НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ
ім.Р.Є.КАВЕЦЬКОГО

АШРАФ АВАД-ЕЛЬКАРІМ ФАДЛЬ-ЕЛЬСІД

УДК: 618.19-006.6-089:615.832.98

Застосування кріодеструкції і кріоасоційованних пептидів у комплексному
лікуванні хворих на рак молочної залози

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ — 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національній медичній академії післядипломної освіти
ім. П.Л.Шупика МОЗ України.

Науковий керівник — доктор медичних наук, професор

Тащієв Рахман Кулієвич,

професор кафедри онкології Національної медичної академії післядипломної
освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, м. Київ.

Офіційні опоненти: — доктор медичних наук, професор

Бережна Нінель Михайлівна,

провідний науковий співробітник відділу біології пухлинної клітини
Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ;

— доктор медичних наук

Чешук Валерій Євгенович ,

доцент кафедри онкології Національного медичного університету ім. О.О.
Богомольця МОЗ України, м. Київ.

Провідна організація — Донецький державний медичний університет ім. М.
Горького МОЗ України, кафедра онкології, променевих методів діагностики
і лікування, м. Донецьк.

Захист дисертації відбудеться «5» липня 2006 р. о 13 годині 30 хвилин на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.
Кавецького НАН України, за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська,
45.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького
НАН України.

Автореферат розісланий «___» червня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор мед. наук
Н.В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Захворюваність раком молочної залози (РМЗ) серед
жіночого населення щорічно зростає в більшості країн світу (Тарутинов
В.И., 2006). В Україні за 2004 р. вона склала 59,5 на 100 тис.
населення, а смертність — 29,7 (Федоренко З.П. і співавт., 2005). Така
висока захворюваність і смертність, наявність нерозпізнаних метастазів
вже на І стадії захворювання у 10-15% хворих (Семиглазов В.Ф., 2001), а
також не задовільний ефект навіть при комплексному лікуванні з
урахуванням патогенетичної форми РМЗ і прогностичних факторів
обумовлюють необхідність удосконалення методів лікування.

Зараз немає сумніву в ефективності органозберігаючих операцій на І-ІІ
стадіях РМЗ (Бондар Г.В. і співавт., 2004, Семиглазов В.Ф., 2002), хоча
за даними літератури, частота місцевих рецидивів при цьому складає
приблизно 20% , а віддалених метастазів — 15-20% (Семиглазов В.Ф. 2001,
Путирский Л.А., 1998) .

Причиною смерті 70-85% хворих з операбельними формами РМЗ (після
радикальної операції) є віддалені метастази. Навіть у хворих на РМЗ з
пухлинами менше 1 см у діаметрі при 10-річному терміні спостереження
після закінчення місцевого лікування (операція і/або променева терапія)
у 10% випадків можливий рецидив захворювання і розвиток віддалених
метастазів. На жаль, клінічна онкологія поки не має у розпорядженні
ефективних лікарських засобів , що дозволяють у всіх випадках зменшити
мікрометастази пухлини (Семиглазов В.Ф., 2002., Bucholz T. et al.,
2002).

За даними Моісеєнко В.М. (2000), середня тривалість життя пацієнток з
моменту виявлення метастазів не перевищує 3 роки, більше 5 років живуть
25-30%, а більше 10 років — 10% хворих. За даними Landіs S.H. et al.
(1999) лікування хворих на метастатичний рак молочної залози за
допомогою стандартних схем терапії є неефективним, а медіана тривалості
життя пацієнтів після виявлення метастазів складає 2 роки. Тому
збільшення виживаності при метастатичному РМЗ і поліпшення якості життя
цих хворих є однією з головних задач клінічної онкології.

Багаторічний досвід застосування кріохірургії в лікуванні хворих з
злоякісними і доброякісними пухлинами різних локалізацій показав її
ефективність і переносимість (Прохоров Г.Г., 2001). При акуратному
виконанні неінвазивна кріохірургічна операція є фактично безкровною. Цей
метод забезпечує абластичність оперативного втручання, що дозволяє
попередити розвиток рецидивів, метастазів і дисемінацію пухлинних клітин
під час операції шляхом блокади кровообігу в судинах, що живлять пухлину
(Коченов В.И., 2003).

Цей метод дозволяє зруйнувати пухлину, яка розташована як на поверхні
тіла, так і в глибині органів, він не має протипоказань (рекомендується
при всіх патогенетичних формах і стадіях РМЗ) (Тащиев Р.К., 2002) і може
поєднуватися з іншими спеціальними методами лікування (променевим,
хіміотерапевтичним та ін.). Тому включення кріохірургічного методу до
комплексного лікування хворих на РМЗ є науково обґрунтованим і клінічно
необхідним.

Ще в роботах Cooper І. S. et. al. (1962); Cohen W.G. (1965); Yantorno C.
et. al. (1966) висловлювалося припущення про розвиток імунологічної
відповіді на кріовплив. Було показано, що після кріодеструкції пухлини
спостерігалась стимуляція протипухлинного, противірусного,
протигрибкового та антимікробного імунітету (Коченов В.И., 2003).
Тащієвим Р. К. (2002), після кріовпливу на великі пухлинні вузли в
печінці було відмічено розсмоктування дрібних пухлинних вузлів у
печінці, розташованих в обох частинах органа, що не піддавалися
кріовпливу.

Нові підходи до імунотерапії пухлин і можливі механізми протипухлинного
імунітету обговорюються в огляді І. В. Абраменко і співавт. (2000), та
Н.М. Бережної і співавт. (2005). Аргументується можливість створення і
застосування протипухлинних аутовакцин при кріовпливі на пухлину. При
цьому варто звернути увагу на характер розвитку імунних реакцій після
кріовпливу при РМЗ. Однак, для того, щоб кріохірургія стала ефективним
способом лікування хворих на новоутворення, необхідне глибоке вивчення
механізмів кріодеструкції пухлин.

Зв’язок роботи з науковими планами, програмами і темами. Дисертаційна
робота виконувалася в рамках планової тематики наукової програми кафедри
онкології Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.
Шупика «Сучасні методи діагностики і лікування злоякісних новоутворень»
(№ державної реєстрації: 0103U008728).

Мета дослідження — підвищення ефективності результатів лікування хворих
на РМЗ ІІ-ІІІ стадії за допомогою проведення передопераційного
кріовпливу на пухлину і наступної імунотерапії із застосуванням
кріоасоційованих пептидів, а також вивчення деяких імунологічних
реакцій, зв’язаних з цим впливом.

Задачі дослідження:

Вивчити морфологічні зміни і спектр білків у пухлинній тканині хворих на
РМЗ до і після кріовпливу на пухлину.

Розробити метод отримання кріоасоційованих пептидів, оцінити їх
імуногенність в експерименті і можливість використання для наступної
імунотерапії хворих на РМЗ.

Провести лікування хворих на РМЗ із включенням у програму терапії
проведення передопераційного кріовпливу на пухлину і наступної
імунотерапії із застосуванням кріоасоційованих пептидів.

Вивчити зміни в системі імунітету хворих на РМЗ при включенні до
комплексного лікування кріовпливу на пухлину з наступною імунотерапією
із застосуванням кріоасоційованих пептидів.

Визначити концентрації пухлиноасоційованого маркера СА15-3 у сироватці
крові хворих на РМЗ в умовах комплексного лікування кріовпливу на
пухлину з наступною імунотерапією із застосуванням кріоасоційованих
пептидів.

Вивчити ефективність лікування (загальну і безрецидивну виживаність
хворих) при включенні до комплексного лікування хворих на РМЗ кріовпливу
на пухлину і імунотерапією із застосуванням кріоасоційованих пептидів.

Об’єкт дослідження:, хворі на РМЗ ІІ-ІІІ стадії (117 жінок у віці від 25
до 85 років) та 200 мишей-самок лінії C57 Bl/6 з перещепленою пухлиною
молочної залози Са 755.

Предмет дослідження: дані клінічних результатів комплексного лікування,
а також патоморфологічні, біохімічні та імунологічні зміни в організмі
хворих на РМЗ, за умов застосування передопераційного кріовпливу на
пухлину з наступною імунотерапією кріоасоційованими пептидами.

Методи дослідження: клінічний (оцінка ефективності лікування на підставі
дослідження безпосередніх результатів лікування, загальної і
безрецидивної виживаності); морфологічний (визначення стадії
захворювання і гістологічного типу пухлини, а також оцінка кріовпливу на
тканину пухлини за шкалою оцінки лікувального патоморфозу);
імунологічний для визначення концентрацій загальних і специфічних ІgА,
ІgM і ІgG у сироватці крові, цитофлюорометричний та імуногістохімічний
методи для визначення показників клітинного і гуморального імунітету та
імуноферментний метод визначення концентрації пухлиноасоційованого
антигену СА15-3 у крові хворих у динаміці; біохімічні (визначення
білкового складу тканини пухлини до і після заморожування з метою
виявлення характеру біохімічних змін, що виникли в тканині пухлини після
кріовпливу); статистичні методи з визначенням t-критерію Ст’юдента,
коефіцієнтів кореляції (r), точний метод Фішера, застосування програмних
ресурсів Statіstіca і SPSS (США).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено, що під дією
низьких температур у пухлинній тканині людини, хворої на РМЗ, а також у
перещепленій пухлині молочної залози Са 755 мишей відбувається зміна
білкового складу , а саме, зменшення вмісту білків з м.м. 40-200 кДа з
одночасним накопиченням глікопептидів з м.м. 12 кДа. Показано, що
вакцинація тварин за допомогою кріоасоційованих глікопептидів приводить
до гальмування росту перевивної пухлини. Розроблено метод комплексного
лікування хворих на РМЗ із включенням кріодеструкції і післяопераційного
введення кріоасоційованих пептидів. Уперше встановлено, що застосування
розробленого методу підвищує безрецидивну виживаність хворих на РМЗ і
супроводжується розвитком реакції протипухлинного імунітету (реакція
гіперчутливості уповільненого типу, поява в сироватці крові хворих
антитіл до компонентів кріоасоційованих пептидів, зміна співвідношення
популяцій імунокомпетентних клітин периферичної крові).

Практичне значення одержанних результатів : Розроблено і впроваджено у
клінічну практику комплексного лікування хворих на РМЗ метод
передопераційного кріовпливу на пухлину з подальшою імунотерапією і
застосуванням кріоасоційованих пептидів, отриманих з тканини
аутологічної пухлини .

Уперше проведена комплексна терапія з метою профілактики рецидивів і
метастазів, що приводить до збільшення загальної і безрецидивної
виживаності хворих на РМЗ.

Впровадження результатів. Результати дослідження (метод комплексного
лікування хворих на РМЗ, що включає кріовплив на пухлину молочної залози
в поєднанні з післяопераційним введенням препарату пептидів із власної
пухлинної тканини, підданої кріовпливу) впроваджені в клінічну практику
в хірургічному відділенні Київської міської онкологічної лікарні та у
відділенні пухлин молочної залози Інституту онкології АМН України.

Особистий внесок здобувача. Здобувач провів патентно-ліцензійний пошук
та аналіз літературних джерел за темою дисертації, приймав участь у
визначенні мети і задач дослідження, проаналізував отримані результати,
сформулював основні положення і висновки роботи.

Автор дисертації безпосередньо брав участь у клінічних дослідженнях і
лікуванні хворих на РМЗ, розробленні препарату пептидів з тканини
пухлини молочної залози після кріовпливу. Здобувач також брав участь у
розробленні і впровадженні в клінічну практику методу комплексного
лікування хворих на РМЗ із застосуванням кріовпливу і імунотерапії за
допомогою кріоасоційованих пептидів.

Автор обробляв архівний матеріал, проводив лікування хворих у
післяопераційному періоді відповідно до схеми протоколу, збирав дані про
безпосередні і віддалені результати після проведеного лікування.

Апробація результатів дисертації. Результати дослідження апробовані на:
засіданнях товариства онкологів м. Києва і Київської області (2004 і
2005 рр.); науково-практичній конференції «Проблеми онкоімунології:
наукові і прикладні аспекти» (Київ, 2003 р.); I-ій Приволзькій науковій
конференції з медичної кріології» (Н. Новгород, Росія, 2003 р.);
міжнародній науково-навчальній конференції Європейського товариства
медичної онкології (ESMO) (Будапешт, 2005 р.); II міжнародній
науково-практичній конференції «Нове в практичній кріології» (Москва,
2005 р.); VІІ міжнародній конференції молодих онкологів «Сучасні
проблеми експериментальної і клінічної онкології» (Київ, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з
них 4 статті в журналах, рекомендованих ВАК України, 2 статті в
закордонних журналах, 6 тез у матеріалах міжнародних конференцій і
з’їздів, отримано 2 патенти України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 110
сторінках машинопису, складається із вступу, огляду літератури, 5
розділів власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій і списку
використаної літератури, який складається з 210 джерел, з них 80
вітчизняних і 130 закордонних . Дисертацію ілюстровано 21 рисунком і 10
таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. У роботі проаналізовано результати
комплексного лікування 117 жінок, хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії,
розподілених на 2 групи. Основна група складалась з 58 хворих на РМЗ,
лікування яких проводилося за стандартними схемами: радикальна
операція, поліхіміотерапія (ПХТ) і/або променева терапія (ПТ), з
включенням методу передопераційного кріовпливу на пухлину. Основна
група, в свою чергу , представлена двома підгрупами: перша (І) підгрупа
— 27 хворих на РМЗ, у лікування яких до стандартних схем було підключено
кріовплив під час операції та післяопераційна імунотерапія за допомогою
введення пептидів, отриманих з підданої кріовпливу власної пухлинної
тканини. Друга (ІІ) підгрупа включала 31 хвору на РМЗ, у лікування яких
до стандартних схем підключили лише кріовплив під час операції; подальше
лікування проходило за звичайними схемами, включаючи радикальну
хірургічну операцію, ПХТ і/або ПТ. Контрольна група представлена 59
хворими на РМЗ, що проходили лікування за стандартними схемами,
включаючи радикальну хірургічну операцію, ПХТ і/або ПТ (табл. 1, 2).

Таблиця 1

Розподіл хворих за стадіями захворювання

Стадія захворювання Основна група Контрольна група

абс.число % абс.число %

II (Т1-3N0-1M0) 32 55 32 54

III (Т2-4N0-3M0) 26 45 27 46

Загальна кількість 58 100 59 100

Вік досліджуваних хворих варіював від 25 до 85 років. Середній вік при
цьому складав 52,6±12,3 років. Згідно з патогенетичною класифікацією
В.Ф. Семиглазова (1997), досліджувані групи хворих були розподілені на:
тиреоїдну (до 35 років), яєчникову (від 36 до 49 років), надниркову (від
50 до 59 років) і інволютивну (після 60 років) (табл. 2).

За морфологічним типом пухлини були розподілені таким чином: у всіх
групах переважав інфільтруючий протоковий рак: в основній групі – 77% ,
в контрольній – 74% ; інфільтруючий дольковий рак в основній групі
складав – 15%, в контрольній – 17%. Інші морфологічні типи, включаючи
муцинозний, скірозний і низькодиференційований рак складали в основній
групі 8%, а в контрольній 9%.

Кріовплив на пухлину проводили під внутрівенним/інтубаційним наркозом за
допомогою кріохірургічної установки «Криоэлектроника-4» (Фірма Пульс –
Київ) , а також за допомогою розроблених нами і впроваджених у клінічну
практику плоских кріоаплікаторів різної форми і величини від 3 до 10 см
у діаметрі. Форму і розмір кріоаплікатора обирали залежно від
локалізації пухлини, її розмірів і розмірів самої молочної залози.
Кріовплив на пухлину проводили з одного полюса у 49 хворих, а з двох
полюсів одночасно у 9 хворих. Для досягнення високої ефективності і
максимального руйнування пухлинної тканини кріовплив проводили двічі зі
спонтанним відтаюванням. Межі замороженої тканини завжди на 2-3 см
виходили за край пухлини. Експозиція при першому заморожуванні – від 10
до 20 хвилин, при другому — від 10 до 15 хвилин. Час спонтанного
відтаювання після першого заморожування — від 20 до 40 хвилин, площа
заморожування — від 4 до 22 см у діаметрі при глибині від 4 до 8 см
Температура заморожування коливалася від –1200 до –1850 С0.

Таблиця 2

Розподіл груп хворих за патогенетичними формами

Патогенетична форма Основна група Контрольна група

абс.число % абс.число %

Тиреоїдна (до 35 років) 2 3 3 5

Яєчникова (від 36 до 49 років) 21 37 23 39

Надниркова(від 50 до 59 років) 17 29 16 27

Інволютивна (після 60 років) 18 31 17 29

Загальна кількість 58 100 59 100

Вимірювання і моніторинг температури замороженої тканини під час
операції проводили за допомогою мідь-константанових термопар,
вмонтованих в ін’єкційні голки і підключених до потенціометра, а також
за даними монітора установки «Криоэлектроника-4».

Морфологічну оцінку ефекту кріовпливу на тканину пухлини проведено за
шкалою оцінки лікувального патоморфозу (К. О. Галахін, 2000).

Імунологічні дослідження хворих основної і контрольної групи проводили в
динаміці до і після операції, а також після ад`ювантного лікування.

Досліджували CD3, CD4, CD19, CD3+CD56+, CD3–CD56+CD16+, субпопуляції Т-
і В-лімфоцитів природних кілерів та природних кілерних Т- лімфоцитів за
допомогою методу проточної цітофлюориметрії і набору моноклональних
антитіл серії Leu («Becton Dіckіnson», США), на апараті FAC Scan
(«Becton Dіckіnson», США) у програмі Lysіs ІІ. Визначення концентрацій
ІgA, ІgM і ІgG у сироватці крові проводили методом радіальної дифузії
(реакція Манчіні) (G. Manchіnі, 1965). Пухлинний маркер (СА15-3) у крові
хворих вивчали у динаміці методом иммуноферментного аналізу. Дослідження
виконані на базі відділу клінічної імунології Інституту клінічної
радіології НЦРМ АМН України (зав. лабораторією д. м.н., проф. Д.А.
Базика).

Для дослідження клітинного імунітету вивчали реакцію гіперчутливості
уповільненого типу за допомогою скарификаційної проби. З цією метою
внутрішньошкірно вводили стерильний розчин кріоасоційованих пептидів,
приготовлених з 200 тис. пухлинних клітин, в об’ємі 0,2 мл. Реакцію
оцінювали через 24 години після введення, вимірюючи діаметр папули, що
утворилася.

Для експериментального обґрунтування роботи проводили серію досліджень
на моделі експериментального пухлинного росту — пухлині молочної залози
Са 755 на 200 мишах-самках лінії С57 Bl/6. Дослідження проводилися на
базі відділу ензимології Інституту експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України (зав. відділом
д. м.н., проф. В.О. Шляховенко). Клітинні лізати досліджували за
допомогою електрофорезу білків у системі поліакриламідного гелю з
додецилсульфатом натрію до і після кріовпливу. Готували препарат
кріоасоційованих пептидів (КАП), а також оцінювали розміри перещепленої
пухлини у мишей при проведенні імунізації препаратом кріоасоційованих
пептидів.

Статистичну оцінку виживаності хворих проводили за допомогою методу
Каплана-Мейера із застосуванням програмних ресурсів Statіstіca і SPSS
(США).

Результати дослідження та їх обговорення. Результати патоморфологічних
досліджень, проведених у 23 жінок, свідчать про ефективність кріовпливу
на пухлину. У 87% хворих виявлена субтотальна девіталізація пухлини з
п’ятикратним зменшенням життєздатної ракової паренхіми. У 13% хворих –
блокування внутрішньопухлинного кровообігу. Крім того, при вивченні
білкового складу тканини пухлини до і після заморожування було виявлено
біохімічні зміни, що виникли внаслідок кріовпливу. Виявлено, що в
результаті кріовпливу в тканині пухлини зменшувався вміст білків з м.м.
40-200 кДа та одночасно відбувалось накопичення глікопептидів з м.м. 12
кДа (рис.1).

Рис. 1. Електрофореграма білків пухлинної тканини: до кріовпливу (А, В,
Д) та після кріовпливу (Б, Г, Е)

Експериментальні дослідження на моделі перевивної пухлини молочної
залози Са 755 мишей дали аналогічні результати. Було проведено роботу по
накопиченню, виділенню та очищенню КАП. При використанні очищеної
фракції КАП в експерименті було показано її імуногенність. Триразове
введення тваринам препарату КАП з наступним перещепленням пухлинних
клітии супроводжувалось гальмуванням росту пухлини на 76%, а у 40%
тварин пухлини не розвилися взагалі.

Ці результати було покладено в основу досліджень щодо застосування КАП
як препарату для післяопераційної імунотерапії 27 хворих на РМЗ ІІ-ІІІ
стадії.

Безпосередні результати лікування хворих показали переносимість і
безпечність включення передопераційного кріовпливу на пухлину і
післяопераційної імунотерапії за допомогою КАП до схеми лікування хворих
на РМЗ ІІ-ІІІ стадії. Незважаючи на те, що включення до операції
кріовпливу на пухлину подовжує час операції на 40-60 хвилин, коли хворі
знаходяться під загальним наркозом, пов’язаних з цим ускладнень у хворих
першої і другої підгруп не спостерігалося.

Під час проведення кріовпливу, яке проводилося при ретельному контролі
за гемодинамікою (артеріальний тиск, пульс, насиченість крові киснем),
відзначена стабільність гемодинаміки і тільки в одному випадку при
поверхневому наркозі спостерігалося зниження артеріального тиску до 90
мм р.ст.

Серйозних ускладнень, пов’язаних з кріовпливом під час операції, у
хворих першої і другої підгрупи не спостерігалося, незалежно від віку
хворих, стадії захворювання і супутньої патології. У деяких випадках
спостерігалася підвищена активність місцевого кровообігу, що вимагало
особливої уваги і ретельної підтримки гемостазу. У післяопераційному
періоді відзначалися такі ускладнення, як асептичний міозит великого
грудного м’яза в одному випадку, нагноєння післяопераційної рани
спостерігалося у трьох хворих, і в однієї хворої відзначалося
загострення хронічного тромбофлебіту.

Таким чином, частота розвитку ускладнень, ймовірно пов’язаних із
застосуванням кріодеструкції, склала 8,62%.

Проведення імунотерапії за допомогою препарату КАП не супроводжувалося
алергічними реакціями, запальними або іншими (загальними або місцевими)
ускладненнями. Метод лікування переносився добре незалежно від віку
хворих, стадії захворювання і супутніх захворювань.

Результати оцінки загальної і безрецидивної виживаності хворих за
методом Каплана-Мейера показали ефективність застосування кріовпливу на
пухлину молочної залози з післяопераційною імунотерапією за допомогою
КАП. Загальну і безрецидивну виживаність було оцінено у 109 хворих. У
цілому, протягом періоду спостереження рецидиви виникли у 30 жінок
(27,52%). При цьому тривалість безрецидивного періоду істотно залежала
від фактора доопераційного кріовпливу на тканину пухлини: застосування
кріовпливу і кріовпливу в комплексі з імунотерапією за допомогою
кріоасоційованих пептидів вірогідно підвищувалась тривалість
безрецидивного періоду захворювання.

Так, у контрольній групі (56 жінок) рецидиви виникли в 22 жінок
(39,28%), а медіана безрецидивного періоду склала 54,0 + 3,76 міс. (95%
довірчий інтервал 46,64 — 61,36 міс).

У групі з застосуванням кріовпливу (32 жінки) протягом періоду
спостереження рецидиви відзначені у 8 жінок (25%).

У групі, де кріовплив на пухлину поєднувався з наступною вакцинацією (21
жінка), рецидивів не спостерігалося. Виявлені розходження є
достовірними: значення статистики (Log Rank склало 6,21; р = 0,0448).

Розходження в тривалості безрецидивного періоду зберігалися і при оцінці
безрецидивної виживаності в контрольній групі та у групі з кріовпливом,
без врахування факту наступної вакцинації (Log Rank = 4,69; р = 0,0303)
(рис. 2).

Рис. 2. Крива безрецидивної виживаності хворих на РМЗ у контрольній
групі, у групі з кріовпливом (кріо) і в групі з кріовпливом +
імунотерапія (кріо+імунотерапія), за Капланом-Мейером

Протягом періоду спостереження в контрольній групі загинуло 15 пацієнток
(26,78%); медіана загальної тривалості життя склала 68,0 + 6,2 міс.
(95%, довірчий інтервал 55,85 — 80,15 міс.). У групі з використанням
кріовпливу загинуло 8 хворих (25%), медіану загальної тривалості життя
не було досягнуто. У групі з кріовпливом і наступною імунотерапією усі
пацієнтки до сьогодні живі і не мають ознак рецидиву основного
захворювання. Однак виявлені розходження є статистично недостовірними
(Log Rank = 2,51; р = 0,2854), що, ймовірно обумовлено відносно коротким
періодом спостереження.

Для з’ясування ролі імунологічних механізмів у реалізації ефекту
застосування кріовпливу з наступною імунотерапією КАП було вивчено деякі
параметри клітинного і гуморального імунітету.

Динаміка субпопуляційного складу лімфоцитів периферичної крові не
виявила достовірних змін досліджуваних показників у хворих контрольної
групи. У той же час у хворих, яким було проведено кріодеструкцію
пухлинної тканини, особливо у хворих І підгрупи, відзначено виражену
тенденцію до підвищення вмісту CD3+ Т-лімфоцитів (р = 0,09 у І підгрупі)
і CD4+ Т-лімфоцитів-хелперів (р = 0,07 у І підгрупі). Це привело до
достовірного зростання імунорегуляторного індексу як в І-й, так і ІІ-й
підгрупах. Вміст CD8+ Т-лімфоцитів-супрессорів, CD19+ В-лімфоцитів,
природних кілерних клітин (CD3-CD56+CD16+), природних кілерних
Т-лімфоцитів (CD3+CD56+CD16+) у хворих з проведеною кріодеструкцією не
змінювався. Не виявлено змін і у концентрації сироваткових
імуноглобулінів різних класів (табл. 3).

Таблиця 3

Деякі показники клітинного і гуморального імунітету в обстежених хворих
І, ІІ підгрупи і контрольної групи (1 — вихідні дані, 2 — повторне
дослідження через 6 міс. після оперативного втручання)

Досліджувані

Параметри Контрольна група І підгрупа ІІ підгрупа

1 2 1 2 1 2

CD19+,

В-лімфоцити, % 13,8 + 1,02 12,98 + 1,11 10,96 + 1,32 11,22 + 1,42 11,65
+ 3,43 10,23 + 2,68

CD3+,

Т-лімфоцити, % 53,01 + 1,75 55,21 + 2,19 52,62 + 2,84 62,81 + 2,46 55,22
+ 3,98 60,15 + 2,42

CD4+, лімфоцити-хелпери % 32,29 + 2,13 35,96 + 2,19 32,68 + 2,94 40,02 +
2,56 35,73 + 3,24 37,73 + 2,14

CD8+, лімфоцити-супресори/ кілери, % 24,62 + 2,03 26,02 + 2,12 24,34 +
2,71 26,07 + 1,86 26,31 + 2,78 24,32 + 2,34

CD4/CD8, імунорегуляторний індекс 1,32 + 0,05 1,34 + 0,04 1,34 + 0,08
1,53 + 0,07* 1,34 + 0,08 1,54 + 0,06*

CD3-CD56+CD16+, природні кілери, % 14,72 + 1,34 15,08 + 1,78 15,50 +
1,86 14,65 + 2,05 13,93 + 2,94 17,25 + 3,37

CD3+CD56+CD16+, природні кілерні Т-лімфоцити, % 9,67 + 1,12 8,56
+ 1,65 12,05 + 1,27 8,85 + 1,34 10,12 + 2,15 7,77 + 1,47

Примітка : * — розходження достовірні при p<0,05 між вихідними і повторними дослідженнями в аналізованих групах. У той же час, у хворих І підгрупи спостерігалися зміни, що свідчать про розвиток специфічної клітинної реакції імунітету на компоненти вакцини, що вводяться. У першу чергу, це виявлялося в розвитку реакції гіперчутливості уповільненого типу. Якщо вихідний діаметр папули на компоненти вакцини, що вводяться, склав у середньому по групі 7,28 + 2,16 мм, то через 2 міс. після введення препарату кріоасоційованих пептидів - 18,58 + 2,49 мм (p<0,03). Тільки в однієї хворої ця проба була негативною. Показником індукції специфічної гуморальної відповіді було виявлення специфічних антитіл до компонентів препарату кріоасоційованих пептидів. Титр цих антитіл значно зростав через 1 місяць після проведення першого курсу імунотерапії. Спостерігалося значне зростання діаметра кілець преципітації при дослідженні зразків сироватки, отриманих після закінчення курсу імунотерапії, у порівнянні з вихідними сироватками (рис.3). Відзначаються також перехресні реакції при дослідженні сироватки крові хворих з алогенними антигенами. Рис. 3. Результати реакції преципітації при дослідженні взаємодії сироваток хворих, отриманих до початку і через 4 міс. після проведення імунотерапії, з компонентами препарату кріоасоційованих пептидів. Розведення сироваток: 1:2 (1); 1:4 (2); 1:8 (3); 1:16 (4) і 1:32 (5). Динаміка дослідження зміни пухлинних маркерів у післяопераційному періоді також свідчить про ефективність запропонованого методу з застосуванням кріодеструкції пухлини і наступної імунотерапії за допомогою препарату кріоасоційованих пептидів (концентрація СА 15-3 знижувалась з 36,81 + 4,81 нг/мл до 23,37 + 3,93 нг/мл (p<0,02) у хворих І підгрупи, проти 34,19 + 5,50 нг/мл і 27,43 + 4,20 нг/мл; (p>0,05) у
контрольній) (рис.4).

Рис. 4. Концентрація пухлиноасоційованого антигену СА15-3 у сироватці
крові хворих І основної підгрупи (1) і контрольної (2)групи

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично обґрунтовано, експериментально і клінічно
підтверджено нове рішення актуальної науково-практичної задачі
онкології, а саме — поліпшення результатів лікування хворих на рак
молочної залози за допомогою проведення передопераційного кріовпливу на
пухлину і наступної імунотерапії з застосуванням кріоасоційованих
пептидів, а також з’ясовано деякі імунологічні механізми цього впливу.

Патоморфологічними дослідженнями показано, що метод кріовпливу на
тканину РМЗ дозволяє досягти стану субтотальної девіталізації пухлини з
п’ятикратним зменшенням вмісту життєздатної пухлинної паренхіми у 87%
хворих і блокуванням внутрішньопухлинного кровообігу у 13% хворих.

Експериментальні дослідження показали, що кріовплив на пухлинну тканину
приводить до накопичення кріоасоційованих пептидів що мають імуногенні
властивості. Розроблено метод отримання цих пептидів з метою
використання у якості засобу імунотерапії.

Розроблено і впроваджено у клінічну практику метод комплексного
лікування хворих на РМЗ, що включає кріовплив на пухлину молочної залози
в поєднанні з післяопераційним введенням препарату пептидів із власної
пухлинної тканини, підданої кріовпливу.

Протипоказань і ускладнень, пов’язаних із застосуванням даного методу,
незалежно від стадії захворювання, обсягу оперативного втручання, віку
хворого і наявності супутніх захворювань не відзначено.

Показано, що використання імунотерапії супроводжується розвитком
клітинної (реакція гіперчутливості уповільненого типу) і гуморальної
(утворення специфічних антитіл) специфічної імунологічної відповіді, а
також до вираженої тенденції підвищення вмісту CD3+ Т-лімфоцитів і CD4+-
лімфоцитів-хелперів, достовірного зростання імунорегуляторного індексу
(з 1,34 + 0,08 до 1,54 + 0,06 у досліджуваній групі проти з 1,32 + 0,05
до 1,34 + 0,04 у контрольній).

Показано, що під впливом кріовпливу на пухлину і імунотерапії з
застосуванням КАП знижується концентрація СА 15-3 з 36,81 + 4,81 нг/мл
до 23,37 + 3,93 нг/мл (p<0,02) у хворих основної групи проти 34,19 + 5,50 нг/мл і 27,43 + 4,20 нг/мл; (p>0,05) у контрольній.

Застосування розробленого методу для хворих на РМЗ супроводжується
достовірним зниженням розвитку метастазів і рецидивів після операції
(39,28% — у контрольній групі, 25% — при включенні до комплексу
лікування кріовпливу, 0% — при включенні до комплексу лікування
кріовпливу з наступною імунотерапією, р<0,05). ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ До комплексу лікування хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії захворювання рекомендується включати кріовплив на пухлину і післяопераційне проведення імунотерапії за допомогою пептидів, отриманих з тканини власної пухлини, підданої кріовпливу, для попередження рецидивів і метастазів захворювання і поліпшення віддалених результатів лікування. Включення кріовпливу на пухлину і післяопераційного проведення імунотерапії за допомогою кріоасоційованих пептидів не викликає серйозних ускладнень і тому рекомендується для лікування хворих на РМЗ з супутніми захворюваннями, а також тих, що мають протипоказання до поліхіміотерапії. СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ НА ТЕМУ ДИСЕРТАЦІЇ Тащиев Р.К., Галахин К.А., Ашраф Авад Эль-Карим. Морфологическая оценка эффективности криовоздействия на рак молочной железы // Хирургия Украины. – 2003. – № 4(8). – С.188–191. (Дисертант особисто проводив обстеження та лікування хворих, приймав участь в оформленні статті). Тащиев Р.К., Ашраф Авад Эль-Карим. Возможности применение низких температур в комплексном лечении рака молочной железы // Сборник научных работ сотрудников КМАПО им. П.Л. Шупика. – 2004. – Вып. 13. – С. 82-87. (Дисертант особисто обстежував та лікував хворих, проводив статистичний аналіз отриманих результатів, приймав участь в оформленні статті). Тащиев Р.К., Шляховенко В.А., Ашраф Авад Эль-Карим. Изучение криовоздействия на ткани опухоли молочной железы и формирования противоопухолевого иммунитета // Хирургия Украины. – 2006. – № 1 (17). – С. 23–26. (Дисертант особисто проводив обстеження та лікування хворих, проводив статистичний аналіз отриманих результатів, приймав участь в оформленні статті). Тащиев Р.К., Абраменко И.В., Шляховенко В.А., Ашраф Авад Эль Карим. Влияние криодеструкции с аутовакцинацией на некоторые параметры клеточного и гуморального иммунитета больных раком молочной железы // Онкология. – 2006. – т. 8, № 1. – С. 61–64. (Дисертант особисто проводив збір та обробку матеріалу, приймав участь в проведенні статистичного аналізу отриманих результаті та оформленні статті). Тащиев Р.К, Тарутинов В.И., Ашраф Авад Эль-Карим. Применение криодеструкции в комплексном лечении рака молочной железы. // Медицинская криология. – 2003. – Вип. 4. – С. 233–238. (Дисертант особисто обстежував та лікував хворих, проводив статистичний аналіз отриманих результатів, приймав участь в оформленні статті). Тащиев Р.К., Ашраф Авад Эль-Карим. Криодеструкции с аутовакцинацией в комплексном лечении рака молочной железы // Медицинская криология. – 2004. – Вып. 5. – C. 199–204. (Дисертант особисто обстежував та лікував хворих, проводив статистичний аналіз отриманих результатів, приймав участь в оформленні статті). Пат. № 70240А, UA, МКП А61К35/12 Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини. В.О.Шляховенко, Р. К.Тащієв, Ашраф Авад Ель-карім, В.С.Мосієнко, Ю.В.Яніш, С.В.Ольшевський, О.В.Мазур, І.В.Абраменко. заявл. 31.12.2003; опубл. 15.09.04, Бюл. № 9. (Дисертант особисто обстежував та лікував хворих, проводив статистичний аналіз отриманих результатів, приймав участь в оформленні заявки на винахід). Пат. 12183U, UA, МКП А61К35/55, А61В17/00. Спосіб лікування раку молочної залози. Р. К.Тащієв, Ашраф Авад Ель-карім. заявл. 15.08.2005; опубл. 16.01.2006, Бюл. № 1. (Дисертант особисто обстежував та лікував хворих, проводив статистичний аналіз отриманих результатів, приймав участь в оформленні заявки на корисну модель). Тащиев Р.К., Галахин К.А., Ашраф Авад Эль-Карим. Клинический опыт применения низких температур в комплексном лечении рака молочной железы. // Сборник научных работ Института онкологии АМН Украины. – 2002. – Вып. 1. – С. 159–162. Тащиев Р.К., Абраменко И.В., Шляховенко В.А., Ашраф Авад Эль-Карим. Образование низкомолекулярных полипептидов как следствие криовоздействия на ткани опухоли и возможный фактор формирования противоопухолевого иммунитета // Онкология. – 2003. – т. 5, № 2. – С. 133–134. Тащиев Р.К., Ашраф Авад Эль Карим. Одномоментное двустороннее криовоздействие в комплексном лечении рака молочной железы. // Сборник научных работ Института онкологии АМН Украины. – 2004. – Вып. 9. – С. 72–73. Taschiev R.K., Ashraf A. Elkarim. Application of autovaccination with the cryosurgical operations of the breast cancer // Annals of Oncology. – 2005. – Vol.16, suppl. 2. – P. 290 - 291. Тащиев Р.К., Ашраф Авад Эль-Карим. Возможности аутовакцинации при криохирургических операциях в комплексном лечении рака молочной железы // Тезисы II-ой международной научно-практической конференции "Новое в практической медицинской криологии". – Москва, 2005. – С. 33–37. Ашраф Авад Эль Карим, Тащиев Р.К., Абраменко И.В., Шляховенко В.А. Специфические иммунные реакции на аутовакцину из полипептидов, образующихся в результате криовоздействия на ткани опухоли молочной железы // Тезисы VII международной конференции молодых онкологов "Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии". – Киев, Украина 2006. – С. 9. АНОТАЦІЯ Ашраф Авад-Елькарім Фадль-Ельсід. Застосування кріодеструкції і кріоасоційованих пептидів у комплексному лікуванні хворих на рак молочної залози. - рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07. - Онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ – 2006. Дисертація присвячена проблемі підвищення ефективності лікування хворих на рак молочної залози (РМЗ) ІІ-ІІІ стадії шляхом включення до комплексу лікування кріовпливу на пухлину з післяопераційним введенням кріоасоційованих пептидів (КАП), і вивчення деяких імунологічних реакцій при операціях з кріовпливом на пухлину. Проведені експериментальні дослідження для вивчення зміни білкового складу в тканині пухлини молочної залози, вивчено ефективность лікування хворих (безпосередні результати, загальна і безрецидивна виживаність хворих) при включенні кріовпливу на пухлину, а також при кріовпливі з наступним введенням КАП; вивчено спектр білків у тканині пухлини до і після кріовпливу при комплексному лікуванні хворих на РМЗ; проведена оцінка реакцій клітинного і гуморального імунітету при кріовпливі на пухлину, а також при кріовпливі з наступним введенням КАП; вивчені зміни концентрації пухлиноасоційованого маркера СА15-3 у сироватці крові в динаміці. У роботі представлено матеріал дослідження 117 хворих на РМЗ ІІ-ІІІ стадії, а також експериментального дослідження росту перещепленої пухлини молочної залози Са755 на 200 мишах-самках лінії С57 Bl/6. Відзначено, що в результаті кріовпливу в тканині пухлини відбувається накопичення глікопептидів з м.м. 12 кДа. Використання цих пептидів для ад'ювантного лікування хворих на РМЗ показало їх переносимість і нешкідливість, здатність поліпшити результати лікування і знизити частоту рецидивів і метастазів на 40%, а також викликати специфічну імунну реакцію у вигляді реакції гіперчутливості уповільненого типу і появу специфічних антитіл. Отримані результати дають підставу рекомендувати включення методу кріовпливу на пухлину з наступним введенням КАП до комплексного лікування хворих на РМЗ. Ключові слова: рак молочної залози, кріодеструкція, кріоасоційовані пептиди, комплексне лікування, імунотерапія. АННОТАЦИЯ Ашраф Авад-Элькарим Фадль-Эльсид. Применение криодеструкции и криоассоциированных пептидов в комплексном лечении больных раком молочной железы. – рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.07. – Онкология. – Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев – 2006. Диссертация посвящена проблеме повышения эффективности лечения больных раком молочной железы (РМЖ) II-III стадии путем включения в комплекс лечения криовоздействия на опухоль с послеоперационным введением криоассоциированных пептидов (КАП) и изучению некоторых иммунологических реакций при операциях с криовоздействием на опухоль. Задачи исследования включали: проведение экспериментального исследования для изучения изменения белкового состава ткани опухоли молочной железы, изучение эффективности лечения больных (непосредственные результаты, общая и безрецидивная выживаемость больных) при включении криовоздействия на опухоли, а также при криовоздействии с последующим введением КАП; изучение спектра белков в ткани опухоли до и после криовоздействия при комплексном лечении больных РМЖ; оценка реакций клеточного и гуморального иммунитета при криовоздействии на опухоли, а также при криовоздействии с последующим введением КАП; изучение изменения концентрации опухолеассоциированного маркера СА15-3 в сыворотке крови в динамике. В работе представлен материал исследования 117 больных РМЖ II-III стадии, а также экспериментального исследования роста перевивной опухоли молочной железы Са755 на 200 мышах – самках линии С57 Bl/6. Отмечено, что в результате криовоздействия в ткани опухоли уменьшается содержание белков с м.м. 40-200 кДа и одновременно происходит накопление гликопептидов с м.м. 12 кДа. Была проведена работа по накоплению, выделению и очистке этих пептидов. При трехкратном введении животным препарата КАП и последующей перевивке опухоли установлено, что у них возникает торможение роста опухоли на 76%, кроме того, у 40% животных опухоли не развивались вообще. Использование КАП для адъювантного лечения больных РМЖ показало их переносимость и безвредность. Предложенный метод лечения РМЖ с включением криовоздействия на опухоль с последующей иммунотерапией с помощью КАП способствовал улучшению результатов лечения и снижению частоты рецидивов и метастазов на 40%. Выявлено, что криовоздействие на опухоль молочной железы с последующей иммунотерапией сопровождается развитием клеточной (реакция гиперчувствительности замедленного типа) и гуморальной (образование специфических антител на компоненты вводимых криоассоциированных пептидов) специфической иммунной реакции, а также выраженной тенденции к повышению содержания CD3+ Т-лимфоцитов и CD4+- лимфоцитов-хелперов и достоверному возрастанию иммунорегуляторного индекса (1,34 + 0,08 до 1,54 + 0,06 в исследуемой группе против с 1,32 + 0,05 до 1,34 + 0,04 в контрольной). Включение в комплексное лечение больных РМЖ криодеструкции опухоли и последующей иммунотерапии с помощью препарата КАП приводит к достоверному снижению концентрации опухолевого маркера СА 15-3 (с 36,81 + 4,81 нг/мл до 23,37 + 3,93 нг/мл (p<0,02), против 34,19 + 5,50 нг/мл и 27,43 + 4,20 нг/мл; (p>0,05) в контрольной). Также снижается частота
развития метастазов и рецидивов после операции (39,28% – в контрольной
группе, 25% – при включении в комплекс лечения криовоздействия, 0% – при
включении в комплекс лечения криовоздействия с последующей
иммунотерапией, (р<0,05). Полученные результаты дают основание рекомендовать включение метода криовоздействия на опухоль с последующим введением КАП в комплексное лечение больных РМЖ , особенно с сопутствующими заболеваниями и противопоказаниями к полихимиотерапии. Ключевые слова: рак молочной железы, криодеструкция, криоассоциированные пептиды, комплексное лечение, иммунотерапия. ANNOTATION Ashraf Awad-Elkarim Fadl-Elseed. The Application of cryodestruction and cryoassociated peptides in combined treatment of patients with the breast cancer. –Manuscript. Dissertation for the candidate of medical science degree in speciality 14.01.07 – Oncology. – R.E. Kevetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of NAS of Ukraine, Kyiv – 2006. Dissertation covers the problem of increasing the efficacy of treatment of patients with breast cancer (BC) II-III stage, by including cryodestruction of tumour and postoperative immunotherapy with cryoassociated peptides (CAP) into the combined treatment, and studying of some immunological responses associated with cryosurgical operations. An experimental research was carried out to study the changes in protein's profile in the breast tumour's tissue. Clinically we studied the efficacy of cryodestruction of tumour with subsequent immunotherapy with CAP in the treatment of patients (overall and disease-free survival); the biochemical changes in the profile of the protein in the tumor tissue in result of cryodestruction; investigate the response of the cellular and humoral immunity to cryodestruction of tumour, and to the immunotherapy with CAP; to study, in dynamics, the changes in concentration of tumor-associated marker CA15-3 in the serum. The work included the material of investigation of 117 patients with BC II-III stages, and an experimental research of tumour Ca755 in 200 mice (female, C57 Bl/6). It was shown, that an accumulation of glycopeptides with MM. 12 kDa occurs in the tumour's tissue as a result of cryodestruction. The practice of using those peptides for adjuvant treatment of patients with BC has shown their ability to improve the results of treatment and to decrease the frequency of relapses and metastasis in 40 %, and also to cause a specific immune response in the form of reaction of delayed-type hypersensitivity and the formation of specific antibodies to CAP. The obtained results give the basis to recommend the method of cryodestruction of tumour with subsequent immunotherapy with CAP in the combined treatment of patients with BC. Key words: breast cancer, cryodestruction, cryoassociated peptides, combined treatment, immunotherapy. 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Тривалість (міс.) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Кумулятівна виживаність кріо+іммунотерапія кріо контроль Групи 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 Розведення сироваток Діаметр преципітата, мм Сироватки після імунізації початкові сироватки

Похожие записи