ім. П.Л. Шупика.

Захист дисертації відбудеться „18” травня 2004 р. о 14 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т
Глушкова 2, корпус 12, ауд.433.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул.
Володимирська 58.

Автореферат розісланий „18” квітня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В.Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Особливістю вірусних інфекцій рослин є той факт, що
рослина, інфікована вірусом, залишається носієм вірусу на все життя.
Особливо гостро проблема фітовірусних інфекцій стоїть у випадку рослин,
що розмножуться вегетативно, оскільки при розмноженні рослин вірус
передається з покоління в покоління (Hadidi et al., 1998). Тому в наш
час актуальними є питання хіміотерапії вірусних інфекцій рослин та
отримання безвірусного посадкового матеріалу.

Відомо декілька класів речовин здатних пригнічувати репродукцію вірусу в
рослині. Сюди відносять рибавірин, азацидин (Hansen, 1989) та похідні
олігоаденілатів (Ткачук и др., 1993). Крім речовин з прямою антивірусною
активністю інтенсивно досліджуються індуктори резистентності. Ці
речовини природнього та синтетичного походження мають непрямий
антивірусний ефект. Проте, при наявності великої кількості
антифітовірусних сполук, з тих чи інших причин, ні одна з них не набула
застосування проти широкого кола вірусів.

Одними з найбільш успішних методів отримання безвірусних рослин на
сьогодні вважаються методи культури тканин та апікальних меристем (Hsu
et al., 2000). Однак, в багатьох випадках регенерація рослин з калусу чи
апікальної меристеми не гарантує їх повного звільнення від вірусу. Саме
тому сьогодні ведуться інтенсивні пошуки антивірусних сполук, при
додаванні яких в середовище для регенерації рослин можна було б
підвищувати відсоток виходу безвірусних рослин. На сьогодні відомо
небагато ефективних інгібіторів вірусів в культурі тканин (Nascimento et
al., 2003). Пошук активних сполук серед інших класів є перспективним
напрямком досліджень, і будь-яка інформація про антивірусну активність
нових сполук має величезне значенння для встановлення закономірності
хімічний склад — активність.

Перспективними, з погляду на біологічну активність, є гетерополіядерні
координаційні сполуки перехідних металів, так як після включення міді,
цинку та інших металів в органічну основу можуть відбутись неочікувані
зміни активності цих металів з можливим набуттям ними антивірусних
властивостей.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась в рамках тематичного плану науково-дослідних робіт
Київського національного університету “Синтез та дослідження
антивірусних речовин” (номер Держреєстрації 0199U003491).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення антивірусної
активності гетерополіядерних координаційних сполук перехідних металів в
різних модельних системах.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

розробити схему дослідженнь антивірусних властивостей гетерополіядерних
координаційних сполук перехідних металів на різних рівнях взаємодії
вірус-рослина;

дослідити антивірусну активність комплексних сполук на моделі
фаг-бактерія;

за допомогою методу рослин-індикаторів вивчити антифітовірусні
властивості комплексних сполук in vitro;

оцінити вплив комплексних сполук на розвиток вірусної інфекції в
культурі тканин Nicotiana tabacum;

різними методами дослідити вплив комплексних сполук на морфологію,
білкові субодиниці та нуклеїнову кислоту вірусів;

вивчити антифітовірусну активність координаційних сполук in vivo.

Об‘єкт дослідження – вірус тютюнової мозаїки, Х-вірус картоплі, вірус
мозаїки цимбідіуму+вірус кільцевої плямистості одонтоглосуму,
бактеріофаг Т4, Nicotiana tabacum сорт Імунний 580, культура тканин
Nicotiana tabacum сорт Trapeson, Datura stramonium, Cymbidium hybridum,
Esherichia coli, гетерополіядерні координаційні сполуки перехідних
металів.

Предмет дослідження – антивірусна активність гетерополіядерних
координаційних сполук перехідних металів, отриманих шляхом прямого
синтезу.

Методи дослідження. Вплив координаційних сполук на інфекційність
бактеріофагу Т4 та фітовірусів (ВТМ та ХВК) вивчали за допомогою методу
титрування бактеріофагів за Граціа та рослин-індикаторів, відповідно.
Дослідження впливу на морфологію віріонів проводили методами електронної
та атомно-силової мікроскопії. Для вивчення дії на структурні білки
застосовували електрофорез в системі ПААГ-NaДДС. За допомогою
біотехнологічних методів досліджували вплив комплексних сполук на
розвиток вірусної інфекції в культурі тканин та рослинах-регенерантах.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено
антифітовірусну активність гетерополіядерних координаційних сполук
перехідних металів in vitro та in vivo. Виявлено найбільш активні
препарати, які проявляють віруліцидну активність по відношенню до ВТМ та
ХВК. Показано, що координаційні комплексні сполуки впливають на
серологічні властивості бактеріофагу Т4, ВТМ та ХВК. Встановлено, що при
дії на віріони найбільш активні сполуки зумовлюють агрегацію віріонів
між собою. Продемонстровано, що в деяких випадках під впливом
гетерополіядерних координаційних сполук спостерігається порушення
морфологічної цілісності віріонів.

Показано, що додавання препаратів координаційних сполук в середовище для
культивування рослин значно редукує розвиток вірусної інфекції. Обробка
експлантів з вірусінфікованих рослин зменшує кількість вірусу в
отриманому калусі.

Практичне значення одержаних результатів. В результаті проведених
дослідженнь розроблено схему дослідженнь антифітовірусної активності
координаційних сполук на різних рівнях взаємодії вірус-рослина, яка може
бути застосована для вивчення препаратів інших класів.

Найбільш активні препарати рекомендується застосовувати для обробки
експлантів перед введенням в культуру тканин та додавати в поживне
середовище, для пригнічення розвитку фітовірусної інфекції. Таким чином,
дані про антивірусну активність гетерополіядерних координаційних сполук
перехідних металів можуть бути використані при розробці засобів захисту
рослин від фітовірусних інфекцій.

Результати досліджень включені в навчальний посібник “Хіміотерапія та
профілактика вірусних інфекцій”, який рекомендовано для студентів
біологічних та медичних спеціальностей.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Інформаційних пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем
експерименту, отримання експериментальних даних та їх попереднє
узагальнення автором дисертації здійснено особисто. Формулювання мети і
задач дослідження та заключний аналіз виконані за участю наукового
керівника проф. Поліщука В.П., проф. акад. УААН Бойка А.Л. та проф.
акад. НАНУ Скопенка В.В. При дослідженні антивірусної активності
координаційних сполук приймала участь Будзанівська І.Г. Дослідження
віруліцидної антифітовірусної активності здійснено за участю Шевченко
Т.П. та Рижкової А.Є. Досліджувані гетерополіядерні координаційні
сполуки перехідних металів синтезовані на кафедрі неорганічної хімії
Київського національного університету імені Тараса Шевченка за участю
Васильєвої О.Ю., Прими О.В., Маханькової В.Г. під керівництвом Кокозея
В.М.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на
Конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту
мікробіології та вірусології НАНУ ім. Д.К. Заболотного (Київ, Україна,
грудень, 2002 р.); Днях науки у Національному Університеті
Києво-могилянська Академія (Київ, Україна, січень, 2002 р.); 1-му
Міжнародному Конгресі європейських мікробіологів (Любляна, Словенія,
червень-липень 2003 р.); 11-му Міжнародному конгресі з вивчення
молекулярних взаємовідносин рослина-мікроорганізм (Санкт-Петербург,
Росія, липень 2003 р.); 86 Конгресі IUPAC (Оттава, Канада, серпень, 2003
р.), Конференції молодих вчених в Інституті молекулярної біології та
генетики НАНУ (Київ, Україна, вересень, 2003 р.).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 11 робіт, з них 5 –
статті у фахових наукових журналах, 1 – навчальний посібник, 5 –
матеріали конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів та їх
обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних джерел.
Повний обсяг роботи складає 142 сторінки друкованого тексту, що включає
38 рисунків, 13 таблиць та перелік використаних джерел (167, з них
129-іноземні).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з трьох підрозділів, в яких наведені
сучасні відомості про способи одержання безвірусних рослин, висвітлені
питання хіміотерапії вірусних інфекцій рослин.

Розділ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для дослідження дії комплексних сполук на інфекційність бактеріофагу Т4
вірусний препарат обробляли комплексними сполуками в 1; 0,1; та
0,01%-ній концентраціях та проводили титрування фагу методом агарових
шарів (за Граціа). Вплив досліджуваних препаратів на нуклеїнову кислоту
вивчали за допомогою електрофорезу ДНК в агарозному гелі.
Антифітовірусну активність препаратів в 1%, 0,1% та 0,01% концентраціях
досліджували додаючи їх до суспензії очищеного ВТМ або ХВК та інокулюючи
сумішами половинки листя тютюну (Nicotiana tabacum) та дурману (Datura
stramonium), відповідно. Вплив координаційних сполук на морфологію,
серологічні властивості та білкові субодиниці вивчали за допомогою
електронної і атомно-силової мікроскопії, імуноферментного аналізу та
електрофорезу білків в поліакриламідному гелі, відповідно. Здатність
координаційних сполук пригічувати розвиток вірусної інфекції in vivo
вичали шляхом інокуляції асептичних рослин вірусом та наступним
вирощуванням їх на середовищах, які містять у своєму складі
координаційні сполуки. Дослідження впливу координаційних сполук на
модельну систему BTM- Lycopersicon esculentum проводили в польових
умовах. За 1 добу до інокуляції проводили обробку рослин 1%, 0,1% та
0,01% розчинами сполуки РО39. Через одну добу після інокуляції проводили
повторну обробку рослин досліджуваними речовинами. Для індукування
калусної тканини in vitro простерилізований та оброблений в 0.7%-му
розчині досліджуваної речовини рослинний матеріал переносили на живильне
середовище MS-1. Через 10 днів спостерігали початок калусоутворення.
Через 30 днів калусну тканину субкультивували на середовища, які містили
0.1%, 0.01% та 0.001% концентрації досліджуваної сполуки. Через 50-60
днів регенеровані пагони переносили на безгормональне поживне
середовище.

Розіл 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Антивірусна активність сполук в модельній системі фаг-бактерія

При дослідженні впливу координаційних сполук на інфекційний титр фагу Т4
встановлено, що з 20 досліджених препаратів 7 проявили антивірусну
активність (таб. 1).

Найбільш ефективно на інфекційність бактеріофагу Т4 впливали сполуки
№66 та №380. При проведенні електронномікроскопічних досліджень
доведено, що після обробки бактеріофагу Т4 речовинами №66 та №380
відбувалась агрегація вірусів Т4 в конгломерати.

Впливу інших сполук на морфологічну цілісність віріонів не
спостерігалось.

Для вивчення можливих механізмів впливу речовин проводилося виділення
нуклеїнової кислоти бактеріофагу та дослідження її можливих порушень під
впливом координаційних сполук. Доведено, що речовина №66 не впливає на
ДНК в розведеннях 0,01, 0,1%. В 1% розведенні спостерігається частокова
деградація НК, а в 10% розведенні дана сполука призводила до помітного
зменшення довжини пробігу молекул та їх деградації (рис. 2).

На наш погляд, в основі механізму дії координаційних сполук №66, №380,
№88, лежить віруліцидний ефект, тобто інактивація позаклітинного
вірусу. Дію цих речовин можна порівняти з віруліцидною дією оксаліну,
теброфену, флореналю. Можна припустити, що координаційні сполуки швидше
впливають на певні структури відростку, ніж на головку.

Комплексні сполуки можуть діяти на будь-яку ланку та будь-який процес
під час інфікування фагом бактеріальної клітини. Одним з можливих
механізмів віруліцидної дії цих речовин є маскування тих рецепторних
ділянок віріону, які відповідають за адсорбцію вірусу на клітинній
стінці бактерії. Результати ІФА дають можливість припустити, що
відбувається вплив сполук №66, №72, №283 на антигенні детермінанти
бактеріофагу Т4, що проявляється в зниженні показника оптичної густини
після обробки вірусів досліджуваними препаратами.

Розробка схеми дослідження антифітовірусної активності препаратів

В запропонованій нами схемі процес дослідження речовин починаєли з
вивчення віруліцидної активності препаратів (рис. 3). При цьому вірус
попередньо обробляли препаратом, інкубували та проводили інокуляцію
рослин-господарів.

Для дослідження можливості стимулювання захисної відповіді рослини
попередньо обробляли речовинами з наступною інокуляцією вірусом. На
даному етапі важливим є встановлення оптимальної дози та часу обробки.

При додаванні сполук в середовище для культивування рослин та інокуляції
досліджуваним вірусом, сполука може проявити як етіотропний антивірусний
ефект, так і вплив на захисні механізми рослини.

Остання стадія досліджень включала в себе експерименти на культурі
тканин. При цьому вивчалась можливість звільнення хворих рослин від
вірусів шляхом регенерації рослин в присутності антивірусних агентів. Ця
стадія є найбільш трудомісткою і починається з обробки експлантів,
отриманих з вірусінфікованих рослин, досліджуваними сполуками. При цьому
важливим є віруліцидний та етіотропний антивірусний ефекти препарату.
Далі сполуки вносяться в середовище для регенерації рослин, при цьому
вони можуть впливати безпосередньо на певну стадію реплікації вірусу чи
стимулювати захисні механізми рослин-регенерантів.

3. Активність комплексних сполук в модельних системах BTM-Nicotіana
tabacum, ХВК — Datura stramоnium

У результаті проведених досліджень показано, що сполуки значно варіюють
за ступенем антифітовірусної активності.

В цілому на модельній системі вірус – рослина нами було перевірено 17
координаційних сполук. З них 10 володіють антивірусною активністю в тому
чи іншому ступені (табл. 2, 3). Найбільш активними в цих системах
виявились сполуки за №377, №221 та №491.

Результати дослідження антифітовірусної активності сполук №718 та РО172
в таблицях не представлені, оскільки вони проявили високий рівень
фітотоксичності. Речовини №88, №221, №289 та №491 здійснювали токсичний
вплив на рослини Nicotiana tabacum в 1% концентрації. Менші концентрації
цих речовин були ефективними проти вірусу, не впливаючи на
рослину-хазяїна. Беручи до уваги цей факт, ми проводили порівняння
активності речовин проти BTM та ХВ, застосовуючи 0,1% концентрацію
сполук.

Отже, протестовано антифітовірусну активність 17 сполук. За ступенем
зниження їх антифітовірусної активності препарати можуть бути розміщені
в наступному порядку:

ХВК
—-377-221-491-380-379-88-463-РО39-РО172-446-436-66-Sh24-Sh326-288-289-
381-РО80

BTM —-
491-РО39-377-221-88-381-446-379-436-PO172-463-380-66-Sh24-Sh326-288-289-
РО80

З представлених результатів видно, що сполуки №377, №221 та №491
проявили високий рівень активності як проти ВТМ, так і проти ХВК. При
порівнянні складу цих сполук встановлено, що спільним для них є
наявність міді та кобальту. Кожна з цих сполук також містить
діетаноламін чи триетаноамін, що можливо обумовлює активність даних
сполук.

Відмінність препарату №491 від інших досліджених препаратів полягає в
тому, що серед усіх досліджених речовин лише він містить у своєму складу
тіоціанатну групу, яка, можливо, здатна модифікувати комплекс міді та
кобальту з етаноламіном, надаючи їм нових біологічних властивостей.

При дослідженні впливу сполук на Х-вірус картоплі за допомогою
електронної мікроскопії спостерігали утворення вірусних конгломерів під
впливом 1% розчину сполуки №377. Окремо вірусні частинки взагалі не
зустрічалися. В контролі вірусні частинки були рівномірно розташовані на
поверхні плівки.

При обробці сполуками №718, №221, №377, Sh24 вірусу тютюнової мозаїки,
спостерігається агрегація вірусних часток між собою, також на
електронномікроскопічних зображеннях видно адсорбцію кристалів речовин
на поверхні вірусних часток, що, можливо, може бути причиною уcкладнення
депротенізації ВТМ при інфікуванні рослин.

У результаті обробки сполукою №377 структура вірусних часток не
змінюється і їх модальні величини залишаються в межах норми для ВТМ, яка
становить 300±10х18±2 нм (рис. 4). Скоріше за все, комплексні сполуки,
агрегуючись навколо віріонів, зпричиняли блокування поверхневих груп
капсидного білку вірусу, які відігріють важливу роль в процесі
депротеїнізації вірусу. Для вивчення вірусних препаратів без додаткової
фіксації була застосована атомно-силова мікроскопія, за допомогою якої
були підтверджені дані електронної мікроскопії.

4. Вплив координаційних сполук на антигенні детермінанти BTM та ХВК

Оскільки антигенні властивості вірусів визначаються структурою
поверхневого білку вірусної частки, то для досліджень використовували
BTM та ХВК, оброблені розчинами координаційних сполук з різними
концентраціями (1%, 0,1% та 0,01%).

Встановлено, що обробка 1 % концентрацією речовин приводила до різного
ступеня зниження показника оптичної густини в залежності від речовини та
вірусу. Так, при обробці ВТМ речовинами №380, № 288 та № 88 показник
Е405 у порівнянні з контролем знижувався на 27%, 60% та 90 %,
відповідно. При дослідженні впливу сполук №221, № 336, №446 та №491 на
серологічні властивості ВТМ показано високу активність препаратів №221
(в 1% концентрації) та №491 (в 1% та 0,1% концентраціях), в той час як
інші дві сполуки виявились менш активними.

Як видно з рисунку 5, значний вплив на зв’язування антитіл з ХВК
здійснювали сполуки №288 та №221, що проявлялось в зниженні показника
оптичної густини в ІФА. Таки чином, наші дослідження показали, що
координаційні сполуки здатні взаємодіяти з поверхневими білками вірусної
частинки, що приводить до блокування антигенних детермінант та зміни
серологічних властивостей вірусу.

Відомо, що утворення комплексу вірусу з будь-якими сполуками є однією з
причин зниження його інфекційності. Можна зробити припущення, що
механізм антивірусної дії включає взаємодію інгібіторів з поверхневими
білками екзогениих вірусів та вірусів, які синтезуються в клітині.
Наслідком такої взаємодії є порушення репродукції та транспорту вірусу.

Вивчення електрофоретичної рухливості білків вірусів після впливу на
них комплексних сполук

У результаті проведення електрофорезу з ВТМ, що був оброблений сполуками
№221, РО172, Sh24 та Sh 326 спостерігався тільки один білковий
компонент, обрахунок молекулярної маси якого за калібровочною кривою
залежності lgMr від довжини пробігу маркерних білків становив 18,0 ± 0,5
кДа (рис. 6.).

*

,

$ & ( ” E |

~

?

Ue

д дією реагентів, що входять до складу буферу зразку (SDS,
меркаптоетанол) білки втрачають нативну конформацію та розправляються і,
можливо, при цьому втрачають зв’язок з сполукою. Саме тому за допомогою
електрофорезу важко прослідкувати можливі зміни в капсиді вірусу.

Вплив координаційних сполук на модельну систему BTM-Nicotiana tabacum

Під впливом 0.01% концентрації сполуки №718 не спостерігалось зниження
концентрації вірусу в порівнянні з контролем, в той час як присутність
0,001% цієї речовини в поживному середовищі знижувала концентрацію
вірусу нижче рівня детекції за допомогою електрофорезу в
поліакриламідному гелі (рис. 7).

У випадку сполуки РО39 ефективнішою виявилась 0,01% концентрація.
Присутність такої концентрації препарату значно інгібувала розвиток
фітовірусної інфекції. Нижча концентрація даної речовини не впливала на
накопичення рослинами капсидного білку BTM (рис. 7.). Результати
електрофорезу білку були підтверджені даними, отриманими за допомогою
імуноферментного аналізу (рис. 7).

Аналізуючи отримані результати, важко пояснити такі відмінності в
активності препаратів. Стосовно сполуки РО39, можна припустити, що її
0,001% концентрація є недостатньою для прояву антифітовірусної
активності. Збільшення концентрації препарату приводить до підсилення
антивірусного ефекту. Слід відмітити, що в активній концентрації дана
сполука не здійснювала токсичного впливу на рослини. Непередбачувані
результати отримані для сполуки №718, вища концентрація якої виявилась
неактивною в порівнянні з нижчою концентрацією. Нашими попередніми
дослідженнями встановлено, що дана сполука проявляє фітотоксичний ефект,
очевидно, пов’язаний з присутністю ДМФА та Ni в її структурі. Раніше
було показано, що підвищений вміст нікелю в поживному середовищі
призводив до збільшення титру Х-вірусу картоплі в рослинах Lycopersicon
esculentum. Тому можна припустити, що в зв’язку з високою
фітотоксичністю сполука пригнічує захисні механізми рослини та надає
можливість для репродукції та поширення вірусу по рослині. Зниження
концентрації препарату усуває фітотоксичний ефект сполуки та створює
несприятливі умови для репродукції вірусу.

Позитивні результати в системі ВТМ-Nicotiana tabacum дала сполука РО172,
яка значно пригнічувала розвиток фітовірусної інфекції в 0,01% та 0,001%
концентраціях. Проте, слід відмітити, що більша концентрація сполуки
проявила фітотоксичний вплив на рослини тютюну.

Вплив координаційних сполук на модельну cистему CYMV+ORSV-Cymbidium
hybridum

Сполуки №718, РО39 та РО172 досліджені в модельній системі
ВМЦ+ВКПО-Cymbidium hybridum. В даній модельній системі активність
препаратів залежала від хімічної природи сполуки та її концентрації. Не
встановлено антивірусної активності сполуки №718 проти ВМЦ+ВКПО. Крім
того, дана речовина проявила фітоксичний ефект, що проявлявся в
пригнічені росту рослин.

На противагу цьому присутність сполуки РО172 в середовищі для
культивування зозулинцевих приводила до значної редукції розвитку
вірусу. Сполука знижувала кількість вірусу нижче рівня детекції за
допомогою ІФА.

Речовина РО39 займає проміжне місце між препаратами РО172 та №718. Під
впливом 0.001% сполуки РО39 концентрація вірусу знижувалась на 42±3,5% в
порівнянні з контролем. 0,01% концентрація цієї сполуки пригнічувала
розвиток вірусу на 100% (рис. 8). Важливою перевагою названих речовин є
те, що вони в активних концентраціях не зпричиняли негативного впливу на
рослини.

Вплив координаційних сполук на модельну систему BTM- Lycopersicon
esculentum

В модельній системі BTM — Lycopersicon esculentum досліджували речовину
РО39. В результаті проведених досліджень показано, що сполука
зумовлювала затримку розвитку симптомів системної інфекції. Однак,
вміст вірусу в рослинах, що були оброблені препаратом становив 20-24
мк/г, що є дуже близьким до відповідного значення контролю 26 мк/г.
Отже, в цій системі сполука не проявила захисного ефекту.

Для дослідження інших способів обробки проводили введеня речовини №
436, в жилку. Встановлено, що при такому способі речовина проявляє
значний ступінь фітотоксичності, зумовлюючи виникнення чорних плям на
листкових пластинках дослідних рослин.

З літературних даних відомо, що ефективність застосування хімічних
агентів для запобігання розвитку фітовірусної інфекції залежить від
дози, часу обробки (до чи після інокуляції) та тривалості обробки. Отже
неефективність препарату, в даному випадку, може бути пов’язана з
невідповідним підбором параметрів, що впливають на прояв
антифітовірусних властвостей речовиною.

Антифітовірусна активність речовин в культурі тканин Nicotiana tabacum

Нами розроблено схему досліджень антифітовірусної активності
гетерополіядерних координаційних сполук в модельній системі BTM —
культура тканин Nicotiana tabacum, що представлена на рисунку 9. Як
видно з рисунку, першим етапом дослідження антифітовірусної активності є
оброка експлантів, отриманих з вірусінфікованих рослин, перед посадкою
на калусогенне середовище. При проведенні експериментів появу калусу з
експлантів спостерігали через 7 днів після посадки на середовище. Через
40 днів калусна тканина, на якій почався процес регенерації пагонів,
розділялася на фрагменти та пересаджувалася на середовища, що містили
різні концентрації досліджуваних сполук (0,1%, 0,01 та 0,001).
Диференційовані пагони отримували через 30-40 днів та субкультивували на
безгормональне середовище. В рослинах-регенерантах проводили визначення
кількості вірусу.

Розроблено також схему дослідження активності комплексних
гетерополіядерних сполук при регенерації рослин з пазушних бруньок (рис.
9). Перевагою даного шляху є те, що через 40 днів після початку
експерименту можна отримати рослини-регенеранти, в порівнянні з 3
місяцями у випадку регенерації з калусної тканини.

В модельній системі BTM — культура ткани Nicotiana tabacum досліджено
наступні сполуки: РО172, РО39, РО239, РО80, №221, №718, №380 та №436.
Результати проведених досліджень свідчать про антифітовірусну активність
деяких з них. Слід зауважити, що рівень антивірусної та фітотоксичної
активності значно варіює для кожної з досліджених речовин.

Високу ефективність показала обробка сполукою РО80 експлантів перед
посадкою на калусогенне середовище. Встановлено 74,2%±5,6 редукцію
вмісту вірусу в калусі, отриманому з оброблених експлантів. Проте при
додаванні цієї сполуки в середовище для регенерації пагонів відмічено
фітотоксичний ефект 0,1% та 0,01% концентрації препарату. Найменша
концентрація досліджуваної речовини (0,001%) не впливала на розвиток
інфекції при регенерації рослин з вірусмісного калусу.

Сполука РО172 проявила антифітовірусну активність в даній системі.
Обробка експлантів речовиною викликала зменшення кількості вірусу в
калусі приблизно на 49,9± 3,7% в порівнянні з контролем. При додаванні
сполуки в поживне середовище в 0,1% концентрації спостерігалась
негативна дія останньої на процес регенерації рослин. В 0,01%
концентрації речовина РО172 пригнічувала розвиток вірусу на 42,3±3,8%.

Речовини РО39 та РО239 не впливали на розвиток вірусної інфекції в даній
модельній системі. Показано, що при культивуванні калусу на середовищах,
які містили різні концентрації сполуки №РО39 ( 0.1%, 0.01%, 0.001%),
спостерігалась негативна дія препарату на подальший процес регенерації
рослин (рис. 10), що проявлялась у почорнінні нижньої частини стебла та
повній зупинці росту при пересадці регенерантів на безгормональне
середовище. Найбільша концентрація досліджуваної речовини призвела до
відмирання калусу через декілька днів. Отже, в даній модельній системі
сполука №РО39 не проявила антивірусної дії, і, навпаки, пригнічувала
процес регенерації рослин.

Однією з найбільш ефективних в культурі тканин виявилась сполука № 718.
Результати ІФА говорять про зниження вмісту вірусу в калусі отриманому з
оброблених експлантів (на 49,7±4,4%). Значної затримки розвитку
симптомів фітовірусної інфекції було досягнуто при регенерації рослин зі
сплячих бруньок в присутності цієї речовини (рис. 11).

Речовина № 221 показала високий рівень фітотоксичності вже на перших
етапах досліджень, що проявлявся в затримці утворення калусу з 10 до 40
днів в порівнянні з контролем. Після посадки калусу на поживне
середовище зі сполукою спостерігалось його відмирання. Сполуки №436 та
№380 не проявили антивірусної активності в даній модельній системі.

Отже, результати проведених досліджень показали, що при культивуванні
калусної тканини, на якій почався процес регенерації пагонів, на
середовищах з різними концентраціями (0,1%, 0,01% та 0,001%) дослідних
препаратів показано, що найвища концентрація (0,1%) сполуки майже в
усіх випадках зпричиняла фітотоксичний ефект та негативно впливала на
подальший процес регенерації пагонів. Тому при постановці наступних
експериментів з дослідження антифітовірусної активності гетерометальних
сполук слід враховувати цей факт та застосовувати нижчі концентрації
препаратів.

При обробці 0,7% концентрацією прапаратів РО172, РО80 та №718 не
відмічено фітотоксичного ефекту та впливу цих сполук на процес
формування калусної тканини. Таким чином, отримані результати дозволяють
рекомендувати ці препарати обробки експлантів перед посадкою на
середовище з метою пригнічення розвитку вірусної інфекції в культурі
тканин та рослинах-регенерантах.

ВИСНОВКИ

Розроблено схему вивчення активності потенційних антифітовірусних
препаратів на різних рівнях взаємодії вірус-рослина, яка включає
дослідження віруліцидної, антивірусної дії та здатності
хіміотерапевтичних препаратів індукувати захисну відповідь рослини.
Створена система може бути застосована для тестування сполук різних
класів.

На моделі взаємодії фаг-бактерія показано високу антивірусну активність
координаційних сполук міді з моно- чи діетаноламіном, що містять нікель
або кобальт.

В модельних системах ВТМ-Nicotiana tabacum та ХВК-Datura stramonium
високий рівень віруліцидної активності (81-98%) проявляють препарати
№491, №221 та №377, які містять перехідні метали мідь та кобальт та
ліганд диетаноламін.

Встановлено, що при дії на віріони ВТМ, ХВК та бактеріофагу Т4 in vitro
координаційні сполуки зумовлюють формування вірусних конгломератів
(№718, №221, №377, Sh24) та приводять до деструкції віріонів (РО239).

Методом імуноферментного аналізу показано, що координаційні сполуки
(№221, №88, №436, №491, №463) впливають на серологічні властивості
вірусів, що проявляється в зниженні показника оптичної густини після
обробки вірусів досліджуваними препаратами.

Показано, що для комплексів міді та цинку з етилендіаміном характерна
антивірусна дія по відношенню до ВМЦ+ВКПО на рослинах Cymbidium
hybridum. Найбільш активна речовина РО172 може бути рекомендована для
зниження вмісту вірусу в рослинах регенерантах.

Гетерополіядерні координаційні сполуки перехідних металів (PO172, PO80
та №718) знижують концентрацію вірусу в калусній тканині Nicotiana
tabacum від 47 до 74% в залежності від препарату та можуть бути
застосовані для обробки експлантів перед введенням в культуру і
додавання в середовище для регенерації рослин.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Рижкова А.Е., Поліщук В.П., Будзанівська І.Г., Тивончук Т.П., Харіна
А.В., Кокозей В.М., Васильєва О.В., Маханкова В.Г., Бойко А.Л., Скопенко
В.В. Антивірусна активність гетерометальних комплексів міді та кобальту
з аміноспиртами отриманих прямим синтезом in vitro// Бюлетень інституту
сільськогосподарської мікробіології.-2000.-№7.-ст. 38-39. (Пошукачем
виконано дослідження антибактеріофагової та антифітовірусної активності
гетерометальних комплексів міді та кобальту з аміноспиртами).

Скопенко В.В., Бойко А.Л., Поліщук В.П., Кокозей В.М., Рижкова А.Е.,
Будзанівська І.Г., Шевченко Т.П., Харіна А.В., Маханкова В.Г., Васильєва
О.В. Вплив гетерометальних комплексів міді та кобальту з аміноспиртами
на інфекційну активність вірусів// Вісник Київського Університету.
Біологія.-2001.- № 35.- ст.21-23. (Пошукачем проведено основні
дослідження впливу комплексних сполук на інфекційність фітовірусів.
Підготовано статтю до друку).

Будзанівська І.Г., Поліщук В.П., Кокозей В.М., Харіна А.В., Васильєва
О.В., Маханкова В.Г. Антивірусна активність гетерометальних комплексів,
що містять мідь в модельній системі бактеріофаг-бактерія// Вісник
Київського Університету. Біологія.-2001.- № 34.- ст.67-71. (Дисертантом
здійснено експериментальну частину та підготовано попереднє
узагальнення).

Харіна А.В., Поліщук В.П., Будзанівська І.Г. Вплив гетероаніонних
координаційних комплексів міді та кобальту на бактеріофаг Т4// Наукові
записки НаУКМА.-2002.-т. 20.-ст.41-45. (Основні досліди та підготовка
статті до друку виконані здобувачем ).

Харіна А.В., Будзанівська І.Г., Поліщук В.П. Хіміотерапія та
профілактика вірусних хвороб сільськогосподарських
рослин//Агроекологічний журнал.-2002.- спеціальний випуск.-ст. 53-62.
(Харіна А.В. здійснила накопичення, обробку даних та підготувала статтю
до друку).

Харіна А.В., Будзанівська І.Г., Поліщук В.П. Хіміотерапія вірусних
інфекцій.-К.: Фітосоціоцентр.- 2003. 117 с. (Збір та інтерпретація
експеримантальних даних, виготовлення ілюстрацій виконано пошукачем).

Скопенко В.В., Бойко А.Л., Поліщук В.П., Кокозей В.М., Рижкова А.Е.,
Будзанівська І.Г., Шевченко Т.П., Харіна А.В., Маханкова В.Г., Васильєва
О.В. Вплив гетерометальних комплексів міді та кобальту з аміноспиртами
на інфекційну активність вірусів// Тези III Міжнародної конференції
“Біоресурси та віруси”-11-15 вересня, 2003.-Київ,- Україна.- ст.21-23.

Корнійчук І.В., Харіна А.В. Дослідження антифітовірусної дії
координаційних сполук міді кобальту на модельній системі ВТМ-Nicotiana
tabacum// Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції
студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна”.- м.
Київ.- 2003.-ст.78-79.

A.V. Kharina , I.G. Budzanivska, V.P. Polischuk. An Investigation of
Antiphitoviral activity of Heterometallic Complexes Obtained by Direct
Synthesis. Abstracts of The 11th International Congress on Molecular
Plant-Microbe Interactions.- July 18-26, 2003- St.-Peterburg, Russia-
p.175.

A.V. Kharina , I.G. Budzanivska, V.P. Polischuk Antiviral activity of
Heterometallic Complexes Obatained by Direct Synthesis. Abstracts of
The39th IUPAC Congress and the 86th Conference of The Canadian Society
for Chemistry.-August 10-15, 2003- Ottawa.- Canada.- p.209.

A.V. Kharina , I.G. Budzanivska, V.P. Polischuk Antiphitoviral activity
of Heterometallic Complexes. Abstracts of The 1st FEMS CONGRESS OF
EUROPEAN MICROBIOLOGIST.-June29- July 3, 2003- Ljubljana, Slovenia-
p.481-482.

АНОТАЦІЯ

Харіна А.В. Дослідження антивірусної активості гетерополіядерних
координаційних сполук перехідних металів на різних рівнях взаємодії
вірус-рослина – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.06-вірусологія.- Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.

В дисертаційній роботі представлено результати дослідження антивірусної
активності гетерополіядерних координаційних сполук перехідних металів на
різних рівнях взаємодії вірус-рослина. Розроблено схему досліджень
властивостей потенційних антифітовірусних препаратів. Досліджено вплив
координаційних сполук на інфекційність Х-вірусу картоплі та вірусу
тюнової мозаїки. У результаті проведених досліджень показано віруліцидну
активність гетерополіядерних координаційних сполук перехідних металів.
Вплив препаратів комплексних сполук на фітовіруси вивчено за допомогою
електронної та атомносилової мікроскопії, електрофорезу в
поліакриамідному гелі та імуноферментного аналізу.

Встановлено, що внесення деяких препаратів координаційних сполук в
середовище для культивування рослин приводить до зниження концентрації
вірусу в рослинах. Показано антифітовірусну активність гетерополіядерних
координаційний сполук перехідних металів в модельній системі вірус
тютюної мозаїки – культура тканин Nicotiana tabacum. Обробка експлантів,
отриманих з вірусінфікованих рослин, комплексними сполуками перед
посадкою на поживне середовище знижує концентрацію вірусу в отриманому
калусі.

Ключові слова: вірус тютюнової мозаїки, Х-вірус картоплі,
гетерополіядерні координаційні сполуки перехідних металів, культура
тканин.

АННОТАЦИЯ

Харіна А.В. Исследование антивирусной активности гетерополиядерных
комплексных соеденений переходных металов на разных уровнях
взаимодействия вирус-растение – Рукопись.

Дисертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.06-вирусология.- Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченка, Киев, 2004.

Дисертация посвящена изучению антивирусной активности гетерополиядерных
комплексных соединений переходных металов на разных уровнях
взаимодействия вирус-растение. Разработано схему исследования свойств
потенциальних антифитовирусных препаратов. Исследовано влияние
гетерополиядерных комплексных соеденений переходных металов на
инфекционность Х-вируса картофеля и вируса табачной мозаики. В
результате проведенных исследований показано вирулицидную активность
гетерополиядерних координационных соединений переходных металов. Влияние
препаратов гетеполиядерных комплексов на фитовирусы изучено с помощью
электронной и атомносиловой микроскопии, электрофореза в
полиакриламидном геле и имуноферментного анализа.

Установлено, что внесение некоторых препаратов координационных
соединений в среду для культивирования растений приводит к редукции
колличества вируса в растениях. Показано антифитовирусную активность
координационых соеденений в модельной системе вирус табачной мозаики —
культура ткани Nicotiana tabacum. Обработка експлантов, полученных с
вирусинфицированых растений, координационными соеденениями перед
посадкой на питательную среду снижает концентрацию вируса в полученом
калусе.

Ключевые слова: вирус табачной мозаики, Х-вирус картофеля,
гетерополиядерные координационные соеденения переходних металов,
культура ткани.

SUMMARY

Kharina A.V. Investigation of antiviral activity of heteropolynuclear
coordination compounds of transition metals on different levels
plant-virus relatioships.- Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 – virology.
Taras Shevchenko’ Kyiv National University, Kyiv, 2004.

The thesis is devoted to antiviral activity of heteropolynuclear
complexes of transition metals in different model systems. The protocols
for testing antiphytoviral activity of miscellaneous compounds have been
developed. Effect of heterometal complex on in vitro virus inhibition
was studied on the bacteriophage T4 – E. coli B model system.
Statisticaly reliable antiphagal activity of some compounds was shown.
The virulicidal activity of heterometallic complex compounds was tested
against TMV and PVX. The activity of investigated comlexes showed lage
variability depending on compound and virus. The bioassays showed that 3
tested compounds had significant activity against both viruses. The
analysis of an elemental composition active materials has shown that all
of them possess the similar features and contain copper, cobalt and
aminoalcohols.

An impact of heteromatallic complexes on virions morphology, capsid
proteins was studied using methods of electron microscopy and atomic
force microscopy, SDS-page and ELISA. The compounds coused a formation
of virus aggregates. The results of ELISA make possible a supposition
of an impact of the complexes on TMV, PXX and phage T4 antigen
determinants.

The compounds were assayed in CyMV+ORSV-Cymbidium hybridum and
TMV-Nicotiana tabacum test systems. Aceptic plants were inoculated with
the virus and cultivated on medium with the compounds. The responce of
the plants inoculated with virus and cultured on the medium with
heterometallic comlexes was different, depending on the compound and
concentration of the compound.

Complex compound were evaluated for their antiphytoviral activity in
TMV- tissue culture test system. For deriving healthy plants using the
way their regeneration from callus or tip meristem the explants were
treated with the compounds. The growing of plants on medium with the
experimental complexes was the next step.

In general the effect of heterometallic complexes as phytoviral
inhibitors may be characterized as complex capable not only of reducing
the TMV infectivity under direct contact, but also of action in infected
plants. Heterometallic complexes seem to influence in a certain way the
methabolism of an infected plant, increasing its resistance to viral
pathogens.

Key words: tobacco mosaic virus, potato virus X, heteropolynuclear
coordination compounds of transition metals, tissue culture.

PAGE 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *