.

Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3106
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ. В.І. ВЕРНАДСЬКОГО

Антюфєєва Ольга Іванівна

УДК: 615.9 – 073 : 535.379

Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Симферополь – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Центральній науково-дослідній лабораторії

Харківського державного медичного університета

Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор

Зайцева Ольга Василівна, Харківський державний медичний

університет, професор кафедри

медичної і біологічної фізики

та медичної інформатики

Офіційні опоненти: доктор
біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович, Київський національний університет

ім. Тараса Шевченка, завідувач кафедри

біофізики, м. Київ

доктор біологічних наук, професор

Якименко Ігор Леонідович,

Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри фізики

та вищої математики, м. Біла Церква

Провідна установа: Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН
України, м. Харків

Захист відбудеться “ 13 ” червня 2006 року о 1400_ годині
на засіданні

спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 у Таврійському національному

університеті ім. В.І. Вернадського за адресою:

95007, Україна, Крим, м. Сімферополь, пр. Вернадського, 4

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Таврійського національного

університету ім. В.І. Вернадського за адресою:

95007, м. Сімферополь, пр. Вернадського, 4

Автореферат розісланий “ 5 ” _травня 2006 року

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради К 52.051.04 Чуян О.М

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі однією із пріоритетних тем, що
розроблюються в прикладній біофізиці (медична та екологічна біофізика),
є проблема дослідження особливостей і механізмів шкідливої дії на
біооб’єкти нових синтезованих хімічних сполук. У повній мірі це
стосується поліефірів, які широко використовуються для виготовлення
полімерних матеріалів, пластмас, пенопластів, епоксидних смол та ін., що
не виключає їх токсичного впливу на водойми, організми тварин і людей
(Жуков В.І., Зайцева О.В., 1999; Штабський Б.М., 1999). Одним із
головних у системі попереджувальних заходів, спрямованих на виключення
шкідливих наслідків хімізації народного господарства, є визначення
безпечних рівнів впливу хімічних сполук на біооб’єкти на основі їхньої
гігієнічної регламентації та обґрунтування донозологічних критеріїв
ранніх виявів біологічної дії хімічних чинників. (Мудрий І.В., 1995;
Трахтенберг І.М., 2001). Метод дослідження біохемілюмінесценції (БХЛ)
середовищ організму виступає як неспецифічний скринінговий тест, що
дозволяє оцінити компенсаторні можливості організму при впливі
токсикантів, зокрема, хімічного походження, контролювати стан
фізіологічних та метаболічних процесів, виявити показники передхвороби.
(Журавлев О.І., 1973; Владимиров Ю.А., Азізова О.А., 1991; Воєйков В.Л.,
1998). Вивчення методом БХЛ функціонального стану системи
вільнорадикального окислення належить до методів визначення
інтегрально-кількісних оцінок токсичної дії на організм людини чинників
виробничого середовища та довкілля (Стежка В.А., 1999; Фархутдинов
У.Р., 1995; Шакиров Д.Ф., 1999).

У доступній науковій літературі не показані місце та роль біофізичних
методів у переліку токсикологічних досліджень хімічних речовин, відсутня
система критеріїв для оцінки методів у визначенні біологічних ефектів
ксенобіотиків. Немає відомостей про застосування біофізичних методів,
зокрема БХЛ, в токсикологічних дослідженнях, для визначення ступеня
токсифікації, кумуляції ксенобіотиків, алергійної і шкіряно-резорбтивної
дії (ШРД) хімічних речовин. Недостатньо визначена роль біофізичних
методів у виявленні тестових показників структурно-метаболічних порушень
в організмі людини при дії токсичних хімічних чинників, що
використовуються в моніторингу „Навколишнє середовище – здоров’я
населення”.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась на базі Центральної науково-дослідної лабораторії
Харківського державного медичного університету в рамках спільного
науково-технічного співробітництва Науково-дослідного інституту екології
людини і гігієни навколишнього середовища ім. О.М. Сисіна РАМН (Москва,
Російська Федерація) і Харківського державного медичного університету за
програмою: “Нові хімічні матеріали-020”, затвердженої ДКНТ 30.10.85 р.
за № 555, номер держреєстрації – 01890081688, а також за темами
науково-дослідницької роботи ХДМУ “Вивчення загальних закономірностей
патологічних процесів і розробка засобів їх корекції”, номер
держреєстрації – 0103U004546 від 2000 р., “Наукове обґрунтування
біохімічної моделі структурно-метаболічних зрушень в організмі внаслідок
впливу екологічних чинників як прогностичної основи діагностики
донозологічних станів”, номер держреєстрації – 0199U001763 від 2002 р.

Мета і завдання дослідження.

Мета роботи – обґрунтування застосування методу біохемілюмінесценції для
оцінки якісних та кількісних параметрів токсикологічних характеристик
ксенобіотиків при дослідженні їх дії на організм людини та
експериментальних тварин.

Для досягнення цієї мети в роботі вирішувались такі задачі:

Вивчити можливість застосування методу біохемілюмінесценції в оцінці
ступеня важкості токсифікації організмів експериментальних тварин новими
синтезованими ксенобіотиками, а також у виявленні органів, систем і
функцій організму, що найбільш ушкоджуються при їхній дії.

Визначити зв’язок між параметрами динаміки інтенсивності
біохемілюмінесценції сироватки крові експериментальних тварин і ступенем
кумуляції ксенобіотиків.

Обґрунтувати можливість виявлення алергійної та шкіряно-резорбтивної дії
(ШРД) ксенобіотиків методом біохемілюмінесценції при
експрес-експериментальних токсикологічних дослідженнях.

Оцінити стабільність і швидкість гідролітичного окислення водяних
розчинів ксенобіотиків за методом хемілюмінесценції.

Обґрунтувати доцільність застосування біофізичних методів дослідження –
біохемілюмінесценції, фосфоресценції та мікроелектрофорезу ядер клітин
букального епітелію при експрес-аналізі біологічної дії ксенобіотиків на
організм робітників хімічних підприємств з метою удосконалення
моніторингу “Навколишнє середовище – здоров’я населення” і подальшим
виділенням тестових діагностичних показників.

Об’єкт дослідження – біохемілюмінесценція біологічних середовищ, а також
водних розчинів токсичних речовин.

Предмет дослідження – обґрунтування застосування методу БХЛ в оцінці
впливу токсичних хімічних речовин на організм людини і тварин.

Методи дослідження. В оцінці ступеня важкості токсифікації організму
експериментальних тварин, ступеня кумуляції ксенобіотиків, виявленні
органів-мішеней використовувався метод БХЛ сироватки крові та
гомогенатів внутрішніх органів. Алергійну та шкіряно-резорбтивну дію
вивчали, крім методу БХЛ, стандартними алергодіагностичними та
біохімічними методами. Визначення стабільності ксенобіотиків у водяних
розчинах провадили інтерферометричним та біохемілюмінесцентним методами.
При вивченні стану адаптаційних резервів організму під впливом
антропогенних хімічних чинників, зокрема малої інтенсивності,
використовували методи біохемілюмінесценції, фосфоресценції сечі та
мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше визначені ступені
токсичності та кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих
інтенсивності біохемілюмінесценції з обґрунтуванням прогнозу потенційної
небезпеки нових синтезованих хімічних сполук. Розроблена класифікація
рівнів важкості токсифікації тварин та виявлені органи-мішені для
кожного із досліджуваних ксенобіотиків.

Уперше показано, що інтенсивність індукованої та спонтанної
біохемілюмінесценції сироватки крові є більш чутливим тестом в
порівнянні з біохімічними методами при виявленні алергійних і
шкіряно-резорбтивних властивостей ксенобіотиків.

Уперше виявлено кореляційний зв’язок між рівнем інтенсивності
хемілюмінесценції водяних розчинів ксенобіотиків та їх стабільністю.

Набуло подальшого розвитку застосування біофізичних методів в оцінці
донозологічного стану здоров’я робітників хімічних виробництв
досліджуваних ксенобіотиків із метою удосконалення моніторингу
„Навколишнє середовище – здоров’я населення”.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють
уявлення про використання методу біохемілюмінесценції в оцінці впливу та
механізму дії токсичних хімічних речовин на організми експериментальних
тварин та робітників хімічних виробництв. Результати роботи покладені в
основу розробки та обґрунтування державних стандартів нешкідливих рівнів
3 нових ксенобіотиків (макроциклічний ефір – 12 краун-4 ; неонол- АФ
9-12; простий поліефір – Л-402-2-100) у воді водойм господарсько-питного
й культурно-побутового призначення (СанПіН №4630-88; Государственные
нормативы ГН 2.1.5.689-98; Постанова № 21 від 2003 р. СЕС України), що
використовуються в поточному й попереджувальному санітарному нагляді за
станом водяних об’єктів. Методичні прийоми, що розроблені дисертантом,
захищені 2 Деклараційними патентами України на винахід. Теоретичні
положення та практичні рекомендації, які одержані за результатами
досліджень, упроваджені в практику навчання студентів на кафедрах
біохімії, екології та гігієни, біологічної і медичної фізики
Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно виконані
експериментальна частина досліджень, розрахунки та побудова усіх
графіків динаміки інтенсивності біохемілюмінесценції, вперше
запропоновані критерії динамічних кривих БХЛ, зроблені аналіз літератури
і статистична обробка отриманих результатів. Вибір теми, обґрунтування
мети, завдань, програми дослідження, аналіз одержаних результатів і
формулювання висновків проведені за участю наукового керівника. Автор
брав особисту участь у написанні праць за темою дисертації, три роботи
написані особисто автором. Біохімічні дослідження проводились разом з
к.б.н., с.н.с. Центральної науково-дослідної лабораторії Харківського
державного медичного університету Г.О. Логіновою. Дослідження
особливостей біологічної дії ксенобіотиків на організм робітників
хімічних виробництв проводили разом з к.б.н., завідувачем ЦНДЛ ХДМУ М.Г.
Щербанем. Дослідження на людях (забір біологічного матеріалу – сечі,
клітин букального епітелію) проводилися відповідно до Гельсінської
декларації з прав людини від 1975 р. з доповненнями Конвенції Ради
Європи „Про права людини у біомедицині” (1996 р.) і вимог комітету з
біоетики при НАН та АМН України. Експериментальні дослідження на
тваринах виконувалися відповідно до „Міжнародних рекомендацій проведення
біомедичних досліджень із використанням тварин” (1985 р.), національних
„Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (Україна, 2001
р.). Особистий внесок здобувача у всіх експериментах і дослідженнях
становить понад 80 %.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
повідомлені й обговорені на VIII; IX; X; XI, XII й XIII Міжнародній
науково-технічній конференції “Екологія і здоров’я людини” (АР Крим,
2000 – 2005 р.р.); 1-му Євразійському конгресі медичних фізиків,
(Москва, РФ, 2001 р.); IV, V та VI Міжнародній міждисциплінарній
науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (АР
Крим, Ялта, 2003 р.; Алушта, 2004; 2005 р.р.).

Публікації. За результатами досліджень, що ввійшли до дисертації,
опубліковано 24 наукові праці, з них 1 монографія (у співавторстві); 7
статей у фахових журналах та 5 публікацій у збірниках наукових праць,
затверджених ВАК України; 9 тез і матеріалів конференцій; 2 Деклараційні
патенти України на винахід. Без співавторів написано 3 праці.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу;
розділів – огляду літератури, матеріалів й методів дослідження, власних
досліджень, аналізу і обговорення результатів досліджень; висновків,
списку з 290 використаних джерел літератури, з них 58 джерел зарубіжних
авторів. Дисертація викладена на 188 сторінках комп’ютерного тексту,
ілюстрована 59 рисунками та містить 22 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовується актуальність теми дослідження, сформульовані
мета й задачі досліджень, наведені наукова новизна та практична цінність
отриманих результатів. Відзначається особистий внесок здобувача.
Вказується, на яких конференціях апробовані результати досліджень і
кількість опублікованих робіт із теми дисертації.

У першому розділі представлений короткий аналіз сучасних літературних
даних про токсичний вплив ксенобіотиків на функціональний стан системи
вільнорадикального окислення (ВРО) біологічних об’єктів. Розглянуто
застосування БХЛ методів в оцінці функціонального стану системи ВРО
організму експериментальних тварин і людини при патологічних станах.

У другому розділі наведені матеріали та методи досліджень. Як об’єкти
впливу на живий організм були використані синтезовані хімічні речовини:
макроциклічний ефір – 12 краун-4; неонол- АФ 9-12; метилцелозольв (МЦ);
макроциклічні поліефіри – Лд-303, 503, 703; прості поліефіри –
Л-402-2-100, Л-1505, надані НВО “СинтезПАВ”, які знайшли широке
застосування в хімічній промисловості. Експериментальні дослідження
виконані на 1520 тваринах: 1280 білих щурів популяції Вістар з
початковою масою тіла 0,18 – 0,21 кг; 132 білі миші масою 0,021 – 0,023
кг; 108 морських свинок масою 0,35 – 0,38 кг.

Гігієнічні та біохімічні методи досліджень обрані відповідно до
нормативних документів і рекомендацій з використання розрахункових й
експериментальних методів при гігієнічному нормуванні хімічних сполук у
воді водних об’єктів. При оцінці ступеня важкості токсифікації організму
експериментальних тварин досліджуваними ксенобіотиками в дозах ДЛ100,
ДЛ50, 1/2 ДЛ50, а також у виявленні органів, систем і функцій організму,
що найбільш ушкоджуються при їхній дії, застосовували метод БХЛ.
Хемілюмінограми сироватки крові експериментальних тварин реєстрували на
хемілюмінометрі ХЛМ1Ц-01. Для одержання посиленої БХЛ використовували
0,5 мл сироватки крові, 1,5 мл фізіологічного розчину, 50 мкл люміналу,
50 мкл 0,5% розчину Н2О2. Для визначення взаємозв’язку між ступенем
кумуляції ксенобіотиків та параметрами динаміки інтенсивності
біохемілюмінесценції будували динамічні криві інтенсивності БХЛ
сироватки крові тварин, токсифікованих дозами 1/5 і 1/10 ДЛ50.
Дослідження ЩРД ксенобіотиків проводили БХЛ і біохімічними методами. Для
виявлення алергійної дії ксенобіотиків досліджували зв’язок між
інтенсивністю БХЛ сироватки крові експериментальних тварин та
показниками імунологічних тестів: реакції специфічної агломерації
лейкоцитів (РСАЛ), реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ),
реакції специфічного ушкодження базофілів (РСУБ) (Алексєєва О.Г., Дуєва
Л.А., 1978). При дослідженні кореляційного зв’язку між інтенсивністю БХЛ
водяних розчинів ксенобіотиків і їх стабільністю застосовували прямий
інтерферометричний метод за допомогою інтерферометра ІТР-1 та непрямий
метод (Гаршенін Є.Ф., 1968). Натурні дослідження дії ксенобіотиків на
організм робітників хімічних виробництв проводили на об’єднаннях НВО
“СинтезПАВ” (м. Шебекіно, Бєлгородська обл., Російська Федерація), ВО
“Хімпром” (м. Первомайськ, Харківська обл., Україна), всього обстежено
296 робітників. Використовували методи біохемілюмінесценції та
фосфоресценції (за допомогою фосфороскопа ФС-1) сечі робітників
(Жуков В.І., Зайцева О.В., 1999). Для визначення токсичної дії
ксенобіотиків на біологічний вік працівників хімічних виробництв
використовувався цитобіофізичний метод внутрішньоклітинного
мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію людини (Шахбазов
В.Г., 1996).

Статистична обробка результатів проведена за допомогою професійного
пакету статистичного аналізу даних “STATISTICA 6,0 for Windows” з
проведенням процедур кореляційного та регресійного аналізу. Вірогідність
розходжень оцінювали за критерієм Ст’юдента при рівні значущості р 8 суток. Данные
показатели могут быть использованы для прогностической оценки
кумулятивных свойств новых синтезируемых химических веществ при их
гигиеническом нормировании. Показано, что при выявлении аллергенных и
сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков, как при внутрикожном
тестировании, так и в подостром опыте при внутрижелудочном введении,
интенсивность индуцированной и спонтанной БХЛ сыворотки крови является
чувствительным тестом, реагирующим не только на вид ксенобиотика, но и
на дозу и время его воздействия. Подтверждено, что методом БХЛ можно
установить эффект кожно-резорбтивного действия (КРД) исследуемых веществ
в более ранние сроки, чем биохимическими методами по функциональным
сдвигам показателей периферической крови и ферментативных систем, что
позволяет считать этот метод высокочувствительным, надежным, высоко
информативным. Определена отрицательная корреляционная связь между
стабильностью водных растворов ксенобиотиков и уровнем интенсивности их
спонтанной и индуцированной хемилюминесценции (Ri = – 0,998).
Установлено, что степень стабильности имеет логарифмическую зависимость
от величины дозы ДЛ50. Значения интенсивности индуцированной и
спонтанной ХЛ водных растворов ксенобиотиков являются прогностическим
критерием оценки стабильности ксенобиотиков к гидролитическому окислению
и биологической активности химических веществ. Показано, что методы БХЛ,
фосфоресценции, микроэлектрофореза ядер клеток буккального эпителия
адекватно отображают структурно-метаболические нарушения в организме при
воздействии токсических химических факторов на производстве, что
позволяет широко использовать эти методы для диагностики
донозологических состояний в мониторинге “Окружающая среда – здоровье
населения”.

Ключевые слова: биофизические методы, биохемилюминесценция,
ксенобиотики, токсичность, гигиеническая регламентация.

SUMMARY

Antyufeyeva О.I. Application of biochemiluminescent methods for
toxicological researches. Manuscript. Thesis for the scientific degree
of a candidate of biological sciences on specialty 03.00.02 –
biophysics. –Tavrida National V.I. Vernadsky University, Simferopol,
2006.

The dissertation deals with one of the important problems of modern
applied biophysics (medical and ecological biophysics) – the development
of quantitative and qualitative criteria in an estimation of influence
of the new synthesized toxic chemical substances on alive organisms.

At the first time the degree of intoxication of animals under the
influence of lethal, toxic and subtoxic doses of xenobiotics has been
estimated (absolutely mortal, extra heavy, heavy, moderate and light)
according to definite the indices of biochemiluminescent (BChL) dynamics
of experimental animals` blood serum. News is the quantitative criteria
for parameters of dynamic BChL curves, determining a degree of
xenobiotics cumulation, have been estimated in the present work. It has
been revealed that at the indication of allergic and skin-resorbtical
properties of xenobiotics the intensity of induced and spontaneous BChL
of blood serum appears to be an apprehensible test, reacting not only at
the kind of xenobiotics but also at the dose and time of its effect. The
connection between stability of xenobiotic water solutions and ChL level
has been defind. The application of biophysical methods in the
estimation of the state of health of chemical units` staff has been
substantiated: BChL, phosphorescences and microelectrophoresis of buccal
epithelium cell kernels.

Keywords: biophysical methods, biochemiluminescent, xenobiotics,
toxicity hygienical stability.

PAGE 2

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

20-30 р.

31-40 р.

41-50 р.

51-60 р.

Інтенсивність, імп/с

контроль

апаратчики синтезу

апаратники окислення

апаратники гідратації

апаратники перегонки

слюсарі КОП

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

20-30 р.

31-40 р.

41-50 р.

51-60 р.

Інтенсивність, імп/с

контроль

апаратчики синтезу

апаратчики окислення

апаратники гідратації

апаратники перегонки

слюсарі КОП

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

0

20

40

60

80

20-30 років

31-40 років

41-50 років

51-60 років

показник

електронегативності (%)

еталон

контроль

апаратники синтезу

апаратники гідратації

слюсарі КОП

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020