.

Закономірності розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки щурів за участі Сa2+-залежних фосфоліпідних сигнальних систем після радіаційного ура

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3532
Скачать документ

Київський університет імені Тараса Шевченка

МАТИШЕВСЬКА ОЛЬГА ПАВЛІВНА

УДК: 577.125: 591: 144: 612.014

ЗАКОНОМІРНОСТІ РОЗВИТКУ ІНТЕРФАЗНОЇ ЗАГИБЕЛІ ЛІМФОЦИТІВ СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ ЗА УЧАСТІ Са2+ – ЗАЛЕЖНИХ ФОСФОЛІПІДНИХ СИГНАЛЬНИХ СИСТЕМ ПІСЛЯ РАДІАЦІЙНОГО УРАЖЕННЯ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеню
доктора біологічних наук

Київ – 1999

Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біохімії Київського університету імені Тараса Шевченка

Науковий консультант: член-кор. НАН України, професор
Кучеренко Микола Євдокимови, Київський
університет імені Тараса Шевченка, завідувач
кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Костерін Сергій Олексійович, Інститут
біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України
завідувач відділу біохімії м’язів

доктор біологічних наук
Дмитренко Микола Петрович, Інститут
екогігієни і токсиколоагії ім.Л.І.Медведя
МОЗ України, завідувач лабораторії біохімії

доктор біологічних наук
Дружин Микола Олександрович, Інститут
експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім.Р.Є.Кавецького НАН України, провідний
науковий співробітник

Провідна установа: Національни медичний університет імені
О.О.Богомольця, м.Київ

Захист відбудеться 25 листопада 1999 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському університеті ім.Т.Шевченка за адресою: просп.акадюГлушкова 2, біологічний факультет, ауд.215.
Поштова адреса: 01033, Київ – 33, вул.Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: вул.Володимирська, 58.

Автореферат розіслани 25 жовтня 1999 року.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Протягом останніх років особливої актуальності набули дослідження біохімічних механізмів формування клітинної відповіді на дію генотоксичних факторів різної природи, у тому числі такого, як іонізуюча радіація. Одним з варіантів клітинної відповіді багатоклітинних систем, направленої на підтримання клітинного гомеостазу та на запобігання переродження клітин внаслідок дії пошкоджуючого фактора є апоптоз, або програмована загибель клітин у інтерфазі (Kerr J.,1980.; Wyllie А.,1987).
Значного успіху у з’ясуванні біохімічних закономірностей розвитку апоптозу було досягнуто завдяки дослідженню радіаційної загибелі лімфоїдних клітин. Лімфоцити – єдині з клітин імунної системи, які гинуть пропорційно до дози ( у діапазоні до 3 Гр ) до вступу у мітоз протягом першої доби після дії радіації. Експериментальне моделювання відповіді лімфоцитів in vitro на дію іонізуючої радіації за умови опромінення клітинної суспензії тимоцитів та ліній лімфоїдних клітин дозволило встановити причинний зв’язок між такою морфологічною ознакою загибелі клітин, як пікноз ядер та міжнуклеосомною деградацією хроматину (Cohen J., 1992; Zhivotovsky B. et al., 1981), виявити залежність загибелі клітин від експресії генів ( Hallahan D., 1992; Wilson L. et al.,1993) та довести, що радіаційна загибель лімфоцитів у інтерфазі є різновидністю апоптозу. Було висунуто гіпотезу, згідно якої безпосередньою мішенню дії радіації є ДНК, а вирішальну роль у ініціації апоптозу відіграє ушкодження генетичного матеріалу, внаслідок чого деблокується генетично детермінована програма загибелі (Duke R. et al., 1983; Wyllie A., 1985). З іншого боку, дослідження широкого спектру індукторів апоптозу виявили залежність інтерфазної загибелі клітин від внутрішньоклітинного балансу іонів кальція ( Nicotera P.et al, 1994, Габай В. и др., 1990) та від систем клітинної сигналізації, які здатні посилювати отриманий сигнал та передавати його транскрипційним факторам – регуляторам експресії генів, що дозволяє визначати апоптоз як загибель від слабких сигнальних взаємодій (Uckun F. et al., 1993; Ейдус Л.,1997; Корыстов В. и др., 1998).
Серед систем, які забезпечують рецепцію сигналу на рівні плазматичної мембрани лімфоцитів та його передачу у внутрішньоклітинний простір, слід насамперед виділити такі Са2+- залежні фосфоліпідні трансдукційні системи, як поліфосфоінозитидна та цикл арахідонової кислоти. Ключові ферменти цих систем – сигнальні фосфоліпази С та А2 використовують мембранні фосфоліпіди як джерело для синтезу універсальних внутрішньоклітинних посередників – інозитол-1,4,5-трифосфату, диацилгліцеролу, арахідонової кислоти та її метаболітів. Внутрішньоклітинні шляхи передачі сигналу за участі цих посередників, що активуються у лімфоцитах у випадку індукованої радіацією інтерфазної загибелі, значною мірою співпадають з тими, які контролюють активацію та диференціацію лімфоцитів у нормі. В обох випадках мають місце підвищення концентрації йонів кальцію у цитоплазмі, посилення гідролізу поліфосфоінозитидів, інтенсифікація обміну арахідонової кислоти, експресія генів с-fos та c-jun та інш.(Будницкая Е., 1986; Uckun F. et al.,1992; Шапошникова В. и др.,1998). Залишається відкритим питання про те, яким чином активація у лімфоцитах однакових регуляторних механізмів може приводити до протилежних наслідків. Важливого значення для вирішення цієї проблеми набуває пошук можливих шляхів перехрещення різних сигнальних шляхів та активації механізмів, що є специфічними тригерами апоптозу, таких, як активація сфінгомієлінази, активація цистеїнових протеїназ сімейства ІСЕ та інш. (Kolesnick R. & Kronke M, 1994; Kidd V., 1998).
Недостатньо досліджені особливості інтерфазної загибелі лімфоцитів за опромінення цілого організму, хоча саме цей тип загибелі визначає такий специфічний прояв променевої хвороби ссавців, як лімфопенія (Ярилин А., 1988; Howie S. et al., 1994). Вважається встановленим, що пригнічення імунної відповіді організму після дії радіації зумовлене вибірковою інтерфазною загибеллю лімфоцитів внаслідок порушенням регуляторної взаємодії між різними субпопуляціями лімфоцитів у органах лімфопоезу – кістковому мозку, тимусі та селезінці (Горизонтов П. и др.,1983; Meyn R.et al., 1993). Тому важливу роль у механізмах генотоксичної дії радіації надають паракринним месенджерам –лейкотрієнам, цитокінінам, факторам росту, які регулюють тривалу у часі міжклітинну взаємодію лімфоцитів різних субпопуляцій та зумовлюють уповільнену кінетику індукції генів – регуляторів апоптозу ( Эйдус Л.1996; Wilson R. et al., 1993; Wu X.et al., 1995).
У зв’язку з цим особливої актуальності набуває дослідження участі різних вторинних посередників та взаємодії сигнальних систем за розвитку індукованої в умовах in vivo радіаційної інтерфазної загибелі клітин у популяції лімфоцитів такого важливого лімфоїдного органу, як селезінка.
Мета та задачі дослідження. Метою роботи було з’ясувати роль компонентів Са2+ – залежних фосфоліпідних трансдукційних систем у ініціації та проведенні індукованого іонізуючою радіацією апоптогенного сигналу у лімфоцитах селезінки щурів.
Були поставлені такі задачі:
– на основі кількісного аналізу та порівняння морфологічних і біохімічних показників стану клітин у популяції лімфоцитів селезінки контрольних та опромінених рентгенівськими променями щурів визначити дозу іонізуючої радіації та термін після впливу, за яких ініціюється інтерфазна загибель лімфоцитів;
– визначити концентрацію вільного цитозольного Са2+ у лімфоцитах селезінки та проникність плазматичної мембрани для Са2+ за розвитку інтерфазної загибелі клітин;
– дослідити зв’язок між структурним станом хроматину та концентрацією цитоплазматичного кальцію у лімфоцитах;
– дослідити активність фосфоліпази С та утворення інозитолфосфатів у лімфоцитах селезінки у контролі та після обробки клітин поліклональними мітогенами та кальцієвим іонофором;
– дослідити активність фосфоліпази С та утворення інозитолфосфатів у лімфоцитах селезінки у динаміці формування відповіді клітин на дію радіації;
– дослідити активність фосфоліпази А2 та вивільнення арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів у лімфоцитах селезінки у контролі та після обробки клітин кальцієвим іонофором;
– дослідити активність фосфоліпази А2 та вивільнення арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів лімфоцитів селезінки за розвитку інтерфазної загибелі клітин;
– дослідити активність ліпоксигенази та вміст первинних продуктів ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти у лімфоцитах селезінки у динаміці формування відповіді клітин на дію радіації;
– дослідити зв’язок між ферментативним переокисленням ліпідів по ліпоксигеназному шляху та деградацією ДНК за розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки з використанням специфічного інгібітора ліпоксигенази ;
– розробити схему шляхів передачі та посилення індукованого радіацією апоптогенного сигналу у лімфоцитах за участі Са2+- залежних фосфоліпідних трансдукційних систем .
Наукова новизна і практичне значення роботи. У результаті проведених досліджень вперше з’ясована роль Са2+- залежних фосфоліпідних трансдукційних систем у розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки за радіаційного ураження організму. Проведений порівняльний аналіз параметрів функціонування поліфосфоінозитидної системи та метаболізму арахідонової кислоти та динаміки розвитку in vivo морфологічних та біохімічних ознак розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин.
Вперше виявлено раннє зростання концентрації вільного цитозольного Са2+ у лімфоцитах селезінки опромінених тварин за розвитку інтерфазної загибелі. Показано, що підвищення концентрації цитозольного Са2+ у клітинах передує міжнуклеосомній фрагментації хроматину, а подовжене утримання підвищеного рівня [Ca2+]i внаслідок зростання кальцієвої проникності плазматичної мембрани прискорює фрагментацію ДНК.
Показано, що на початковій стадії розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин відбувається активація фосфоліпази С та модифікація взаємодії компонентів у системі поверхневий рецептор-мембранозв’язані регуляторні білки – фосфоліпаза С. Вперше встановлено, що на ранньому етапі розвитку інтерфазної загибелі у лімфоцитах селезінки посилюється синтез основного Са2+-мобілізуючого посередника – інозитол-1,4,5-трифосфату.
Досліджені властивості фосфоліпази А2 лімфоцитів селезінки, що гідролізує арахідоноїлвмісні фосфоліпіди та ідентифіковані ендогенні субстрати ферменту. Показано, що у процесі індукованої радіацією інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки відбувається вивільнення арахідонової кислоти зі складу мембранних фосфоліпідів та одночасне підвищення у мембранній фракції клітин активності фосфоліпази А2, що гідролізує фосфатидилхолін та фосфатидилетаноламін.
Встановлено, що лімфоцити селезінки проявляють ліпоксигеназну активність та ідентифіковано ендогенні продукти ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти. Знайдено, що у процесі розвитку радіаційної загибелі лімфоцитів селезінки у інтерфазі відбувається інтенсифікація ферментативного переокислення субстратів ліпоксигеназою та підвищення вмісту 15-гідроксиейкозатетраєнової кислоти та лейкотрієну В4. Доведено, що специфічне пригнічення ліпоксигеназного шляху переокислення арахідонової кислоти призводить до значного зниження міжнуклеосомної фрагментації ДНК у лімфоцитах селезінки опромінених тварин.
На основі отриманих даних та даних літератури розроблена схема шляхів передачі та посилення індукованого радіацією апоптогенного сигналу у лімфоцитах селезінки за участі іонів кальцію, окремих компонентів Са2+- залежних фосфоліпідних трансдукційних систем та факторів, що є специфічними тригерами апоптозу.
Результати проведених досліджень мають загальнотеоретичне значення для адекватної біохімічної оцінки плейотропних ефектів екстремальних нефізіологічних та цитотоксичних факторів. Дослідження шляхів передачі сигналу до розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів є необхідним етапом для встановлення конкретних біохімічних механізмів реалізації апоптозу клітин різних типів. Ідентифікація окремих сигнальних шляхів апоптозу має важливе практичне значення, оскільки забезпечує можливість розробки підходів до контролю над цим процесом, зокрема, до направленого пошуку препаратів, здатних ініціювати інтерфазну загибель перероджених злоякісних клітин або ж попереджати загибель нормальних клітин у випадку променевої терапії або дії інших нефізіологічних факторів.
Особистий внесок автора. Дисертантом особисто здійснений інформаційний пошук та оцінка літературних даних, розроблена схема та обгрунтована методологія постановки експериментів, виконані експериментальні дослідження, проведений аналіз отриманих результатів, підготовлені друковані праці. Результати деяких підрозділів отримані безпосередньо автором та за участі аспірантів кафедри біохімії (Сировець Т.О. – підрозділ 3.2.1., Слатвінської О.В.- підрозділ 3.3.3, Пастуха В.М.- підрозділ 3.3.4., Солодушко В.О – підрозділ 3.1.1). Отримані результати викладені у спільних публікаціях. Електронно-мікроскопічний аналіз препаратів лімфоцитів селезінки здійснений у співробітництві зі с.н.с. Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Чернишовим В.І.
Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка та виконана у рамках теми N 97083 ” Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації ” комплексної наукової програми “Здоров’я людини”, а також тем 5.3/ 34 та 5.4/483 Міністерства України у справах науки і технології.
Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на VI (Київ, 1992) та VII (Київ, 1997) Українських біохімічних з’їздах, II ( Київ, 1993) та III (Москва, 1997) Радіобіологічних з’їздах, міжнарожній науковій конференції ” Навколишнє середовище і здоров’я ” ( Чернівці, 1993), I Українському з’їзді біофізичного товариства ( Київ, 1994), I міжнародній практичній конференції ” Sustainable Development: Environmental Pollution and Ecological Safety”( Дніпропетровськ, 1995), Х Міжнародному конгресі з радіаційних досліджень ( Вюрцбург, Німеччина, 1995), конференції ” Віддалені наслідки опромінення в імунній системі та гемопоетичній системах” ( Київ, 1996), конференції ” Проблемы противолучевой защиты” ( Москва, 1998).
Публікації. Результати досліджень представлені у 20 статтях та 13 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних та зарубіжних журналах, збірниках наукових праць та матеріалах з’їздів та конференцій.
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на …сторінках машинописного тексту і складається із вступу, основної частини, що містить огляд літератури ( 4 розділи) та експериментальну частину (3 розділи), заключної частини (1 розділ), висновків та цитованої літератури ( …. джерел). Робота містить ….рисунків , …. таблиць та 1 схему.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури докладно розглянуті питання біохімічної регуляції протікання процесів активації, диференціації та апоптичної загибелі лімфоїдних клітин. Проведений детальний аналіз сучасних уявлень про молекулярні механізми та функціональне значення таких регуляторних систем, як Са2+-мобілізуюча поліфосфоінозитидна та цикл арахідонової кислоти. Висвітлено біохімічні аспекти розвитку інтерфазної загибелі клітин, викликаної іонізуючою радіацією.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі були використані такі реагенти та матеріали: Ficoll-Paque ( Pharmacia, Швеція), нордигідрогуайаретикова кислота (Serva, Німеччина), квіна-2 ацетоксиметиловий ефір(Amersham, Велика Британія), НЕРЕS, іонофор А23187, фітогемаглютинін та ліпополісахарид E. coli, луброл РХ, лінолева кислота, тритон Х-100 (Ferak, Німеччина), 14С-арахідонова кислота, 14С-2- арахідоноїлфосфоліпіди, 14С-2- лінолеїлфосфатидилетаноламін, фосфатидил-2-3Н-інозитол, 3Н-2-міоінозитол, (Amersham, Англія), набори для визначення вмісту 15-НЕТЕ ( Advanced Magnetic Inc, CША), лейкотрієну В4, простагландинів F2 та E2 ( Amersham, Англія); пластини для тонкошарової хроматографії, сілікагель RH 40/5, фільтри “Синпор” N6 (Хемапол, Чехія), колонки Particil 10 SAX для аніонообмінної хроматографії інозитолфосфатів (Whatman, Англія); фосфатидилсерин, фосфатидилхолін, фосфатидилетаноламін, фосфатидилінозит, фосфатидилгліцерол (завод бактеріальних препаратів, Харків); 45СаCl2 , 32Р-Н3РО4 – підприємство “Ізотоп”, Київ.
Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей масою 130 –150 г. Тварин піддавали тотальному одноразовому опроміненню на рентгенівській установці РУМ-17 за таких експозиційних доз – 1,29 10-2 Кл/кг ( поглинута доза – 0,5 Гр) та 2,58 10-2 Кл/кг ( поглинута доза – 1 Гр). Умови опромінення: потужність дози– 0, 2 Гр/хв, фільтри 0,5 мм ( Cu + Al), напруга 180 кВ, сила струму 5 мА, фокусна відстань – 50 см.
Лімфоцити отримували методом градієнтного центрифугування суспензії клітин селезінки у розчині Ficoll-Paque або фікол-верографіну (  = 1,077) (Boyum A., 1968). Після руйнування клітин у гіпоосмотичному буфері та центрифугування отримували фракції без’ядерного гомогенату ( супернатант 1000g, 5 хв), цитозольну та мембранну ( 100000g, 60 хв).
Концентрацію вільного Са2+ у клітинах визначали з застосуванням флуоресцентного зонду квін-2 (Tsien R.et al.,1982). Флуоресценцію суспензії клітин вимірювали на спектрофлюориметрі Shimadzu RF-510 ( Японія),  збудження – 339 нм,  емісії – 490 нм.
Вміст малонового диальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою ( Стальная И. и Гаришвили Т., 1977). Антиокислювальну активність визначали за константою пригнічення реакції окислення 2,4- дихлорфеноліндофенолу біологічним матеріалом (Семенов В.,1985).
Оцінку фрагментації ДНК проводили після лізису клітин розчином з 2 мМ ЕДТА та 0,5 % тритоном Х-100. Проби центрифугували ( 15000 g, 20 хв) для розділення інтактного хроматину (осад) від відщеплених фрагментів ДНК (супернатант). Вміст ДНК у зразках визначали із застосуванням дифеніламінового реактиву ( Burton K.,1956).
ДНК екстрагували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24:1) після депротеїнізації проб (Skalka M. et al., 1976). Електрофорез ДНК проводили у 1% агарозному гелі за напруги поля 2 мВ/сек протягом 15 год (200 С). У якості маркерних використовували фрагменти ДНК фага ., утворені рестриктазою Pst I. Гелі фарбували розчином броміду етидію (1 мкг/мл) і після збудження флуоресценції ультрафіолетом фотографували на плівку Мікрат-300. Негативи денситометрували на мікроденситометрі MD-100 ( Німеччина).
Вхід кальцію у лімфоцити визначали за інкубування суспензії лімфоцитів у стандартному сольовому середовищі, що містило 1 мкКі 45СаCl2. Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри Синпор N 6.
Оцінку утворення інозитолфосфатів проводили з використанням клітин, інкубуваних протягом 1 год у середовищі 199, що містило 5 мкКі /мл 3H-2-міо-інозитолу. У середовище інкубації попередньо мічених клітин додавали 0,1% БСА та 10 мМ LiCl для пригнічення активності фосфомоноестераз. Реакцію зупиняли додаванням суміші хлороформ:метанол (1:2). Водну фазу використовували для розділу інозитолфосфатів на колонках Partisil 10 SAX. Елюцію інозитол-1-фосфату, інозитол-1,4-дифосфату та інозитол-1,4,5-трифосфату проводили послідовно, використовуючи по 2 мл 0,2М, 0,4М та 0,8М КН2 РО4 (рН 3,35) відповідно (Sugiya Н. et al., 1987).
Активність фосфоліпази С визначали у середовищі, що містило 0,02 мкКі фосфатидил-2- 3H- інозитолу ( 19,9 Кі/ммоль) (Carter Н. et al., 1987). Реакцію зупиняли додаванням суміші хлороформ : метанол : HCl ( 100 : 200 : 0,3 ), 0,6 мл хлороформу та 0,6 мл води. Кількість відщепленого інозитолу визначали за радіоактивністю верхньої фази.
Для включення арахідонової кислоти лімфоцити інкубували у середовищі 199, що містило 0,5 мкКі 14С- арахідонової кислоти ( 56 мКі/ммоль) протягом 1 год при 370С. Ліпіди екстрагували сумішшю хлороформ : метанол : НCl (1 : 2 : 0,06). Тонкошарову хроматографію ліпідів проводили на пластинах “Хемапол” у системі хлороформ : метанол : аміак ( 68 : 28 : 4) ( Hirata F. et al.,1978). Розподіл 14С- арахідонату поміж фосфоліпідів оцінювали за радіоактивністю плям.
Для оцінки вивільнення арахідонової кислоти попередньо мічені за 14С – арахідонатом лімфоцити інкубували у стандартному сольовому розчині, що містив деліпідизований 0,2 % БСА для зв’язування вивільненої жирної кислоти. Реакцію зупиняли, додаючи холодний розчин 10 мМ КН2РО4 (рН 7,4). Після центрифугування проб ( 1000g, 5 хв) визначали радіактивність надосадової рідини.
Активність фосфоліпази А2 визначали у середовищі, що містило 0,05 мкКі 1-стеароїл-2-14С-арахідоноїл-ФХ або 1-ацил-2-14С-арахідоноїл – ФЕ (56 мКі/ммоль) (Katsumata M. et al.,1986). Реакцію зупиняли, додаючи 5% розчин тритону – Х-100 та 40 мМ ЕДТА. Арахідонову кислоту екстрагували, додаючи 150 мг сульфату натрію та 2,5 мл гексану. Рівень вивільненого арахідонату розраховували за радіоактивністю аліквоти гексану після розділення фаз.
Активність ліпоксигенази визначали спектрофотометричним способом з використанням лінолевої кислоти (Бутович И. и Кухарь В.,1989). Реакцію проводили у термостатованих кюветах спектрофотометра Specord M-40 при 35 0С, реєструючи приріст оптичного поглинання при 234нм, зв’язаного з утворенням гідропероксидних похідних лінолевої кислоти.
Визначення вмісту метаболітів арахідонової кислоти у клітинах проводили радіоімунним методом після екстрагування ейкозаноїдів холодним етилацетатом з використанням наборів для визначення лейкотрієну В4 (Аmersham, Англія) та 15 -НЕТЕ (Advanced Magnetic Inc, США) згідно рекомендацій фірми – виробника.
Статистичну обробку даних проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский М.,1981) Розрахунки та побудова графіків проводились на IBM PC-486 з використанням прикладних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Морфологічна та біохімічна оцінка стану лімфоцитів селезінки після рентгенівського опромінення тварин. Першочерговим пунктом дослідження формування in vivo відповіді лімфоцитів селезінки на дію іонізуючої радіації було отримання популяції радіочутливих клітин селезінки та морфологічна оцінка їх стану у динаміці після рентгенівського опромінення тварин. Згідно даних електронно-мікроскопічного аналізу, отримуваний препарат лімфоцитів селезінки представлений малими та середніми лімфоцитами з рівномірним розміщенням еухроматинових та гетерохроматинових зон у ядрі. Це клітини, що перебувають у стадіях G0 та G1 клітинного циклу і характеризуються нестабільністю геному та значною чутливістю до дії радіації.
Для з’ясування залежності ураження лімфоцитів селезінки щурів від дози радіації тварин піддавали тотальному рентгенівському опроміненню у дозах 0,5 та 1 Гр та визначали вміст клітин у препараті лімфоцитів селезінки у термін до 6 діб. Звязок, який спостерігається між дозою опромінення тварин, кількістю загиблих клітин та початком їх регенерації у селезінці дозволив використати величину загальної кількості лімфоцитів у одиниці обєму тканини як кількісний критерій оцінки їх променевого ураження. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр кількість лімфоцитів у досліджуваній популяції не змінювалась протягом 2 год, знижувалась через 1 добу на 27,8%, а через 3 доби повністю відновлювалась. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр зниження кількості лімфоцитів селезінки спостерігалось у більш ранній термін і було більш значним – на 31,9 % через 12 год і на 53,2 % через 1 добу, часткове відновлення мало місце через 6 діб. Отже, тотальне рентгенівське опромінення тварин у дозах 0,5 та 1 Гр призводить до різного за швидкістю та величиною зниження кількості малих та середніх лімфоцитів селезінки протягом першої доби. Процес спустошення популяції лімфоцитів після дії радіації визначається двома показниками: інтерфазною загибеллю клітин у ранній період після дії чинника та подальшою реалізацією ураження у ході репродуктивної загибелі клітин ( Белоусова О. и др., 1979; Ярилин А. и др., 1982). Для визначення характеру радіаційної загибелі клітин досліджували морфологічні та біохімічні показники стану лімфоцитів у термін, який передує максимальному зниженню їх кількості у популяції.
У препаратах лімфоцитів, отриманих через 3 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр, морфологічних відмінностей порівняно з контролем не виявлено. Через 12 год у популяції лімфоцитів виявляються окремі клітини з нерівномірним розміщенням хроматину та зоною перинуклеарного просвітлення, що розцінюють як ознаку активації лімфоцитів та проходження S – G2 фаз клітинного циклу ( Петров Р. и др., 1983).
Більш значні морфологічні зміни виявляються у препаратах лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр – через 3 год у популяції лімфоцитів присутні клітини з осмофільними скупченнями гранулярного гетерохроматину, зосередженими біля одного з полюсів ядерної мембрани, а також клітини з ядром зменшених розмірів, заповненим конденсованим гетерохроматином. Такі морфологічні зміни відповідають раннім ознакам розвитку інтерфазної загибелі клітин, коли має місце утворення крупних (50 – 300 тисяч пар основ) фрагментів ДНК (Sun X. & Cohen G., 1994). Через 12 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр у популяції лімфоцитів селезінки, окрім клітин з пікнотичним ядром, виявлено вакуолізовані клітини та оточені мембраною фрагменти, що містять хроматин та інтактні органели. Такі ознаки є показником пізньої стадії апоптозу та розвитку некротичних процесів у клітинах (Columbano A., 1995; Kroemer G. et al., 1998).
Для біохімічної оцінки структурного стану хроматину у лімфоцитах досліджували вміст продуктів деградації хроматину – низькомолекулярних фрагментів ДНК полідезиксирибонуклеотидів (ПДН), які екстрагуються з ядер у розчин з низькою іонною силою (рис.1). У лімфоцитах селезінки опромінених тварин виявлено підвищення частки деградованої ДНК, яке залежить від дози радіації. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр підвищення вмісту ПДН у клітинах виявляється через 12 год і є незначним – до 16% від загального вмісту ДНК.
Після дії радіації у дозі 1 Гр підвищення вмісту ПДН у клітинах виявляється через 6 год, через 12 год воно становить 31 % від загального вмісту ДНК. Як показало електрофоретичне розділення ДНК у агарозному гелі, фрагменти ДНК лімфоцитів селезінки опромінених тварин розподілялись у вигляді смуг, інтенсивність яких була значно більшою у випадку розділення ДНК лімфоцитів тварин, опромінених у дозі 1 Гр (рис. 2). Згідно маркерного аналізу, довжина фрагментів у смугах складала 400, 600 та 800 пар нуклеотидів, тобто була кратною довжині ДНК нуклеосом. Отже, у лімфоцитах селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, відбувається значне впорядковане міжнуклеосомне розщеплення хроматину за участі ферментів, які атакують лінкерні ділянки ДНК. Одним з таких ферментів є Mg2+, Ca2+ – залежна ендонуклеаза, що конститутивно експресується у лімфоцитах та активується за розвитку інтерфазної загибелі клітин (Zhivotovsky B. et al., 1993; Никонова Л. и др., 1998).

Порушення у системі підтримання стабільності хроматину значною мірою визначається зміною таких параметрів метаболічного стану клітини, як окисно-антиоксидантна рівновага та кальцієвий гомеостаз. Як показало дослідження антиоксидантної активності та вмісту малонового диальдегіду, упродовж 6 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр процеси вільнорадикального окислення у лімфоцитах селезінки утримуються на мінімальному стаціонарному рівні. Після дії радіації у дозі 1 Гр спостерігається підвищення вмісту МДА порівняно з контролем у термін 3 – 6 год та зниження антиоксидантної активності через 12 год. Отже, опромінення тварин у дозі 1 Гр призводить до раннього зсуву окисно-антиоксидантної рівноваги у лімфоцитах у бік надмірної інтенсифікації реакцій вільнорадикального переокислення. На нашу думку, активація процесів перекисного окислення мембранних ліпідів, яка значною мірою позначається на структурному стані мембран, може призводити також до порушення компартменталізації такого важливого вторинного месенджера, як кальцій.
Згідно результатів, отриманих нами у експериментах з використанням флюоресцентного зонду квін-2, опромінення тварин у дозах 0,5 та 1 Гр призводить до порушення кальцієвого гомеостазу у лімфоцитах селезінки (табл.1). Концентрація вільного цитозольного Ca2+ у лімфоцитах контрольних тварин становила 117  10 нМ. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр значення [Са2+]i у лімфоцитах не змінюється протягом 3-6 год і зростає через 12 год. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр концентрація катіону у цитозолі клітин зростає через 3 год і утримується на підвищеному рівні упродовж 12 год.

Таблиця 1
Концентрація вільного цитозольного Са2+ ( нМ) у лімфоцитах селезінки після опромінення тварин (n = 6-8)

Доза опромінення 3 год 6 год 12 год
0,5 Гр 112  18 110  15 238  31 *
1 Гр 167  21 * 245  32 * 195  25 *
* р  0,05 порівняно з контролем

Критеріями порушення кальцієвого гомеостазу у клітинах є не лише підвищення концентрації Са2+ у цитоплазмі, але й зміна мембранної проникності для катіону. Для оцінки кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів досліджували вхід Са2+ у клітини (рис.3) та розраховували кінетичні параметри процесу – початкову швидкість надходження (Vо) та максимальний вхід (Рmax) катіона. Аналіз кінетичних параметрів дозволив проаналізувати можливі причини виявленого нами підвищення концентрації йонів вільного цитозольного кальція у лімфоцитах опромінених тварин.
Через 3-6 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр кінетичні параметри входу Са2+ у лімфоцити не змінюються. Посилення входу катіону внаслідок зростання початкової швидкості його надходження у клітини виявляється через 12 год ( рис. 3А). Отже, підвищення рівня [Ca2+]i у лімфоцитах після дії радіації у дозі 0,5 Гр співпадає з підвищенням кальцієвої проникності плазматичної мембрани клітин і зумовлене посиленням входу катіону із позаклітинного середовища.
Через 3 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр кінетичні параметри входу Са2+ у лімфоцити також не змінюються ( рис. 3Б). Це означає, що підвищення рівня [Ca2+]i на ранньому етапі ініціації інтерфазної загибелі клітин відбувається внаслідок виходу катіону з внутрішньоклітинних депо. Через 6 год відмічено двократне підвищення початкової швидкості надходження Са2+ у лімфоцити, а через 12 год має місце зростання не лише Vо, але й інтесивності потоку кальцію через плазматичну мембрану, про що свідчить підвищення величини Рmax. Таким чином, раннє підвищення рівня вільного Са2+ у цитозолі лімфоцитів та подовжене його утримання після опромінення тварин у дозі 1 Гр є показником надлишкового накопичення Са2+ у лімфоцитах внаслідок незбалансованості процесів буферування катіона у внутрішньоклітинних депо та його входу через плазматичну мембрану.
Виявлене нами підвищення кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів у термін 3-6 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр дозволило дослідити вплив Са2+ на процес міжнуклеосомної деградації хроматину у клітинах. Для цього вивчали динаміку накопичення фрагментів ДНК (ПДН) у контрольних лімфоцитах та лімфоцитах, виділених через 3 год після дії радіації протягом 90-хвилинної інкубації клітин у середовищі без додавання кальцію та у середовищі, що містило 2 мМ СаCl2 (рис.4).

Інкубація клітин, виділених з контрольних тварин, супроводжується незначним, незалежним від наявності кальцію у середовищі інкубації, зростанням вмісту ПДН. На початковому етапі інкубації лімфоцитів селезінки опромінених тварин у середовищі без додавання кальцію має місце підвищення швидкості фрагментації ДНК порівняно з контролем, однак, на більш пізніх етапах інкубації швидкість накопичення ПДН у клітинах знижується. Додавання кальцію у середовище інкубації призводить до значного зростання швидкості розщеплення ДНК та до підвищення вмісту ПДН, накопичених протягом 90 хв. Отже, накопичення Са2+ у лімфоцитах селезінки внаслідок підвищення кальцієвої проникності плазматичної мембрани може бути однією з причин опосередкованих через кальцій незворотніх порушень структури та цілісності хроматину за розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки після опромінення тварин у дозі 1 Гр.
Проведений нами аналіз морфологічних та біохімічних показників стану клітин у популяції малих та середніх лімфоцитів селезінки свідчить, що формування відповіді клітин in vivo на дію іонізуючої радіації у дозах 0,5 та 1 Гр відбувається різними шляхами. Наявність морфологічних ознак активації клітин, незначна кількість загиблих клітин, підвищення [Ca]i та вмісту МДА у клітинах у термін, віддалений від дії променевого фактора вказують, що опромінення тварин у дозі 0,5 Гр не викликає метаболічних порушень, достатніх для активації тригерного механізму розвитку ураження лімфоцитів і у популяції лімфоцитів селезінки переважають процеси адаптивної проліферації, у ході якої гинуть найбільш радіочутливі клітини.
Опромінення тварин у дозі 1 Гр супроводжується значним зниженням кількості клітин у популяції малих та середніх лімфоцитів селезінки та проявленням морфологічних та біохімічних ознак інтерфазної загибелі клітин. Уповільнена динаміка розвитку радіаційної загибелі лімфоцитів, а також той факт, що зростання концентрації вільного цитозольного Ca2+ у лімфоцитах передує розвитку міжнуклеосомної деградації хроматину дозволяють припустити важливу роль Са2+-залежних мембранних систем клітинної сигналізації у посиленні викликаного дією іонізуючої радіації апоптогенного сигналу.
Таким чином, популяція малих та середніх лімфоцитів селезінки опромінених щурів може бути використана як модель для дослідження розвитку in vivo індукованої радіацією інтерфазної загибелі лімфоцитів, а порівняльне дослідження функціонування Са2+-залежних регуляторних систем гідролізу мембранних фосфоліпідів у клітинах після дії in vivo іонізуючої радіації у дозах 0,5 та 1 Гр – як експериментальний прийом для з’ясування пускових механізмів інтерфазної загибелі лімфоцитів.
Дослідження активності поліфосфоінозитидної месенджерної системи у лімфоцитах селезінки у ранній період після опромінення тварин. Фосфоліпаза С, ключовий фермент поліфосфоінозитидної системи, здійснює гідроліз фосфоефірного зв’язку усіх трьох типів фосфоінозитидів з утворенням вторинних месенджерів – внаслідок розщеплення фосфатидилінозитолу та фосфатидилінозитол-4-фосфату у клітинах підвищується вміст диацилгліцерола, а внаслідок розщеплення фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату – диацилгліцерола та інозитол-1,4,5-трифосфата (Rhee S. et al, 1989; Cockroft S, 1992). Вивчення активності фосфоліпази С у лімфоцитах з використанням екзогенного субстрату фосфатидилінозитолу показало, що ферментативна активність виявляється як у мембранній, так і цитозольній фракціях, досягає оптимального рівня у області рН 6,5 та за 80мкМ концентрації субстрату. Достатньо високий рівень ферментативної активності обох фракцій проявляється у середовищі без додавання кальцію, однак максимальна швидкість ферментативного розщеплення фосфатидилінозитолу, як і інших екзогенних фосфоліпідів ( Carter H. & Smith A., 1987 ) розвивається у присутності кальцію у субмілімолярній концентрації у середовищі інкубації
Для оцінки активності фосфоліпази С у наближених до in vivo умовах, тобто за фізіологічної концентрації субстрата у клітинній мембрані та йонів кальцію у цитозолі клітин, були використані лімфоцити, попередньо мічені за 3Н-інозитолом. Оскільки фосфоліпаза С забезпечує трансмембранний етап проведення активаційного сигналу у внутрішньоклітинний простір, насамперед досліджували ферментативну активність лімфоцитів за умови активації антигенспецифічних рецепторних комплексів плазматичної мембрани. Для цього використовували поліклональні мітогенні ліганди фітогемаглютинін (ФГА) та ліпополісахарид E. coli (ЛПС), які здатні перехресно зшиватися з поверхневими рецепторами клітин. Отримані криві залежності ефекту ліганда від часу інкубації з лімфоцитами відображають ефективність їх зв’язування з клітинною мембраною, необхідного для індукції активності фосфоліпази С (рис.5). Хроматографічне розділення сумарної фракції утворених у ході інкубації клітин інозитолфосфатів показало, що як ЛПС, так і ФГА посилюють синтез усіх трьох типів інозитолфосфатів, однак найбільшою мірою – інозитол-1,4,5-трифосфату (ІФ3). Отже, у досліджуваній нами модельній системі функціонує механізм передачі сигналу від рецептора зовнішньої мембрани всередину клітини за участі поліфосфоінозитидної системи. Вплив ФГА та ЛПС на активність фосфоліпази С порівнювали з дією кальцієвого іонофора А23187, також здатного проявляти мітогенний ефект. Додавання іонофора у середовище інкубації клітин викликало незначне підвищення включення мітки у інозитолфосфат (ІФ) та інозитол-1,4-дифосфат (ІФ2) і не впливало на утворення ІФ3 ( рис. 5). Це узгоджується з літературними даними, згідно яких синтез інозитолфосфатів відбувається за фізіологічної концентрації іонів кальцію у цитозолі (Nakanishi H. et al., 1989; Conti A.et al., 1993). Отже, взаємодія фосфоліпази С з мембранними фосфоінозитидами визначається, перш за все, станом рецепторного комплексу у складі плазматичної мембрани лімфоцитів.

Дослідження активності фосфоліпази С у лімфоцитах селезінки проводили через 1, 3, 6 та 12 год після опромінення тварин, використовуючи без’ядерний гомогенат клітин та мічений субстрат фосфатидилінозитол. Згідно представлених на рис. 6 даних, у ранній період після дії іонізуючої радіації відбувається підвищення ферментативної активності лімфоцитів селезінки, рівень якого залежить від дози радіації. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр ферментативна активність клітин зростає через 3 год. Опромінення тварин у дозі 1 Гр призводить до більш значної модифікації активності фосфоліпази С – ферментативна активність підвищується через 1 год, досягає максимального рівня через 3 год і пригнічується порівняно з контролем через 12 год.
Аналіз ферментативної активності субклітинних фракцій лімфоцитів показав, що через 3 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр фосфоліпазна активність мембранної фракції зростає на 33,5 % порівняно з контролем, а цитозольної – не змінюється. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр ферментативна активність мембранної та цитозольної фракцій підвищується на 120 та 73 % порівняно з контролем відповідно. Отримані дані дозволяють припустити, що однією з мішеней дії іонізуючої радіації у дозі 1 Гр є компоненти поліфосфоінозитидної системи, зв’язані з плазматичною мембраною лімфоцитів селезінки.
Щоб дослідити вплив іонізуючої радіації на функціональний стан рецепторів плазматичної мембрани лімфоцитів, які спряжені з фосфоліпазою С та активуються під дією лігандів, здатних викликати їх агрегацію, вивчали вплив ліпополісахарида на активність фосфоліпази С у лімфоцитах у контролі та через 3 год після опромінення тварин. Преінкубація протягом 5 хв у присутності ліпополісахариду лімфоцитів селезінки контрольних тварин викликає підвищення активності фосфоліпази С у без’ядерному гомогенаті клітин ( табл. 2), що узгоджується з даними, отриманими нами при дослідженні впливу ЛПС на утворення інозитолфосфатів у лімфоцитах. Активуючий ефект проявляється також за преінкубації з мітогеном лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 0,5 Гр. Однак, додавання ЛПС у середовище преінкубації лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, не впливає на активність фосфоліпазну активність клітин.
Таблиця 2
Вплив ліпополісахариду на активність фосфоліпази С лімфоцитів селезінки у контролі та через 3 год після опромінення тварин (n = 4)

Умови експеримента Активність,
нмоль інозитолфосфату ( мг білка хв)-1
Умови преінкубації
без добавки + ЛПС
контроль 6.1  0,6 19,4  1,2**
опромінення 0,5 Гр 8,6  0,8 12,3  1,1**
опромінення 1 Гр 10,2  0,9* 9,8  0,7
* р 0,05 порівняно з контролем
** р 0,05 порівняно з преінкубацією без добавки

Очевидно, опромінення тварин у дозі 1 Гр призводить до структурних або функціональних змін у стані плазматичної мембрани лімфоцитів селезінки, які модифікують взаємодію фосфоліпази С з мембранозв’язаними білками-регуляторами та викликають активацію фермента, яка не контролюється через стимуляцію антигенспецифічних рецепторів.
Отримані дані свідчать про активацію у лімфоцитах опромінених тварин ключового компонента поліфосфоінозитидної системи – фосфоліпази С, однак не дають уявлення про природу утворюваних продуктів гідролізу поліфосфоінозитидів. Синтез інозитолфосфатів досліджували за інкубації лімфоцитів селезінки, виділених через 1, 3 та 6 год після опромінення тварин та попередньо мічених за 3Н-інозитолом. Вміст мітки у сумарній фракції інозитолфосфатів після 5-хвилинної інкубації контрольних клітин складав 490  45 імп/хв на 107 клітин. відмічене Підвищення порівняно з контролем включення мітки у сумарну фракцію інозитолфосфатів у лімфоцитах виявлене через 1 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр, та через 1 і 3 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр. Ці дані підтверджують факт ранньої активації фосфоліпази С у лімфоцитах опромінених тварин.
Хроматографічне розділення сумарної фракції інозитолфосфатів дозволило провести порівняльний аналіз утворення різних типів інозитолфосфатів у лімфоцитах контрольних та опромінених тварин. У лімфоцитах контрольних тварин був виявлений такий розподіл мітки: ІФ – 240  35, ІФ2 –140  23 , ІФ3 – 120  25 імп /хв на 107 клітин. Нами знайдено, що посилення синтезу інозитолфосфатів у лімфоцитах через 1 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр зумовлене утворенням інозитол-1-фосфату, вміст якого, на відміну від інших інозитолфосфатів, підвищується порівняно з контролем. На основі цих даних зроблений висновок, що основним месенджером, який утворюється поліфосфоінозитидною системою лімфоцитів селезінки у ранній термін після дії радіації у дозі 0,5 Гр є диацилгліцерол. Очевидно, у цьому випадку відбувається направлення сигналу у бік опосередкованої через взаємодію з диацилгліцеролом активації Са2+, фосфоліпід- залежної протеїнкінази та каскаду протеїнкіназ, що фосфорилюють різні ефекторні білки. Така посттрансляційна модифікація білків лежить в основі формування адаптивної відповіді клітин через стимуляцію проліферації (Meyn R. et al., 1993, Prasad A.et al., 1994).

Спектр інозитолфосфатів, утворюваних у лімфоцитах селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, інший ( рис.7). Через 1 год після дії радіації підвищується вміст мітки у складі синтезованого у клітинах інозитол-1-фосфату, а через 3 год – у складі інозитол –1,4-дифосфату. Однак найбільшою мірою порівняно з іншими інозитолфосфатами у період 1-3 год після дії радіації посилюється утворення такого вторинного месенджера, як інозитол-1,4,5-трифосфат. Отже, інтенсифікація ферментативного гідролізу поліфосфоінозитидів у лімфоцитах селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, супроводжується активацією окремого сигнального ланцюга, що контролює рівень цитоплазматичного Са2+ у клітинах. Оскільки розщеплення фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату у складі клітинних мембран та утворення інозитол-1,4,5-трифосфату – це головний механізм мобілізації кальцію з ендоплазматичного ретикулума лімфоцитів (Corado I., 1990;Conti A.et al., 1993), є підстави вважати, що виявлене нами раннє підвищення концентрації Са2+ у цитозолі лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, зумовлене вивільненням Са2+ саме з цього внутрішньоклітинного компартменту.
Враховучи, що розвиток інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки після опромінення тварин відбувається за умови одночасного підвищення концентрації цитозольного Са2+ у клітинах та посилення процесів перекисного окислення ліпідів, досліджували роль у формуванні пострадіаційних реакцій лімфоцитів ферментів, активність яких значною мірою визначається утворенням продуктів реакцій вільнорадикального переокислення та внутрішньоклітинною концентрацією кальція – фосфоліпази А2, що гідролізує арахідоноїлвмісні фосфоліпіди, та ліпоксигенази.
Дослідження активності фосфоліпази А2 та Са2+-залежного метаболізму арахідонової кислоти у лімфоцитах селезінки після опромінення тварин.
Дослідження вивільнення арахідонової кислоти зі складу мембранних фосфоліпідів лімфоцитів селезінки проводили на клітинах, що включили 14С-арахідонат протягом 90-хвилинної інкубації з міткою. Оскільки нові місця для включення жирної кислоти до складу фосфоліпідів з’являються лише після дії фосфоліпази А2, оцінка розподілу мітки між основними фракціями ліпідів у мічених за 14С-арахідонатом лімфоцитах дозволяє ідентифікувати ендогенні субстрати фосфоліпази А2. Згідно результатів хроматографічного розділення ліпідної фракції мітка розподіляється таким чином ( % від загальної кількості включеної мітки) – ацилгліцерини – 11,6; лізофосфатидилхолін – 5,7; фосфатидилсерин + фосфатидилінозитол – 9,5; фосфатидилхолін – 21,8; фосфатидиетаноламін – 47,3; фосфатидилгліцерол – 4,1. Отже, у лімфоцитах існують гетерогенні пули арахідонату, доступність яких для фосфоліпази А2 може бути різною. Ці особливості створюють умови для контрольованого вивільнення арахідонової кислоти під впливом різноманітних регуляторних факторів та її функціонування у якості локального вторинного посередника.
Кількість мітки, що вивільняється протягом інкубації лімфоцитів селезінки контрольних тварин у середовище, яке містило деліпідизований БСА для зв’язування жирної кислоти, є незначною ( рис. 8А), що свідчить про низьку інтенсивність обміну арахідонової кислоти у нестимульованих лімфоцитах. Додавання у середовище інкубації лімфоцитів 0,5 мкМ кальцієвого іонофору А23187 значно стимулює вивільнення арахідонової кислоти. Додавання ліпополісахариду також посилює вивільнення арахідонової кислоти у середовище інкубації клітин, хоча ефект є більш уповільненим і менш виявленим порівняно з А23187. Ці дані вказують, що важливим фактором, який контролює процес вивільнення арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів у лімфоцитах селезінки, є концентрація внутрішньоклітинного Са2+, а мобілізація арахідонової кислоти внаслідок активації рецептора мітогенним лігандом опосередковується через допоміжні регуляторні механізми, серед яких основний – фосфатидилінозитоловий цикл (Errasfa et al., 1989).

Порівняльний аналіз кінетичних параметрів включення 14С-арахідонату у лімфоцити селезінки контрольних та опромінених тварин показав, що після дії іонізуючої радіації обмін арахідонової кислоти прискорюється. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр зміни виявляються через 12 год, коли має місце зростання початкової швидкості V0 включення мітки у лімфоцити. Через 6 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр виявляється підвищення значення не лише V0, але й Т05 – часу напівмаксимального включення 14С-арахідонату у лімфоцити.
Згідно результатів, представлених на рис.8Б,В інтенсифікація обміну арахідонової кислоти у лімфоцитах селезінки після дії радіації пов’язана з посиленням її вивільнення зі складу мембранних фосфоліпідів. Так, за інкубації лімфоцитів, виділених через 12 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр, кількість 14C-арахідонової кислоти у середовищі інкубації підвищується порівняно з контролем. За інкубації лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, значно зростає не лише кількість арахідонової кислоти у середовищі інкубації, але й швидкість її вивільнення. Звертає на себе увагу подібність у характері вивільнення арахідонату з мембранних фосфоліпідів у лімфоцитах селезінки тварин після опромінення у дозі 1 Гр та за умови преінкубації контрольних лімфоцитів у присутності кальцієвого іонофора А23187. Така подібність свідчить, що підвищення рівня внутрішньоклітинного Са2+впливає на вивільнення арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів клітин незалежно від того, викликане воно кальцієвим іонофором чи підвищенням кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів внаслідок дії радіації. Кальцій, таким чином, є одним з тригерних факторів активації вивільнення арахідонової кислоти у лімфоцитах селезінки, що зазнають інтерфазної загибелі.
Оскільки підвищення вмісту вільної арахідонової кислоти у клітинах відбувається внаслідок активації ендогенного фосфоліпідного гідролізу, вивчали роль у цьому процесі фосфоліпази А2. Дослідження активності фосфоліпази А2 у лімфоцитах селезінки проводили, використовуючи екзогенні мічені субстрати 14С-арахідоноїлфосфатидилетаноламін та 14С-арахідоноїлфосфатидилхолін. Активність фосфоліпази А2 у лімфоцитах селезінки була вищою за наявності залишку арахідонової кислоти порівняно з олеїновою у sn-2 положенні перетворюваного фосфоліпіда, досягала максимального рівня у області лужних значень рН, пригнічувалась у присутності 2 мМ ЕГТА, проявлялась за фізіологічної концентрації кальція у середовищі інкубації та зростала за її підвищення у діапазоні субмілімолярної концентрації катіону, що в цілому відповідає властивостям цитозольної фосфоліпази А2 типу IV (Lesllie C.et al., 1990; Dennis E., 1994). Розподіл фосфоліпазної активності між мембранною та цитозольною фракціями лімфоцитів, залежність ферментативного гідролізу від концентрації йонів кальцію та його максимальна швидкість були різними для двох субстратів. Так, у мембранній фракції лімфоцитів селезінки виявляється 24,4% та 41,9 % від загальної ферментативної активності за використання субстратів фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну відповідно, значення КСа2+ – константи напівмаксимальної активації кальцієм реакції ферментативного гідролізу двох субстратів становили 0,13  0,01 та 0,55  0,07 мМ відповідно, максимальна швидкість фосфоліпідного гідролізу була вищою за використання субстрату фосфатидилетаноаміну.
Нами виявлено підвищення фосфоліпазної активності мембранної фракції лімфоцитів селезінки опромінених тварин, яке відбувається у різний термін після дії радіації залежно від дози опромінення та типу субстрату ( табл. 3). Так, через 12 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр у мембранній фракції клітин підвищується гідролітична активність фосфоліпази А2 стосовно фосфатидилхоліну, а через 6 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр посилюється ферментативне розщеплення як фосфатидилхоліну, так і фосфатидилетаноламіну.
Таблиця 3
Активність фосфоліпази А2 (нмолі арахідонату/ хв  мг білка) у мембранній фракції лімфоцитів селезінки після опромінення тварин( n = 4-6)

умови експерименту субстрат
14С-2-арахідоноїл-
фосфатидилхолін 14С-2-арахідоноїл
фосфатидилетаноламін
контроль 0,40  0,03 1,50  0,16
0,5 Гр , 6 год 0,53  0,06 2,02  0,25
12 год 0,70  0,08* 2,04  0,29
1 Гр 6 год 0,58  0,05* 2,51  0,22*
12 год 0,42  0,03 1,91  0,30*

*р  0,05

Підвищення фосфоліпазної активності мембранній фракції лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, співпадає у часі з виявленою нами інтенсифікацією процесів перекисного окислення мембранних ліпідів у клітинах. Структурний стан мембран є одним з факторів, що визначає інтенсивність фосфоліпідного гідролізу у клітинах- внаслідок посилення реакцій вільнорадикального окислення до рівня, який є критичним для ініціації порушення структури мембрани, відбувається локальне підвищення активності фосфоліпази А2 (Ланкин В., 1984; Burak W.et al., 1995). Отримані нами дані свідчать про те, що вивільнення арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів лімфоцитів селезінки за розвитку інтерфазної загибелі відбувається внаслідок активації фосфоліпази А2. Субстратом активованого ферменту можуть бути різні фосфоліпіди, локалізовані у певних ділянках мембрани, доступність яких для ферменту залежить від структурного стану мембрани.
Регуляція каталітичної активності фосфоліпази А2 великою мірою відбувається через взаємодію цього фермента з іонами кальцію – підвищення концентрації Са2+ у субмікромолярному діапазоні призводить до зв’язування катіона фосфоліпазою А2 та до переходу фермента у форму з більш високою спорідненістю до субстрата, а за підвищення Са2+ у діапазоні 10 –100мкМ відбувається зв’язування фермента з мембраною та його активація ( Lin L.et al., 1993; Nalefski E. et al., 1994). Згідно результатів, представлених на рис. 9, преінкубація лімфоцитів селезінки контрольних тварин з кальцієвим іонофором А23187 викликає підвищення активності фосфоліпази А2 у фракції без’ядерного гомогенату стосовно 14С-2-арахідоноїлфосфатидилетаноламіну. Через 6 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр фосфоліпазна активність лімфоцитів підвищується на 21% і зростає за преінкубації клітин з іонофором так само, як і у лімфоцитах контрольних тварин. Фосфоліпазна активність лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, зростає на 75% порівняно з контролем, обробка клітин кальцієвим іонофором не призводить до підвищення активності фосфоліпази А2. Ці дані вказують, що після опромінення тварин у дозі 1 Гр концентрація Са2+ у цитозолі лімфоцитів селезінки підвищується до рівня, який є достатнім для активації ферментативного гідролізу арахідоноїлвмісних фосфоліпідів та вивільнення значної кількості арахідонової кислоти.

Утилізація надлишку вивільненої з мембранних фосфоліпідів арахідонової кислоти забезпечується через Са2+- залежну індукцію ліпоксигеназної активності у клітинах (Ланкін В., 1984; Keppler D.,1992). У проведених нами експериментах з використанням субстрату лінолевої кислоти та супернатанту 18000g, отриманого після центрифугування без’ядерного гомогенату клітин, як ферментного препарату, показано, що у лімфоцитах селезінки відбувається ферментативне переокислення екзогенної поліненасиченої кислоти з утворенням гідроперекисних радикалів. Ліпоксигеназна активність досягала оптимального рівня за рН 6,4 та 0,1мкМ концентрації субстрату, проявлялась за фізіологічної концентрації іонів Са2+, зростала за підвищення концентрації СаCl2 до 0,1 мМ та пригнічувалась у присутності 0,2 мМ ЕГТА у середовищі інкубації. Радіоімунним методом у лімфоцитах селезінки були ідентифіковані ендогенні продукти ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти – 15- гідроксиейкозатетраєнова кислота (15-НЕТЕ) та лейкотрієн В4.
Після рентгенівського опромінення тварин ліпоксигеназна активність лімфоцитів селезінки змінюється. Після дії радіації у дозі 0,5 Гр підвищення ферментативної активності виявлене через 12 год (рис. 10). Опромінення тварин у дозі 1 Гр викликає більш раннє і тривале підвищення ліпоксигеназної активності лімфоцитів – воно виявляється через 3 год і утримується упродовж 6 год, однак через 24 год ферментативна активність пригнічується порівняно з контролем на 25%. Виявлений нами характер зміни ліпоксигеназної активності лімфоцитів селезінки опромінених тварин узгоджується з особливостями регуляції ферменту – якщо продукти нефермантативного перекисного окислення ліпідів у низьких концентраціях активують ліпоксигеназу, то утворення значної кількості продуктів ферментативного ПОЛ призводить до пригніченням активності ферменту ( Lands W. et al., 1985).

Посилення ліпоксигеназної активності лімфоцитів селезінки опромінених тварин супроводжується одночасним підвищенням вмісту ендогенних продуктів ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти у клітинах ( табл.4). Так, через 12 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр у лімфоцитах селезінки виявляється підвищення вмісту первинного продукту ліпоксигеназної реакції 15-НЕТЕ. У лімфоцитах селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, кількість синтезованої 15-НЕТЕ значно зростає через 3 – 6 год. Така сама залежність від дози радіації виявлена і при дослідженні вмісту лейкотрієну В4 у лімфоцитах селезінки після опромінення..
Таблиця 4
Вміст 15-НЕТЕ та ЛТ В4 (пг/107 клітин) у лімфоцитах селезінки
після опромінення тварин
Умови експеримента Термін НЕТЕ, ЛТ В4, пг/107 клітин
контроль 57.8  3.7 19,3  2,2
опромінення, 0,5 Гр 3 год 63,4  7.4 –
6 год 70.2  9.4 28,6  4,9
12 год 221.8  25.5* 43,1  5,3*
опромінення, 1 Гр 3 год 122.6  14.2* 42,3  5,1*
6 год 185.8  18.6* 78,1  8,2*
12 год 49.1  5.8 39,2  6,2*

* р  0,05 порівняно з контролем

Виявлене нами підвищення ліпоксигеназної активності лімфоцитів селезінки після дії радіації можна пояснити як зміну адаптаційного характеру, направлену на зниження у опромінений клітині рівня активних форм кисню внаслідок їх перенесення ліпоксигеназою на поліненасичені жирні кислоти. Однак утворення у надмірних кількостях таких продуктів радикальної природи, як первинні метаболіти ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти, може призводити до порушення окисно-антиоксидантної рівноваги у клітинах та до зміни експресії генів (Будницкая Е., 1986; Tebbey P.et al.,1993).

Для з’ясування можливої ролі інтенсифікації ліпоксигеназного окислення арахідонової кислоти у розвитку індукованої радіацією інтерфазної загибелі лімфоцитів вивчали динаміку накопичення фрагментів ДНК (ПДН) у контрольних лімфоцитах та лімфоцитах, виділених через 3 год після дії радіації протягом 60-хвилинної інкубації клітин у середовищі без добавок та у присутності нордигідрогуаяретикової кислоти – інгібітора окисного метаболізму поліненасичених жирних кислот, який селективно пригнічує активність ліпоксигенази (Sircar J. et al, 1983; Луйк А.,1988). Додавання 20 мкМ НДГК у середовище інкубації приводить до значного пригнічення розщеплення ДНК у лімфоцитах селезінки опромінених тварин, особливо на початкових етапах інкубації клітин (рис.10). Отримані дані дозволяють дійти висновку, що ліпоксигеназні метаболіти арахідонової кислоти, які посилено утворюються у лімфоцитах ранній період після опромінення тварин у дозі 1 Гр, виконують роль ендогенних медіаторів інтерфазної загибелі лімфоцитів.

Заключна частина.

Як модель розвитку in vivo інтерфазної загибелі лімфоцитів нами використана популяція малих та середніх лімфоцитів селезінки щурів, кількість клітин у якій значно знижується у ранній період радіаційного ураження після рентгенівського опромінення тварин у дозі 1 Гр. На основі порівняльного дослідження динаміки розвитку морфологічних та біохімічних ознак інтерфазної загибелі клітин у модельній системі та параметрів функціонування Са2+-залежних фосфоліпідних трансдукційних систем розроблена схема формування індукованого радіацією апоптогенного сигналу у лімфоцитах селезінки ( рис.11).
Згідно отриманих нами результатів, першочергову роль у розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки після рентгенівського опромінення тварин відіграють мембранні компоненти сигнальних систем. Ініціація розвитку морфологічних ознак інтерфазної загибелі лімфоцитів у досліджуваній популяції лімфоцитів селезінки відбувається одночасно з інтенсифікацією процесів перекисного окислення, підвищенням активності фосфоліпази С, посиленням синтезу інозитол-1,4,5-трифосфату у клітинах та зростанням концентрації вільного цитозольного Са2+. Втрата чутливості фосфоліпази С до дії поліклонального мітогена ЛПС свідчить, що активація ферменту та проведення індукованого радіацією сигналу у лімфоцитах відбуваються через механізми, які не потребують зв’язування ліганда зі спряженим с фосфоліпазою С поверхневим рецептором. Найбільш вірогідними з таких механізмів є агрегація рецепторів плазматичної мембрани внаслідок зшивок, утворених при рекомбінації радикалів білків ( Koteles G., 1982, Sosiynsky V., 1991) та активація чутливих до кисневмісних радикалів тирозинових протеїнкіназ fyn та lck, які забезпечують зв’язування фосфоліпази С з мембраною та активацію фермента (Chalupny N. et al.; 1991Rao A., 1994).
Виявлене нами підвищення активності фосфоліпази С у мембранній фракції лімфоцитів селезінки та посилення утворення ІФ3 у лімфоцитах селезінки опромінених тварин відбувається у ранній післярадіаційний період, коли проникність плазматичної мембрани для іонів кальцію не змінюється. Це свідчить, що причиною раннього підвищення концентрації цитозольного Са2+ у лімфоцитах, що гинуть у інтерфазі, є мобілізація катіону з ендоплазматичного ретикулуму через рецептори-каналами, спорідненість яких до ІФ3 зростає при незначному підвищенні концентрації месенджера у нанамолярному діапазоні (Berridge M., 1984; Chow S.& Jondal M., 1990; Scharff O. et al, 1993). Вивільнення катіону з ендоплазматичного ретикулума може бути пусковим механізмом порушення внутрішньоклітинної компартменталізації катіону в опромінених клітинах та подовженого утримання концентрації вільного цитозольного Са2+ на підвищеному рівні, оскільки підвищення кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів у більш віддалений термін після дії радіації … незбалансований вхід катіону у внутрішньоклітинний простір.
Наслідком порушення кальцієвого гомеостазу та накопичення Са2+ у цитоплазмі клітин може бути потрапляння катіону у ядро та посилення Са2+-залежної експресії генів сімейства gadd – позитивних регуляторів апоптозу (Bartlett L. et al., 1992; Smeyne R. et al., 1993). Надмірного поповнення ядерного кальцієвого пулу може бути однією з причин зміни конформації хроматину та активації Са2+ – залежного ендонуклеолізу ДНК.
Однією з реакцій клітин на дію екстермальних факторів та оксидативного стресу є індукція синтезу фосфоліпази А2 та ліпоксигенази (Schewe T. & Kunh H.,1991; Chen X. et al., 1996). Тривале утримання підвищеної концентрації Са2+ у цитоплазмі лімфоцитів селезінки опромінених тварин підвищує вірогідність насичення катіоном обох Са2+-зв’язуючих ферментів, механізмом активації яких є Са2+ -залежна транслокація до мембрани (Keppler D., 1992; Lin L. et al., 1993). Активація ферментів у такий спосіб відбувається після певного лаг-періоду і забезпечує посилення індукованого радіацією кальцієвого сигналу та розвиток у лімфоцитах селезінки опромінених тварин більш повільних змін метаболізму, що регулюються утворюваними вторинними месенджерами. Так, арахідонова кислота, час існування якої у клітинах довший порівняно з ІФ3, є регулятором кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів, здатна мобілізувати Са2+ з функціональних різних внутрішньоклітинних кальцієвих депо ( Гуковская А. и др., 1989; Liskovitch M., 1992; Tsunoda et al., 1993) та є активатором сфінгомієлінази – фермента, відповідального за синтез цераміда – тригера апоптозу, активатора протеїназ сімейства ІСЕ ( Cifone M. et al., 1995). Внаслідок розвитку ланцюгових реакцій переокислення ліпідів та полегшення доступа зв’язаної з мембранами активованої фосфоліпази А2 до субстрату у лімфоцитах селезінки опромінених тварин відбувається вивільнення арахідонової кислоти зі складу мембранних фосфоліпідів, що були недоступними для фермента у контролі. Серед метаболітів, що утворюються при утилізації ліпоксигеназою надлишку арахідонової кислоти у лімфоцитах селезінки, 15-НРЕТЕ є найбільш ефективним індуктором експресії c-fos – одного з генів ранньої відповіді, регулятора клітинного циклу. Посилення експресії цього гену незалежно від стадії клітинного циклу є однією з умов розвитку інтерфазної загибелі клітин ( Manome Y. et al.,1993; Wilson R. et al., 1993). Утворювані лейкотрієни можуть зв’язуватись рецепторами на поверхні клітин та виконувати роль ауто- та паракринних медіаторів апоптозу, що узгоджується з уповільненою динамікою інтерфазної загибелі клітин у досліджуваній популяції малих та середніх лімфоцитів селезінки опромінених тварин.
Таким чином, розвиток in vivo радіаційної загибелі лімфоцитів у інтерфазі відбувається внаслідок індукованої радіацією плейотропних змін у функціонуванні мембранних сигнальних систем та модифікації просторово-часової організації їх взаємодії – одночасної активації декількох мембранних Са2+-залежних фосфоліпідних трансдукційних шляхів, порушення послідовності утворення та тривалості сигналів, які регулюють протікання метаболічних процесів як на мембранному, так і геномному рівнях.

Висновки

1. Встановлено, що після тотального рентгенівського опромінення щурів у дозі 1 Гр у популяції малих та середніх лімфоцитів селезінки відбувається зниження кількості клітин внаслідок їх загибелі у інтерфазі. Інтерфазний характер загибелі лімфоцитів доведений на основі як морфологічних (конденсація хроматину, пікнотизація ядра), так і біохімічних ( накопичення у клітинах фрагментів ДНК довжиною 400, 600 та 800 пар основ, порушення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу) ознак. Виявлена уповільнена динаміка розвитку in vivo індукованої радіацією інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки, яка свідчить про трансформацію у популяції клітин радіаційного сигналу за участі мембранних сигнальних систем.
2. Показано, що у досліджуваній популяції лімфоцитів селезінки функціонують механізми проведення активаційного сигналу від плазматичної мембрани у внутрішньоклітинний простір за участі сигнальних фосфоліпаз С та А2 – зшивання поверхневих рецепторів лімфоцитів поліклональними мітогенами ЛПС та ФГА призводить до посилення гідролізу поліфосфоінозитидів та утворення інозитолфосфатів, а обробка клітин кальцієвим іонофором викликає посилення вивільнення арахідонової кислоти зі складу арахідоноїлвмісних фосфоліпідів.
3. Встановлено, що однією з ранніх реакцій за ініціації інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин є активація фосфоінозитид-специфічної фосфоліпази С у мембранній фракції клітин та модифікація взаємодії компонентів у системі поверхневий рецептор лімфоцита – мембранозв’язані білки –фосфоліпаза С, внаслідок якої підвищення активності фосфоліпази С відбувається через механізми, що не потребують зв’язування ліганда зі спряженим з фосфоліпазою С рецептором.
4. Показано, що на ранньому етапі розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин відбувається посилення синтезу інозитолфосфатів та зміна їх спектру у клітинах. Методом хроматографічного розділення інозитолфосфатів доведено, що найбільшою мірою порівняно з ІФ та ІФ2 у лімфоцитах селезінки після опромінення тварин у дозі 1 Гр посилюється утворення Са2+-мобілізуючого месенджера – інозитол-1,4,5-трифосфату.
3. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр у лімфоцитах селезінки відбувається підвищення концентрація вільного цитозольного Са2+, виміряної за допомогою кальцієвого флуоресцентного зонду квін-2. Встановлено, що підвищення рівня Са2+ у цитозолі лімфоцитів у ранній термін після дії радіації передує накопиченню продуктів міжнуклеосомної фрагментації ДНК і відбувається за відсутності змін кінетичних параметрів входу кальція у клітини. Ці дані вказують, що пусковим механізмом порушення кальцієвого гомеостазу у лімфоцитах селезінки опромінених тварин є опосередковане через інозитол-1,4,5-трифосфат вивільнення катіону з ендоплазматичного ретикулуму.
4. Показано, що тривале утримання концентрації цитозольного кальцію на підвищеному рівні у лімфоцитах селезінки на більш пізніх етапах розвитку радіаційної загибелі клітин зумовлене зростанням початкової швидкості надходження 45Са2+ у клітини та збільшенням інтенсивності трансмембранного потоку катіона. Підвищення кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів селезінки співпадає у часі з посиленням процесів перекисного окислення ліпідів, зниженням антиоксидантної активності та прискоренням міжнуклеосомної деградації ДНК.
5. Встановлено, що основними ендогенними субстратами фосфоліпази А2 у мічених за 14С-арахідонатом лімфоцитах селезінки є фосфатидилетаноламін та фосфатидилхолін. У процесі розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів зростає швидкість вивільнення арахідонової кислоти зі складу мембранних фосфоліпідів лімфоцитів та кількість вивільненої у середовище інкубації арахідонової кислоти. Одночасно у мембранній фракції клітин підвищується активність фосфоліпази А2, яка гідролізує арахідоноїл-ФЕ та арахідоноїл-ФХ. Ці дані вказують, що посилення вивільнення арахідонової кислоти у лімфоцитах селезінки опромінених тварин відбувається внаслідок активації фосфоліпази А2, що здійснює гідроліз різних пулів арахідоноїлвмісних фосфоліпідів.
8. Лімфоцити селезінки проявляють ліпоксигеназну активність, перетворюючи екзогенну лінолеву кислоту з утворенням гідроксипероксидних похідних. Ідентифіковані первинні ендогенні продукти ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти у клітинах – 15-гідроксиейкозатетраєнова кислота та лейкотрієн В4. Встановлено, що за розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин ліпоксигеназна активність підвищується, а вміст 15-НЕТЕ та ЛТ В4 зростає.
9. Встановлено, що специфічний інгібітор ліпоксигенази нордигідрогуайаретикова кислота пригнічує міжнуклеосомну деградацію ДНК у лімфоцитах селезінки опромінених тварин. Ці дані вказують на роль первинних продуктів ліпоксигеназного переокислення арахідонату як медіаторів розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів.
10. Запропонована схема проведення індукованого радіацією сигналу та його трансформації на мембранному та геномному рівнях у апоптогенний сигнал, яка враховує роль кальція у порушенні просторово-часової взаємодії різних компонентів Са2+-залежних фосфоліпідних трансдукційних систем у лімфоцитах після опромінення тварин.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

1.Ручко М.В., Слатвинская Е.А., Матышевская О.П., Кучеренко Н.Е. Увеличение концентрации свободного Са2+, определенной с помощью квина –2 в лимфоцитах селезенки облученных крыс// Укр. биохим. журн. – 1990. – т.62, N 4. – С. 110 –113.
2. Кучеренко Н.Е., Матышевская О.П., Остапченко Л.И., Пархомец Т.И., Ручко М.В., Слатвинская Е.А. Содержание циклических нуклеотидов, свободного цитоплазматического Са2+ и малонового диальдегида в лимфоцитах селезенки и тимоцитах при действии невысоких доз радиации// Радиобиология. – 1991. – Т.31, N 5. – С. 739 – 742.
3. Слатвинская Е.А., Матышевская О.П., Кучеренко Н.Е. Фосфолипаза А2 в лимфоцитах селезенки крыс, гидролизующая арахидоноилфосфолипиды// Укр. биохим. журн. – 1991. – Т. 63, N 6. – С. 48-52.
4. Позур В.К., Матышевская О.П., Остапченко Л.И., Кучеренко Н.Е. Индукция бактериальными пептидогликаном и липополисахаридом ранних и промежуточных признаков активации лимфоидных клеток экспериментальных животных// Иммунология. – 1993. – N1. – С. 25-27
5. Пастух В.М., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Вивчення активності 5-ліпоксигенази в лімфоцитах селезінки та тимусі щурів// Вісник Київського університету. Біологія. – 1993. – N25. – С.14 – 17.
6. Пастух В.Н., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Вивчення умов протікання 5-ліпоксигеназної реакції в лімфоцитах селезінки щурів// Доповіді АН УКраїни. – 1993. – N6. – С.131- 134.
7. Матышевская О.П., Слатвинская Е.А., Кучеренко Н.Е. Фосфолипаза А2 в биохимических реакциях лимфоцитов селезенки на рентгеновское облучение// Вопросы медицинской химии. – 1994. – Т.40, N 2. – С. 28 – 31.
8. Матышевская О.П., Слатвинская Е.А., Кучеренко Н.Е. Высвобождение арахидоната из лимфоцитв селезенки крыс после облучения // Укр. биохим. журн. – 1994. – Т. 66, N 3. – С. 60- 66.
9. Слатвінська О.А., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Вплив рентгенівського опромінення на активність фосфліпази А2 у субклітинних фракціях лімфоцитів селезінки та тимусу щурів// Вісник Київського університету. Біологія. – 1995. – N26. – С.99 – 104.
10. Солодушко В.О., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Ендонуклеоліз хроматину у лімфоцитах селезінки та тимусу щурів після опромінення // Укр. біохім. журн. – 1997.- Т.69, N 4. – С. 88 – 94.
11. Солодушко В.О., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Са, Mg-залежна ендонуклеазна активність тимоцитів щурів після опромінення // Доповіді НАН України. – 1996. – N10. – С. 147 – 150
12. Матишевська О.П. Апоптоз – запрограмована форма клітинної загибелі // Вісник Київського університету. Біологія. – 1998. – N 27. – С.3 – 7.
13. Матышевская О.П. Роль инозитолтрифосфата в формировании кальциевого сигнала в Т-лимфоцитах // Укр. биохим. журн. – 1998. – Т.70, N4. – С.3 – 15.
14. Сировець Т.А., Пархомець Т.І., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Вплив рентгенівського опромінення на активність фосфоліпази С, що гідролізує фосфатидилінозитол у лімфоцитах селезінки щурів // Вісник Київського університету. Біологія. – 1998. – N 28. – С.12 – 14
15. Матишевська О.П. Утворення інозитолтрифосфату в лімфоцитах селезінки щурів на ранньому етапі після рентгенівського опромінення // Укр. биохим. журн.- 1998. – Т. 70, N 4. – С. 94 – 100.
16. Матишевська О.П. Послідовність включення сигнальних механізмів через фосфоліпазу С/ інозитолтрифосфат та фосфоліпазу А2 / арахідонат у лімфоцитах селезінки щурів// Вісник Київського університету. Біологія. – 1998. – N 28. – С.14-16.
17. Матышевская О.П., Пастух В.Н., Солодушко В.А. Липоксигеназная активность и содержание 15-НЕТЕ в лимфоцитах седезенки крыс при действии ионизирующей радиации // Укр. биохим. журн.- 1998. – Т. 70, N 5. – С. 91 –96
18. Солодушко В.О., Гринюк І.І., Борисов С.І., Матишевська О.П. Залежність від кальцію індукованого радіацією ендонуклеолізу хроматину у лімфоїдних клітинах // Вісник Київського університету. Біологія. – 1998. – N 28. – С.3 – 7.
19. Матышевская О.П. Биохимические аспекты вызванного радиацией апоптоза // Укр. биохим. журн.- 1998. – Т. 70, N 5. – С. 15 – 29.
20. Матышевская О.П., Пастух В.Н., Солодушко В.А. Ингибирование липоксигеназной активности снижает индуцированную радиацией фрагментацию ДНК лимфоцитов // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1999. – Т.39, N 2-3. – С. 282 – 286.

Матишевська О.П. Закономірності розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки щурів за участі Са2+-залежних фосфоліпідних сигнальних систем після радіаційного ураження. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський університет імені Тараса Шевченка, Київ, 1999.
Дисертацію присвячено дослідженню участі поліфосфоінозитидної системи та Са2+-залежного метаболізму арахідонової кислоти у розвитку інтерфазної загибелі клітин у популяції радіочутливих лімфоцитів селезінки після тотального рентгенівского опромінення тварин. Встановлено, що ініціація розвитку морфологічних ознак апоптозу лімфоцитів після дії радіації у дозі 1 Гр відбуваєтья одночасно з підвищенням активності фосфоліпази С у мембранній фракції лімфоцитів, посиленням синтезу інозитол-1,4,5-трифосфату та зростанням рівня цитозольного Са2+ у клітинах. Подовжене утримання підвищеної концентрації цитозольного Са2+ внаслідок зростання кальцієвої проникності плазматичної мембрани на більш пізньому етапі розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів супроводжується активацією фосфоліпази А2, вивільненням арахідонової кислоти зі складу мембранних фосфоліпідів, підвищенням вмісту первинних продуктів ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти та прискоренням міжнуклеосомної деградації хроматину. Розроблено схему проведення індукованого радіацією сигналу та його трансформації у апоптогенний, яка враховує роль кальція у порушенні просторово-часової взаємодії різних компонентів Са2+-залежних фосфоліпідних трансдукційних систем у лімфоцитах.
Ключові слова: апоптоз лімфоцитів, радіація, інозитол-1,4,5-трифосфат, арахідонова кислота, ліпоксигеназа, кальцій, фрагментація ДНК.

Матышевская О.П. Закономерности развития интерфазной гибели лимфоцитов селезенки крыс при участии Са2+-зависимых фосфолипидных сигнальных систем после радиационного воздействия. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1999.
Диссертация посвящена исследованию роли полифосфоинозитидной системы и Са2+-зависимого метаболизма арахидоновой кислоты в развитии интерфазной гибели клеток в популяции радиочувствительных лимфоцитов селезенки после тотального рентгеновского облучения животных. Установлено, что инициация развития морфологических признаков после действия радиации в дозе 1 Гр происходит одновременно с активацией фосфолипазы С, усилением синтеза инозитол-1,4,5-трифосфата и повышением уровня цитозольного Са2+ в клетках. Длительное поддержание повышенной концентрации цитозольного Са2+ вследствие увеличения кальциевой проницаемости плазматической мембраны на более позднем этапе развития интерфазной гибели лимфоцитов сопровождается активацией фосфолипазы А2, освобождением арахидоновой кислоты из состава мембранных фосфолипидов, увеличением содержания первичных продуктов липоксигеназного превращения арахидоната и усилением межнуклеосомной фрагментации ДНК. Разработана схема проведения индуцированного радиацией сигнала и его трансформации в апоптогенный, учитывающая роль кальция в нарушении пространственно-временного взаимодействия различных компонентов Са2+-зависимых фосфолипидных трансдукционных систем лимфоцитов.
Ключевые слова: апоптоз лимфоцитов, радиация, инозитол-1,4,5-трифосфат, арахидоновая кислота, липоксигеназа, кальций, фрагментация ДНК.

Matyshevska O.P. Mechanisms of rat spleen lymphocytes interphase death involving Ca2+-dependent phospholipid signalling systems after radiation injury. – Manuscript.
Thesis for a doctor’s degree by speciality 03.00.04 – biochemistry. – Kyiv Taras Shevchenko University, Kyiv, 1999.
The dissertation is devoted to investigation of the role of polyphosphoinositide system and Ca2+-dependent metabolism of arachidonic acid in interphase cells death in the population of radioisensitive spleen lymphocytes after total X-ray irradiation of rats in a dose 1 Gy. Appearance of the early morphologic features of apoptosis is shown to be induced concurrently with phospholipase C activation, inositol-1,4,5-triphosphate synthesis stimulation and elevation of free cytosolic Ca2+ concentration. Increase in calcium permeability of the lymphocytes plasma membrane leading to more sustained cytosolic Ca2+ elevation closely correlates with phospholipase A2 activation, arachidonic acid release from membrane phospholipids, increase of the content of initial products of arachidonic acid lypooxydation and DNA internucleosomal fragmentation. The model of radiation induced signal transduction and transformation into apoptotic signal considering the role of calcium in disturbance of spatiotemporal interacion of Ca2+-dependent phospholipid signalling systems was elaborated.
Кey words: lymphocyte apoptosis, radiation, inositol- 1,4,5-triphpsphate, arachidonic acid, lypoxygenase, calcium, DNA fragmentation.

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020