МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

ВОЛЧИК ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 615.03:615.244:615.322

Застосування методів in vitro на етапах доклінічного вивчення лікарських
засобів

14.03.05 – фармакологія

А в т о р е ф е р а т

дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис:

Робота виконана на кафедрі фізіології та фармакології Національного
фармацевтичного університету (м. Харків)

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор МАЛОШТАН Людмила
Миколаївна, Національний фармацевтичний університет, завідуюча кафедрою
фізіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор МАСЛОВА Наталія
Федорівна, ДП “Державний науковий центр лікарських засобів”, (м.
Харків), НАН України, завідуюча лабораторією біохімічної фармакології

доктор біологічних наук, професор ПЕТРЕНКО Олександр Юрійович, Інститут
кріобіології та кріомедицини м. Харков, НАН України, завідуючий відділом
кріобіохімії.

Провідна установа Харківський державний медичний університет, кафедра
фармакології, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “24” лютого 2006 р. о 1200 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному
фармацевтичному університеті за адресою м. Харків 61002, вул.
Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного
фармацевтичного університету м. Харків 61168, вул. Блюхера, 4.

Автореферат розісланий “20” січня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

проф. Дмитрієвський Д. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом відзначається неухильний ріст
захворювань печінки, що потребує від виробників насичення
фармацевтичного ринку не тільки новими гепатопротекторами, але й
проведення більш поглиблених досліджень вже існуючих препаратів
[И.П.Алексеева, 2003]. Це пов’язано з тим, що механізми деяких
препаратів маловивчені і вивчення продовжується навіть після їх
впровадження в практику.

Вивчення властивостей препаратів традиційно проводиться за допомогою
моделей, відтворюваних на тваринах. Використання цих методів вагомо
відображається на собівартості готової лікарської форми. Тому останнім
часом все частіше використовуються методи in vitro на основі культур
клітин, зокрема гепатоцитів [A. Wolf et al, 1997; The Report and
Recommendations of ECVAM Workshop 29, 1999]. Використання таких методів
дозволяє зекономити досить часу та грошей, а крім того це є гуманним
ставленням до тварин з боку етичних норм і є однією з вимог GLP [A. P.
Li et al, 1998; R.L.Fisher et al, 1995; Schramm U. et al, 1999; S.
Coecke et al, 1999]. Тому дослідження в цому напрямі є актуальними.

В останні роки використання культур клітин тварин і людини з чисто
експериментальної процедури перетворилося в технологічний компонент
багатьох біологічних досліджень і виробничих процесів [Hartung T., 2001,
Zucco F., 1997]. Багато недоліків, що мають місце при проведенні
експериментів на тваринах, при цьому зникають. Культури клітин легко
доступні і стабільні, легко відтворюються, їх можна стандартизувати і
поширювати між лабораторіями, а також кріоконсервувати [Hartung Thomas,
D-Konstanz, Gstraunthaler Gerhard et al., 2000; Hartung T.,
Gstraunthaler G., Coecke S. et al., 2001; Clemendson C., Barile F.A.,
Chesne C. et al, 2000; Genschow E., Spielmann H., Scholtz G. et al.,
2002]. Методи з використанням клітин також легше валідувати.

Використання для дослідження нативних клітин або культури гепатоцитів є
підходящою моделлю для дослідження широкого спектра ксенобиотиків і
індукуємою ними токсичності [Яковлев С.В., 2002; J. G. Hengstler, D.
Utesch, P. Steinberg et al, 2000; A. P. Li, P. D. Gorycki, J. G.
Hengstler et al, 1999].

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана за планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного
університету з проблеми МОЗ України „Хімічний синтез, виділення та
аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв’язку
„структура-дія”, створення нових лікарських препаратів”. Номер
держреєстру 0198U007011.

Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи – експериментальне
обгрунтування застосування методів in vitro на етапах доклінічних
досліджень гепатозахистних лікарських засобів. Виходячи з поставленої
мети було необхідним вирішення наступних завдань:

Визначити перспективність застосування методів дослідження лікарських
засобів за допомогою культури клітин на основі гепатоцитів людини.

Визначити LC50 гепатотоксинів СС14, гентаміцину, тетрацикліну та
Д-галактозаміну.

Визначити ЕС50 гепатопротекторів Ліолів, Глутаргін, Силібор та
кардіопротектору Предуктал in vitro.

Вивчити вплив гепатопротекторів на гепатоцити in vitro за умов створення
модельної патології різного походження та дослідити:

виживаність гепатоцитів в культурі під впливом гепатопротекторів та
кардіопротектору на фоні ураження гепатотоксинами;

біохімічні зміни в клітинах під впливом гепатопротекторів та
кардіопротектору на фоні ураження гепатотоксинами;

морфометричні та морфологічні зміни гепатоцитів в культурі під впливом
гепатопротекторів на фоні ураження гепатотоксинами.

Порівняти результати вивчення лікарських засобів Ліолів, Глутаргін,
Силібор, отриманих шляхом in vivo та in vitro на моделі ураження СС14.

Провести порівняння фармакоекономічних витрат, що необхідні для вивчення
токсикологічних властивостей лікарських засобів та вивчення їх
ефективності in vitro та in vivo.

Об’єкт дослідження – фармакологічна активність Ліоліву, Глутаргіну,
Силібору та Предукталу in vitro

Предмет дослідження – застосування культури клітин HepG2 для дослідження
токсикологічних та фармакологічних властивостей лікарських засобів
(гепатопротекторів).

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані
фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, гістологічні, морфологічні
методи дослідження та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене вивчення
гепатопротекторів вітчизняного виробництва за допомогою методів in
vitro. Встановлено, що на різних моделях ураження гепатоцитів в культурі
досліджувані гепатопротектори Ліолів, Глутаргін та Силібор виявили
стимулюючий ефект щодо проліферативної активності клітин в культурі.
Виявлено, що під впливом гепатопротекторів нормалізувалися біохімічні та
морфометричні показники уражених гепатоцитів в культурі. Спостерігалася
позитивна динаміка у морфологічному стані уражених гепатоцитів під
впливом гепатопротекторів на фоні ураження токсинами.

Показано, що зміни функціональних показників гепатоцитів in vivo та in
vitro мали однакову тенденцію, що свідчить про автентичність
застосованого методу на основі культури гепатоцитів. Вперше проведений
порівняльний фармакоекономічний аналіз щодо оцінки ефективності Ліоліву
in vivo та in vitro показав економічну доцільність застосування методу з
використанням культури гепатоцитів.

Новизна роботи підтверджена патентом (19)UA(11)66216(13)A від 15.04.2004
р. на спосіб визначення токсичних або фармакотерапевтичних доз
лікарських речовин.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обгрунтовано
використання методів in vitro на основі клітинних культур на етапі
доклінічних досліджень лікарських речовин і скринінгових досліджень
хімічних сполук.

За матеріалами дисертації опубліковані методичні рекомендації
„Використання тест-системи на основі гепатоцитів у вивченні ефективності
біологічно активних речовин” (Київ, 2005), затверджені МОЗ України.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в навчальний процес на
кафедрі загальної та клінічної фармакології Одеського державного
медичного університету, кафедрі фармакології Тернопільского державного
медичного університету ім І.Я. Горбачевського, кафедрі фармакології з
курсом клінічної фармакології Криммедуніверситету, кафедрі фармакології
та клінічної фармакології Дніпропетровської медичної академії, кафедрі
фармакології Вінницького національного медичного університету ім М.І.
Пирогова, кафедрі фармакології Луганського державного медичного
університету.

Особистий внесок дисертанта в одержання наукових результатів. Разом з
науковим керівником визначені мета, завдання, розроблені методичні
підходи, згідно з якими відібрані моделі та методи для виконання
експериментальної частини дисертаційної роботи. Особисто проведені:
патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження,
фармакоекономічний аналіз, статистична обробка, аналіз та систематизація
отриманих результатів, сформульовані висновки дисертації. В наукових
працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати
власних експериментальних досліджень, прийнята участь в аналізі й
узагальненні отриманих даних, у написанні статей.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені і
обговорені на Міжнародному семінарі „Лабораторные животные – возможные
альтернативы в экспериментальной фармакологии” (м. Харків, 2002);
науково-практичній конференції “Гепатопротекторы в Украине: перспективы
и реалии” (м. Харків, 2003); Всеукраїнській науково-практичній
конференції з міжнародною участю „Лекарства-человеку” (м. Харків, 2004);
науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи використання
вітчизняного препарату Глутаргін в клініці внутрішніх хвороб” (м.
Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт. З
них – 5 статей (у наукових фахових виданнях), 4 тези доповідей, 1
патент, 1 методичні рекомендації.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 161 сторінках,
має 40 рисунків, 32 таблиці і складається з вступу, огляду літератури,
матеріалів і змісту досліджень, 5 розділів власних експериментальних
досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків,
списку літератури. Перелік використаних джерел містить 227 найменувань,
в тому числі 156 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи експериментальних досліджень. Розробку моделей
гострого ураження гепатоцитів в культурі проводили за допомогою внесення
гепатотоксинів в різних концентраціях в культуру клітин HepG2
виробництва лабораторії іммуногенетики МГНЦ РАМН. Для моделювання
патології на культурі гепатоцитів були застосовані традиційно
використовувані токсини in vivo: СС14, тетрациклін, Д-галактозамін
(Доклінічні дослідження лікарських засобів: Метод. рек., 2001). Також
для моделювання патології in vitro використовували гентаміцин, який з
ціллю моделювання патології печінки на тваринах раніше не
використовувався, але є експериментальні та клінічні свідчення про його
гепатотоксичну дію (Хазанов А.И. и др. 2000 г.).

Для визначення LC50 токсинів використовували концентрації в таких
діапазонах: СС14 — (0,41-13,0) нмоль/мл, гентаміцин – (0,00022-0,0053)
ммоль/мл, тетрациклін – (0,0078-0,13) мкмоль/мл та Д-галактозамін –
(0,07-2,24) мкмоль/мл.

Вивчення ЕС50 досліджуваних лікарських засобів проводилося у наступному
диапазоні концентрацій: Ліолів – (80-320) мкг/мл; Глутаргін – (150-600)
мкг/мл; Силібор – (20-80) мкг/мл, Предуктал – (5-20) мкг/мл.

Зміни біохімічного стану гепатоцитів в культурі визначали за
показниками, що є найбільш характерними для патології печінки: АЛТ, АСТ,
ЛФ, ЛДГ, (-ГТП (за допомогою наборів ЗАТ “Диакон-ДС”) та МДА, ДК
(Медицинские лабораторные технологии, 1998).

Крім того, вивчався вплив гепатотоксинів на морфологічний стан клітин в
культурі та на їх морфометричні показники, оцінка яких проводилась за
допомогою комп’ютерної програми “Scion Image”.

Токсини вносили до культури гепатоцитів на 2-у добу після їх
розсіювання, а оцінку виживаності клітин, біохімічних показників та
морфологічних і морфометричних показників проводили на 3-ю добу.

Дослідження лікарських засобів in vivo проводили на статевозрілих
нелінійних щурах-самцях вагою 200-270 г, що утримувались в стандартних
умовах віварію, на базі ЦНДЛ НФаУ. Усього в експерименті було
використано 40 тварин. Експеримент проводився згідно з методичних
рекомендацій під ред. О.В. Стефанова, 2001.

Результати власних досліджень. При дослідженні виживаності гепатоцитів в
культурі під впливом токсинів у різних концентраціях було виявлено, що
СС14 у концентрації

0,0065 мкмоль/мл призвів до загибелі 53,87 % клітин в культурі,
гентаміцин призвів до загибелі 62,44 % клітин в культурі у концентрації
1,1 мкмоль/мл, тетрациклін у концентрації

0,062 мкмоль/мл загубив 52,5 % клітин та Д-галактозамін у концентрації
0,559 мкмоль/мл призвів до загибелі 54,6 %. Таким чином, ці концентрації
відповіли LC50 для використовуваної нами культури клітин.

Найбільш токсичним виявився тетрахлорметан, тому що для того, щоб
викликати загибель приблизно 50 % клітин у культурі він використовувався
в найменшій концентрації в порівнянні з іншими токсинами. Найменш
токсичний виявився гентаміцин, оскільки викликає 50 % загибелі клітин в
найбільшій концентрації в порівнянні з іншими гепатотоксинами.

Дія токсинів у вказаних концентраціях (LC50) сприяє порушенню
біохімічних показників в культурі (рис. 1).

Рис. 1. Ступінь змін біохімічних показників після внесенні СС14 в
культуру гепатоцитів.

Дані рис. 1 свідчать про те, що дія СС14 в концентрації LС50 призводить
до порушення біохімічних показників печінки. При проведенні послідуючих
експериментів з гентаміцином, тетрацикліном і Д-галактозаміном
спостерігався такий саме ефект. Усі досліджувані показники змінилися
наступним чином: активність АЛТ зросла в (1,6 — 2,3) рази, АСТ — у 2,1
рази, (-ГТП – в (1,8 — 2,0) рази, ЛФ – в (2,0 — 2,2) рази, ЛДГ – в (1,8
— 2,0) рази, вміст ДК зріс в (1,9 — 2,2) рази і МДА – в (1,8 — 2,0)
рази.

Вплив гепатотоксинів призвів також до морфологічних і морфометричних
змін у клітинах, характерних для грубих морфо-патологічних порушень у
гепатоцитах. Під їх впливом відбулися зміни форми і цілісності клітин, у
ядрах спостерігалися коагуляція хроматину, пікноз, лізис ядра.
Морфометрично спостерігається збільшення площі та переметру клітин, а
також ядерно-цитоплазматичних відносин (відносини площі та периметра
ядра до площі і периметра цитоплазми відповідно). Ядерно-цитоплазматичні
відношення за площею збільшилися на (63,16 – 115,79) %, за периметром –
на (32,5 – 65,0) %.

Ці дані, також як і біохімічні показники, є підтвердженням того факту,
що оцінка токсичності тієї або іншої речовини по виживанню гепатоцитів у
культурі є інформативним і достовірним показником.

Проведений експеримент дозволив визначити LС50 СС14, гентаміцину,
тетрацикліну та Д-галактозаміну для подальшого моделювання патології
гепатоцитів в культурі. Вивчення змін біохімічних та морфометричних
показників та морфологічного стану гепатоцитів в культурі показали, що
мають місце грубі порушення, що характерні для патології печінки in
vivo. Внесення токсинів в концентрації LС50 призвело до зміни
біохімічних та морфометричних показників майже вдвічі.

Визначення ЕС50 лікарських засобів проводилося на моделі ураженя СС14
гепатоцитів в культурі. Токсин використовувався у концентрації LC50.
Експеримент займав 4 доби, оскільки гепатопротектори вносилися до
культури клітин на 3-ю добу експерименту.

Рис. 2. Залежність виживаності гепатоцитів у культурі від концентрації
Ліоліву (L) в культуральному середовищі на моделі ураження CCl4.

Примітки: * — достовірна відмінність від групи інтактного контролю; ** —
достовірна відмінність від групи негативного контролю.

Рис. 3. Залежність виживаності гепатоцитів у культурі від концентрації
Глутаргіну (Glu) в культуральному середовищі на моделі ураження CCl4.

Примітки: * — достовірна відмінність від групи інтактного контролю; ** —
достовірна відмінність від групи негативного контролю.

Рис. 4. Залежність виживаності гепатоцитів у культурі від концентрації
Силібору (Sb) в культуральному середовищі на моделі ураження CCl4.

Примітки: * — достовірна відмінність від групи інтактного контролю; ** —
достовірна відмінність від групи негативного контролю.

Рис. 5. Залежність виживаності гепатоцитів у культурі від концентрації
Предукталу (Pr) в культуральному середовищі на моделі ураження CCl4.

Примітки: * — достовірна відмінність від групи інтактного контролю; ** —
достовірна відмінність від групи негативного контролю.

Як видно з вищенаведених рисунків 2-5 Ліолів виявив найбільш високу
протекторну дію у концентрації 160 мкг/мл культурального середовища,
Глутаргін – у концентрації 300 мкг/мл, Силібор – 40 мкг/мл та Предуктал
– 10 мкг/мл. Таким чином, ці концентрації є ЕС50 для випробовуваних
лікарських засобів та були використані у подальшіх експериментах на
культурі клітин. Предуктал був залучний до експерименту з метою
визначення специфічності дії випробовуваних гепатопротекторів на моделі
ураження культури клітин.

В експерименті по вивченню ефективності Ліоліву, Глутаргіну, Силібору та
Предукталу in vitro досліджувався їх вплив на виживаність гепатоцитів в
культурі, зміни їх біохімічного стану та вплив гепатопротекторів на
морфологічні і морфометричні зміни на фоні ураження 4-ма токсинами.

Для цього проводили моделювання ураження культури гепатоцитів СС14,
гентаміцином, тетрацикліном та Д-галактозаміном у концентраціях LC50.

В таблиці 1 наведені дані, щодо виживаності клітин в кульутурі після
внесення гепатопротекторів в концентраціях ЕС50 на фоні ураження клітин
токсинами у концентраціях LC50.

Як видно з таблиці 1 при внесенні токсинів в культуру гепатоцитів
виживаність клітин впала на (49,75-53,22) %. При внесенні Ліоліву в
культуру клітин на фоні ураження токсинами виживаність гепатоцитів
зросла у порівнянні з групою негативного контролю на (31,33 – 36,97) %,
при внесенні Глутаргіну — на (40,54 – 51,76) %, при внесенні Силібору —
на (39,08 – 52,7) %, при внесенні Предукталу – на (22,2 – 27,1) %.

Таблиця 1.

Оцінка виживаності клітин в культурі при різних моделях їхнього
ураження.

Виживаність клітин, % Поглинання при

550 нм (М(m) Ріст виживаності клітин в культурі у порівнянні з
контрольною групою, (%)

CCl4 46,78 0,250 ( 0,0139 ** —

CCl4+L160 82,69 0,442 ( 0,0158 *,** 35,91

CCl4+Glu300 89,88 0,481 ( 0,0172 * 43,10

CCl4+Sb40 85,86 0,459 ( 0,0266 *,** 39,08

CCl4+Pr10 76,60 0,766 ( 0,003 *,** 29,82

Gt 48,88 0,262 ( 0,0135 ** —

Gt+L160 80,72 0,432 ( 0,0191 *,** 31,84

Gt+Glu300 91,22 0,488 ( 0,0209 * 42,34

Gt+Sb40 89,51 0,479 ( 0,0281 * 40,62

Gt+Pr10 75,20 0,752 ( 0,004 *,** 26,32

Т 41,36 0,370 ( 0,013 ** —

Т+L160 80,02 0,709 ( 0,025 **,* 38,66

Т+Glu300 93,12 0,825 ( 0,013 * 51,84

Т+Sb40 94,06 0,833 ( 0,022 * 52,70

Т+Pr10 72,70 0,727 ( 0,027 *,** 31,34

D-gl 50,25 0,502 ( 0,002 ** —

D-gl+L160 81,58 0,815 ( 0,004 *,** 31,33

D-gl+Glu300 90,79 0,907 ( 0,003 *,** 40,54

D-gl+Sb40 90,29 0,902 ( 0,001 *,** 40,04

D-gl+Pr10 74,50 0,745 ( 0,003 *,** 24,25

Примітки: Gt – гентаміцин, Т – тетрациклін, D-gl – Д-галактозамін, L –
Ліолів, Glu – Глутаргін, Sb – Силібор, Pr – Предуктал.

* — вірогідна відмінність від контрольної групи;

** — вірогідна відмінність від інтактної групи.

Таким чином, вплив лікарських засобів на ураженні гепатоцити призвів до
підвищення виживаність цих клітин в культурі, що свідчить про
ефективність відтворюваних моделей in vitro. Але вплив гепатопротекторів
виявився ефективнішим у порівнянні з кардіопротектором, що свідчить про
специфічність дії гепатопротекторів відносно даної культури клітин,
тобто гепатоцитів.

При вивчені біохімічного стану клітин після дії гепатопротекторів на
фоні ураження токсинами в культурі гепатоцитів у порівнянні з групою
негативного контролю також спостерігалася нормалізація досліджуваних
показників.

Вплив гепатотоксинів призвів до таких змін біохімічних показників:
активність АЛТ зросла у 1,32-2,1 рази, АСТ – у 1,9-2,11 рази, (-ГТП – у
1,8-2,2 рази, ЛФ – у 2,0-2,15 рази, ЛДГ – у 1,8-2,2 рази, ДК – у 2,2-2,4
рази, МДА – у 1,8-1,9 рази.

Проведені експерименти показали, що, незалежно від моделі ураження
культури гепатоцитів, використовувані препарати виявляють протекторний
ефект. Цей ефект виражається в нормалізації перелічених біохімічних
показників. Під впливом Ліоліву на моделі ураження СС14 означені
показники знизилися у порівнянні з групою негативного контролю:
активність АЛТ знизилася у 1,32 рази, АСТ – у 2,1 рази, (-ГТП – у 1,8
рази, ЛФ – у 1,9 рази, ЛДГ – у 2,0 рази, ДК – у 1,7 рази, МДА – у 1,6
рази. Під впливом Глутаргіну зниження цих показників сталося таким
чином: АЛТ – 1,4 рази, АСТ – у 2,1 рази, (-ГТП – у 1,9 рази, ЛФ – у 2,0
рази, ЛДГ – у 2,0 рази, ДК – у 2,6 рази, МДА – у 1,7 рази. Силібор
призвів до зниження досліджуваних показників таким чином: АЛТ – у 1,4
рази, АСТ – у 2,1 рази, (-ГТП – у 1,8 рази, ЛФ – у 2,0 рази, ЛДГ – у 1,9
рази, ДК – у 2,3 рази, МДА – у 1,6 рази. Дія Предукталу також знизила
значення біохімічних показників: АЛТ – 1,2 рази, АСТ – у 1,8 рази, (-ГТП
– у 1,7 рази, ЛФ – у 1,6 рази, ЛДГ – у 1,9 рази, ДК – у 1,7 рази, МДА –
у 1,7 рази.

Вплив лікарських засобів на фоні дії гентаміцину, тетрацикліну та
Д-галактозаміну призвів до таких саме знижень активності АЛТ, АСТ,
(-ГТП, ЛФ, ЛДГ та вмісту ДК і МДА.

Таким чином, виявлені зміни біохімічних показників свідчать про те, що
використовувані гепатопротектори виявляють більший у порівнянні з
кардіопротектором стабілізуючий ефект in vitro. Результати, отримані для
гепатопротекторів узгоджуються з відомими результатами експериментів in
vivo [Бабак О.Я., Фролов В.М., Харченко Н.В., 2005].

2

o

oe

F

H

L

N

0

2

T

&

F

&

F

&

” ”

•kd

&

культуру). Але у всіх випадках спостерігалася ізоморфність клітин,
наявність чітких клітинних границь, амфофільність цитоплазми, нормальний
стан і розташування ядерця в ядрі. Лише частина клітин була
гіпертрофована, зруйнована та характеризувалася зернистістю цитоплазми і
зміненим станом ядра. Особливої різниці між дією гепатопротекторів на
фоні ураження токсинами не спостерігалося.

Рис. 6. Зміни морфометричних показників гепатоцитів в культурі під
впливом гепатопротекторів на фоні ураження CCl4.

Примітки: L – Ліолів; Glu – Глутаргін; Sb – Силібор.

* — вірогідна відмінність від групи інтактного контроля;

** — вірогідна відмінність від групи з токсином.

На рис. 6. показани зміни ядерно-цитоплазматичних відносин гепатоцитів
при введенні гепатопротекторів у культурі на фоні введення СС14. Такі ж
саме зміни спостерігалися й при моделюванні патології в культурі із
застосуванням гентаміцину, тетрацикліну та Д-галактозаміну.
Ядерно-цитоплазматичні відношення за площею збільшилися в 1,63 – 2,21
рази, за периметром – в 1,3 – 1,55 рази. Подібні зміни морфометричних
показників ще раз свідчать про наявність грубих патологічних порушень у
структурі гепатоцитів.

Після внесення в культуру гепатоцитів, уражену різними токсинами,
гепатопротекторів морфометричні показники вірогідно знизилися у
порівнянні з групою негативного контролю. Під впливом
ядерно-цитоплазматичні відношення за площею знизилися у 1,8-2,4 рази; за
відношенням по периметру – у 1,2-1,4 рази. При внесенні Глутаргіну
ядерно-цитоплазматичні відношення знизилися таким чином: за відношенням
по площі – у 1,6-2,2 рази; за відношенням по периметру – у 1,2-1,4 рази.
Силібор призвів до зниження ядерно-цитоплазматичних відношень за площею
– у 1,7-2,4 рази; за периметром – у 1,1-1,4 рази.

Отримані результати є ще одним доказом ефективності препаратів Ліолів,
Глутаргін і Силібор. Завдяки їх дії значення морфометричних показників,
що зросли під впливом гепатотоксинів, знизилися, а деякі не відрізнялися
від значень у групі інтактного контроля.

Таким чином, біохімічні та морфологічні зміни показують, що незалежно
від виду патології на культурі клітин спостерігалася одна і та ж
тенденція, що свідчить про позитивний вплив лікарських засобів з
гепатопротекторною активністю.

З метою визначення змін, що відбулися у культурі клітин, було б доцільно
провести аналогічні випробування in vivo. Для цього був використаний
СС14 для відтворення модельної патології.

Введення CC14 викликає в щурів важке отруєння, що призводить до загибелі
25 % тварин. У тварин, що вижили, не відзначені статистично значимого
зниження маси тіла порівняно з вихідним рівнем (табл. 2). Масовий
коефіцієнт печінки збільшився і перевищував на 54 % показник інтактних
тварин (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив Глутаргіна, Силібора і Ліоліва на показники виживаності, маси тіла
і масовий коефіцієнт печінки (МКП) щурів в умовах підгострого CCl4 —
гепатиту (М ( m)

Експериментальні групи, Виживаність, % Маса тіла, г МКП, %

Вихідна Через 7 днів

Інтактний контроль 100 242,5 ( 4,33 246,3 ( 3,87 2,58 ( 0,03

Негативний контроль 75 249,4 ( 6,01 247,5 ( 6,42 3,68 ( 0,22*

Глутаргін, 100 мг/кг 100 238,1 ( 5,74 244,4 ( 5,21 2,84 ( 0,08**

Силібор, 80 мг/кг 100 246,3 ( 5,32 251,3 ( 4,09 2,90 ( 0,12**

Ліолів, 40 мг/кг 100 240,0 ( 5,98 245,6 ( 5,04 2,86 ( 0,09**

Примітка: * — розходження статистично вірогідні у порівнянні з інтактним
контролем;

** — розходження статистично вірогідні у порівнянні з негативним
контролем; МКП – масовий коефіцієнт печінки.

Введення СС14 у культуру гепатоцитів HepG2 призвело до загибелі 53,22 %
клітин у культурі (табл. 1) та до інтенсифікації процесів цитолізу і
ПОЛ.

Підгострий вплив CC14 викликав порушення біохімічних показників у
гомогенатах печінки, що виявлялося в підвищенні рівня сироваткових
ферментів, активації процесів ПОЛ (табл. 3).

Таблиця 3.

Зміна біохімічних показників під впливом Ліоліва, Глутаргіна і Силібора
in vivo на фоні ураження тварин СС14.

показники цитолізу і ПОЛ in vivo

Інтактна група СС14 L Glu Sb

АЛТ, мкмоль/с(л 0,38 ± 0,03 0,94 ± 0,04* 0,45 ± 0,03** 0,47 ± 0,04**
0,43 ± 0,04**

АСТ, мкмоль/с(л 0,62 ± 0,04 1,1 ± 0,06* 0,8 ± 0,04** 0,78 ± 0,05*,**
0,82 ± 0,06**

МДА, нмоль/г ткани 23,7 ± 2,28 66,53 ± 6,13* 28,75 ± 2,44** 40,67 ±
5,14** 31,49 ± 3,54**

ДК, мкмоль/г 0,24 ± 0,03 0,49 ± 0,06* 0,27 ± 0,03** 0,32 ± 0,03** 0,35 ±
0,03**

ЛФ, нмоль/с(л 1062,34 ± 104,96 2218,57 ± 97,44* 1111,59 ± 87,63** 1190,9
± 109,18** 1272,71 ± 110,22**

ЛДГ, мккат/л 6,4 ± 0,7 16,17 ± 0,4* 8,96 ± 0,9*,** 8,8 ± 0,8*,** 10,13 ±
0,86*,**

(-ГТП, мккат/л 1,1 ± 0,01 1,75 ± 0,07* 1,12 ± 0,08** 1,17 ± 0,13** 1,21
± 0,09**

Примітки: L – Ліолів; Glu – Глутаргін; Sb – Силібор.

Внесення гепатопротекторів в культуру гепатоцитів призвело до
вірогідного підвищення виживаності клітин у цій культурі в порівнянні з
негативним контролем (табл. 3).

Досліджувані біохімічні показники після дії гепатопротекторів вірогідно
знизилися, як у гомогенатах печінки тварин, так і в культурі клітин,
наближаючись до рівня інтактного контролю (табл. 3).

Введення тетрахлорметану викликало у щурів важке ураження печінки.
Везикули переважно великі, часто займають усю цитоплазму гепатоцитів. У
багатьох клітинах трапляється жирова і гидропічна (балонна) дистрофія.
Досить часто спостерігаються мікрокісти і руйнування клітин. В осередках
деструкції спостерігається помірна кількість лімфоцитів, макрофагів,
нечисленні поліморфноядерні лейкоцити, що місцями формують дрібні
ліпогранульоми навколо жирових кист. Чисельність двуядерних гепатоцитів
візуально знижена. Відзначено значне коливання розмірів ядер клітин
(анізонуклеоз). У деяких з них збільшена кількість ядерець (до 3-4 на
ядро). Мітози в гепатоцитах дуже рідкі. СС14, введений в культуру
гепатоцитів, як було сказано вище, призвів до патологічних змін
морфофункціонального стану цих клітин.

Введення тваринам гепатопротекторів призвело до значного поліпшення
морфологічного стану печінки і стабілізації морфометричних показників.

У стані печінки щурів, що лікувалися ліолівом, спостерігається значно
більш слабка виразність стеатозу центролобулярних і перипортальних зон.
Гідропічна дистрофія – слабка або помірна. Активізуються процеси
регенерації: більше мітозів у гепатоцитах, клітин у фазі синтезу ДНК,
двуядерних клітин.

Введення на фоні впливу CCl4 глутаргіну поліпшувало стан печінкової
паренхіми. Жирова дистрофія гепатоцитів в основному середньо- і
мілкокрапельна. Гідропічна дистрофія клітин зустрічається рідко. У самих
зонах ураження збільшена кількість клітин, що зберігають усі ознаки
життєздатності. Добре простежується інтенсифікація ознак регенерації:
збільшений анізонуклеоз; є клітини, ядра яких – у фазі синтезу ДНК. У
препаратах збільшена чисельність мітотичних клітин, що поділяються,
візуально підвищена наявність двоядерних гепатоцитів, що синтезують
більшу кількість білка.

Силібор у трохи меншому ступені, у порівнянні з глутаргіном, впливає на
інтенсивність жирової дистрофії, яка викликана CCl4: везикули часто ще
досить великі, але жирові кисти рідкі. Гідропічна дистрофія гепатоцитів
виражена слабко. Істотно звужуються розміри осередків ураження, що
розташовуються часто ізольовано один від одного або обмежуються
периметром судини, не поширюючи всередину паренхіми. Підвищена кількість
клітин з незміненим ядром і цитоплазмою. Збільшена кількість клітин, що
знаходяться у фазі синтезу ДНК, визначаються і гепатоцити, що
знаходяться на різних стадіях мітозу.

Після внесення в культуру гепатоцитів гепатопротекторів, що вже
описувалося, спостерігалися позитивні зміни у морфофункціональному стані
клітин (структурна цілісність клітин, більша ізоморфність у порівнянні з
негативним контролем, чіткі клітинні границі, амфофільність цитоплазми,
нормальний стан і розташування ядерця в ядрі).

Морфометричні показники клітин на гістопрепаратах після введення СС14
тваринам вірогідно зросли (рис. 7), а також у гепатоцитах на
пофарбованих мазках in vitro (рис. 6). Після впливу гепатопротекторів ці
показники значно знизилися у порівнянні з негативним контролем, як in
vivo (рис. 7), так й in vitro (рис. 6).

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що гепатопротектори в
умовах інтоксикації, викликаної 4-х денним введенням CCl4, запобігають
загибелі тварин і в значній мірі зменшують біохімічні ознаки
інтоксикації.

В умовах ураження культури гепатоцитів тим же токсином спостерігалося
поліпшення проліферативних здібностей клітин після введення в культуру
гепатопротекторів і ослаблення процесів цитолізу і ПОЛ (см. вище). Це
свідчить про наявність однакових тенденцій у змінах морфологічних і
морфометричних показників як in vivo, так і in vitro, і про те, що
моделі ураження тварин і гепатоцитів у культурі, створені за допомогою
СС14, відповідають один одному.

Рис. 7. Динаміка змін ядерно-цитоплазматичних відносин після внесення
гепатопротекторів на фоні ураження гепатоцитів in vivo CCl4.

Примітка: * — вірогідна відмінність від групи інтактного контролю; ** —
вірогідна відмінність від групи негативного контролю.

Фармакоекономічний аналіз показав, що експеримент по визначенню
ефективності Ліоліва на тваринах коштував 2920,53 грн., а за часом на
його проведення необхідно було 14 днів. На проведення експерименту по
вивченню фармакологічної активності Ліоліва на культурі гепатоцитів було
витрачено 510,70 грн. За часом експеримент зайняв 4 дні.

Таким чином, на експеримент in vitro було витрачено в 4,69 рази менше
грошей, ніж на експеримент in vivo та в 3,5 менше часу.

Виходячи з усього вище сказаного випливає очевидна затратно-ефективна
вигода використання методів на основі культури гепатоцитів або будь-якої
іншої культури клітин при проведенні фармакологічних досліджень на етапы
скринінгу, що свідчить про значно більшу комплаєнтність зазначеного
методу.

ВИСНОВКИ

Теоретично обгрунтована та експериментально доведена можливість
моделювання патології in vitro (на культурі гепатоцитів) за допомогою
різних гепатотоксинів, використовуваних з метою створення модельної
патології різної етиології на тваринах. Отримані результати свідчать про
автентичність методу in vitro традиційно використовуваним методам in
vivo. Запропонований метод з використанням культури клітин економічний і
гуманний стосовно тварин. Застосування методу in vitro на основі
культури клітин відповідає вимогам GLP і директивам ЄС по обмеженню
використання тварин у біомедичній практиці.

Доведена перспективність застосування культур клітин при дослідженні
лікарських засобів

Визначені LC50 токсинів на культурі клітин.

Визначені ЕС50 лікарських засобів за допомогою культури гепатоцитів.

На відтворених різних моделях патології печінки in vitro була показана
можливість порівняльного вивчення лікарських препаратів: патологічні
зміни біохімічних і морфо-функціональних показників клітин в культурі
під впливом гепатотоксинів нормалізуються після внесення досліджуваних
гепатопротекторів.

Порівняльні дослідження, проведені на культурі клітин і на білих
лабораторних щурах, показали наявність однакових тенденцій у змінах
біохімічних і морфо-функціональних показниках клітин як in vitro, так і
in vivo.

Порівняльний аналіз економічних витрат, необхідних для вивчення
ефективності гепатопротектора Ліолів in vitro і in vivo, показав
очевидну перевагу використання культури клітин на цьому етапы
доклінічних досліджень у порівнянні з використанням тварин.

Проведені порівняльні дослідження по ефективності використання методів
in vitro на деяких етапах доклінічного вивчення лікарських засобів
доказали комплаєнтну наукову, економічну та біоетичну перевагу цих
методів у порівнянні з традиційними методами з використанням тварин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Волчик І. В., Дроговоз С. М., Чернова Т. М. Використання клітинних ліній
у фармакології і токсикології. // Одеський медичний журнал. – 2002. — №
4(72). — С. 110. (Особистий внесок здобувача – узагальнення
результатів).

Волчик І. В., Дроговоз С. М., Чернова Т. М. Переваги використання
клітинних ліній для фармакологічних та токсикологічних досліджень. //
Фізіологічно активні речовини. – 2002. — № 2(34). – С. 80-82. (Особистий
внесок здобувача – узагальнення результатів).

Цитопротекторні властивості Глутаргіну у відношенні клітин лінії HepG2
при токсичному впливі гентаміцину в експерементах in vitro. / І. В.
Волчик, С. М. Дроговоз, О. В. Доровський, Т. М. Зубченко, О. В. Супрун
// Вісник фармації. – 2003. — № 4(36). – С. 95-98. (Особистий внесок
здобувача – експериментальні дослідження).

Оцінка ефективності дії гепатопротекторів in vitro на моделі ураження
клітин лінії HepG2 Д-галактозаміном. / І. В. Волчик, Л. М. Малоштан, В.
М. Коваленко, Ю. Ю. Микулинський // Фармацевтичний журнал. – 2004. — №
4. – С. 91-94. (Особистий внесок здобувача – дослідження, статистична
обробка даних).

Волчик І. В., Малоштан Л. М.. Гепатозахисна активність Глутаргіну in
vitro. // Клінічна фармація. – 2004. – Т.8, № 4. – с. 46-49. (Особистий
внесок здобувача – проведення експерименту, статистична обробка даних).

Волчик И. В., Дроговоз С. М., Прокопищак Н. И. Оценка in vitro
эффективности и токсичности препарата лиолив. // Материалы
научно-практической конференции “Лекарства – человеку”. – Харьков. 2002.
– Т. XVII. – С. 106.

Волчик И. В. Изучение фармакотерапевтических свойств аргинина глутамата
in vitro. // Международный семинар „Лабораторные животные – возможные
альтернативы в экспериментальной фармакологии”: Тез. докл. – Харьков.
2002. – С. 45.

Волчик І.В., Малоштан Л.М. Вплив гепатопротекторів на біохімічний стан
гепатоцитів на моделі ураження СС14 in vitro. // Всеукраинская
научно-практическая конференция с международным участием
„Лекарства-человеку”. Материалы конференции. – Харьков. 2004. – с. 39.

Черних В.П., Малоштан Л.М., Дроговоз С.М., Волчик І.В., Микулінський
Ю.Ю., Щегільська О.А. Використання тест-системи на основі гепатоцитів у
вивченні ефективності біологічно активних речовин. Методичні
рекомендації. – Київ. 2005.

Волчик И.В., Малоштан Л.Н., Доровской А.В. Изучение гепатопротекторных
свойств глутаргина на культуре гепатоцитов человека. //
Науково-практична конференція “Досягнення та перспективи використання
вітчизняного препарату Глутаргін в клініці внутрішніх хвороб”: Тез.
докл. – Харків. 2005. – с. 152.

Деклараційний патент на винахід: Спосіб визначення токсичних або
фармакотерапевтичних доз лікарських речовин. Волчик І. В., Микулінський
Ю. Ю., Дроговоз С. М., Чепелюк В. І., Щегільська О. А. /
(19)UA(11)66216(13)A. — Бюл. № 4 від 15.04.2004. 5с.

Волчик І.В. Застосування методів in vitro на етапах доклінічного
вивчення лікарських засобів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук
за спеціальністю – 14.03.05 – фармакологія. – Національний
фармацевтичний університет, Харків, 2006.

Дисертація присвячена експериментальному вивченню вітчизняних
гепатопротекторів за допомогою методів in vitro. На культурі гепатоцитів
були змодельовані ураження клітин тими ж токсинами, що й на тваринах.
Дія токсинів призводила до загибелі приблизно 50 % гепатоцитів в
культурі.

На моделі з використанням СС14 була показана можливість визначення
ефективних концентрацій гепатопротекторів in vitro. Виживаність клітин в
культурі після внесення гепатопротекторів на фоні ураження їх токсином
різко зросла.

Вивчення біохімічного стану гепатоцитів в культурі під впливом токсинів
показало зростання, майже в 2 рази, таких показників, як АЛТ, АСТ, ЛФ,
ЛДГ, (-ГТП, МДА, ДК, що є маркерними для визначення патології печінки in
vivo. Дія гепатопротекторів призвела до нормалізації цих показників.
Морфологічний стан та морфометричні показники гепатоцитів в культурі
після впливу на них токсинів мали негативні зміни. Дія гепатопротекторів
практично повністю усунула ці зміни.

При порівняльному аналізі такі ж зміни біохімічних показників,
морфологічного стану гепатоцитів та їх морфометричних показників
спостерігалися при моделюванні ураження щурів тетрахлорметаном.

Фармакоекономічний аналіз показав явну перевагу методу з використанням
культури клітин у порівнянні з традиційним методом з використанням
тварин.

Результати досліджень за темою дисертації стали основою для впровадження
методу з використанням клітинних культур при дослідженні фармакологічних
та токсикологічних властивостей лікарських засобів.

Ключові слова: культура гепатоцитів, гепатопротектори, гепатотоксини, in
vitro.

Волчик И.В. Применение методов in vitro на этапах доклинического
изучения лекарственных средств. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
по специальности 14.03.05 – фармакология. – Национальный
фармацевтический университет, Харьков, 2006.

Диссертация посвящена изучению отечественных гепатопротекторов с помощью
культуры гепатоцитов. Актуальность исследования диктуется необходимостью
внедрения новых, более экономичных и менее трудоемких методов при
проведении доклинических исследований по определению LC50 и ЕС50
лекарственных средств.

Целью настоящей работы явилось экспериментальное сравнение
гепатопротекторов различных классов (Лиолив, Глутаргин, Силибор) с
помощью метода in vitro на основе культуры гепатоцитов.

На первом этапе эксперимента проводился подбор LC50 токсинов in vitro,
используемых in vivo. В качестве токсинов использовались СС14,
гентамицин, тетрациклин и Д-галактозамин. LC50 этих веществ подбирались
в течении 3-х дней с помощью оценки выживаемости гепатоцитов в культуре.

Подбор ЕС50 для гепатопротекторов осуществлялся на модели поражения
культуры клеток СС14.

При изучении эффективности перечисленных препаратов на модели поражения
культуры гепатоцитов токсинами был показан рост пролиферативных свойств
клеток в культуре после внесения в нее гепатопротекторов. Внесение в
культуру токсинов привело к росту маркерных для печеночной патологии
биохимических показателей примерно в 2 раза (АЛТ, АСТ, ЛДГ, (-ГТП, ЩФ,
МДА, ДК). Внесение в эту же культуру на фоне ее поражения токсинами
гепатопротекторов привело к нормализации этих показателей.

При попадании в культуру гепатоцитов токсинов наблюдались грубые
патологические изменения морфологической структуры клеток и увеличение
их морфометрических показателей. Действие гепатопротекторов вызывало
исчезновение нарушений и нормализацию показателей.

Сравнительное изучение результатов, полученных in vitro и in vivo на
модели поражения СС14, показало одинаковые тенденции в изменениях
выживаемости гепатоцитов в культуре клеток и у животных: гибель примерно
50 % тест-объектов после действия токсина и рост их выживаемости после
введения гепатопротекторов. Исследуемые биохимические показатели под
воздействием СС14 выросли примерно в 2 раза и in vitro, и in vivo.
Действие гепатопротекторов привело к их снижению до уровня нормы.
Патологические морфологические изменения гепатоцитов в культуре и в
печени животных, появившиеся после введения СС14, после внесения
гепатопротекторов исчезли. Возросшие морфометрические показатели в
леченых группах экспериментальных объектов также практически сравнялись
с нормой.

При изучении эффективности Лиолива in vitro было затрачено 4,69 раза
меньше финансовых средств, чем на эксперимент in vivo. При этом
потребовалось в 3,5 раза меньше времени при проведении эксперимента in
vitro, чем in vivo. Это свидетельствует об очевидной
затратно-эффективной выгоде использования методов на основе культуры
гепатоцитов или любой другой культуры клеток при проведении
фармакологических исследований на этапе скрининга.

Таким образом примененный метод изучения токсичности и эффективности
лекарственных средств с использование культуры гепатоцитов доказал свою
состоятельность для применения в повседневной практике.

Ключевые слова: культура гепатоцитов, гепатопротекторы, гепатотоксины,
in vitro.

Volchik I.V. In vitro methods using at preclinical medications
investigations. – Manuscript.

Thesis for a Kandidat of pharmaceuticals sciences degree in speciality
14.03.05 – pharmacology. National pharmaceutical university, Kharkov,
2005.

The dissertation is devoted to study of produced domestically
hepatoprotectors by in vitro methods. We’d modeled culture of
hepatocites affection by some toxins, which are using for animals
modeling. Their effect resulted to 50 % cells death.

There was shown the possibility to detect hepatoprotectors effective
concentration in vitro using CCl4 model. Cells viability in the culture
had rised steeply after hepatoprotectors carry in at toxins lesion
background.

The biochemical state investigation of hepatocites in the culture had
shown the increasing, about twice, of ALT, AST, LDG, alkaline
phosphatase, (-GTP, MDA, diene conjugates at toxins lesion background.
These indexes are markers for liver pathology in vivo. Hepatocites
morphological and morphometrical indexes have pathological changing.
Hepatoprotectors action had grade all the changes.

The comparative analysis had shown the same changes of rats hepatocites
morphological and morphometrical state, when there was CCl4 lesion
modeling.

Рharmacoeconomical analysis had shown an advantage of the method with
cell culture using with traditional method with animal using.

The dissertation results had become a base for the method with cell
culture using implantation for medications toxicological and
pharmacological properties investigation.

Key-words: hepacytes culture, hepatoprotectors, hepatotoxins, in vitro.

PAGE 20

Похожие записи