НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

янєва ольга дорофіївна

УДК 615.015.8+546.3

Взаємодія мультирезистентних до металів бактерій з іонами міді, кадмію і
ванадію

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, акад. НАН України
Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фізіології
промислових мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Козлова Ірина Панасівна, Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий
співробітник відділу загальної та ґрунтової мікробіології;

доктор біологічних наук, професор Ставська Софія Стефанівна, професор
кафедри екології та технології рослинних полімерів Національного
технічного університету України “КПІ”

Захист відбудеться 19 грудня 2007 року о 12 годині на засіданні
Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ,
вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий «16» листопада 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник
Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Забруднення навколишнього середовища іонами важких
металів представляє актуальну проблему в усьому світі [Nriagu, 1988].
Мікроорганізми, стійкі до цих токсичних агентів, привертають все більшу
увагу в зв’язку з можливістю їх використання в ремедіаційних процесах
[Malik, 2004]. Як правило, мікроорганізми, резистентні до іонів важких
металів, виділяють переважно з джерел з високим рівнем техногенного
навантаження [Анисимова и др., 1993; Piotrowska-Seget et al., 2005].
Проте доволі мало відомо про розповсюдження мікроорганізмів, стійких до
високих концентрацій іонів важких металів, в місцях існування, що не
піддавалися техногенному впливу.

Характер взаємодії між бактеріями та іонами важких металів може бути
різним за своєю природою. Так, мідь є необхідним для життєдіяльності
клітин мікроелементом, іони кадмію та срібла не залучені до нормального
метаболізму клітин і високотоксичні для живих істот навіть в низьких
концентраціях, ванадій може використовуватися як кофактор деяких
ферментів, але не є необхідним для життєдіяльності переважної більшості
організмів [Nies, 1999]. Такі властивості вказаних іонів металів та їх
висока токсичність як забруднювачів навколишнього середовища
[Перепелиця, 2004] зумовлюють необхідність вивчення взаємодії між
бактеріями та цими іонами металів.

Розуміння основ природи такої взаємодії в перспективі може привести до
більш інтенсивного використання таких мікроорганізмів в очистці
навколишнього середовища від іонів важких металів. Особливий інтерес
представляють мікроорганізми, здатні до відновлення п’ятивалентного
ванадію, який використовується в металургійній промисловості і входить
до складу нафтопродуктів та вугілля. Процес відновлення ванадату
бактеріями мало досліджений, в більшості випадків його пов’язують з
анаеробним диханням [Antipov et al., 2000; Carpentier et al., 2003].

Таким чином, все вищевикладене є підгрунтям для вивчення розповсюдження
в джерелах з різним рівнем техногенного навантаження мікроорганізмів,
стійких до іонів важких металів, і дослідження особливостей взаємодії
мультирезистентних до металів бактерій з іонами міді, кадмію, ванадію.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась в рамках бюджетної теми відділу фізіології промислових
мікроорганізмів ІМВ НАНУ “Дослідження систематичного положення та
фізіолого-біохімічних особливостей мікроорганізмів, які мають промислове
значення”, реєстраційний номер 0198V007755 (1999-2003р.) та “Систематика
і біосинтетичні можливості бактерій і дріжджів. Розробка наукових основ
створення за їх допомогою нових біотехнологічних препаратів і процесів”
номер 0104U003000 (2004-2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження
розповсюдження мікроорганізмів, стійких до високих концентрацій ряду
іонів важких металів, в джерелах з різним рівнем техногенного
навантаження та вивчення особливостей взаємодії селекціонованих штамів з
іонами міді, кадмію і ванадію. Відповідно до мети були поставлені
наступні завдання:

виділити з джерел з різним рівнем техногенного навантаження
мікроорганізми, резистентні до високих концентрацій іонів міді, кадмію,
срібла і ванадію;

провести скринінг мультирезистентних до цих іонів металів бактерій серед
ізольованих штамів;

здійснити ідентифікацію відібраних штамів;

визначити характер індукції стійкості відібраних штамів до іонів міді,
кадмію, ванадію;

визначити генетичні детермінанти стійкості штамів до іонів міді та
кадмію;

визначити здатність відібраних штамів до акумуляції та ефлюксу
(активного транспорту) іонів міді та кадмію;

дослідити процес відновлення відібраними штамами п’ятивалентного
ванадію.

Об’єктом дослідження були 110 штамів резистентних до іонів металів
мікроорганізмів, ізольованих з джерел з різним рівнем техногенного
навантаження.

Предметом дослідження були поширення мікроорганізмів, резистентних до
іонів міді, кадмію, срібла та ванадію, в джерелах з різним рівнем
техногенного навантаження і взаємодія мультирезистентних штамів бактерій
з високими концентраціями іонів міді, кадмію і ванадію.

Матеріали і методи дослідження. Для виконання поставлених задач
використовували фізико-хімічні, мікробіологічні, фізіологічні і
молекулярно-генетичні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Було отримано нові дані про
розповсюдження мікроорганізмів, стійких до високих концентрацій іонів
міді, кадмію, срібла і ванадію, в джерелах з різним рівнем техногенного
навантаження. Виділено 110 штамів мікроорганізмів, резистентних до
високих концентрацій цих іонів металів. Виявлені нові місця існування
ванадатвідновлювальних мікроорганізмів.

Показано, що значна частина ізольованих штамів мала множинну стійкість
до іонів важких металів. Штами з найвищим рівнем множинної стійкості до
іонів металів належали до виду Pseudomonas aeruginosa. Встановлено, що
стійкість до іонів міді та кадмію мультирезистентних штамів P.
aeruginosa зумовлюється принаймні двома різними механізмами – адсорбцією
іонів металів на поверхні клітин та АТФ-залежними системами ефлюксу.
Показано відновлення ванадату бактеріями в мікроаерофільних умовах, яке
не пов’язане з анаеробним диханням. Вперше показано індукцію
бактеріального відновлення п’ятивалентного ванадію
дициклогексилкарбодіімідом в аеробних умовах.

Практичне значення одержаних результатів. Було створено колекцію
мікроорганізмів, стійких до високих концентрацій іонів міді, кадмію,
срібла і ванадію. Штами, здатні акумулювати іони міді та кадмію і
відновлювати ванадат, в перспективі можуть бути використані в
біоремедіаційних процесах. Визначено механізми захисту та відповіді
мікроорганізмів на токсичну дію іонів важких металів, що є підгрунтям
для розробки нових підходів в очистці навколишнього середовища, зокрема
стічних вод, від іонів важких металів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з теми дисертації,
проведено математичну та статистичну обробку одержаних експериментальних
даних, їх аналіз та порівняння з даними літератури, а також підготовку
результатів досліджень для їх опублікування.

Автором особисто виконано виділення та скринінг мікроорганізмів, стійких
до іонів важких металів, проведено ідентифікацію відібраних штамів
мультирезистентних бактерій з використанням мікробіологічних методів,
досліджено вплив іонів міді, кадмію і ванадію на ріст та продукцію
екзополіцукриду відібраних штамів бактерій. Здобувач самостійно
проводила роботу по вивченню індукції стійкості до важких металів та
процесу відновлення ванадату дослідженими штамами, дослідила акумуляцію
та ефлюкс іонів міді та кадмію клітинами мультирезистентних штамів
бактерій.

Аналіз жирних кислот проведено к.б.н. А.М. Остапчуком (ІМВ НАН України),
виділення плазмідної ДНК здійснено спільно з к.б.н. С.Ю. Римарь
(Інститут молекулярної біології і генетики НАН України), визначення
вмісту іонів важких металів методом атомно-адсорбційної
спектрофотометрії проведено д.х.н. А.І. Самчуком (Інститут геохімії,
мінералогії і рудоутворення НАН України), за що автор роботи висловлює
їм щиру подяку. У плануванні основних напрямків роботи та обговоренні
результатів брав участь науковий керівник д.б.н. проф. Підгорський В.С.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та
положення дисертації доповідались та обговорювались на міжнародній
науково-теоретичній конференції молодих вчених “Молодь і досягнення
науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2003), міжнародній
конференції “Современные проблемы загрязнения почв” (Москва, 2004), III
(X) з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), 10-й
Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология – наука ХХІ века”
(Пущино, 2006), міжнародній конференції “Мікробні біотехнології” (Одеса,
2006), п’ятій міжнародній науково-практичній конференції студентів,
аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна. Сучасний стан науки:
досягнення, проблеми та перспективи розвитку” (Київ, 2007), міжнародній
конференції студентів і мододих вчених «Modern Problems of Microbiology
and Biotechnology» (Одеса, 2007), конкурсах експериментальних робіт
молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України (Киів, 2003, 2005, 2006 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з
них 4 статті в фахових виданнях і 6 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 139
сторінках машинописного тексту і складається з розділів: „Вступ”, „Огляд
літератури”, „Матеріали та методи досліджень”, „Результати досліджень”,
„Обговорення результатів”, „Висновки”, „Список використаних джерел”,
який містить 207 посилань, з яких 195 іноземних авторів. Робота містить
13 таблиць та 32 рисунки.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 4 підрозділів. У першому з них
розглядаються загальні властивості іонів міді, кадмію, ванадію і срібла
та їх токсичність. У другому підрозділі наведено дані про екологію та
генетичні основи стійкості бактерій до іонів важких металів, а також
відомості про резистентних до цих токсикантів представників роду
Pseudomonas. В третьому підрозділі представлено відомості про основні
механізми резистентності мікроорганізмів до іонів важких металів. У
четвертому підрозділі розглядається перспективність застосування
стійких до іонів важких металів мікроорганізмів в ряді біоремедіаційних
та технологічних процесів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Об’єктами дослідження були 110 штамів стійких до іонів важких металів
мікроорганізмів, виділених з джерел з різним рівнем техногенного
навантаження (табл. 1).

Таблиця 1

Джерела виділення мікроорганізмів, стійких до іонів металів

Джерело виділення

з низьким рівнем техногенного навантаження з високим рівнем техногенного
навантаження

Лісовий грунт, Яготинський р-н, Київська обл. Грунт біля автозаправної
станції, м. Київ

Орний грунт, Яготинський р-н, Київська обл. Грунт з території заводу
комунального машинобудування “Коммаш”, м.Київ

Коров’ячий гній, приватне господарство, с. Новосілки, Київська обл.
Дренажні води муніципальних сміттєзвалищ, с. Пирогів, м. Київ

Курячий послід, приватне господарство, с. Новосілки, Київська обл.
Стічні води з території заводу комунального машинобудування “Коммаш”, м.
Київ

Кар’єрний пісок, Яготинський р-н, Київська обл. Повітря лабораторії
відділу фізіології промислових мікроорганізмів, Інститут мікробіології і
вірусології, м. Київ

Для порівняльних досліджень в роботі були використані штами бактерій
Pseudomonas aeruginosa УКМ B-1T (ATCC 10145) і Pseudomonas aeruginosa
УКМ B-900 (ATCC 9027), підтримувані в Українській Колекції
Мікроорганізмів, і штами Escherichia coli K12(F) і Escherichia coli
J53(RP4) з колекції відділу молекулярної генетики бактеріофагів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАНУ. Для
визначення спектру стійкості до іонів важких металів та впливу іонів
міді, кадмію, срібла і ванадію на ріст бактерій були відібрані 7 штамів
мультирезистентних до іонів металів бактерій. Для дослідження взаємодії
між мультирезистентними штамами та іонами міді, кадмію і ванадію були
відібрані 3 штами бактерій.

Для виділення штамів використовували агаризоване середовище М наступного
складу (г/л): КH2PO4 – 0,5; NH4NO3 – 0,5; MgSO4 – 0,1, дріжджовий
екстракт – 0,5; 3-заміщений цитрат Na – 10,0. Іони металів вносили
окремо після їх стерилізації в таких концентраціях: Cu2+ — 1,0 г/л у
вигляді CuSO4x5H2O, V5+ — 1,0 г/л у вигляді NH4VO3, Cd2+ – 0,5 г/л у
вигляді Cd(NO3)2, Ag+ – 0,1 г/л у вигляді AgNO3. Визначення чисельності
бактерій проводили турбідиметричним методом та методом серійних
розведень. Мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) ряду іонів важких
металів для штамів бактерій визначали на агаризованому середовищі М, що
містило відповідні концентрації іонів важких металів.

Морфолого-культуральні та фізіологі-біохімічні властивості штамів
бактерій визначали  загальноприйнятими методами [Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology, 1984; 1997]. Вивчали морфологію клітин,
культуральні властивості, рухливість, забарвлення за Грамом, тип
метаболізму, наявність каталази, оксидази, аргініндигідролази за методом
Мелера [Moeller, 1955], здатність до росту при 50С та 420С, утворення
левану з сахарози, гідроліз желатини і крохмалю, здатність до
денітрифікації. Здатність бактерій синтезувати флуоресцентний пігмент та
піоцианін визначали на середовищі Кинг А та Кинг В, відповідно [King et
al., 1954]. Для вивчення засвоєння бактеріями органічних сполук як
єдиного джерела вуглецю на агаризованому середовищі Козера, що містило
0,1% субстрату, було використано 51 сполуку, в тому числі цукри,
органічні кислоти, амінокислоти, спирти, тощо. Здатність бактерій
асимілювати вуглеводні вивчали в рідкому середовищі М, в яке додавали
бензин А76, бакинську нафту, гексадекан та дизельне пальне (0,1 об.%) як
єдине джерело вуглецю. Здатність бактерій до продукування сірководню
визначали на середовищі Кліглера [Kligler, 1917].

Дослідження продукування екзополіцукриду (ЕПЦ) бактеріями проводили за
допомогою методу Liu et al. [Liu et al., 1998]. Екзополіцукрид
осаджували 2 об’ємами охолодженого при –200С 960 етанолу. Індукцію
стійкості до іонів міді, ванадію та кадмію мультирезистентних штамів
бактерій досліджували шляхом попередньої інкубації штамів в середовищі,
що містило 0,1 г/л Cu2+, 0,05 г/л Cd2+ або 0,1 г/л V5+ (індуковані
культури) чи в середовищі без іонів металу (неіндуковані культури), з
подальшим пересівом їх в середовище, що містило 1,0 г/л Cu2+, 0,5 г/л
Cd2+ або 1,0 г/л V5+. За контроль вважали ріст неіндукованих культур в
середовищі, що містило 1,0 г/л Cu2+, 0,5 г/л Cd2+ або 1,0 г/л V5+.

Плазмідну ДНК виділяли методом Law et Crickmore [Law, Crickmore, 1997].
Візуалізацію ДНК здійснювали методом електрофорезу в агарозному гелі.
Відбір транскон’югантів проводили на середовищі М з іонами міді або
кадмію та канаміцином (50 мг/л). Гідроліз клітинних ліпідів та
метилювання жирних кислот проводили в 1,5% розчині сірчаної кислоти в
метанолі при 800С протягом 1 год. Метилові ефіри жирних кислот
екстрагували сумішшю диетилового ефіру та гексану (1:1 за об’ємом)
[Васюренко и др., 1982]. Склад жирних кислот визначали на
хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert  (США).

Вміст іонів міді та кадмію в біомасі визначали методом
атомно-адсорбційної спектрофотометрії. Атомне поглинання визначали на
атомно-адсорбційному спектрофотометрі Сатурн-3 з графітовим аналізатором
і дейтерієвим коректором фону. Акумуляцію іонів міді та кадмію визначали
в клітинах бактерій до і після інкубації біомаси в гіпертонічному
розчині 9% NaCl протягом 12 год. для видалення зв’язаних з поверхнею
клітин іонів металів. Ефлюкс іонів міді та кадмію з клітин бактерій
оцінювали за різницею вмісту відповідного іону металу в біомасі до та
після 1 год. інкубації бактерій в середовищі, що не містило цих іонів
металів. Визначали вплив інгібітору АТФазної активності
N-N-дициклогексилкарбодііміду (ДЦКД) (0,04 г/л) та інгібітору білкового
синтезу бактерій хлорамфеніколу (0,1 г/л) на ріст мультирезистентних
штамів в присутності 1,0 г/л Cu2+, 0,5 г/л Cd2+ чи 1,0 г/л V5+, на
акумуляцію та ефлюкс іонів міді та кадмію клітинами бактерій та
відновлення ванадату відібраними штамами в мікроаерофільних умовах.
Також визначали вплив ДЦКД в концентрації 0,04, 0,08 та 0,2 г/л на
відновлення ванадату бактеріями в аеробних умовах.

Концентрацію ванадат-іону в середовищі визначали за допомогою
колориметричного методу, в основі якого лежить утворення стійкого
комплексу чотирьохвалентного ванадію з перекисом водню жовто-коричневого
кольору в кислому середовищі [Музгин и др., 1981]. Для визначення
природи відновлення ванадату бактерії засівали у флакони з фосфатним
буфером, що містив ванадат як єдиний акцептор електронів та цитрат
натрію як донор електронів. Для створення анаеробних умов флакони
продували аргоном.

Отримані дані статистично обробляли з використанням комп’ютерної
програми Microsoft Excel.

Розділ 3. мікроорганізми, стійкі до іонів важких металів, в Джерелах з
різним рівнем техногенного навантаження

З джерел з різним рівнем техногенного навантаження було ізольовано 110
штамів мікроорганізмів, що були здатні рости на агаризованому середовищі
М в присутності 1,0 г/л Cu2+, 1,0 г/л V5+, 0,5 г/л Cd2+ або 0,1 г/л Ag+.
Відомо, що стійкі до іонів важких металів мікроорганізми часто виділяють
з джерел з високим рівнем техногенного навантаження [Piotrowska-Seget et
al., 2005; Viti et al., 2003]. Однак більша частина стійких до іонів
металів мікроорганізмів (58,18%) була ізольована нами з джерел з низьким
рівнем техногенного навантаження. Переважну більшість ізольованих
мікроорганізмів складали бактерії: грамнегативні палички (61,8%),
грампозитивні палички (30%) та коки (0,9%). Рідше виділяли мікроскопічні
гриби (0,9%) та дріжджі (5,45%) (рис. 1).

Рис. 1. Різні групи стійких до іонів металів мікроорганізмів в джерелах
з різним ступенем техногенного навантаження. 1 – лісовий грунт, 2 –
орний грунт, 3 — кар’єрний пісок, 4 — коров’ячий гній, 5 – курячий
послід, 6 – повітря, 7 — грунт біля автозаправної станції, 8 — грунт з
території заводу комунального машинобудування, 9 — стічні води заводу
комунального машинобудування , 10 — дренажні води муніципального
сміттєзвалища.

Зі 110 ізольованих штамів 93 штами (84,54%) були резистентні до
п’ятивалентного ванадію, 80 штамів (72,73%) — до іонів міді, 62 штами
(56,36%) були стійкі до дії іонів кадмію, а 54 ізоляти (49,09%) — до
іонів срібла. 43 культури (39,09%) були здатні рости на суміші іонів
міді, кадмію і срібла, і тільки 17 штамів були стійкі до одного металу.
Найчастіше зустрічалися мікроорганізми з фенотипом CuV (66 штамів), CdV
(56 штамів), VАg (49 штамів), CuCd (48 штамів) (рис. 2).

Рис. 2. Множинна стійкість ізольованих штамів мікроорганізмів до іонів
важких металів

Для грамнегативних штамів був характерний більш широкий спектр
резистентності до іонів металів, а серед грампозитивних культур майже
половину (49%) складали штами, стійкі до 1 чи 2 іонів важких металів.

Отже, стійкі до іонів важких металів мікроорганізми виділяли з джерел як
з високим, так і низьким рівнем техногенного навантаження. Більшість
ізольованих штамів мікроорганізмів мали множинну стійкість до іонів
важких металів.

Більшість ізольованих штамів (88,18%) були здатні рости у рідкому
середовищі з ванадатом у мікроаерофільних умовах (рис. 3), при цьому 29
штамів відновлювали ванадат до ванаділ-іону (V4+), про що свідчило
забарвлення середовища в сіро-бузковий колір.

Рис. 3. Ріст стійких до іонів важких металів мікроорганізмів в рідкому
середовищі в присутності V5+ та відновлення ними ванадату в
мікроаерофільних умовах

Штами, здатні до відновлення ванадату в мікроаерофільних умовах,
виділяли з джерел як з високим, так і низьким рівнем техногенного
навантаження (рис. 4). Вперше нами були ізольовані ванадатвідновлювальні
мікроорганізми з курячого посліду, коров’ячого гною, повітря
лабораторії, тощо. Таке поширення ванадатвідновлювальних мікроорганізмів
можна пояснити як відносно низькою токсичністю ванадію для бактерій
[Bell et al., 2004], так і неспецифічним механізмом відновлення
ванадату, притаманним різним групам мікроорганізмів [Андреюк и др.,
2003].

Для подальших досліджень було відібрано сім штамів бактерій, що мали
множинну стійкість до іонів міді, кадмію, срібла і ванадію. Всі вони
були грамнегативні рухливі каталазопозитивні палички.

Ці штами бактерій мали схожий спектр резистентності до ряду іонів важких
металів (Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+, Ag+, Mo6+), однак характеризувалися
значними коливаннями МІК іонів ртуті (0,025-0,2 г/л) та шестивалентного
хрому (0,005-2,0 г/л). Штам А17 виявив найбільшу резистентність до всіх
досліджених іонів металів і мав МІК Hg2+ і Cr6+, які значно перевищували
ці показники для інших штамів.

Рис. 4. Ванадатвідновлювальні мікроорганізми в джерелах з різним рівнем
техногенного навантаження. 1 – лісовий грунт, 2 – орний грунт, 3 —
коров’ячий гній, 4 – курячий послід, 5 – повітря, 6 — грунт біля
автозаправної станції, 7 — грунт з території заводу комунального
машинобудування, 8 — стічні води заводу комунального машинобудування.

th

$ ? I I

O

O

oe

u

$

u

ue

th

$ O

O

u

&

Fкі до дії іонів важких металів в рідкому середовищі, проте іони срібла
в рідкому середовищі були високотоксичні для всіх досліджених штамів. Ці
штами були відібрані для подальших досліджень. За фенотиповими ознаками
та жирнокислотним спектром відібрані штами А17, А03 та С25а були
віднесені до виду P. аeruginosa.

Розділ 4. Взаємодія мультирезистентних штамів Pseudomonas aeruginosa з
іонами міді, кадмію і ванадію

Стійкість мікроорганізмів до іонів важких металів може бути
конститутивною або індукованою ознакою. Характер відповіді штамів P.
аeruginosa A17, A03 та C25a на індукцію низькими концентраціями іонів
міді, ванадію та кадмію був специфічним для кожного штаму. Спостерігали
індукцію стійкості до іонів міді та кадмію у штамів P. аeruginosa А03 та
С25а, але не штаму P. аeruginosa А17. Індукований характер стійкості до
п’ятивалентного ванадію спостерігали лише у штаму P. аeruginosa С25а при
попередній дії низьких концентрацій іонів ванадію.

Одним з основних механізмів захисту бактерій від токсичної дії іонів
важких металів є зв’язування їх зовнішньоклітинними біополімерами
[Bruins et al., 2000]. Штами P. аeruginosa А17, А03 та С25а по-різному
реагували на дію іонів міді, кадмію і ванадію. Продукція ЕПЦ
пригнічувалась у всіх досліджених штамів в присутності ванадату, а також
в присутності іонів міді та кадмію у штаму P. аeruginosa А17. Навпаки,
іони кадмію стимулювали продукцію ЕПЦ у штамів P. аeruginosa А03 та
С25а, а іони міді – у штаму P. аeruginosa С25а.

Стійкість бактерій до іонів важких металів може кодуватися як
хромосомними, так і позахромосомними генетичними детермінантами. Деякі
автори зазначають, що гени, які відповідають за нормальний метаболізм
іонів металів в клітині, зазвичай розташовані на хромосомі, а генетичні
детермінанти стійкості мікроорганізмів до токсичних концентрацій іонів
металів мають плазмідну природу [Bruins et al., 2003; Cervantes et al.,
2001]. Кожен з досіджених нами штамів містив єдину високомолекулярну
плазміду вагою близько 100 kb. Ми припускаемо, що плазміда, яку містив
штам P. аeruginosa С25а, несла гени стійкості до іонів міді та кадмію,
оскільки штам E. coli J53, чутливий до іонів міді і кадмію, в результаті
кон’югативного процесу набував стійкості до іонів міді та кадмію (табл.
2). Отже, виділення мікроорганізмів з множинною стійкістю до іонів
важких металів з джерел як з низьким, так і високим рівнем техногенного
навантаження можна пояснити горизонтальним переносом генетичних
детермінант стійкості до іонів металів плазмідами або іншими
позахромосомними елементами.

Таблиця 2

Частота кон’югації між штамом P. aeruginosa С25а і штамами E. coli K12
та E.coli J53

Кон’югаційна суміш Час інкубації, хв.

45 90

P. aeruginosa C25a+E.coli K12 на середовищі з міддю 0 0

P. aeruginosa C25a+E.coli K12 на середовищі з кадмієм 0 0

P. aeruginosa C25a+E.coli J53 на середовищі з міддю 4×10-3 6×10-3

P. aeruginosa C25a+E.coli J53 на середовищі з кадмієм 4×10-3 6×10-3

Забруднення довкілля важкими металами доволі часто супроводжується
забрудненням органічними сполуками, у тому числі і нафтопродуктами
[Клімова, 2006; Wilson et al., 2005]. Показано, що штами P. aeruginosa
А17, А03 та С25а були здатні використовувати як єдине джерело вуглецю
нафту, гексадекан та дизельне пальне. Використання штамів
мікроорганізмів, стійких до іонів важких металів та здатних до
деградації ксенобіотиків, є одним з перспективних напрямків в
біоремедіаційних процесах.

Здатність до зв’язування іонів важких металів на поверхні або всередині
клітини широко розповсюджена серед мікроорганізмів. Було встановлено, що
штами P. aeruginosa А17, А03 та С25а були здатні акумулювати іони міді
та кадмію як на поверхні клітин, так і всередині клітин (рис. 5). Більш
ніж 90% іонів міді сорбувалися на поверхні клітин штамів А03 та С25а, в
той час як на поверхні клітин штаму А17 сорбувалося лише 37%
акумульованих іонів міді. 55-65% іонів кадмію сорбувалися на поверхні
клітин P. aeruginosa А17, А03 та С25а.

Рис. 5. Акумуляція іонів міді та кадмію штамами P. aeruginosa А17 (А),
А03 (Б) та С25а (В). Вміст міді та кадмію в клітинах визначали до
(чорний колір) та після (сірий колір) обробки гіпертонічним розчином.

Деякі мікроорганізми здатні експортувати іони металів з цитоплазми
назовні або в периплазматичний простір (система ефлюксу). Згідно Nies,
система активного транспорту іонів металів з клітини представляє
найбільшу групу систем стійкості до іонів важких металів у бактерій
[Nies, 2003]. При дослідженні ефлюксу іонів міді та кадмію з клітин
штамів P. aeruginosa спостерігали зниження вмісту іонів міді та кадмію в
клітинах штамів P. aeruginosa через 1 год. культивування клітин в
середовищі, що не містило іонів металів, при цьому зниження вмісту іонів
кадмію було більш значним (80-96%) в порівнянні з міддю (38-70%) (рис.
6).

Рис. 6. Ефлюкс іонів міді та кадмію з клітин штамів P. aeruginosa А17
(А), А03 (Б) та С25а (В). Вміст міді та кадмію в клітинах визначали до
(чорний колір) та після (сірий колір) інкубації клітин в середовищі без
металу.

Отримані результати можуть свідчити про те, що в механізмі стійкості
штамів P. aeruginosa А17, А03 та С25а до іонів міді та кадмію задіяні
системи активного транспорту іонів металів з клітини, а саме системи
ефлюксу. Таке припущення в подальшому підтвердилося даними про
пригнічення акумуляції та ефлюксу іонів міді та кадмію з клітин штамів
P. aeruginosa А17, А03 та С25а інгібітором АТФазної активності ДЦКД
(рис. 7). Оскільки системи ефлюксу використовують енергію АТФ або
хеміоосмотичного градієнту [Nies, 2003], було зроблено висновок про те,
що системи ефлюксу штамів P. aeruginosa А17, А03 та С25а містять АТФази.

Рис. 7. Вплив дициклогексилкарбодііміду на ефлюкс іонів міді та кадмію з
клітин штамів P. aeruginosa А17 (А), А03 (Б) та С25а (В). Вміст міді та
кадмію в клітинах визначали до (чорний колір) та після (сірий колір)
інкубації клітин в середовищі без металу.

Хлорамфенікол, що є інгібітором білкового синтезу у бактерій,
пригнічував акумуляцію та ефлюкс іонів міді та кадмію штамами P.
aeruginosa А17, А03 та С25а (рис. 8). Так, здатність штамів P.
aeruginosa А17, А03 та С25а акумулювати іони міді складала лише 23,66%,
14,3% та 37,88% від контрольних зразків, відповідно. При дії
хлорамфеніколу здатність штамів А17 та А03 акумулювати іони кадмію
складала 36,28% та 57,2% від контролю, а штам С25 акумулював іони кадмію
на тому ж рівні, що й необроблені клітини. Такі результати свідчать про
важливу роль синтезу білку de novo в механізмі стійкості досліджуваних
штамів до іонів міді та кадмію.

Присутність АТФ-залежних систем ефлюксу іонів важких металів характерна
для різних груп мікроорганізмів, в тому числі такі системи широко
розповсюджені серед стійких до іонів металів бактерій роду Pseudomonas
[Saxena et al., 2002; Mago, Srivastava, 1994]. Водночас слід зазначити,
що система ефлюксу не є єдиним механізмом стійкості штамів P. aeruginosa
А17, А03 та С25а до іонів міді та кадмію, оскільки ДЦКД в присутності
іонів важких металів не пригнічував росту бактерій. Оскільки було
показано, що значна частина іонів міді та кадмію сорбується на поверхні
клітин штамів P. aeruginosa, було зроблено висновок про те, що
резистентність штамів P. aeruginosa А17, А03 та С25а до іонів міді та
кадмію зумовлюється принаймні двома різними механізмами захисту –
сорбційними процесами на поверхні клітин та АТФ-залежними системами
ефлюксу.

Рис. 8. Вплив хлорамфеніколу на ефлюкс іонів міді та кадмію з клітин
штамів P. aeruginosa А17 (А), А03 (Б) та С25а (В). Вміст міді та кадмію
в клітинах визначали до (чорний колір) та після (сірий колір) інкубації
клітин в середовищі без металу.

Відомо, що деякі бактерії здатні відновлювати ванадат до
чотирьохвалентного ванадію в анаеробних або мікроаерофільних умовах
[Carpentier et al., 2003; Ortiz-Bernad et al., 2004]. Було показано, що
штами P. aeruginosa А17, А03 та С25а відновлювали ванадат в
мікроаерофільних умовах (рис. 9), при цьому активність відновлення
ванадату підвищувалась в 2-3 рази при збільшенні кількості посівного
матеріалу: на 26-у добу культивування штамів А17, А03 та С25а
концентрація V5+ в середовищі знижувалась на 18,1%, 18,4% та 19,6%,
відповідно, якщо посівний матеріал складав 5х107 КУО/мл, та на 38,2,
60,6 та 47,7%, відповідно, при посівному матеріалі 1,5х108 КУО/мл.
Спостерігали лише незначне збільшення біомаси бактерій в перші 1-2 доби
культивування. Слід зазначити, що помітне зниження концентрації ванадату
в середовищі спостерігали лише з 7-10-ї доби культивування. Такі дані
можуть вказувати на те, що процес відновлення V5+ штамами P. aeruginosa
А17, А03 та С25а не є анаеробним диханням.

При культивуванні штамів P. aeruginosa А17, А03 та С25а в анаеробних
умовах в фосфатному буфері, що містив лише ванадат як єдиний акцептор
електронів та цитрат натрію як донор електронів, відновлення ванадату не
спостерігали, що є підтвердженням того, штами P. aeruginosa А17, А03 та
С25а не використовують ванадат як кінцевий акцептор електронів в
анаеробному диханні.

Рис. 9. Відновлення ванадату штамами P. аeruginosa А17 (А), А03 (Б) та
С25а (В) в мікроаерофільних умовах. Посівний матеріал складав 5х107
КУО/мл (?) і 1,5х108 КУО/мл (?).

Було показано, що відновлюють ванадат лише живі клітини P. aeruginosa, а
в середовищі, що містило убиті прогріванням клітини, відновлення
ванадату не спостерігалося (рис. 10). Таким чином, отримані дані
вказують на те, що відновлення ванадату штамами P. aeruginosa А17, А03
та С25а потребує наявності життєздатних клітин або їх метаболітів, а не
є суто фізико-хімічним процесом.

Штам P. aeruginosa А17 і в аеробних умовах був здатний до відновлення
ванадату (до 15%) при додаванні в середовище інгібітору АТФазної
активності ДЦКД, при цьому в умовах відсутності ДЦКД відновлення
ванадату не спостерігалось. Концентрація ДЦКД помітно не впливала на
процес відновлення ванадату штамом P. aeruginosa А17. Індукція
бактеріального відновлення ванадату в аеробних умовах інгібітором
АТФзної активності дцкд показана вперше.

Рис. 10. Відновлення ванадату інтактними та вбитими клітинами штаму P.
aeruginosa А17. 1 – вбиті прогріванням клітини, 2 – живі клітини, 3 –
середовище без клітин.

Таким чином в представленій роботі показано, що стійкість досліджених
штамів бактерій до іонів важких металів обумовлена декількома
механізмами. Дані щодо розуміння механізмів стійкості мультирезистентних
штамів бактерій до іонів важких металів в перспективі можуть привести до
удосконалення існуючих та впровадження нових біоремедіаційних підходів.

ВИСНОВКИ

Мікроорганізми, стійкі до високих концентрацій іонів міді, кадмію,
срібла і ванадію, розповсюджені в джерелах як з високим так і низьким
рівнем техногенного навантаження. Переважна кількість ізольованих штамів
мала множинну стійкість до 2 або більше іонів важких металів. Серед 110
ізольованих штамів домінували грамнегативні палички (61,8%).

Досліджені штами характеризувалися широким спектром стійкості до іонів
важких металів. Штами з найвищим рівнем множинної стійкості до іонів
важких металів належали до виду Pseudomonas aeruginosa.

Стійкість мультирезистентних штамів P. аeruginosa до іонів міді та
кадмію зумовлена сорбційними процесами на поверхні клітини та
АТФ-залежними системами ефлюксу, в яких задіяний синтез білку de novo.

Резистентність до іонів міді та кадмію мала індукований характер у
штамів P. aeruginosa А03 та С25а і конститутивний — у штаму P.
aeruginosa А17. Індукція стійкості до ванадату встановлена у штаму P.
aeruginosa С25а.

Показано кон’югативний перенос детермінант стійкості до іонів міді та
кадмію з штаму P. aeruginosa С25а до штаму E. coli J53.

Показано відновлення ванадату штамами P. aeruginosa, що не пов’язане з
анаеробним диханням. Виявлено індукцію бактеріального відновлення
ванадату в аеробних умовах інгібітором АТФазної активності
дициклогексилкарбодіімідом.

Показано здатність штамів P. aeruginosa А17, А03 та С25а використовувати
як єдине джерело вуглецю нафту, гексадекан та дизельне пальне, що може
бути використано в біоремедіаційних процесах.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

Янєва О.Д., Смирнова Г.Ф., Підгорський В.С. Розповсюдження
метал-резистентних мікроорганізмів в екологічних нішах з різним ступенем
забруднення // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник
наукових праць. – Вип. 193: Біологія. – Чернівці: “Рута”, 2004. – С.
47-52. (Здобувачем особисто вивчено розповсюдження стійких до іонів
важких металів мікроорганізмів в різних місцях існування)

Янєва О.Д, Смирнова Г.Ф., Підгорський В.С. Резистентність до
антибіотиків і важких металів деяких грамнегативних бактерій // Вісник
Одеського Національного Університету. – 2005. — Т. 10, випуск 7. — С.
96-101. (Здобувачем особисто досліджено стійкість до іонів важких
металів і антибіотиків мультирезистентних штамів бактерій)

Янєва О.Д., Смирнова Г.Ф., Підгорський В.С. Індукція стійкості до іонів
міді і кадмію мультирезистентних штамів роду Pseudomonas // Доповіді НАН
України. – 2007. — № 3. – С. 181-185. (Здобувачем вивчено індуковану
відповідь штамів роду Pseudomonas на дію іонів міді і кадмію)

Ianieva O.D., Smyrnova H.F. Effects of heavy metal ions on some
gram-negative multiresistant strains // Науковий вісник Ужгородського
університету. Серія “Біологія”. — 2007. — Випуск 20. – С. 234-238.
(Здобувачем особисто досліджено вплив іонів важких металів на ріст 7
штамів мультирезистентних бактерій)

Подгорский В.С., Смирнова Г.Ф., Янева О.Д. Особенности рапространения
металлрезистентных микроорганизмов в различных экологических нишах //
Сборник тезисов международной научной конференции “Современные проблемы
загрязнения почв” (Москва, 24-28 мая, 2004) — М.: МГУ. – 2004. – С. 256.

Янєва О.Д., Смирнова Г.Ф., Підгорський В.С. Резистентність до
антибіотиків і важких металів деяких грамнегативних бактерій // Х з’їзд
товариства мікробіологів України (Одеса, 15-17 вересня, 2004). Тези
доповідей. – Одеса: Астропринт. — 2004. – С. 95.

Янева О.Д., Смирнова Г.Ф., Подгорский В.С. Рост и индукция устойчивости
к тяжелым металлам грамотрицательных металлрезистентных бактерий //
Биология – наука XXI века: 10 Пущинская школа-конференция молодых
ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН (Пущино,
17-21 апреля 2006 года). Сборник тезисов. Пущино. – 2006. – С. 222.

Янева О.Д., Смирнова Г.Ф., Подгорский В.С. Индукция устойчивости к ионам
меди и кадмия мультирезистентных штаммов рода Pseudomonas // Тези
доповідей міжнародної наукової конференції “Мікробні біотехнології”
(Одеса, 11-15 вересня, 2006), ).- Одеса: Астропринт. – 2006. — С. 212

Янєва О. Штами Pseudomonas aeruginosa, мультирезистентні до іонів важких
металів // Шевченківська весна: Матеріали Міжнародної науково-практичної
конференції студентів, аспірантів та молодих вчених. – Вип. V: У 5-х
част. – Ч.1 / За заг. ред. проф. О.К. Закусила. – Київ: ВЦ
“Принт-центр”. — 2007. – С. 91-94.

Ianieva O. Accumulation of heavy metal ions by multiresistant strains
Pseudomonas aeruginosa // Modern problems of Microbiology and
Biotechnology: Book of abstracts: Матеріали Міжнародної конференції
молодих учених і студентів / Голов. ред. В.О. Іваниця. – Одеса:
Астропринт. — 2007. – С. 4.

Анотація

Янєва О.Д. Взаємодія мультирезистентних до металів бактерій з іонами
міді, кадмію і ванадію. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена вивченню особливостей взаємодії мультирезистентних
до металів бактерій з іонами міді, кадмію і ванадію. Виділено 110 штамів
мікроорганізмів, стійких до високих концентрацій іонів міді, кадмію,
срібла і п’ятивалентного ванадію, з джерел з різним рівнем техногенного
навантаження. Показано домінування грамнегативних бактерій серед
ізольованих штамів. Серед ізольованих штамів домінували мікроорганізми з
фенотипом множинної стійкості CuV (60%), CdV (50,9%), VАg (44,54%),
тощо. Виявлені нові місця існування ванадатвідновлювальних
мікроорганізмів.

Штами з найвищим рівнем множинної стійкості до іонів важких металів
належали до виду Pseudomonas aeruginosa. Показано індукцію стійкості
мультирезистентних штамів P. аeruginosа А03 та С25а до іонів міді та
кадмію і штаму P. аeruginosа С25а до ванадату. Показано кон’югативний
перенос детермінант стійкості до іонів міді та кадмію з штаму P.
аeruginosа С25а до штаму Escherichia coli J53.

Встановлено, що стійкість мультирезистентних штамів P. аeruginosа до
іонів міді та кадмію визначалась принаймні двома різними механізмами –
сорбційними процесами на поверхні клітин та АТФ-залежними системами
ефлюксу.

Показано здатність штамів P. аeruginosа відновлювати до 60% ванадату в
мікроаерофільних умовах. Цей процес не був пов’язаний з анаеробним
диханням. Вперше спостерігали індукцію бактеріального відновлення
ванадату в аеробних умовах інгібітором АТФазної активності
дициклогексилкарбодіімі-дом.

Одержані дані сприяють з’ясуванню механізмів захисту бактерій від
токсичної дії важких металів.

Ключові слова: резистентні до іонів важких металів мікроорганізми,
поширення, множинна стійкість, Pseudomonas aeruginosa, взаємодія

аннотация

Янева О.Д. Взаимодействие мультирезистентных к металлам бактерий с
ионами меди, кадмия и ванадия. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена изучению особенностей взаимодействия
мультирезистентных к металлам бактерий с ионами меди, кадмия и ванадия.
Выделено 110 штаммов микроорганизмов, устойчивых к высоким концентрациям
ионов меди, кадмия, серебра и пятивалентного ванадия, из мест обитания
с различным уровнем техногенной нагрузки. Среди выделенных штаммов
доминировали грамотрицательные бактерии. Наиболее часто встречались
такие фенотипы множественной устойчивости: CuV (60%), CdV (50,9%), VАg
(44,54%) и др. Обнаружены новые места обитания ванадатвосстанавливающих
микроорганизмов.

Штаммы с выраженной множественной устойчивостью к ионам тяжелых металлов
принадлежали к виду Pseudomonas аeruginosа. Показана индукция
устойчивости мультирезистентных штаммов P. аeruginosа А03 и С25а
конститутивный характер устойчивости штамма P. аeruginosа А17 к ионам
меди и кадмия, а также индукцию устойчивости штамма P. аeruginosа С25а к
ванадату. Продемонстрирован конъюгативный перенос генетических
детерминант устойчивости к ионам меди и кадмия из штамма P. аeruginosа
С25а в штамм Escherichia coli J53.

Установлено, что устойчивость штаммов P. аeruginosа к ионам меди и
кадмия определялась по крайней мере двумя разными механизмами –
сорбционными процесами на поверхности клетки и АТФ-зависимыми системами
эффлюкса.

Показана способность штаммов P. аeruginosа восстанавливать до 60%
ванадата в микроаэрофильных условиях. Этот процесс не являлся анаэробным
дыханием. Показана индукция бактериального восстановления ванадата в
аэробных условиях ингибитором АТФазной активности
дицикло-гексилкарбодиимидом.

Полученные результаты способствуют болем глубокому пониманию механизмов
защиты бактерий от действия ионов тяжелых металлов.

Ключевые слова: резистентные к ионам тяжелых металлов микроорганизмы,
распространение, множественная устойчивость, Pseudomonas aeruginosa,
взаимодействие.

summary

Ianieva O.D. Interactions of multiply metal-resistant bacteria with ions
of copper, cadmium and vanadium. – Manuscript.

The thesis for the candidate degree by speciality 03.00.07. –
microbiology. Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

The final objective of the thesis was to study interactions of multiply
metal-resistant bacteria and ions of copper, cadmium and vanadium. 110
strains of microorganisms resistant to high levels of copper, cadmium,
silver and pentavalent vanadium have been isolated from sites with
different level of technogenic influence. The presence of microorganisms
resistant to high levels of copper, cadmium, silver and vanadium in the
sites with both low and high level of technogenic influence has been
shown. Gram-negative bacteria were prevalent among the isolated strains.
The new habitats of vanadate-reducing microorganisms have been found.

Most isolated strains were multiply metal-resistant. The multiple metal
resistance phenotypes CuV (60%), CdV (50.9%), VAg (44.5%) were
predominant among the isolated microorganisms.

Three strains with highest multiple resistance to heavy metal ions have
been identified as Pseudomonas aeruginosa. Copper and cadmium resistance
of A17 and A03 strains was shown to be inducible while that of A17
strain was constitutive. Vanadate resistance of C25a strain was
inducible. Heavy metal ions either stimulated or inhibited the
exopolysaccharide production by P. aeruginosa strains. The strains P.
aeruginosa A17, A03 and C25a assimilated oil, diesel oil and hexadecane
as a sole carbon source. Genetic determinants of copper and cadmium
resistance have been transferred by conjugation from P. aeruginosa C25a
strain to Escherichia coli J53.

Copper and cadmium resistance of multiresistant P. aeruginosa strains
was determined by two different mechanisms – sorption processes on the
cell surface and ATP-dependent efflux systems.

P. aeruginosa strains have been shown to reduce up to 60% vanadate under
microaerophilic conditions. Vanadate reduction started after the active
phase growth. This process did not represent anaerobic respiration. The
possibility that vanadate reduction was the result of a spontaneous
process has been eliminated. This is the first report of induction of
bacterial vanadate reduction under aerobic conditions by ATPase
inhibitor dicyclohexylcarbodiimide.

The obtained results can provide new insights into the mechanisms of
bacterial heavy metal resistance.

Key words: heavy metal resistant microorganisms, distribution, multiple
resistance, Pseudomonas aeruginosa, interaction.

Похожие записи