НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

ШАНДРЕНКО СЕРГІЙ ГРИГОРОВИЧ

УДК 577.128

Зміни обміну оксиду азоту в організмі щурів при його гіперпродукції та
можливості їхньої корекції (епр спектроскопічні дослідження)

03.00.04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана а Інституті екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя
МОЗ України

Науковий керівник — доктор біологічних наук, професор

ДМИТРЕНКО Микола Петрович,

завідувач лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології
ім.Л.І.Медведя МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

СТАРОДУБ Микола Федорович,

головний науковий співробітник відділу молекулярної

біології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

МЕЛЬНИКОВ Олег Ростиславович,

старший науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу Інституту
експериментальної патології, онкології та радіобіології
ім.Р.Е.Кавецького НАН України.

Захист відбудеться 10 грудня 2007 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9)

Автореферат розісланий 9 листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук

Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Оксид азоту (NO) ферментативно синтезується
різними типами клітин. При низьких (фізіологічних) концентраціях він як
внутришньоклітинний та міжклітинний месенджер здійснює в організмі
важливі сигнальні і регуляторні функції, зокрема, контролює активність
гуанілатциклази і ряду інших ключових ферментів, тонус судин,
нейромедіацію, агрегацію тромбоцитів, функцію клітин імунної системи
тощо (Moncada S. et all,1999, Palmer R. et all, 1988). Високі
концентрації NO в організмі можуть створюватися екзогенними та
ендогенними чинниками. Надходження в організм екзогенних донорів NO (
оксидів азоту, N- и S-нітрозосполук, неорганічних і органічних нітратів
тощо), які є одними з основних антропогенних забруднювачів довкілля,
може збільшувати концентрацію NO до токсичного рівня, і це є небезпека
для здоров’я людини. Високі рівні NO можливі через індукцію відповідної
ізоформи NO-синтази (тип II), що виникає в клітинах організму при
запальних процесах, зокрема, септичних станах у відповідь на дію ендо- і
екзотоксинів мікроорганізмів (Schmidt H., et all, 1996, Wolf G., et all,
1997). Надзвичайні концентрації NO створюють в організмі умови
нітрозативного і оксидативного стресу, за яких виснажуються
антиоксидантні і репаруючі ДНК системи та полегшується реалізація
цитотоксичної дії NO. Така різнонаправлена дія NO в залежності від його
концентрації спонукає приділяти особливу увагу її визначенню в клітинах
і тканинах організму. На сьогодні дані щодо характеру дії в організмі NO
та шляхів її корекції в більшості досліджень отримані опосередкова-ним
шляхом і є досить суперечливими. Це пов’язано з методичними труднощами,
що виникають при дослідженні обміну NO і його властивостей. NO є
реактогенний радикал, що легко вступає в реакції з залізом, О2, а
особливо з супероксидом (О2-) і тому має обмежений термін життя
(декілька секунд) та радіус дії. Найбільш прямим і незамінним методом,
що дозволяє безпосередньо здійснювати моніторинг інтенсивності
утворення NO, а також вивчати його обмін в дослідах in vitro та
in vivo є метод електронного парамагнітного резонансу (ЕПР). Цим методом
також можна визначати ряд показників, що характеризують процеси в
організмі, які пов’язані з обміном NO та його токсичною дією.

Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану
науково-дослідної роботи лабораторії біохімії Інституту екогігієни та
токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України та виконана у рамках таких тем:
“Дослідження участі оксиду азоту в патогенезі СНІД та СНІД-подібних
імунодефіцитних станів” (1994-1995), № ДР 0193U034229, шифр теми 93/10;
“Дослідження біохімічних механізмів апоптозу клітин імунної системи”
(1994-1996), № ДР 196U024284, шифр теми 5/269; “Роль оксиду азоту в
механізмі дії ліків та отрут” (1995-1996), № ДР 0196U008343, шифр теми
92/49; “Дослідження метаболізму оксиду азоту і формальдегіду та
механізмів їх спільної дії” (2001-2005), № ДР 0101U007592, шифр теми
05.07/00014.

Мета та задачі дослідження: Метою роботи було дослідити методом ЕПР
закономірності змін обміну NO в організмі щурів за умов його
гіперпродукції, що викликана різними чинниками, та можливість корекції
цих порушень.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі задачі:

1. Дослідити динаміку вмісту нітрозильних комплексів в умовах
підвищення рівня NO в організмі з екзогенних джерел (інтоксикація щурів,
що викликана нітритом натрію та нітропрусидом натрію) та активації
ендогенного синтезу NO у щурів (ін’єкції вакцини БЦЖ та інтратрахеальна
інсталяція азбестового волокна).

2. Дослідити стан різних фондів тривалентного заліза в плазмі крові
щурів при гіперпродукції NO.

3. Вивчити властивості екзогенного акцептору NO на основі комплексу
унітіолу з залізо-аскорбатом, ефективність його використання для
корекції обміну NO при гіперпродукції NO в організмі.

Об’єкт дослідженння — щури лінії Wistar за умов гіперпродукції NO в
організмі.

Предмет дослідження — встановлення закономірності змін обміну NO при
його гіперпродукції в організмі за рахунок надходження екзогенних джерел
та активації ендогенного синтезу.

Методи дослідження — при виконанні роботи використовувався метод
електронного парамагнітного резонансу. Дослідження виконувалися в
динаміці, через певні проміжки часу після введення щурам речовин, що
досліджувалися. В умовах in vitro дія донору та акцептору NO
досліджувалася на тимоцитах щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна роботи полягає у
тому, що розроблено модель активації ендогенного синтезу NO у щурів
шляхом імунізації вакциною БЦЖ, на якій визначено вміст NO, динаміку
утворення нітрозильних комплексів в крові та печінці та сукупність ЕПР
параметрів, що характеризують токсичний вплив NO. Встановлено, що
незалежно від місця локалізації введеного індуктора NO, де виникає
осередок запалення, відбувається загальна індукція NO-синтазних систем в
організмі, що призводить до підвищення рівня NO в різних клітинах,
тканинах та крові. Експериментально доведено, що гіперпродукція NO в
організмі супроводжується збільшенням в плазмі крові лабільного
тривалентного заліза, що впливає на обмін заліза в крові та може
підсилювати стан оксидативного стресу. Створено новий препарат
“Нітоксидел” (комплекс унітіолу з залізо-аскорбатом), що здатен
зв’язувати і транспортувати NO, зменшувати його токсичний вплив при
гіперпродукції в організмі шляхом екранування ендогенних мішеней дії NO.

Практична значимість одержаних результатів. Розроблено та досліджено
метод зниження токсичного впливу NO в умовах його гіперпродукції в
організмі через введення екзогенного акцептору NO, а також метод
інтенсифікації ендогенного синтезу NO в організмі фармакологічними
препаратами, які призводять до індукції NO-синтази та покращують умови
для регуляторної дії NO. Ці методи можуть бути використані в розробці
фармакологічних програм лікування захворювань, патогенез яких
ґрунтується на порушенні обміну NO в організмі.

Розроблено метод визначення концентрації лабільного окисленого заліза в
плазмі крові як біомаркера, що тісно корелює з підвищенням рівня NO. Цей
біомаркер можна використовувати в клінічних дослідженнях для визначення
патологічних станів організму, що пов’язані з гіперпродукцією NO, коли
неможливо використати метод ЕПР для аналізу нітрозильних комплексів в
зразках крові через низьку концентрацію останніх.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснений інформаційний
пошук та оцінка літературних даних, розроблена схема та обґрунтована
методологія постановки експериментів, виконані експериментальні
дослідження, проведений аналіз отриманих результатів разом з науковим
керівником професором Дмитренко М.П. Експерименти на тимоцитах та
перитоніальних макрофагах щурів було проведено спільно з науковими
співробітниками лабораторії біохімії Інституту екогігієни та
токсикології Кішко Т.О. та Смердовою Л.М. Отримані результати викладені
у спільних публікаціях. Решта дослідів проводилась здобувачем
самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були
представлені на засіданнях лабораторії біохімії на протязі 1994-2007
років, Першій національній науково-практичній конференції з проблем
ВІЛ/СНІД (Київ, 1995), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ,
1997), 2-nd Parnas Conference (Gdansk, 1998), міжнародному Європейському
конгресі токсикологів EUROTOX (Istanbul, 2001), “Intracellular
Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)” (Київ, 2001), VIII
Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), науковій конференції
«Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической
защиты» (Санкт-Петербург, 2004); на II з’їзді токсикологів України
(Київ, 2004); VI Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні
проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини», присвяченій
100-річчю з дня народження Л.І.Медведя (Київ, 2005).

Публікації. Результати досліджень представлені у 9 статтях в періодичних
наукових фахових виданнях України, що включено в перелік, затверджений
ВАК України, та 15 тезах доповідей на наукових конференцях. За
матеріалами дисертації отримано 2 патенти на винахід.

Обсяг і структура роботи. Дисертацію викладено на 123 сторінках
друкованого тексту, вона містить 10 таблиць, 25 рисунків та складається
з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, викладення
експериментальних результатів та їх обговорення, висновків, списку
використаної літератури. Останній включає 187 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуті властивості NO, його біологічна роль,
основні механізми регуляторної та токсичної дії в організмі. Обговорено
дані літератури про ендогенний синтез NO в організмі, структуру та
функціонування NO-синтаз. Наведені матеріали про утворення NO
нітритредуктазними системами. Розглянуті механізми транспортування NO в
організмі, утворення лабільних нітрозотіолів та нітрозильних комплексів
з лабільним негемовим залізом. Висвітлено взаємодію NO з різними формами
заліза, залізовміщуючими білками та його вплив на транспорт електронів в
мітохондріях.

Методи експериментальних досліджень. Об’єктом досліджень були зразки
цільної крові, плазми крові, тканини печінки, нирок, серця та легенів,
тимоцити та макрофаги, отримані від щурів. У роботі були використані
такі реактиви та матеріали: нітрит натрію, нітропрусид натрію, вакцина
БЦЖ, азбестове волокно марки А6-46, унітіол, залізо-аскорбат,
діетилдитіокарбомат натрію, залізо сірчанокисле. Дослідження проводили
на статевозрілих щурах лінії Wistar вагою 180-250 г. Раціон складався з
концентрованого гранульованого комбікорму з виключенням овочів для
зменшення надходження в організм щурів нітриту та нітрату.

Нітрит натрію вводили тваринам перорально в дозі 0,1 ЛД50 (12мг/кг маси
тіла) щодня на протязі двох місяців, комплекс унітіолу з
залізо-аскорбатом підшкірно у дозі 0,01 ЛД50 (8мг/кг) щодня на протязі
двох місяців. Нітропрусид натрію вводили перорально в дозі 30 мг/кг маси
тіла, комплекс унітіолу з залізо-аскорбатом тварини отримували
підшкірно у дозі 50мг/кг разово за 15 хвилин до введення нітропрусиду
натрію. Вакцину БЦЖ вводили щурам інтраперитоніально разово в дозі 10
мг/кг маси тіла, препарат “Нітоксидел” перорально у дозі 30 мг/кг
щоденно на протязі 25 діб після вакцинації. Суспензію азбестового
волокна вводили інтратрахеально в дозі 5 мг/кг в 0,2 мл фізіологічного
розчину. Пастку NO вводили наступним чином: розчин діетилдитіокарбомату
натрію (ДТК) в дозі 500 мг/кг в 2,5 мл води внутрішньобрюшино та розчин
цитрату двовалентного заліза (сульфат заліза 37,5 мг/кг + цитрат натрію
187,5 мг/кг) підшкірно за 30 хвилин до декапітації щурів. Отримання
перитоніальних клітин та виділення макрофагів здійснювали з
використанням середовища RPMI 1640, забуференого NaHCO3 до рН 7,3. Для
проведення дослідів in vitro перитоніальні макрофаги та тимоцити
отримували за методиками, що описані у Дж. Клауса, 1990.

ЕПР-спектроскопічні дослідження проводили на радіоспектрометрі “Varian
Е-109” (США) з робочою частотою НВЧ поля 9,6-9,9 ГГц при температурі
рідкого азоту. Абсолютну кількість парамагнітних центрів розраховували
методом подвійного інтегрування сигналу. Оцифровування та математичну
обробку спектрів проводили за допомогою апаратно-програмного комплексу
Multicon (Interactive Signal Processor, v.1.50). Дослідження
спектральних характеристик комплексу унітіолу з залізо-аскорбатом
проводили на спектрофотометрі “Specord M-40” (Німеччина). Статистичну
обробку результатів проводили за допомогою програми “Statistica” та
“Excel”.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ЕПР-дослідження обміну NO. Субхронічна дія нітриту натрію. Нітрит натрію
(НН) є екзогенним джерелом NO тривалої дії, він відновлюється за
допомогою ферментативних та неферментативних нітритредуктазних реакцій
(Реутов В.П., 1995). Субхронічне навантаження тварин НН дозволяє
дослідити зміни вивчаємих показників при тривалому нітрозативному
стресі. При пів- та двомісячному пероральному введені НН в спектрі ЕПР
зразків крові реєструється підвищення інтенсивності синглетного сигналу
з g=6,0 — високоспинового метгемоглобіну в 2 та 3 рази відповідно
(табл.1). Суттєве збільшення частини гемоглобіну, що вибуває з
кисневотранспортного процесу, спричинено активною участю гемоглобіну в
нітрит-редуктазних реакціях по відновленню нітрит-іону до NO. Утворений
в крові NO взаємодіє з окси- та деоксигемоглобіном, утворюючи
нітрозильний комплекс Нв-NO. В зразках від дослідних тварин реєструється
характерний широкий сигнал Нв-NO (gx=2.07, gz=1.98, Az=17.5 Gs) з
триплетним розщепленням при g=2.01 (рис.1).

Рис.1. Сигнал ЕПР нітрозильного комплексу гемоглобіну Hb-NO.

Розрахована концентрація комплексів Нв-NO в крові склала: 4,6 та 4,8 мкМ
для півмісячного та двомісячного досліду відповідно Таким чином, рівень
NO в крові на протязі всього досліду залишається практично незмінним і
визначається надходженням нітрит-іонів до організму, його метаболізацією
та виведенням. В той же час, рівень metHb в двомісячному досліді
збільшується на 50% по відношенню до півмісячного, що свідчить про
недостатню активність метгемредуктазних систем в організмі для підтримки
рівня metHb відповідно рівню NO.

В тканині печінки дослідних тварин реєструються динітрозильні комплекси
негемового заліза з парними SH-групами білків (DNIC, рис.2А) на рівні
1,3 та 1,5 мкмоль/г при пів- та двомісячному навантаженні НН відповідно.
Цитохром Р-450 та мітохондріальні металопротеїни, аналогічно
гемоглобіну, мають нітрит-редуктазну активність, що могло би пояснити
утворення NO в печінці в процесі відновлення нітрит-іону. Однак,
відсутність змін в інтенсивності відповідних сигналів (g: 2,25; 2,00;
1,94) спростовує таку можливість. DNIC утворюється за рахунок
вивільнення NO з комплексу Hb-NO. Враховуючи, що “час життя” NO в DNIC в
десятки разів більше, ніж в Hb-NO, виходить, що коефіцієнт передачі NO з
крові до печінки не більше кількох процентів. Саме гемоглобін крові є
основною мішенню дії НН, екрануючи інші біологічні структури від
токсичної дії останнього.

Рис. 2. Спектр ЕПР тканини печінки щурів при пероральному введені
нітриту натрію. Cинглетний анізотропічний сигнал з gсер=2.03 – DNIC: А-
тварини, яким вводили НН; В –інтактні тварини.

Гостра інтоксикація нітропрусидом натрію (НП). НП є екзогенним джерелом
NO швидкої дії. В організмі НП швидко розпадається з вивільненням NO.
Разове введення розчину НП моделює стан короткочасної гіперпродукції NO
в організмі (Баскаков М.Б. та інш., 2000), що дозволяє дослідити
властивості обміну NO` по релаксації відповідних параметрів.

Вже через 30 хв. після введення НП реєструється максимальна кількість
нітрозильних комплексів в крові – Hb-NO на рівні 38 мкМ, яка в
подальшому стрімко падає: на першу годину – на 37%, на другу – на 85%.
Така динаміка є доказом короткочасного масованого утворення NO з НП в
крові. В той же час кількість DNIC в печінці за 30 хв. та за 60 хв.
залишається незмінною: 7,8 та 7,9 мкмоль/г відповідно, а через 2 години
зменшується всього на 30%. Таке співвідношення двох динамік вказує на
наступну схему перерозподілу NO: НП?Hb-NO?DNIC. Кількість metHb при
введенні НП стрімко зростає, через 30 хв. збільшується в 4 рази і через
60 хв. зростає ще на 10% (табл.1). Динаміка metHb співпадає з DNIC:
коефіцієнт кореляції 0,99 (p<0.05). Метгемутворення визначається не тільки рівнем NO в крові (Hb-NO), але і кількістю депонованого NO в DNIC, де він тривалий час зберігається та поступово вивільнюється. Так через 3 години рівень Hb-NO складає всього 3% від максимального, а metHb – 67%. Поступове вивільнення NO з DNIC підтримує на значному рівні metHb. NO та його активні метаболіти інгібують мітохондріальне дихання як прямо, так і опосередковано (Radi R., et all, 2002). Встановлено зменшення сигналу мітохондріальних вільних радикалів (g=2.00) на 20%. NO вступає в реакцію з відновленими формами убіхінону з утворенням NO- та радикалу убісеміхінону. Незважаючи на високі концентрації NO стан інших парамагнітних центрів в печінці (цитохроми Р-450, мітохондріальні залізо-сірчані центри та інші) залишається незмінним. Як і у дмсйєдах з нітритним навантаженням при дії НП гемоглобін крові є основною мішенню токсичної?ді? NO, екрануючи інші біологічні структури. Вплив вакцини БЦЖ. Інфекційні захворювання, що супроводжуються запальними процесами, а також ін’єкція тваринам бактеріального ендотоксину ліпополісахаридної природи супроводжуються багатократним збільшенням кількості нітратів, що виділяються з організму разом з сечею (Wagner D.A.,et all, 1985). Це пов’язано з активацією процесів ендогенного синтезу NO в різних клітинах та тканинах організму (Moncada S., et all, 1991). Аналіз спектрів ЕПР зразків крові та тканин органів при введені щурам вакцини БЦЖ доводить наявність пролонгованого процесу активації NO-синтазних систем (табл.1). Вже на 6-ту годину реєструються нітрозильні комплекси в крові (Hb-NO) та в тканині печінки (DNIC). Ці показники мають схожу динаміку: максимальне значення досягається на 10-ту добу і в подальшому знижуються. На 20-ту добу сигнал Hb-NO зникає зі спектру крові, хоча кількість DNIC залишається на рівні 18% від максимального значення. Зміни концентрації нітрозильних комплексів в печінці відбуваються значно повільніше, ніж в крові, що свідчить про наявність в печінці і, можливо, в інших органах специфічного депо, в якому NO може зберігатися тривалий час і в подальшому вивільнюватися. В спектрі виділених перитоніальних макрофагів реєструється сигнал DNIC (рис.4), величина якого характеризує активність NO-синтаз в них. Максимальний розмах сигналу DNIC в марофагах спостерігається на 10-13 добу, майже одночасно з піком утворення нітрозильних комплексів у крові та інших тканинах. Рис. 3. Сигнал DNIC в зразках перитоніальних макрофагів. Рівень високоспінового metHb в зразках крові після вакцинації стрімко збільшується: на 6-ту годину на 50%, максимальні значення досягаються на 10 добу (у 2,3 рази). Після цього відбувається поступове його зменшення. Швидкість нормалізації metHb менша за Hb-NO. Так, на 20-ту добу сигнал Hb-NO зникає зі спектру крові, в той час як metHb залишається достатньо високим: на 60% більшим за контроль. При постійному надходженні NO за рахунок активності синтезуючих та нітритредуктазних систем може виникнути позитивний зв’язок, який підтримує високий рівень метгемоглобіну. З одного боку, взаємодія NO та його метаболітів з гемоглобіном є основною причиною утворення metHb, з іншого боку, NO гальмує активність метгемредуктаз. Тому для нормалізації рівня metHb потрібно більше часу, ніж для розпаду нітрозильних комплексів в крові та тканинах при нормалізації рівня NO. Сигнали залізо-сірчаних центрів (g=1,94) та вільнорадикальних убісеміхінонних радикалів (g=2,00) в зразках тканини печінки характеризують стан мітхондріальних електронтранспортних структур. Аналіз цих сигналів показує їхню високу зворотну кореляцію з вмістом нітрозильних комплексів в крові та печінці: k= 0,95-0,98 (p<0,05). Вже на 6-ту годину після введення вакцини БЦЖ відбувається суттєве падіння інтенсивності обох мітохондріальних сигналів. Вірогідність ушкодження оксидом азоту мітохондрій достатньо велика. Висока чутливість мітохондрій до ушкодження зумовлена вмістом великої кількості металопротеїнів та тіолів, що реагують з NO та його метаболітами (Drapier JC,et all, 1988). Рис. 4. Порівняльні спектри різних органів (серце, нирки, легені) при введенні пастки NO: ДТК-Fe+2 на 10 добу після вакцинації БЦЖ. В плазмі крові, у відмінності від печінки, реєструється різке зростання величини сигналу вільних радикалів (ВР, g=2,00). На 4-ту добу цей параметр у 5 разів перевищує контрольний рівень, потім поступово знижується. Однак, на 20-й день рівень ВР залишався в 2,5 разів більшим за контроль. Зростання кількості ВР в плазмі обумовлено інтенсифікацією вільнорадикальних реакцій, що спричинено активацією метаболізму при імунній відповіді на введення вакцини БЦЖ. Значний вклад у зростання кількості ВР вносить збільшення фонду лабільного заліза в плазмі, яке може бути каталізатором окислювальних реакцій. На 10-ту добу у порівнянні з 4-ю відбувається на 50% зменшення ВР в плазмі. Саме у цей проміжок часу спостерігається підсилення продукції NO, який реагує з вільнорадикальними формами кисню, утворюючи NO-метаболіти, що призводить до зниження ВР в плазмі. NO впливає на рівень церулоплазміну (ЦП) крові, сигнал якого (g=2,06) монотонно зменшується на протязі всього часу дослідження. На 20-добу цей параметр на 50% менший за контроль. Існують експериментальні дані, які свідчать про взаємодію NO з мідь-вміщуючими центрами церулоплазміну, що призводить до суттєвого зменшення його оксидазної активності. (Musci G, et all, 1991). Падіння інтенсивності сигналу ЦП відповідає характеру такої взаємодії. ЦП забезпечує включення двовалентного заліза в залізо-транспортний білок трансферин. Зменшення оксидазної активності ЦП повинно вплинути на вміст заліза в трансферині, а отже на інтенсивність відповідного сигналу (g=4,3). Однак, в досліді спостерігаються зворотні процеси. Інтенсивність сигналу g=4,3 поступово зростає на протязі всього дослідження, та на 20-добу цей параметр у 2,3 рази вищий, ніж контроль. Причини такої “аномальної” динаміки, криються у взаємодії NO з різними формами заліза, що розглядається в іншому розділі роботи. Для визначення кількості синтезованого NO в тканинах була використана NO-пастка – ДТК+Fe+2. Мононітрозильний комплекс ДТК+Fe+2-NO накопичується в тканинах, стабільний в біологічному середовищі при дії кисню та інших окислювачів. Використання пастки дозволяє визначити швидкість процесу утворення NO в різних органах. На рисунку 4 наведені характерні сигнали з триплетним розщепленням мононітрозильного комплексу заліза з ДТК (gII=2,04, g?= 2,02). На 10-ту добу після вакцинації зареєстровано такі концентрації NO в тканинах печінки, серця, легенів, нирок відповідно: 5,9; 4,6; 2,8 та 2,7 мкмоль/(г·год). Таким чином, перитоніальне введення вакцини БЦЖ призводить не тільки до активації перитоніальних макрофагів та індукції в них NO-синтази типу 2, але і до загальної активації ендогенних NO-синтазних систем в різних органах. Інтратрахеальне введення азбестового волокна (АВ). В патогенезі розвитку фіброзу під дією високотоксичного пилу ключову роль відіграють альвеолярні макрофаги. Відомо, що АВ при надходженні в легені активують альвеолярні макрофаги, що ініціює в них індукцію NO –синтази та вивільнення великої кількості NO, а також активних форм кисню (Du H. et all, 2003). Концентрація нітрозильного комплексу “пастка-NO” в тканинах легенів на 3, 6 та 10 добу була відповідно 1,4; 1,9 та 1,6 мкмоль/(г·год), що в 12-16 разів більше, ніж контроль. Незначна кількість NO, що зареєстрована у зразках тканини легенів контрольних тварин спричинена великою кількістю заліза, що вводилося щурам для утворення необхідної концентрації пастки. В групі дослідних тварин, яким не вводили пастку, були досліджені додаткові показники, що представлені в таблиці 1. В печінці на 3, 6 та 10 добу після інсталяції АВ зареєстровано DNIC на рівні (1,8-2,5) мкмоль/г, який був відсутній у контрольних тварин. Коефіцієнт кореляції між сигналом “пастка-NO” в легенях та DNIC в печінці: k=0.9 (p<0.05). Інтратрахеальне введення АВ спричиняє активацію NO-синтази не тільки безпосередньо в легенях, але і в печінці. Рис. 5 Спектр ЕПР тканини легенів щурів при введені пастки NO–ДТК+Fe+2. Триплетний сигнал з g=2.03 відповідає комплексу ДТК+Fe+2-NO: А - щури з внутрішньотрахеальним введенням АВ; В - інтактні тварини. На 6-ту добу зареєстровано зменшення сигналу цитохромів Р-450 в печінці на 30%, що свідчить про пригнічення активності детоксикуючої системи організму. Гіперпродукція NO в гепатоцитах призводить до зниження вмісту цитохромів Р-450 за рахунок дисоціації гему від апоферменту (Kim Y., et all, 1995). Відбулося підвищення рівня сигналу Cu2+-центрів: 3-тя доба - на 41% , 6-та доба - на 69%, що вказує на можливе збільшення кількості супероксиддизмутази та інтенсифікацію антирадикального захисту. Сигнал мітохондріальних ВР на 6 добу зменшився на 21%, очевидно, в наслідок гальмування електронтранспортних процесів в мітохондріях. Таким чином, NO при активації його ендогенного синтезу (вакцинація БЦЖ та введення АВ) має доступ до металопротеїнів печінки (мітохондріальні парамагнітні центри, цитохром Р-450) на відміну від NO, що надходить в організм або утворюється в ньому з екзогенних донорів (НН, НП). Розробка методу визначення кількості лабільного окисленого заліза в плазмі крові. В плазму крові залізо поступає з кишечнику у відновленому стані та утворює залізо-сірчані комплекси з альбуміном. ЦП окислює це залізо та включає його в трансферин, де воно екранується від хімічної взаємодії. Відомо, що фонд лабільного Fe+2 є важливим елементом транспортування NO, так як разом з низькомолекулярними тіолвміщуючими сполуками (цистеїн, глутатіон, тіосульфат та інші) утворює залізосірчаний комплекс, при приєднанні до якого NO формується лабільний низькомолекулярний нмDNIC, факт утворення та функціонування якого експериментально доведено (Vanin A.F., 1991). Припустимо, що при його розпаді залізо окислюється: Fe+2? Fe+3. Так як Fe+3 при фізіологічних умовах не може бути включеним у трансферин, воно повинно випадати із шляхів метаболізму заліза, накопичуватися в крові та в подальшому виводитися з організму. Fe+3 в трансферині має характерний анізотропічний синглетний сигнал g =4,3 з триплетною тонкою структурою (рис.6. А). Fe+3 поза трансферином має синглетний сигнал з тим же g-фактором (рис 6. В). При суперпозиції двох сигналів відбудеться зміна форми “ідеального” сигналу Fe+3тран (рис.6. D). При підвищенні рівня NO в організмі якраз і реєструється “зсунута” форма сигналу трансферину. Щоб експериментально довести це припущення, був використаний розчин ДТК. Досліди показали: ДТК по відношенню до лабільного (не включеного до трансферину) окисленого заліза (Fe+3лаб) виступає відновником, утворюється залізо-сірчаний комплекс, в якому Fe+3? Fe+2, відповідний сигнал з g=4,3 зникає; Fe+3 в трансферині (Fe+3тран) не доступне для взаємодії з ДТК. При додаванні розчину ДТК до плазми інтактних тварин сигнал з g=4,3 не змінюється. Рис. 6. Порівняльні сигнали ЕПР окисленого заліза: А- трансферину (контрольні тварини); В – сигнал FeCl3, С - сигнал FeCl3 в розчині з альбуміном, D – сумарний сигнал трансферину та FeCl3, Е – сигнал в плазмі дослідних тварин. У випадку зразків із “зсунутою” формою сигналу g=4,3 після додавання розчину ДТК відбувається нормалізація форми сигналу. Вводиться параметр зсуву сигналу, величина якого залежить від співвідношення між лабільним та трансфериновим Fe+3. Різниця між цим показником до та після додавання розчину ДТК до зразку плазми буде пропорційна кількості Fe+3лаб у зразку. Для калібровки методу використовується розчин FeCl3 на 0,1 М фосфатному буфері (рН=7,0). Чутливість методу становить 0,05 мг/л Fe+3. e J L i yoooooooooooeiaOoeoeoeOOOOOO >

@

ae

e

T ? H

J

hi§H*

D

H

P

 

Q в зразках плазми крові. В досліді з нітритним навантаженням на протязі
0,5 місяця Fe+3лаб не зареєстровано. Через 2 місяці цей показник
становив 12% від фонду Fe+3тран. Введення НП спричинило значні зміни
сигналу g =4,3, але сам препарат НП є джерелом заліза та дає власний
потужний сигнал в цій частині спектру, тому кількість Fe+3лаб при
введені НП не визначали.

При вакцинації БЦЖ спостерігається монотонне зростання величини сигналу
окисленого заліза (g=4,3), який характеризує сумарний вміст заліза в
трансферині та поза ним. На 13-20 добу концентрація Fe+3сумарне зросла у
двічі. У той же час реєструється зниження концентрації Fe+3тран. На 10
добу, коли відбувається максимальне підвищення рівня NO, вміст заліза в
трансферині падає в 2 рази, що може суттєво вплинути на метаболізм
заліза в організмі. Паралельно зі зменшенням трансферинового фонду
заліза в крові відбувається стрімке зростання кількості Fe+3лаб. На
10-13 добу лабільний фонд був в 2,7-2,8 разів вищим за трансфериновий.
Суттєве вичерпування фонду двовалентного заліза в крові, що є джерелом
для заповнення залізом трансферину, є ще однією з причин пригнічення
транспортування заліза залізотранспортним білком – трансферином. Різні
автори вказують на вичерпування фонду лабільного Fe+2 в макрофагах та
інших клітинах організму при значному підвищенні рівня NO (Bohnke R, et
all, 1995, Cairo G.,et all, 2000, Сooper C.E., 1999, Drapier JC, 1993),
що підтверджує можливість такої гіпотези.

При внутрішньотрахеальному введені азбестового волокна рівень Fe+3лаб
постійно зростає на протязі всього досліду та на 6 і 10 добу складає
більш ніж 70% від кількості заліза в трансферині. В той же час
спостерігається зменшення заліза в трансферині на 35%. Такий
перерозподіл заліза свідчить про можливі зміни в метаболізмі цього
важливого для біосинтезу металу.

Наведені результати експериментально доводять факт утворення пулу
лабільного окисленого заліза поза трансферину крові при підвищенні
рівня NO. Значна концентрація цієї форми заліза в крові (до 270% від
вмісту заліза в трансферині) свідчить про можливість його накопичення в
крові, оскільки Fe+3лаб вибуває із звичайного шляху метаболізму заліза
в плазмі крові. Суттєве зменшення кількості заліза в трансферині при
активації синтезу NO в організмі можна пояснити спустошенням фонду
лабільного Fe+2 в крові, що є основним джерелом заліза для заповнення
трансферину. Отже NO виступає одним з регуляторів обміну заліза в
організмі. Формування фонду Fe+3лаб повинно призвести до активації
утворення високореакційних вільних та гідроксильних радикалів, які
здатні окислювати білки, пошкоджувати ліпіди мембран та ДНК, в
результаті чого реалізується один з механізмів запуску оксидативного
стресу при гіперпродукції NO.

Отримані дані також вказують на те, що концентрація Fe+3лаб в крові є
неспецифічним показником підвищення рівня NO в організмі. В дослідах на
тваринах сигнал Нв-NO є основним ЕПР показником обміну NO. Однак, в
клінічних дослідженнях рівень NO, як правило, не настільки великий, щоб
утворити достатню для реєстрації концентрацію нітрозильних комплексів,
тим більше сигнал Нв-NO накладається на широкий та потужний сигнал ЦП
(g=2.05). Це суттєво обмежує використання методу ЕПР для клінічних
досліджень обміну NO. Аналіз форми сигналу з g=4,3 та визначення
кількості Fe+3лаб є більш чутливим методом оцінки рівня NO в
організмі, особливо при активації його ендогенного синтезу.

Теоретична модель можливості корекції обміну NO в організмі. В умовах
гіперпродукції NO в організмі утворюються низькомолекулярні
динітрозильні комплекси лабільного нмDNIC з тіолвміщуючими лігандами:
цистеїном, глутатіоном, тіосульфатом (Ванин А.Ф., 1998). Такі нмDNIC є
більш стабільними, ніж вільний NO. Якщо час життя NO в біологічному
середовищі обмежено кількома секундами, то нмDNIC стійкий на протязі
хвилин. нмDNIC здатні переміщуватися між внутрішньоклітинними
компартментами та клітинами, виконувати функцію донорів NO. Вважається,
що саме нмDNIC реалізують функції ендотелій залежного фактору релаксації
судин (Kleschyov A, et all, 2002).

NO-синтезуючі системи та мішені дії NO розділені у просторі. Розподіл NO
між ними можна апроксимувати експонентою, оскільки процес
транспортування NO буде включати дифузійні та дрейфові компоненти (Kayne
M., 2003): n(x)=N0exp(-x/л), де л- усереднена ефективна довжина
дії NO (рис.7). Припускаємо, що в організмі існує система регуляції
циклу NO, яка підтримує таку активність NO-синтезуючих систем, щоб
забезпечити необхідний рівень NO на мішені дії (Nдії). За рахунок
нерівномірного розподілу утворюються зони з високою концентрацією NO, де
найбільш імовірні прояви токсичної дії NO. Гіперпродукція NO та
нерівномірний розподіл у просторі призводять до створення системи
негативного зворотного зв’язку, що обмежує та контролює активність
NO-синтезуючих систем. Наприклад, синтезований в макрофагах NO спричиняє
як регуляторний, так і токсичний вплив не тільки на мішені дії NO, але і
на макрофагів, що продукують це NO (Miranda KM, 2000). NO синтезується
набагато більше, ніж використовується за призначенням.

Рис.7. Теоретична модель розподілу оксиду азоту у просторі від місця
його синтезу до мішені дії.

Ефективність NO-синтезуючих систем визначається градієнтом концентрації
NO на відстані від місця синтезу до мішені дії. Зниження кількості NO в
місці його утворення при збереженні необхідної кількості NO на мішені
дії можливе за рахунок збільшення ефективної довжини переносу NO (л).
Ендогенні акцептори NO: нмDNIC, гемоглобін – здатні зв’язувати,
транспортувати та при певних умовах вивільнювати NO. Час життя та
рухомість цих нітрозильних комплексів визначають параметр л. Для
збільшення параметру необхідно ввести в біологічну систему екзогенний
акцептор NO з аналогічними властивостями, але з більшим часом життя
комплексу акцептор?-NO. Токсичний вплив NO залежить від імовірності та
швидкості реакції з мішенню. Наявність додаткового акцептора NO, який
був би здатний конкурувати за зв’язування NO з ендогенними мішенями,
може зменшити токсичну дію NO та за рахунок послаблення негативного
зворотнього зв’язку покращити функціонування NO-синтазних систем. Такий
акцептор також може забезпечити більш рівномірний розподіл NO у
просторі.

Властивості препарату “Нітоксидел”. Розроблено новий препарат
“Нітоксидел”, що представляє собою стабільний залізо-сірчаний комплекс
(UFeA) унітіолу (C3H7S3O3Na) та залізо-аскорбату
((C6H8O6·FeO)·1/2FeSO4·H2O). Комплекс UFeA має малиновий колір з трьома
максимумами у спектрі електронного поглинання: 265, 355 та 540 нм.
Процес формування UFeA можна контролювати за оптичними спектрами.
Залізо-аскорбат має пік поглинання на 620 нм. При додаванні до нього
розчину унітіолу смуга поглинання на 620 нм зменшується, натомість
з’являється на 540 нм. По перерозподілу оптичної густини між 620 нм та
540 нм можна судити про оптимальне молярне співвідношення вихідних
компонентів. Аналіз оптичних спектрів показав, що UFeA утворюється
еквімолярно до унітіолу та залізо-аскорбату. В ЕПР-спектрі UFeA є два
синглетних сигнали: g=2.00 – симетричний сигнал аскорбінового радикалу,
g=4,3 – широкий анізотропічний сигнал тривалентного заліза. Подальший
аналіз з використанням розчину ДТК показав, що це залізо не входить у
структуру залізо-сірчаного комплексу та присутнє як пасивна домішка. При
взаємодії UFeA з NO утворюється динітрозильний комплекс UFeA-NO, при
цьому відбувається перерозподіл оптичної густини поглинання в більш
короткохвильову ультрафіолетову частину спектру. Комплекс UFeA-NO
парамагнітний — в спектрі ЕПР він має характерний для DNIC синглетний
анізотропічний сигнал з gсер=2,03 та шириною пік-пік 20 мТл.

Стабільність UFeA-NO в біологічному середовищі досліджено in vitro.
Через UFeA продули газову суміш, що містила NO (1% NO, 99% N2).
Формування UFeA-NO контролювали за спектрами ЕПР. Створений таким чином
насичений комплекс UFeA-NO інкубували в середовищі гепаринезованої
цільної крові. В спектрі ЕПР спостерігалося поступове зменшення
“вузького” сигналу UFeA-NO та зростання “широкого” сигналу Hb-NO з
характерним триплетним розчепленням. Такий перерозподіл спектральної
густини ЕПР поглинання доводить про можливість передачі NO з UFeA-NO на
гемоглобін. В результаті дослідження встановлено:

Час життя UFeA-NO (час, за який концентрація зменшується в 2,7 разів) в
середовищі цільної крові становить приблизно 45 хвилин.

Комплекс UFeA-NO здатен частково передавати NO на гемоглобін з
утворенням Нв-NO. Коефіцієнт передачі розраховано за наведеною формулою:

де ф — час життя відповідного комплексу, S – динаміка сигналу
відповідного комплексу.

Розрахунки дали значення коефіцієнту передачі: Кпер=0,08. При розпаді
комплексу UFeA-NO до 8% NO передається на гемоглобін.

Комплекс UFeA здатен конкурувати за зв’язування NO з гемоглобіном. При
продувці через рівномолярний розчин UFeA та Нв (лізат еритроцитів)
газової суміші (1%NO, 99%N2) в спектрі ЕПР реєструються сигнали UFeA-NO
та Hb-NO у співвідношенні концентрацій 64 та 36%.

Здатність UFeA екранувати біологічні структури від токсичної дії NO
досліджено in vitro на тимоцитах щурів. При інкубації тимоцитів в
середовищі з вмістом 0,1 мМ НП відбувається суттєве збільшення кількості
загиблих клітин в процесі інкубації. Так, за 7 годин інкубації кількість
мертвих клітин зросло з 7 % без НП до 45% в присутності НП. Цитотоксичні
властивості НП обумовлені його здатністю вивільнювати NO, який спричиняє
загибель клітин. Додавання до інкубаційного середовища 1 мМ комплексу
UFeA призвело до зменшення кількості загиблих клітин за 7 годин
інкубації до 24%. Такий результат однозначно пояснюється спроможністю
комплексу UFeA зв’язувати NO та екранувати клітини від його токсичного
впливу. Таким чином, UFeA проявляє цитопротекторні властивості при дії
донорів NO.

Вплив комплексу унітіолу з залізо-аскорбатом на ЕПР показники при
гіперпродукції оксиду азоту в організмі. При нітритній інтоксикації
гемоглобін крові виступає основною мішенню дії NO. Додаткове введеня
щурам його акцептора UFeA призвело до зменшення кількості нітрозильних
комплексів в крові Hb-NO в 1,8 разів та в печінці DNIC- в 2,5 разів
(табл.1). Комплекс Hb-NO утворюється в процесі нітритредуктазних реакцій
на гемоглобіні та за рахунок вивільнення NO з ендогенних депо. Акцептор
UFeA не здатен вплинути на перший процес формування Hb-NO, але за
рахунок екранування Нв суттєво послаблює інтенсивність другого процесу.
Зменшення кількості комплексів Hb-NO, з одного боку, характеризує
ефективність акцептора UFeA, з іншого боку, свідчить про інтенсивність
обміну NO між нітрозильними комплексами в крові та печінці. На нітритній
моделі DNIC в печінці формується, в основному, за рахунок вивільнення NO
з Hb-NO. Тому акцептор UFeA здатен суттєво зменшити кількість
депонованого NO. Як наслідок, відбувається послаблення токсичного
навантаження на гемоглобін – концентрація metHb зменшилась в 1,4-1,6
разів.

При гострій інтоксикації НП введення акцептору UFeA призводить до
зниження всіх показників, що пов’язані з утворенням нітрозильних
комплексів та дією NO. Як видно з даних, представлених в табл. 1,
зменшення кількості нітрозильних комплексів в крові та печінці відбулося
майже однаково – в 1,8 разів. Зниження рівня NO в організмі призводить
до послаблення його токсичного впливу – рівень metHb знизився в 1,9
разів.

Ступінь NO-інтоксикації при вакцинації БЦЖ характеризують рівень metHb
в крові та величини сигналів мітохондріальних центрів. Додаткове
введення акцептору UFeA призводить на 10 добу до зменшення кількості
нітрозильних комплексів в крові і печінці в 1,7 разів. Таким чином, як і
у випадку з гіперпродукцією NО під дією екзогенних донорів, при
активації ендогенного синтезу комплекс UFeA під час максимальної
продукції NO ефективно знижую його рівень в організмі, за рахунок чого
відбувається зменшення інтоксикації: рівень metHb на 10 добу знижується
в 1,5 рази.

Близьке розташування мітохондріальної NO-синтази (mNOS) до учасників
електронтранспортного ланцюгу забезпечує пряму дію синтезованого NO на
дихання мітохондрій (Bringold U., 2000). При введенні UFeA
спостерігається зменшення спаду величин сигналів мітохондріальних
залізо-сірчаних центрів та вільних радикалів, що свідчить про
доступність UFeA до внутрішньоклітинних структур мітохондрій та його
NO-екрануючу дію.

На 20-25 добу після вакцинації БЦЖ рівень нітрозильних комплексів
нормалізується: сигнал Hb-NO зникає зі спектру зразків крові, DNIC
реєструються на низькому рівні – (1,6-0,8) мкмоль/г. Введення комплексу
UFeA забезпечує збереження підвищених рівнів нітрозильних комплексів в
цей проміжок часу, тобто 20-25 діб: Hb-NO відповідно 3,2 та 1,4 мкМ;
DNIC – 1,8 та 1,6 мкмоль/г. На 25 добу кількість DNIC під впливом UFeA
збільшилася в 2 рази. Таким чином, отримані результати вказують на
пролонгування активності NO-синтазних систем в організмі при введенні
екзогенного NO-акцептору UFeA. Поясненням цього факту може бути
спроможність UFeA зменшувати токсичний вплив на саму NO-синтезуючу
систему через екранування її від ушкоджуючої дії NO, а також через
покращення транспортування NO.

На основі отриманих результатів запропоновано дві схеми корекції
порушень обміну NO:

При гіперпродукції NO: вводиться екзогенний акцептор NO – комплекс
унітіолу з двовалентним залізом, що повинно призвести до зменшення
проявів нітрозативного стресу.

При гіпопродукції NO: вводиться індуктор NO-синтази, наприклад,
ліпополісахарид (в клінічних умовах можливе застосування
фармакологічного препарату – пірогеналу) та комплексу унітіолу з
двовалентним залізом. Використання останнього забезпечить пролонгування
інтенсифікації обміну NO та послабить його токсичну дію.

Схема корекції обміну NO при його гіпопродукції була використана для
розробки ефективної фармакологічної програми лікування еректильної
дисфункції (И.И.Горпинченко та інші, 2001).

ВИСНОВКИ

За допомогою методу електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) виявлені
раніше невідомі особливості обміну NO в організмі в умовах його
гіперпродукції, встановлені нові шляхи регуляції обміну заліза в плазмі
крові і розроблені методи корекції порушень обміну NO, а саме:

1.Гіперпродукція NO за рахунок екзогенних джерел (разове введення щурам
нітропрусиду натрію (30мг/кг) та субхронічне введення нітриту натрію
(12 мг/кг)) призводить до появи нітрозильного комплексу гемоглобіну
Hb-NO (38 мкМ і 4,6 мкМ відповідно) та зростання кількості
метгемоглобіну (в 4,6 і 3,6 разів) в крові, утворення динітрозильних
комплексів негемового заліза DNIC (7,9 мкМ і 3,4 мкМ) в тканині печінки.
Нормалізація цих змін у часі збільшується в такій послідовності: Hb-NO,
DNIC, metHb.

2.Введення щурам вакцини БЦЖ перитоніально і азбестового волокна
інтратрахеально призводить до збільшення кількості NO в різних тканинах
організму, появі DNIC в печінці та макрофагах, Hb-NO в крові та
збільшення metHb. Під впливом обох чинників зміни вказаних показників
мають схожу динаміку і тісно корелюють між собою. Максимальне їх
збільшення відбувається на 10-тий день, а коефіцієнт кореляції між DNIC
та metHb становить 0,95-0,97 (p<0.05), що дозволяє розглядати метгемоглобінемію як наслідок виникнення нітрозативного стресу. 3.Збільшення в організмі щурів рівня NO, що викликано індукцією його синтезу, на відміну від дії екзогенних донорів NO, пригнічує електронтранспортні процеси в мітохондріях. 4.Індукована різними чинниками гіперпродукція NO в організмі супроводжується накопиченням в плазмі крові лабільного окисленого заліза Fe+3 та зменшенням його вмісту в трансферині. Кількість лабільного Fe+3 в крові може бути використаною як діагностичний показник зростання рівня NO в організмі людей і тварин. 5.Створено препарат “Нітоксидел” – залізо-сірчаний комплекс унітіолу з залізо-аскорбатом, що здатен утворювати з NO динітрозильний комплекс, який є більш стійким, ніж природні DNIC. Препарат конкурує за зв’язування NO з гемоглобіном і має цитопротекторні властивості при дії на тимоцити донорів NO. 6.Препарат “Нітоксодел” зменшує прояви нітрозативного стресу у щурів, що викликаний введенням донорів NO і вакцини БЦЖ. Список опублікованих праць здобувача. Дмитренко Н.П., Шандренко С.Г., Кузьминский С.Н., Веременко Л.М., Кишко Т.О. Биологическая активность нового препарата - акцептора оксида азота // Журн. АМН України. -1996. - 2, № 4. - С. 722-731. Дмитренко Н.П., Сноз С.В., Шандренко С.Г., Кишко Т.О., Смердова Л.Н., Веременко Л.М. Влияние акцепторов оксида азота на критериально значащие биохимические показатели у крыс с нитритной нагрузкой // Современные проблемы токсикологии. - 1998. - № 1. - С.24-28. Кишко Т.О., Шандренко С.Г., Дмитренко Н.П. Об участии оксида азота и супероксида в апоптозе тимоцитов, визванном папаверином и нитропруссидом натрия // Современные проблемы токсикологии. - 2001. - № 1. - С. 26-31. Дмитренко М.П.,Шандренко С.Г. ЭПР-ные характеристики, отражающие синтез оксида азота у крыс в ответ на инъекцию вакцины БЦЖ// Укр. біохім. журн. - 2001.-73,№3.-С.55-60. Дмитренко Н.П., Кишко Т.О., Шандренко С.Г. О роли ксантиноксидази в цитотоксическом действии нитратов и нитритов // Укр. біохім. журн. -2001. - 73, №6. - С.113-118. Горпинченко И.И., Дмитренко Н.П., Мирошников Я.О., Шандренко С.Г. Лечение больных с эрекционной дисфункцией воздействием на обмен оксида азота// Журн. АМН України. - 2001. - 7, №2. - С.364-368. Дмитренко М.П., Смердова Л.Н.,Шандренко С.Г. Метод визначення участі оксиду азоту в механізмі дії хімічних речовин// Современные проблемы токсикологии.-2002.- №4.- С.93-95 Проданчук Г.Н., Шандренко С.Г., Кишко Т.О., Дмитренко Н.П. Новые аспекты механизма токсического действия гидроксиламина// Современные проблемы токсикологии. - 2006.- №1.-С.37-46 Дмитренко М.П., Михайленко В.М., Главин А.А., Сноз С.В., Кишко Т.О., Шандренко С.Г., Смердова Л.Н. Обмен N-нитрозодиметиламина у крыс со стрептозотоциновым диабетом// Современные проблемы токсикологии.-2006.- № 4.- С.21-26. Дмитренко Н.П., Кузьминский С.М., Попко В.І., Сноз С.В., Щандренко С.Г., Шиліна В.Ф. Вивчення впливу нового акцептора оксиду азоту імуферину на деякі показники стану імунітету// Збірник тез. першої націо нальної науково-практичної конференції з проблем ВІЛ/СНІД. Київ, 24-26 січня 1995 р. - С.87-88. Дмитренко Н.П., Шандренко С.Г., Сисецький А.П. Альтернативні варианти біохімічних ефектів дії нітратів на організм людей з ішемічною хворобою серця //Тези доп. VII Укр. біохім. з'їзду. Київ, 1997. -ч.І. - С.125-126 Дмитренко М.П., Сноз С.В., Шандренко С.Г., Кішко Т.О., Смердова Л.М., Веременко Л.М. Вплив акцепторів оксиду азоту на критеріально значущі біохімічні показники щурів з нітритною інтоксикацією // Тези доп. VII Укр. біохім. з'їзду. Київ, 3-6 вересня 1997 р.- ч.ІІІ.- С.25-26. Dmitrenko N.P., Shandrenko S.G., Snoz S.V., Kishko T.O., Smerdova L.N. Investigation the new drug nitoxidel - nitric oxide's acceptor // Abstractі of 2-nd Parnas Conference. Gdansk, Arthur's Court, 11-13 September 1998. - P. 46 Горпинченко І.І., Дмитренко М.П., Мирошников Я.О., Шандренко С.Г. Застосування комплексної методики індукування виробки монооксиду азоту в лікуванні хворих з еректильною дисфункцією// Матеріали конференції "Актуальні проблеми фармакології і токсикології".Київ, 7-8 грудня 2000 р.- С.9-10 N.P.Dmitrenko, T.O.Kishko, S.G. Shandrenko. About a role of xanthine oxidase in reduction and displaying of cytotoxic action nitrate and nitrite// Abstracts of EUROTOX. Turkey, Istanbul, Military Museum, 13-16 September 2001.- Toxicol.Lett.-2001.-123.-Supl.1.-Р.41 M.Dmitrenko, L.Smerdova, S.Shandrenko. N0 role in N-nitrosodimethylamine, Sodium nitroprusside and nitroglycerine cytotoxic action to rat peritoneal macrophages// Abstracts of EUROTOX. Turkey, Istanbul, Military Museum, 13-16 September 2001.- Toxicol.Lett.-2001.-123.-Supl.1.-Р.79. Kishko T.O., Shandrenko S.G., Dmitrenko M.P. Cytotoxic action of nitrate and nitrite due to nitrate reductase activity of xanthine oxidase system in rat organism // Programme and Abstract of Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS). Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001. М.П.Дмитренко, Т.О.Кішко, С.Г.Шандренко. Роль ксантиноксидоредуктази в механізмі цитотоксичної дії як ферментної системи, що синтезує активовані кисневі метаболіти і відновлює нітрати// Тези доповідей І з'їзду Токсикологів України. Київ, 11-13 жовтня 2001 р. - С.52-53. Л.М.Смердова, С.Г.Шандренко. Дослідження цитотоксичної дії донорів оксиду азоту на перитоніальні макрофаги щурів за допомогою пастки NO// Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду. Чернівці, 1-3 жовтня 2002р. -Укр.біохім.журнал, -74,№4а, - 2002. –С.82. Дмитренко Н.П., Шандренко С.Г. Коррекция уровня оксида азота в организме//Материалы научной конференции "Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты. Россия, Санкт-Петербург, 20-21 мая 2004 г. - С.340-341. Шандренко С.Г., Кишко Т.О., Дмитренко М.П., Сноз С.В., Шиліна В.Ф. NO синтез при азбестовій інтоксикації// Тези доповідей ІІ з'їзду токсикологів України. Київ, 12-14 жовтня 2004 р. - С.52-53. Шандренко С.Г. Утворення лабільного Fe3+ в крові при підвищенні рівня оксиду азоту // Тези доповідей ІІ з'їзду токсикологів України. Київ, 2004. - С.135-136. Проданчук Г.М., Шандренко С.Г., Кішко Т.О., Дмитренко М.П. Особливості токсичної дії гідроксиламіну // Тези доповідей ІІ з'їзду токсикологів України. Київ, 12-14 жовтня 2004 р. - С.69-70. Проданчук Г.Н., Шандренко С.Г., Кишко Т.О., Дмитренко Н.П. Новые аспекты в механизме токсического действия гидроксиламина// Тези доповідей VI Міжнародної науково-практичної конференції "Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини" присвяченої 100-річчю з дня народження Л.І.Медведя. Київ, 1-3 жовтня 2005 р.- С.58-59 Спосіб зниження рівня оксиду азоту в організмі людини і тварин: Патент на винахід UA 21154/ Дмитренко М.П., Шандренко С.Г. - №95073456; Заявл. 24.07.95; Опубл. 27.02.08, Бюл. №1. Спосіб визначення сумарного вмісту N-нітрозоамінів: Патент на винахід UA 17375/Дмитренко М.П., Шандренко С.Г., Кішко Т.О. - №960205552; Заявл. 15.02.96; Опубл. 31.10.97, Бюл. №5. АНОТАЦІЯ Шандренко С.Г. Зміни обміну оксиду азоту в організмі щурів при його гіперпродукції та можливості їхньої корекції (ЕПР спектроскопічні дослідження). –Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Київ, 2006. Дисертацію присвячено дослідженню змін обміну оксиду азоту (NO) в організмі щурів на моделях гіперпродукції NO із застосуванням методу електронного парамагнітного резонансу (ЕПР). Досліджено динаміку утворення нітрозильних комплексів гемового та негемового заліза, а також параметри ЕПР, що характеризують токсичний вплив NO, на таких моделях: гостра інтоксикація нітропрусидом натрію, субхронічна дія нітриту натрію, вакцинація БЦЖ та інтратрахеальне введення азбестового волокна. Експериментально доведено, що гіперпродукція NO супроводжується накопиченням в плазмі крові лабільного окисленого заліза, для визначення вмісту якого розроблено новий метод ЕПР. Розглянута теоретична модель можливості корекції порушень обміну NO в організмі шляхом введення екзогенного акцептора NO. Розроблено препарат “Нітоксидел” - залізосірчаний комплекс залізо-аскорбату з унітіолом. Показано, що цей комплекс здатен зв'язувати NO з утворенням динітрозильного комплексу, транспортувати та частково вивільнювати NO в біологічному середовищі. Розроблено спосіб зменшення кількості та токсичного впливу NO при його гіперпродукції в організмі, а також спосіб інтенсифікації ендогенного синтезу NO. Ключові слова: оксид азоту, нітрозильні комплекси, екзогенний акцептор NO, лабільне окислене залізо. АННОТАЦИЯ Шандренко С.Г. Изменения обмена оксида азота в организме крыс при его гиперпродукции и возможности их коррекции (ЭПР спектроскопические исследования). - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2007. Диссертация посвящена изучению изменений обмена оксида азота (NO) в организме крыс на моделях гиперпродукции NO c использованием метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Исследована динамика образования нитрозильных комплексов гемового и негемового железа, а также параметры ЭПР, отражающие токсическое действие NO, на разных моделях повышения уровня NO в организме. Aeia?i?iaeoeoeey NO за счет екзогенных источников (разовое введение нитропруссида натрия (30 мг/кг) и субхроническое введение нитрита натрия (12 мг/кг)) приводит к образованию нитрозильного комплекса гемоглобина Hb-NO (38 ieI ? 4,6 ieI niioaaonoaaiii) e e oaaee/aieth eiee/anoaa iaoaaiiaeiaeia (a 4,6 e 3,6 ?ac) a e?iae, ia?aciaaieth aeeieo?iceeueiuo eiiieaenia iaaaiiaiai aeaeaca DNIC (7,9 ieI e 3,4 ieI) a oeaie ia/aie. A?aiy ii?iaeecaoeee yoeo eciaiaiee oaaee/eaaaony a oaeie iineaaeiaaoaeueiinoe: Hb-NO, DNIC, metHb. Aaaaeaiea e?unai aaeoeeiu AOeAE ia?eoiieaeueii e acaanoiaiai aieieia eio?ao?aoaaeueii i?eaiaeeo e oaaee/aieth eiee/anoaa NO a ?aciuo oeaiyo i?aaiecia, iiyaeaieth DNIC a ia/aie e iae?ioaaao, Hb-NO a e?iae, oaaee/aieth iaoaaiiaeiaeia e niaaeo neaiaeia ieoioiiae?eaeueiuo oeaio?ia a ia/aie. Iiae aeeyieai iaieo yooaeoi?ia yoe iieacaoaee eiatho iaeeiaeiaoth aeeiaieeo e oanii ei??aee?otho iaaeaeo niaie. Iaeneiaeueiia eo eciaiaiea i?ienoiaeeo ia 10-e aeaiue, a eiyooeoeeaio ei??aeyoeee iaaeaeo DNIC e metHb ninoaaeyao 0,95-0,97 (p<0.05), /oi iicaieyao ?anniao?eaaoue iaoaaiiaeiaeiaieth eae neaaenoaea ieo?icaoeaiiai no?anna. Экспериментально доказано, что гиперпродукция NO сопровождается накоплением в плазме крови лабильного окисленого железа, для определения содержания которого разработан новый метод ЭПР. Рассмотрена теоретическая модель возможности коррекции нарушений обмена NO в организме путем введения экзогенного акцептора NO. Создан препарат “Нитоксидел” - железосерный комплекс железо-аскорбата с унитиолом. Показано, что этот комплекс способен связывать, транспортировать и частично высвобождать NO в биологической среде. Препарат успешно конкурирует за связывание NO с гемоглобином и обладает цитопротекторными свойствами при действии на тимоциты доноров NO. На моделях гиперпродукции NO в организме введение “Нитоксидела” приводит к ослаблению нитрозативного стресса: уменьшается содержание ендогенных нитрозильных комплексов и метгемоглобина, уменьшается спад сигналов митохондриальных центров. На модели вакцинации БЦЖ препарат “Нитоксидел” пролонгирует состояние повышенного уровня NO в организме. На основе полученных результатов разработан способ уменьшения количества NO в организме и ослабления его токсического действия при гиперпродукции NO в организме, а также способ интенсификации эндогенного синтеза NO. Ключевые слова: оксид азота, нитрозильные комплексы, екзогенный акцептор NO, лабильное окисленное железо. SUMMARY Shandrenko S.G. Nitric oxide metabolism changes in rat’s organism under it’s hyperproduction and possibilities of their correction (EPR spectroscopy investigation). Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2007. The thesis describes the investigation of nitric oxide metabolism changes on different experimental models of it’s hyper-production in rat’s organism. The investigation was conducted by EPR spectroscopy. Formation of heme- and non-heme iron-nitrosyl complexes and EPR parameters concerning NO toxic action were investigated on following models: nitroprussid acute intoxication, subhronic nitrite natrium administration, BCG vaccination, asbestos fibers intratraheal instillation. It was experimentaly demonstrated that NO hyper-production resulted in the formation of labile ferric iron pool in blood plasma. New method to determine this kind of iron was developed. Theoretical model of NO metabolism changes correction with an exogenous NO-acceptor application was considered. The biochemical properties of an iron-sulfur complex containing iron-ascorbat and unithiol were investigated. This complex can bind NO forming dinitrosyl-iron complex, carry NO and partially release NO in the organism. Methods of NO level and its toxic effect diminution and endogenous NO-synthesis intensification were developed. Key words: nitric oxide, nitrosyl complex, exogenous NO-acceptor, labile ferric iron pool. PAGE 3

Похожие записи