ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ

ТЕРПЯЧА ІРИНА ВАСИЛІВНА

УДК: 618. 177 – 089. 888. 11: 612. 592: 612. 616: 615. 014. 41

Зберігання сперміїв в умовах гіпотермії для використання в програмі
екстракорпорального запліднення ооцитів людини

03.00.19 — кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник:

академік НАН України

ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

завідувач відділу кріобіології системи репродукції

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

ЖЕГУНОВ ГЕННАДІЙ ФЕДОРОВИЧ

Харківська державна зооветеринарна академія МАП України,

завідувач каф. хімії і біохімії

доктор біологічних наук, професор

ГЛАДКОВА АЛЛА ІВАНІВНА

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН
України, завідувач лабораторії репродуктивної ендокринології

Провідна установа:

Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра урології

Захист відбудеться «21» грудня 2004 р. о 1330 на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська, 23, 61015,
м. Харків

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України,

вул. Переяславська, 23, 61015, м. Харків

Автореферат розісланий «20» листопада 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор

член – кореспондент НАН України А.М. Гольцев

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

У даний час значні розходження у ступені реалізації фізіологічної
здатності до народження певної кількості дітей у різних групах населення
значною мірою визначаються соціально-економічними умовами життя. Серед
факторів, що впливають на демографічні процеси, важлива роль
приділяється проблемі безпліддя (Грищенко В.І., 1990, Глушак Т.І.,
2000).

Актуальність проблеми. При лікуванні безпліддя широко застосовуються
методи допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), для яких важливими є
способи підвищення фертильності чоловічих гамет, їх короткострокове і
тривале зберігання з мінімальними втратами біологічної активності. Для
цього використовують методи зберігання гамет в умовах низьких
температур, які супроводжуються істотним зниженням або уповільненням на
певний період активності метаболічних процесів у клітинах.

Використання різних методів контрольованої суперовуляції в програмах
допоміжних репродуктивних технологій сприяє дозріванню декількох
фолікулів у одному циклі, але синхронність у розвитку фолікулів буває не
завжди (Bosch E., 2002). У результаті цього отримані з фолікулів
яйцеклітини можуть мати різний ступінь зрілості. У проведених раніше
дослідженнях (Jacobs M., 2001) було показано, що час попередньої
інкубації зрілих ооцитів становить 5 — 6 годин до часу інсемінації, у
той час як незрілі ооцити проходять стадію дозрівання 20 — 24 години.

Незважаючи на оптимізацію кожного етапу ЕКЗ, не завжди вдається досягти
високого рівня запліднення яйцеклітин. За даними (Карачун О.Є., 2000) в
умовах in vitro від 10 до 50 % ооцитів не запліднюються. У літературі
зустрічаються повідомлення про позитивні й негативні спроби провести
реінсемінацію ооцитів, що не запліднилися (Bussen S., 1997). З цією
метою автори використовували нативну сперму чоловіка чи сперму донора.
Перспективним у цьому відношенні є застосування для цих цілей сперміїв
чоловіка, що зберігалися в умовах гіпотермії протягом 18 — 24 години.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обраний напрямок
досліджень пов’язаний з науковою темою Інституту проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України 2.2.6.96 “Вивчення особливостей дії низьких
температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні клітини в
залежності від етапу гамето- та ембріогенезу, розробка середовищ
зберігання, кріоконсервації та репарації нелетальних кріопошкоджень цих
біооб’єктів”.

Мета і задачі дослідження – визначити умови гіпотермічного зберігання
активнорухливих сперміїв людини, які забезпечують високу цілість
морфологічних і функціональних властивостей гамет для подальшого
використання в програмі екстракорпорального запліднення ооцитів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Вивчити морфологічні й кінетичні показники активнорухливої фракції
сперміїв до і після впливу гіпотермічних умов зберігання в середовищах
різного композиційного складу (Menezo B2, Хенкса, Ham F-10).

2. Дослідити вплив гіпотермічних умов зберігання (80С протягом
0-24-48-72 годин) на морфофункціональні властивості сперміїв, виділених
з еякулятів з різним вмістом швидких гамет (0-10-20-30 %).

3. Вивчити вплив температурних умов (40С; 80С; 220С; 370С) зберігання
(24 години) у середовищі Menezo B2 на активність акрозину в сперміях
активнорухливої фракції.

4. Визначити життєздатність сперміїв активнорухливої фракції, що
зберігалася в гіпотермічних умовах (80С, 24 години, середовище Menezo
B2), при культивуванні в інкубаторі (5% СО2, 370С, середовище Menezo B2)
протягом 0-24-48-72 годин.

5. Провести порівняльне дослідження запліднюючої здатності
активнорухливої фракції сперміїв нативних та після гіпотермічних умов
зберігання (80С, 24 години, середовище Menezo B2) відносно ооцитів
різного ступеня зрілості на етапах біотехнологічного циклу програми ЕКЗ,
а також каріотипу отриманих ембріонів.

Об’єкт дослідження – морфологічні та функціональні властивості
активнорухливої фракції сперміїв людини.

Предмет дослідження — запліднююча здатність активнорухливої фракції
сперміїв після гіпотермічних умов зберігання.

Методи дослідження: морфологічні, біохімічні, цитогенетичні,
математично-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше на різних етапах
біотехнологічного циклу програми екстракорпорального запліднення ооцитів
людини досліджена життєздатність активнорухливої фракції сперміїв,
виділеної із еякулятів з різним ступенем астеноспермії. Уперше в
порівняльному аспекті досліджений вплив температурних умов зберігання на
морфологічні та кінетичні властивості активнорухливої фракції сперміїв,
виділеної з різних еякулятів, і показано, що оптимальними є умови
гіпотермічного зберігання при температурі 80С. Новими є також результати
дослідження динаміки кінетичних показників сперміїв при зберіганні (80С)
їх у середовищах різного композиційного складу (Хенкс, Ham F-10, Menezo
B2), які свідчать про те, що використання середовища Menezo B2 сприяє
пролонгуванню життєздатності гамет. При цьому термін збереження високої
біологічної активності сперміїв (до 30 годин) відповідає тому, який є
необхідним для підготовки ооцитів різного ступеня зрілості до
запліднення в програмі ЕКЗ. Автором уперше показаний кореляційний
зв’язок між морфологічними і функціональними показниками сперміїв зі
швидким прогресивним рухом, отриманих після гіпотермічного зберігання, і
показниками життєздатності сперміїв, що були визначені в наступному
біотехнологічному циклі — в умовах культивування. Новими є також дані
щодо показників активності ферменту акрозину при досліджених автором
умовах гіпотермічної консервації сперміїв людини і визначення
оптимальних складових цього етапу підготовки біоматеріалу до програми
ЕКЗ (середовище, температура, термін зберігання). У роботі вперше для
реінсемінації незапліднених ооцитів застосовані спермії, що зберігалися
в гіпотермічних умовах консервації. Автор уперше використав у
біотехнологіному циклі ЕКЗ для інсемінації незрілих ооцитів фракцію
активнорухливих сперміїв, що зберігалася при 80С, і довів, що частота
запліднення такими сперміями і кількість хромосомних порушень в
ембріонах не відрізняється від показників, отриманих при використанні
нативних сперміїв.

Практичне значення одержаних результатів. Автором вивчена життєздатність
активнорухливої фракції сперміїв людини на різних етапах біологічного
циклу екстракорпорального запліднення і запропонована методологія їх
гіпотермічного зберігання. Розроблена методологія щодо особливостей
застосування гіпотермічних умов консервації сперміїв, використовується в
програмі екстракорпорального запліднення при лікуванні безплідних
подружніх пар у відділі кріобіології системи репродукції Інституту
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України на базі 5-го
спеціалізованого клінічного пологового будинку м. Харкова.

Автором запропоноване удосконалення методу “спливання”, завдяки якому
значно підвищується ефективність виділення зі сперми фракції швидких
гамет, що розширює можливості застосування методу ЭКО, зокрема при
чоловічому факторі безплідності. Розробки автора можуть бути
рекомендовані для застосування в лікувальних установах, що займаються
діагностикою і лікуванням безплідності, зокрема, — методами допоміжних
репродуктивних технологій.

Теоретичні положення і практичні розробки дисертаційної роботи
впроваджені в навчальний процес кафедр Харківського державного медичного
університету, Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено вивчення та
узагальнення сучасних даних вітчизняної та зарубіжної літератури,
визначено напрямок, мету та задачі дослідження, вивчено вплив
гіпотермічного зберігання активнорухливої фракції сперміїв на їх
кінетичні та біохімічні характеристики, проведена інсемінація незрілих
ооцитів після їх дозрівання та реінсемінація ооцитів сперміями, які
зберігалися в умовах гіпотермії. Дисертант проводила особисто виділення
ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх ступеня зрілості, селекцію
активнорухливої фракції сперміїв з еякуляту, інсемінацію, культивування
ооцитів та ембріонів, лабораторний етап ембріотрансплантації,
статистичний аналіз та узагальнення одержаних даних за матеріалами
роботи. У підборі груп пацієнтів для одержання матеріалу дослідження
брали участь к.м.н. Л.І. Луцька, к.м.н. Г.Г. Геродес. К.б.н. М.Й. Крамар
допомагала аспіранту освоїти методи дослідження сперми людини, к.б.н.
Н.Н. Чуб – методики культивування репродуктивних клітин. К.б.н. М.П.
Петрушко допомагала в проведенні цитогенетичних досліджень ембріонів. У
публікаціях, що видані у співавторстві з зазначеними дослідниками,
дисертанту належить постановка і проведення експериментів, аналіз та
статистична обробка отриманих результатів, підготовка матеріалів до
друку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були
представлені на 1 з’їзді Українського товариства кріобіології і
кріомедицини (Харків, 1995), на симпозіумі з міжнародною участю
«Безплідність. Допоміжні репродуктивні технології» (Київ, 1995, 1997,
1999), Міжнародних наукових форумах “31st Annual Meeting Society for
cryobiology”, (Kyoto, Japan, 1994) та “The Society for cryobiology Cryo
–95” (Madison, Wisconsin, 1995).

Публікації. Головні положення дисертації викладені в 5 статтях у
наукових фахових журналах, у 2 статтях збірників наукових праць і в 4
тезах доповідей на наукових конференціях, із них 3 — на міжнародних.

Структура дисертації. Робота викладена на 134 сторінках і має традиційну
структуру подання: вступ, основна частина, що складається з трьох
розділів (огляд наявної літератури за темою дисертації, матеріали і
методи дослідження, отримані результати та їх обговорення), висновки,
список літературних джерел — 172 найменування (22 сторінки). Дисертація
містить 11 ілюстрацій (11 сторінок) і 4 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна методика й основні методи дослідження.

Підготовку і дослідження сперми проводили відповідно до рекомендацій ВОЗ
(World Health Organization, 1999). У роботі використовували зразки з
нормоспермією та астеноспермією. Виділення фракції сперміїв зі швидким
прогресивним прогресивним рухом (активнорухливі) проводили методом
“спливання”, який у процесі роботи було модифіковано. Збереження фракції
сперміїв з прогресивним рухом (Паепус Е.Н., 1991) визначали контролем
спермограми через 1, 24, 48 і 72 години після виділення з еякуляту
фракції сперміїв з прогресивним рухом з використанням середовища Menezo
В2 і тієї ж фракції, що пройшла умови гіпотермії. Визначення
життєздатності сперміїв проводили методом суправітального фарбування,
який грунтується на здатності дегідрогенази живих сперміїв відновлювати
молекули еозину (World Health Organization, 1999).

Для дослідження умов, необхідних для максимального зберігання
морфо-функціональних властивостей виділеної з еякуляту активнорухливої
фракції сперміїв застосовували різні температурні діапазони, терміни
зберігання, та середовища різного композиційного вмісту. Вивчалася
можливість зберігання сперміїв при фізіологічній температурі (370С) та в
умовах дії гіпотермічних температур: 220С; 80С; 40С. Для зберігання
сперміїв були застосовані середовища Хенкса та Ham F-10 у співвідношенні
9:1 з сироваткою крові людини та середовище Menezo B2, до складу готової
форми якого входить 10 % бичачого альбуміну (Laboratoire C.C.D.,
Франція). Визначення активності ферменту акрозину проводили за методикою
Санкт-Петербурзького Інституту генетики і розведення
сільськогосподарських тварин (Мороз Л.Г., 1980) у модифікації Н.Ю.
Смаглій (Смаглій Н.Ю., 1990). Оцінка активності акросомального екстракту
основана на нефелометричному визначенні кількості казеїну,
нерозщепленого акрозином. Для визначення запліднюючої здатності сперміїв
використовували метод запліднення in vitro ооцитів людини (Эдлер К.,
1990). Фолікулярну рідину з ооцитами аспірирували шляхом
трансвагінальної пункції фолікулів. Після виділення ооцитів візуальну
оцінку їх ступеня зрілості проводили під мікроскопом Olympus SZ – CTV
(Японія) за класифікацією (William B.R.,1984). Отримані ооцити ретельно
відмивали від фолікулярної рідини та клітин крові і переносили в
планшети з лунками («Nunc») із середовищем Menezo B2. Культивування
проводили в СО2 -інкубаторі (“Forma Scientific”, США) при температурі
370С та з 5 % — ним вмістом СО2. Інсемінацію проводили в середовищі
Menezo B2 сперміями виділеної фракції з розрахунку 100 000 на 1
яйцеклітину. Через 20 годин під інвертованим мікроскопом “Leitz”
(Німеччина) проводили контроль запліднення за наявності двох
пронуклеусів. При відсутності запліднення проводили реінсемінацію
ооцитів виділеною фракцією сперміїв, що зберігалася в умовах гіпотермії
з розрахунку 100 000 сперміїв на ооцит. Ембріони людини культивували в
середовищі Menezo В2 в СО2 -інкубаторі при постійних режимах температури
(370С), вологості (90 %) і газового складу (5 % СО2 в атмосфері
інкубатора). Морфологічну оцінку ембріонів проводили під контролем
інвертованого мікроскопа “Leitz” (Німеччина) за шкалою, запропонованою
Erenus (Erenus М., 1991). Ембріони через 48 годин культивування
переносили пацієнтці в порожнину матки. Для приготування цитогенетичних
препаратів використовували метод Тарковського (Tarkowsky A.N.,1966) і
Дибана (Dyban A.,1993). Статистичну обробку експериментальних даних
здійснювали за методом Ст’юдента – Фішера (Меркур’єва Е.К., 1964) на
ПЕВМ IBM РС Pentium MMX із застосуванням пакета програм Excel.

Результати власних досліджень автора

Дослідження почали із вивчення впливу середовищ різного композиційного
вмісту на кількість гамет у виділеній активнорухливій фракції. Були
апробовані середовища на основі розчинів Хенкса та Ham F-10, а також
середовище Menezo B2. Було показано, що найбільша кількість сперміїв у
виділеній активнорухливій фракції містилась при застосуванні середовищ
Menezo B2. і Ham F-10: 13,22(1,1 млн/мл і 12,92(1,6 млн/мл із вмістом
сперміїв із швидким прогресивним рухом 92,87(3,6 % та 93,54(4,1 %
(відповідно). У цей же час загальна кількість сперміїв при виділенні з
застосуванням середовища Хенкса зменшувалась на 9 % порівняно з
показниками, що мали місце при застосуванні інших середовищ (рис.1).
Отримані зразки зберігали при температурі 80С протягом 24 годин.
Доведено, що при апробованих умовах зберігання кількість активнорухливих
сперміїв не змінювалась у середовищах Menezo B2. і Ham F-10, але
зменшувалась у 7,58 разів порівняно з вихідними даними (після виділення)
при зберіганні у середовищі, виготовленому на основі розчину Хенкса.
Незважаючи на те, що загальна кількість отриманих сперміїв і кількість
сперміїв з швидким прогресивним рухом після гіпотермічного зберігання не
змінювалась при застосуванні середовищ Menezo B2 і Ham F-10, у наступних
серіях досліджень застосовували тільки середовище Menezo B2, яке
простіше у практичній роботі (не потребує допоміжних етапів виготовлення
кінцевого розчину) і використовується для культивування ооцитів і
ембріонів у нашій роботі.

Рис. 1 Вплив середовищ різного композиційного вмісту на збереження
активнорухливої фракції сперміїв в умовах гіпотермії (80С) протягом 24
годин

Виходячи із важливості вихідних морфофункціональних характеристик
сперміїв, які застосовуються у програмі ЕКЗ для запліднення ооцитів, у
наступній серії експериментів вивчали вплив гіпотермічних умов
зберігання на динаміку вмісту гамет із швидким прогресивним рухом,
виділених з еякулятів з астеноспермією, які мали різний вміст сперміїв
із швидким прогресивним рухом.

Еякуляти поділяли на три групи. I група (нормоспермія) містила
активнорухливих гамет 20-30 %, II — 10-20 %, III — 0-10 %. Концентрація
гамет у першій групі була найвищою і складала 52,78(2,3 млн/мл із
вмістом 28,1 % активнорухливої фракції (14,83(1,9 млн/мл), у другій
групі — 46,71(2,9 млн/мл і кількість активнорухливих сперміїв складала
17,4 % (8,13(1,2 млн/мл). Концентрація активнорухливих гамет у III групі
була 41,11(2,1 млн/мл, гамет із швидким прогресивним рухом 7,6 %
(3,12(0,4 млн/мл). Після виділення активнорухливої фракції
сперматозоїдів із еякуляту концентрація гамет у I-II-III групах,
відповідно, складала: 25,62(1,9;15,47(1,7; 6,17(0,9 млн/мл. Із цього
видно, що у II групі містилось сперматозоїдів з швидким прогресивним
рухом у 1,66 рази менше, ніж I, а III – у 4,15 рази менше, ніж у I.
Тобто, різниця між I і III групами складала 76 %.

Зразки кожної групи сперми переносили у гіпотермічні умови зберігання
(80С) у середовищі Menezo B2 і досліджували динаміку вмісту гамет із
швидким прогресивним рухом протягом 24-48-72 годин (рис. 2).

Рис. 2 Вплив гіпотермічних умов зберігання на активнорухливу фракцію
сперміїв еякулятів різних вихідних властивостей

Було показано, що при апробованих умовах зберігання у першій групі
зразків досліджуваний параметр через 24 години не змінювався, а через 48
годин становив 59,6 % від контрольного чи показників, отриманих через 24
години. Пролонгування термінів гіпотермічного зберігання до 72 годин
призводило до зменшення вмісту гамет із швидким прогресивним рухом
порівняно із показниками, отриманими у контрольній точці “48 годин” у
2,5 рази. Це складало всього 23 % від показників контролю і 40 % — від
отриманих через 48 годин зберігання. Треба зазначити, що після 24 годин
гіпотермічного зберігання зниження вмісту гамет через кожну добу
складало в середньому 40 %.

У другій групі зразків зниження вмісту гамет у динаміці спостережень
було дещо більшим і складало у середньому 46 % у кожну наступну добу
після 24 годин зберігання, що на 6 % більше, ніж у I групі. Основні
зміни досліджуваного параметру відбувались у проміжку часу від 24 до 48
годин зберігання зразків, і більш виражені вони були у 1 групі
(нормоспермія), де вихідні показники були значно кращі (25,62(1,9
млн/мл).

Зразки третьої групи мали, як вище зазначалося, найнижчі вихідні
досліджувані показники. Разом з тим, динаміка їх змін у першу добу
гіпотермічного зберігання не відрізнялась від отриманої для перших двох
груп, після чого відбувалось різке зменшення (у 4,5 разів) вмісту гамет
із швидким рухом: їх вміст складав усього 18 % від контрольного.
Збільшення термінів гіпотермічного зберігання призводило до того, що у
зразках спостерігались лише поодинокі гамети із швидким рухом.

Таким чином, виходячи із отриманих даних, при гіпотермічних умовах
зберігання активнорухливої фракції сперміїв треба надавати значення
вихідним показникам. Здатність апробованих умов до збереження
досліджених параметрів була найбільш виражена у II групі зразків. Разом
з тим необхідно акцентувати, що через 48 годин гіпотермічного зберігання
вміст швидких гамет у зразках усіх груп був достатній для інсемінації
ооцитів у програмі ЕКЗ. Через 72 години зберігання у програмі ЕКЗ могли
бути застосовані тільки зразки I і II груп.

Відомо, що одним із етапів програми ЕКЗ є культивування у СО2-
інкубаторі. Саме тому важливо прослідити особливості динаміки рухової
активності та життєздатності сперміїв, що продовжують участь у
підготовці до запліднення. Було відібрано 79 еякулятів, що мали
концентрацію сперміїв 46,4(3,9 млн/мл. Ці зразки містили 12,8(1,2 %
активних і 31,7(1,9 % — повільно рухомих клітин. Життєздатні клітини
оцінювали згідно з забарвленням еозином. Зразки еякулятів містили
79,1(3,2 % живих гамет. Виділена рухлива фракція містила 93,5(2,1 %
активнорухливих клітин, з них життєздатними — 97,7(1,6 %.

Вивчення динаміки життєздатності та рухливості клітин показало, що
24-годинне зберігання зразків в умовах культивування не впливало на їх
життєздатність і на кількість клітин, що зберегли рухливість. Ці
показники не відрізнялись у групах після гіпотермічного 24-годинного
зберігання і тих, що виділили із отриманих 79 еякулятів. При
культивуванні в СО2- інкубаторі зменшення вимірюваних показників
відбувалося у часовому інтервалі між 24 і 48 годинами культивування
зразків (рис.3). Як видно, життєздатність клітин зменшалася через 48
годин на 25 %, а кількість активнорухливих клітин із прогресивним рухом
– на 86 %.

Продовження терміну культивування зразків призводило до втрати
життєздатності 2/3 частини клітин, а кількість сперміїв із прогресивним
рухом у порівнянні з показниками “48 годин” була на 82 % нижчою і в
порівнянні з контролем складала 2,6 %.

Рис. 3 Кінетична активність і життєздатність активнорухливої фракції
сперміїв, що перебувала в умовах гіпотермії (80С) протягом однієї доби,
при культивуванні в середовищі Menezo B2 різний термін часу

Таким чином, апробовані умови досліджених етапів дозволяли продовжувати
участь у програмі тільки тим зразкам клітин, які зберігались після
гіпотермічної консервації в умовах культивування не більше 48 годин.

$

&

6

:

L

V

B ?

¦

$

&

???????????&

(

*

,

.

0

2

4

6

8

:

V

?

¦

e

FВідомо, що одним із адекватних інформативних показників запліднюючої
здатності сперміїв є показники активності акрозину. Його вихід з
акросомальної мембрани сприяє проникненню спермія через блискучу
оболонку яйцеклітини. Саме тому важливо вивчити особливості динаміки
активності ферменту на етапах програми ЕКЗ і визначити ті, які
призводять до його зміни і співвіднести ці зміни із змінами у рухливій
активності.

Дослідження впливу температурного фактора на збереження активності
ферменту показало, що при температурі 40С через 24 години лише 17,3(1,2
% сперміїв зберігали активну рухливість. При цьому активність акрозину
складала 0,20(0,018 ум.од (рис. 4). Зберігання зразків при кімнатній
температурі (220С) протягом 24 годин призводило до зменшення
активнорухливої фракції сперміїв у порівнянні з вихідними у 2,38 разів,
а активності акрозину – у 2,9 разів. Разом з тим, активність ферменту в
останньому випадку була у 3 рази вищою, ніж при температурі зберігання
40С.

Показники вмісту гамет у рухливій фракції через 24 години зберігання при
температурі 80С не відрізнялись від вихідних, але активність акрозину в
них була на 18 % нижчою. Ці зразки продовжували зберігати і через 48
годин від початку спостереження мали 57,9(2,9 % гамет у рухливій
фракції, що на 38 — 40 % нижче, ніж у термін “24 години” або у
порівнянні з вихідними значеннями. Активність акрозину при пролонгуванні
апробованих умов гіпотермічного зберігання до 48 годин зменшувалась на
12 % у порівнянні з отриманими у точці “24години” і на 27 % — у
порівнянні з вихідними.

Рис.4 Активність акрозину в сперміях виділеної активнорухливої фракції
еякуляту при різних температурах зберігання протягом 24 годин

У зразках, що зберігались при фізіологічній температурі (370С) протягом
24 годин, було всього 0.07(0,008 % рухливих сперміїв. Активність
акрозину у цих умовах зберігання була найменшою з отриманої у інших
зразках при будь-яких температурних умовах зберігання і складала всього
0,032(0,0015 ум.од., що у 54,4 рази нижче, ніж у контролі.

Таким чином, аналіз експериментальних даних свідчить, що температурний
фактор є значимим при підготовці сперміїв для програми ЕКЗ. Для участі у
програмі можуть бути застосовані тільки ті зразки, які зберігалися при
температурі 80С не довше 24 годин. Разом з тим, треба відзначити, що
показники динаміки активності ферменту за різних умов температурного
зберігання дозволяють дати рекомендації не застосовувати для цього інші
температури, окрім 80С, і у будь-якому випадку за апробованих умов не
пролонгувати термін зберігання сперміїв понад 24 годин. Показники
активності ферменту акрозину при цьому є більш чутливим тестом
визначення життєздатності сперміїв, ніж показники їх рухливості.

Наступним етапом досліджень було вивчення запліднюючої здатності
сперміїв після визначених оптимальних умов гіпотермічного зберігання.

Були застосовані спермії, отримані у чоловіків 51 подружньої пари, що
проходили лікування за програмою ЕКЗ. Спермії мали такі показники:
концентрація гамет — 41,1(4,5 млн/мл, активнорухливих в ній було
16,6(1,9 %. У виділеній фракції швидких гамет було 94,6(3,55 %. Після
застосування найбільш оптимальних умов гіпотермічного зберігання (24
години зберігання при 80С у середовищі Menezo B2), проаналізованих вище,
активнорухливих клітин залишалось 91,8(3,4 %.

Спермії використовували для запліднення 261 ооцитів, отриманих у 51
жінки, що лікувались із застосуванням програми ЕКЗ. Ооцити поділяли на 4
групи. У 1 групі було 97 зрілих яйцеклітин, які запліднювали
активнорухливою фракцією нативних сперміїв (контроль). Другу групу
складали зрілі ооцити, які запліднювали сперміями, що зберігались при
встановлених у дослідженні оптимальних умовах зберігання. Група 3 була
представлена 35 яйцеклітинами, які у день аспірації були класифіковані
як клітини III ступеня зрілості. У 4 групі було 38 ооцитів, які
класифікували як яйцеклітини II ступеня зрілості. Ооцити 3 і 4 груп
після дозрівання інсемінували сперміями, що зберігались при
гіпотермічних умовах (80С) протягом 24 годин.

У першій серії досліджень порівнювали запліднюючу активність нативних
сперміїв і тих, що зберігались в гіпотермічних умовах, по відношенню до
ооцитів 1 і 2 груп (рис.5). У першій групі два пронуклеуси спостерігали
у 66 зиготах (68 %), а у другій – у 73,6 %. Різниця складала 6 %, що
свідчить про можливість застосування для запліднення сперміїв, які
пройшли етап 24-х годинного гіпотермічного зберігання у
біотехнологічному циклі програми ЕКЗ.

Друга серія досліджень включала проведення інсемінації ооцитів II і III
ступеня зрілості після їх дозрівання протягом 20 годин. 73 незрілі
яйцеклітини, отримані в день аспірації, культивували в умовах
інкубатора протягом 20 годин окремо від зрілих клітин. При наявності
першого полярного тільця (показник дозрівання) проводили інсемінацію
сперміями, що брали участь у етапі гіпотермічного зберігання. Здатність
сперміїв до запліднення ооцитів II і III ступеню була різна і складала
відповідно, 57,1 % та 45,0 %.

Тринадцять ембріонів різних стадій розвитку, отриманих після запліднення
дозрілих in vitro ооцитів сперміями, що зберігались в умовах гіпотермії,
були використані для ембріопереносу п’ятьом жінкам. Про вагітність
повідомила одна пацієнтка (20 % у перерахуванні на ембріоперенос).

Рис. 5 Показники запліднення ооцитів різного ступеня зрілості нативними
сперміями (1) і сперміями, що зберігалися в гіпотермічних (80С) умовах
(2,3,4).

Логічним продовженням проведених досліджень було вивчення можливості
застосування активнорухливої фракції сперміїв, які зберігались в
апробованих умовах гіпотермічного зберігання, для реінсемінації ооцитів,
що не запліднилися. Із 352 ооцитів, отриманих у 30 жінок, через 18-20
годин після первинної інсемінації заплідненими були 72,2 % клітин.
Ооцити, які не запліднилися, включали у повторне запліднення із
застосуванням інсемінації сперміями, що зберігались в гіпотермічних
умовах протягом 24 годин. Наявність ознак запліднення досліджувалась
через 20-24 години і результати порівнювали з отриманими після первинної
інсемінації. До першої групи було віднесено ооцити, які запліднювались
через 18 годин після інсемінації, а до другої – ті, яким було проведено
реінсемінацію. З 254 зигот першої групи подальший розвиток у культурі
продовжили 98,4 % ембріонів. З 98 ооцитів другої групи наявність двох
пронуклеусів спостерігали у 23,5 % клітин. Через 24 години на стадії 2-6
бластомерів знаходилося 20 ембріонів (табл.1), 86,9 % від загальної
кількості запліднених клітин.

Таблиця 1

Результати реінсемінації ооцитів сперміями, що зберігалися в умовах
гіпотермічних температур (80С) протягом 24 годин

Кількість інсемінованих ооцитів Кількість зигот Кількість ембріонів

група 1 352 254 (72,2 %) 250 (98,4 %)

група 2 98 23 (23,5 %) 20 (86,9 %)

група 1 — ооцити, що запліднилися через 18 годин після інсемінації

група 2 – ооцити, реінсеміновані сперміями, що зберігалися в умовах
гіпотермії

Проведене каріотипування десяти ембріонів (на стадії двох бластомерів),
отриманих після інсемінації ооцитів спермою, що зберігалась в умовах
гіпотермії, показало, що 9 ембріонів мали нормальний каріотип (6-46 ХУ,
3-46 ХХ). Один ембріон було охарактеризовано як мозаїчний – 45Х;-С, 47
ХХ. Таким чином, частота хромосомних порушень в ембріонах, отриманих
після інсемінації спермою, яка зберігалась в умовах гіпотермії, складала
10 %, що не перевищує аналогічний показник при використанні з цією метою
нативної сперми.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне, експериментальне
узагальнення та нові рішення наукової проблеми, що стосується вивчення
властивостей активнорухливої фракції сперміїв в різних умовах
гіпотермічного зберігання та її застосування для інсемінації ооцитів
після дозрівання і реінсемінації незапліднених ооцитів людини.

Спермії, що були виділені із еякулятів з астеноспермією з застосуванням
середовища Menezo B2 або середовища на основі Ham F-10, мали вихідні
морфологічні і функціональні показники на 22 % вищі, ніж при
застосуванні середовища на основі розчину Хенкса; після гіпотермічних
умов зберігання протягом 24 годин композиційний вміст середовищ Menezo
B2 і Ham F-10 не впливав на показники збереження кінетичної активності
сперміїв, в той час як у середовищі на основі розчину Хенкса цей
показник був у 7,6 разів нижчим.

Концентрація гамет зі швидким прогресивним рухом після гіпотермічних
умов зберігання (80С) залежала від такого показника у вихідних еякулятах
з астеноспермією. У групах з нормо- (I) та помірною астеноспермією (II)
після 24 годин зберігання концентрація сперміїв залишалася нарівні з
контролем, після чого кількість гамет зі швидким прогресивним рухом
зменшувалася, відповідно, на 41 % і 50 %. Через 72 години
активнорухливих гамет у зразках I групи було на 7 % більше, ніж в
зразках II групи. Концентрація гамет зі швидким прогресивним рухом у
групі зі значною астеноспермією (III) через 48 годин складала тільки
16,5 % від вихідних.

Активність акрозину у досліджених зразках сперміїв залежала від
температурних умов її зберігання (370С;220С; 40С; 80С); тільки при
температурі 80С через 24 години активність ферменту не відрізнялась від
вихідних показників; визначення активності акрозину є більш чутливим
показником функціонального стану сперміїв в умовах дії температурних
факторів, ніж їх кінетична активність.

Розроблена і апробована методологія застосування сперміїв, що
зберігались в гіпотермічних умовах, для запліднення незрілих ооцитів;
поетапна інсемінація ооцитів, що знаходились на дозріванні, дає
можливість збільшити кількість ембріонів для переносу пацієнтці і
підвищити частоту настання вагітності в програмі екстракорпорального
запліднення.

Ефективність програми ЕКЗ можна покращити за рахунок збільшення
кількості запліднених яйцеклітин, застосовуючи реінсемінацію ооцитів, що
не запліднились, сперміями, які зберігались при 80С. При цьому частота
хромосомних порушень в ембріонах, отриманих після реінсемінації ооцитів
такими сперміями, не перевищує аналогічного показника при використанні
нативних гамет.

Розроблена методологія зберігання активнорухливої фракції сперміїв в
умовах гіпотермічних температур може бути використана для короткочасного
зберігання чоловічих гамет у програмах допоміжних репродуктивних
технологій.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Использование спермиев, хранившихся в условиях гипотермии для
реинсеминации неоплодотворенных ооцитов в программе ЭКО // Проблемы
криобиологии. – 1998. — № 3. – С. 48-52 (співав.: Грищенко В.І., Піняєв
В.І., Петрушко М.П., Луцька Л.І., Крамар М.Й., Юрченко Г.Г.; дисертантом
було зроблено літературний пошук щодо реінсемінації ооцитів, проведено
виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, розроблено
методику реінсемінації ооцитів, що не запліднилися, сперміями, які
зберігалися в умовах гіпотермії).

Морфофункциональные характеристики спермиев человека, хранившихся при
низких положительных температурах // Проблемы криобиологии. — 1998. — №
4. – С. 63-64 (співав.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Крамар М.Й., Черепанова
Т.А., Кучков І.М.; дисертантом було проведено виділення активнорухливої
фракції з еякуляту, її зберігання в умовах гіпотермії, дослідження
активності ферменту акрозину в сперміях до і після зберігання,
узагальнення отриманих результатів).

Беременность и роды после переноса деконсервированных эмбрионов //
Проблемы криобиологии. – 2003. — № 3. – С. 99-102 (співавтор.: Петрушко
М.П., Геродес Г.Г.; дисертантом було проведене виділення ооцитів з
фолікулярної рідини, попередня інкубація ооцитів до інсемінації,
виділення активнорухливої фракції сперміїв, інсемінацію, аналіз
отриманих ембріонів).

Повышение результативности программы ЭКО путем поэтапной инсеминации
ооцитов разной степени зрелости спермиями, хранившимися в условиях
гипотермии // Медицина сегодня и завтра. – 2004. — №1.- С. 173-176
(співавтор.: Геродес Г.Г., Луцька Л.І.; дисертантом було проведено
літературний пошук щодо дозрівання ооцитів різного ступеню зрілості,
виділення ооцитів з фолікулярної рідини, оцінку їх якості, проведено
серію експериментів щодо інсемінації незрілих ооцитів сперміями, які
зберігалися в умовах гіпотермії).

Application of sperm stored under hypotermia conditions for
reinsemination of non-fertilized oocytes under extracorporal
fertilization program // Journal of Assisted Reproduction and Genetics.
– 1999. — Vol. 16, № 3. — P. 150 (співав.: Грищенко В.І., Піняєв В.І.,
Петрушко М.П., Луцька Л.І.; дисертантом було зроблено літературний пошук
щодо реінсемінації ооцитів, проведено виділення ооцитів з фолікулярної
рідини, оцінку їх якості, розроблено методику реінсемінації ооцитів, що
не запліднилися, сперміями, які зберігалися в умовах гіпотермії).

Possibilities of using spermatozoa stored under hypothermia conditions
for in vitro fertilization // Comptes rendus de L’Academie Bulgare des
Sciences. – 1994. — Vol. 47, № 10. — P. 109-110 (співав.: Чуб Н.Н.,
Тодоров П.Т., Піняєв В.І.; дисертантом було проведено: зберігання
сперміїв в умовах гіпотермії та запліднення ооцитів).

Изучение пенетрационной и оплодотворяющей способности спермиев человека,
хранившихся в условиях гипотермии // Бесплодие: Вспомогательные
репродуктивные технологии. – К.: Ин-т репродуктивной медицины УАННП. –
1995. – 166 с. (співавтор.: Чуб Н.Н., Піняєв В.І., Луцька Л.І.;
дисертантом було проведене зберігання сперміїв в умовах гіпотермії,
оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і після зберігання,
інсемінацію ооцитів сперміями, що зберігалися в умовах гіпотермії,
узагальнення і аналіз отриманих результатів).

Morfological and functional integrity of human embryo and sperm after
storage // Proc. 31st Annual Meeting Society for cryobiology. — Kyoto
(Japan). – 1994. — P. 103 (співавтор.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Піняєв
В.І., Юрченко Г.Г., Крамар М.Й., Чадаєв В.Е., Луцька Л.І.; дисертантом
було проведене зберігання сперміїв в умовах гіпотермії, оцінка
кінетичної активності сперматозоїдів до і після зберігання, узагальнення
отриманих результатів).

Morphofunctional, суtоgеnеtіс characteristics of gametes, zygotes and
embryos after exposure to hypothermia // Proc. The Society for
cryobiology “Cryo 95”. — Madison (Wisconsin).- 1995. — № 2-52
(співавтор.: Грищенко В.І., Чуб Н.Н., Піняєв В.І., Юрченко Г.Г., Крамар
М.Й., Петрушко М.П.; дисертантом було проведене зберігання сперміїв в
умовах гіпотермії, оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і
після зберігання, узагальнення отриманих результатів).

Способность сперматозоидов, хранившихся при гипотермии, к оплодотворению
in vitro // Труды 1 съезда украинского общества криобиологии и
криомедицины. — Харьков: Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины. — 1995. — С. 275-276 (співавтор.: Чуб Н.Н., Геродес Г.Г.,
Піняєв В.І.; дисертантом було проведене зберігання сперміїв в умовах
гіпотермії, оцінка кінетичної активності сперматозоїдів до і після
зберігання, інсемінація ооцитів сперміями, що зберігалися в умовах
гіпотермії, узагальнення і аналіз отриманих результатів).

АНОТАЦІЯ

Терпяча І.В. Зберігання сперміїв в умовах гіпотермії для використання в
програмі екстракорпорального запліднення ооцитів людини. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, Харків, 2004.

Дисертаційна робота присвячена вивченню дії гіпотермічних умов
зберігання на морфофункціональні характеристики сперміїв людини. Для
вирішення поставлених у роботі задач було досліджено вплив різних
середовищ, температурних умов та термінів зберігання на кінетичну
активність, життєздатність та активність акрозину сперміїв
активнорухливої фракції, виділенних із еякуляту людини, і показано, що
найкраще ці показники зберігаються при температурі 80С у середовищі
Menezo B2 протягом 24 годин. У роботі було доведено, що спермії, які
перебували в умовах гіпотермії, зберігають свою запліднюючу здатність.
Була розроблена й апробована методологія використання цих сперміїв для
запліднення первісно незрілих ооцитів після їх дозрівання та
реінсемінації яйцеклітин, що не запліднилися, при лікуванні безплідності
методом екстракорпорального запліднення.

Ключові слова: безплідність, екстракорпоральне запліднення, гіпотермічні
умови зберігання, спермії, акрозин, ооцити, ембріони.

АННОТАЦИЯ

Терпячая И.В. Хранение спермиев в условиях гипотермии для использования
в программе экстракорпорального оплодотворения ооцитов человека. –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.19 – криобиология. Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, Харьков, 2004.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния низких положительных
температур на фракцию спермиев с быстрым прогрессивным движением,
выделенную из эякулята человека, в частности на ее кинетические
характеристики, жизнеспособность, сохранность в спермиях фермента
акрозина и на их оплодотворяющую способность. При выборе температуры и
среды хранения наиболее высокую сохранность кинетической активности и
жизнеспособности гамет наблюдали после хранения при температуре 80С в
среде Menezo В2. При использовании этой методики спермии сохраняют эти
показатели на исходном уровне в течение 24-х часов. Результаты
экспериментов свидетельствуют о том, что количество быстрых гамет, в
выделенной из эякулята фракции активноподвижных спермиев и прошедшей
гипотермические условия хранения в течение 48 часов, остается
достаточным для обеспечения инсеминации ооцитов в программе
экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Результаты изучения динамики активности фермента акрозина в спермиях до
и после хранения их при разных температурах свидетельствует о том, что
данный показатель достоверно не изменяется после хранения в течение
суток при температуре 80С. Сохранность активности акрозина коррелирует с
сохранностью подвижности спермиев при хранении их в разных температурных
режимах. Результаты определения активности акрозина в спермиях
существенно повышают объективность оценки сохранности акросомы мужских
гамет и позволяют судить об эффективности применяемого режима хранения
(80С, среда Menezo В2).

Для оценки оплодотворяющей способности спермиев была использована
методика экстракорпорального оплодотворения ооцитов. Полученные нами
данные, свидетельствующие о сохранности морфофункциональных свойств
спермиев в гипотермических условиях хранения (80С, среда Menezo В2),
дали основание считать целесообразным применить их для поэтапной
инсеминации ооцитов в программе ЭКО.

Был проведен сравнительный анализ оплодотворяющей способности нативных
спермиев и спермиев, прошедших гипотермические условия хранения в
течение 24 часов, и показано, что они сохраняют свою оплодотворяющую
способность. Эмбрионы, полученные при использовании таких спермиев,
имели лучшие морфологические характеристики по сравнению с эмбрионами,
полученными после инсеминации ооцитов нативными спермиями, что
свидетельствует о селективном действии низких положительных температур
на сперматозоиды. Исходя из этих данных, нами была разработана
методология инсеминации незрелых ооцитов после их дозревания спермиями,
прошедшими гипотермические условия хранения. Применение данной методики
позволяет увеличить количество эмбрионов для трансплантации и тем самым
повысить частоту наступления беременности.

При проведении программы ЭКО до 50 % ооцитов не оплодотворяются. Нами
была разработана методология реинсеминации неоплодотворившихся ооцитов
спермиями, прошедшими гипотермические условия хранения, что позволяет
увеличить частоту оплодотворения ооцитов в программе ЭКО.
Цитогенетические исследования позволили установить, что частота
хромосомных нарушений в эмбрионах, полученных после инсеминации ооцитов
спермиями, прошедшими гипотермические условия хранения, не превышает
аналогичный показатель при использовании нативной спермы.

Таким образом, хранение активноподвижной фракции спермиев, выделенной из
эякулята человека, в гипотермических условиях, обеспечивает сохранность
гамет в функционально активном состоянии в течение суток. Применение
таких спермиев позволяет повысить эффективность программы
экстракорпорального оплодотворения ооцитов человека при лечении
бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий.

Ключевые слова: бесплодие, экстракорпоральное оплодотворение,
гипотермические условия хранения, спермии, акрозин, ооциты, эмбрионы.

SUMMARY

Terpyachaya I.V. Spermatozoa storage under hypothermia conditions for
usage in IVF program of human oocytes.- Manuscript.

Thesis for obtaining the scientific degree of candidate of biological
sciences on the speciality 03.00.19.- cryobiology. Institute for
Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of
Sciences of Ukraine, Kharkov 2004.

The thesis is dedicated to studying the effect of low positive
temperatures on spermatozoa fraction with a fast progressive movement,
isolated from human ejaculater on its morphofunctional characteristics.
In order to solve the tasks set in the work the technique for storage of
actively motile fraction of spermatozoa, isolated from human ejaculate
was elaborated. When selecting temperature and storage medium the
highest integrity of kinetic activity, gamete viability and acrosin
activity was observed under 8°C in the Menezo B2 medium. According to
the investigations results the spermatozoa, stored under hypothermia
conditions within 24 hrs were shown to preserve their fertilising
ability. Proceeding from these data there was elaborated the technique
for insemination of immature oocytes after their maturation and for
reinsemination of non-fertilised oocytes with spermatozoa, stored under
hypothermia has been elaborated. The carried-out investigations testify
to the efficiency of this technique performance, that allows to increase
the frequency of fertilisation and to augment the pregnancy percentage.

Key words: infertility, in vitro fertilization, hypothermia conditions
storage, spermatozoa, acrosin, oocytes, embryos.

PAGE 8

Похожие записи