НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ІНСТИТУТ ФІЗИКИ НАПІВПРОВІДНИКІВ ІМ. В.Є. ЛАШКАРЬОВА

БОЛТОВЕЦЬ Прасковія Миколаївна

УДК 578.74; 578.85; 543.45

Взаємодія антиген-антитіло в умовах поверхневого плазмонного резонансу
та застосування цього явища для визначення вірусспецифічних макромолекул

03.00.06 — вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної біології вірусів Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та відділі
функціональної оптоелектроніки Інституту фізики напівпровідників ім.
В.Є. Лашкароьва НАН України

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАНУ

Дяченко Наталія Сергіївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України,

завідувач відділу молекулярної біології вірусів

кандидат фізико-математичних наук,

Снопок Борис Анатолійович, Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є.
Лашкароьва НАН України,

старший науковий співробітник відділу функціональної оптоелектроніки

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН
України, завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем

доктор медичних наук, с.н.с.

Рибалко Світлана Леонтіївна, Інститут епідеміології та інфекційних
хвороб Міністерства охорони здоров’я України, завідувач лабораторії
контролю якості імунобіологічних препаратів

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист дисертації відбудеться “18” лютого 2004 р. о 1000 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті
мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою:
03143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ,
вул. Заболотного, 154

Автореферат дисертації розіслано “15” січня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з важливих завдань сучасної вірусології є
експресна, дешева і адекватна детекція вірусів у клінічному матеріалі
(для вірусів людини і тварин), уражених рослинах (для вірусів рослин) та
навколишньому середовищі. Наявність вірусних часток у досліджуваному
матеріалі дозволяє робити висновки щодо наявності інфекційного процесу,
екологічної і епідеміологічної ситуації. Необхідно також зазначити, що
одні й ті самі клінічні прояви можуть викликатись різними вірусами, тому
для встановлення етіології захворювання необхідна розробка
високоспецифічних та експресних методів лабораторної діагностики
вірусних хвороб.

Одним з перспективних шляхів розробки методів експрес-діагностики
вірусних хвороб уявляється застосування оптоелектронних перетворювачів,
зокрема, тих, що використовують ефект поверхневого плазмонного
резонансу, ППР (surface plasmon resonance, SPR). Основні переваги
використання подібного роду систем для діагностики вірусних захворювань
перед традиційними методами дослідження імунохімічних взаємодій
обумовлені можливістю експресного отримання інформації, безпосереднього
дослідження міжмолекулярних взаємодій, та аналізу кінетичних параметрів
процесу зв’язування, що дозволяє визначити механізм такого процесу, а
також відсутністю необхідності використання дорогих мічених реактивів.

Для отримання достовірної інформації щодо білок-білкової взаємодії з
використанням методу ППР суттєвою є процедура іммобілізації на сенсорній
поверхні рецепторних центрів білків. З одного боку, їх закріплення
повинне забезпечувати відсутність небажаних структурних змін на поверхні
перетворювача, з іншого – сприяти впорядкованому орієнтованому
розташуванню молекул. Оскільки загальновживані способи модифікації
плівки золота, зокрема, створення карбоксиметилдекстранового шару на її
поверхні, не дозволяють повною мірою реалізувати можливості методу в
цьому напрямку (зокрема, внаслідок гідродинамічних обмежень для
взаємодії партнерів), створення проміжного шару між досліджуваним білком
і металом, який мав би одночасно захисні властивості і здатність
орієнтувати молекули в просторі, представляє як теоретичний, так і
практичний інтерес.

Простота і експресність методик, заснованих на використанні
оптоелектронних перетворювачів, дозволяють розробляти зручні у
практичному використанні процедури для оперативної діагностики вірусних
інфекцій у клінічних умовах, а також для визначення вмісту вірусів у
рослинах, у тому числі, тих, що мають сільськогосподарську цінність.
Однак, незважаючи на досить широке застосування методу ППР для вивчення
різноманітних білків, даний метод не знайшов ще широкого застосування
для детекції вірусів та їх антигенів. Представляє інтерес розробка
підходів до експресного виявлення білків важливих з медичної і
сільськогосподарської точок зору вірусів, зокрема, мажорного білка
капсиду аденовірусів гексону та структурного білка Х-вірусу картоплі. Як
модельний об’єкт для відпрацювання системи детекції вірусів бажано
використовувати вірус з добре знаною просторовою структурою і невеликими
розмірами, яким є вірус тютюнової мозаїки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Робота була виконана в
Інституті мікробіології і вірусології НАНУ та Інституті фізики
напівпровідників НАНУ на протязі 1999-2002 рр. Робота відповідає
основному напрямку науково-дослідних робіт відділу молекулярної біології
вірусів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ і відділу
функціональної оптоелектроніки Інституту фізики напівпровідників НАНУ.
Тема роботи була затверджена Вченою Радою ІМВ НАНУ. Робота виконувалась
у рамках теми “Вивчення молекулярних механізмів взаємодії ДНК-геномних
вірусів з клітиною як передумова розробки засобів етіотропної терапії та
специфічної діагностики спричинених ними захворювань” (Постанова Бюро
ВМББЕКФ НАНУ від 01.12.1999) та державної комплексної науково-технічної
програми “Розробка технологій і організація виробництва
напівпровідникових мікросенсорів, електронних приладів і систем на їх
основі для екологічного моніторингу і енергозбереження”, 1996-2001 рр.
(Доручення Кабінету Міністрів України від 16.05.96 № 9918/97), номер
держ. реєстрації 0197U008668.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення в умовах
поверхневого плазмонного резонансу взаємодії антиген-антитіло (на таких
прикладах, як: імуноглобуліни G (IgG) людини – антивидові IgG кози;
структурний білок Х-вірусу картоплі (ХВК), гексон аденовірусу типу 2
(Ад2), вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) – відповідні специфічні IgG) та
розробка підходу до визначення ВТМ і вказаних білків з використанням
ППР.

Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

розробка оптимального методу формування на поверхні сенсора шару малих
молекул з ефективним негативним зарядом як перший етап створення
сенсорної системи для детекції вірусів;

вивчення взаємодії білкової молекули з модифікованою поверхнею сенсора в
залежності від рН середовища на прикладі соєвого інгібітора трипсину
(soybean trypsin inhibitor, STI) та комп’ютерне моделювання впливу зміни
умов середовища на зарядовий стан білка з точки зору його орієнтації на
поверхні, що несе ефективний негативний заряд;

оптимізація процесу іммобілізації імуноглобулінів G на поверхні сенсора,
модифікованій тіоціанатом калію (KNCS) і білком А Staphylococcus aureus
(St. aureus);

дослідження взаємодії між вірусними білками і відповідними специфічними
IgG, іммобілізованими на модифікованій поверхні сенсора, на прикладі
структурного білка ХВК і гексона Ад2;

моделювання кінетики іммобілізації специфічних антитіл на модифікованій
поверхні сенсора і їх подальшої взаємодії з очищеним ВТМ;

розробка процедури виявлення і кількісного визначення ВТМ в гомогенатах
інфікованих клітин за допомогою сенсора, модифікованого тіоціанатом і
білком А St. aureus.

Об’єкт дослідження. Вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), гомогенати
інфікованих ВТМ клітин, поліклональна специфічна сироватка до ВТМ, IgG
людини і антивидові IgG кози, специфічні до IgG людини, структурний
білок ХВК, гексон Ад2 і відповідні специфічні сироватки, білок А St.
aureus, трипсин (Т) і його соєвий інгібітор.

Предмет дослідження. Взаємодія в умовах поверхневого плазмонного
резонансу між ВТМ, структурним білком ХВК, гексоном Ад2 і відповідними
специфічними антитілами, IgG людини і антивидовими IgG кози, трипсином і
його соєвим інгібітором на поверхні сенсора, що несе ефективний
негативний заряд.

Методи дослідження. Поверхневий плазмонний резонанс, імуноферментний
аналіз, преципітація в агаровому гелі, непрямий метод флюоресцюючих
антитіл, світлова мікроскопія, спектрофотометрія, комп’ютерне
моделювання.

Наукова новизна отриманих результатів. В умовах поверхневого плазмонного
резонансу досліджено взаємодію між вірусними білками та іммобілізованими
на модифікованій поверхні сенсора відповідними специфічними IgG на
прикладі структурного білка ХВК і гексону Ад2. Розроблено новий підхід
до визначення ВТМ і вказаних білків з використанням ППР.

Запропоновано нову методику модифікації поверхні сенсора для визначення
вірусів чи їх білків шляхом формування на поверхні сенсора шару малих
молекул з ефективним негативним зарядом, яка дозволяє запобігти
денатурації білків, зокрема, імуноглобулінів G, і забезпечити їх
орієнтовану іммобілізацію, а також уникнути стадії блокування незайнятих
місць за допомогою бичачого сироваткового альбуміну (БСА).

На підставі комплексного вивчення біоспецифічних процесів поблизу
поверхні сенсора показано, що її послідовна обробка тіоціанатом і білком
А St. aureus забезпечує стабільну, відтворювану іммобілізацію
імуноглобулінів G, що продемонстровано на прикладі взаємодії
іммобілізованих специфічних IgG з антивидовими IgG і вірусними білками.

На основі комп’ютерної моделі зарядового стану білків і його зміни в
залежності від зміни зовнішніх умов на прикладі STI і білка А St. aureus
обґрунтована просторова структура білків на зарядженій поверхні.
Зокрема, виявлено, що білок А St. aureus може формувати структури різної
конформації з різною поверхневою щільністю в залежності від стану
поверхні, що відповідно впливає на його здатність до орієнтованої
іммобілізації антивірусних імуноглобулінів G.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано нову оригінальну
процедуру кількісного визначення вірусу шляхом іммобілізації комплексу
специфічні IgG-вірус на модифіковану тіоціанатом і білком А St. aureus
поверхню сенсора, яку продемонстровано на прикладі ВТМ.

Запропоновано зручний і експресний спосіб визначення вірусів або їх
білків з використанням іммобілізованих специфічних IgG, орієнтуючого
шару білка А St. aureus і мономолекулярного зарядженого шару NCS-, який
продемонстровано на прикладі ВТМ, структурного білка ХВК і гексона Ад2.
ВТМ виявлений у гомогенатах клітин зеленої водорості Bracteacoccus minor
(Br. minor), інфікованої ВТМ на стадії зооспор і листя Nicotiana
tabacum, інфікованого ВТМ.

Показано, що для забезпечення оптимальної розпізнавальної здатності
антивірусних IgG на поверхні сенсора необхідна його послідовна обробка
KNCS і білком А St. аureus. Показано, що така модифікація поверхні
сенсора дозволяє адекватно визначати наявність ВТМ у пробі. Методика
обґрунтована за допомогою зіставлення результатів з даними, отриманими
методами ІФА і світлової мікроскопії.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізовано наукову
літературу за темою дисертації. Основний об’єм експериментальної роботи,
обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання висновків
дисертаційної роботи здійснені здобувачем особисто. Безпосередньо
автором були проведені експерименти з дослідження методом ППР взаємодії
іммобілізованих на поверхні сенсора специфічних імуноглобулінів з
відповідними вірусними білками, аналіз можливого впливу зарядового стану
білка і зміни його конформації на процес його іммобілізації з допомогою
комп’ютерного моделювання. Здобувачем особисто проведено модифікацію
поверхні сенсора і імобілізацію комплекса STI-T на модифіковану поверхню
сенсора; автор самостійно підібрала умови для оптимальної імобілізації
білка А St. aureus на поверхні сенсора; здобувачем досліджено
іммобілізацію імуноглобулінів на модифіковану поверхню та порівняно
виявлення вірусу в гомогенатах клітин методами ППР і ІФА. Здобувачем
самостійно проаналізовано отриманий матеріал, який викладено у ряді
статей у спеціальних виданнях і тезах доповідей на вітчизняних і
міжнародних конференціях.

ВТМ був отриманий від к.б.н. Т.П. Шевченко (Київський Національний
Університет); структурний білок ХВК і гексон Ад2 і специфічні
антисироватки до них були отримані від к.б.н. Л.Ф. Діденко і к.б.н. Л.М.
Носач (Інститут мікробіології і вірусології НАН України); дослідження
вмісту ВТМ в культурі Br. minor було здійснено спільно з В.Р. Бойко
(Київський Національний Університет); визначення трипсину за методом
Ерлангера було проведене спільно з к.б.н. С.В. Верьовкою (Інститут
біохімії НАН України); обговорення особливостей зарядового стану
модифікованої поверхні сенсора здійснювалось за участю д.х.н. Я.Д.
Лампеки (Інститут фізичної хімії НАН України), які є співавторами
відповідних публикацій. Науково-технічне забезпечення експерименту
здійснювалось під керівництвом д.ф.-м.н., проф. Ю.М. Ширшова (Інститут
фізики напівпровідників НАН України).

Планування основного напрямку дисертаційної роботи, обговорення
результатів і їх узагальнення здійснювалися під керівництвом д.б.н.,
член-кор. НАНУ професора Н.С. Дяченко і к.ф.-м.н. Б.А. Снопка.

Апробація результатів роботи. Основні матеріали дисертації доповідалися
на Конференції молодих учених “Актуальні проблеми фундаментальної та
прикладної біохімії 2001”, травень 2001 р., Київ, Україна; 14th
IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory
Medicine, Prague, Czech Republic, 26.05-31.05 2001; 7й Международной
научно-техничнеской конференции «Актуальные проблемы твердотельной
электроники и микроэлектроники», 17.09-22.09 2000 г., Дивноморское,
Россия; International Smart Sensing Symposium, 26.09-30.09 2000, Kyiv,
Ukraine; 3й Міжнародній конференції “Біоресурси і віруси”, вересень 2001
р., Київ, Україна; 27th Meeting of the Federation of European
Biochemical Societies, 30.06-05.07 2001, Lisbon, Portugal; Конференції
молодих вчених і аспірантів з молекулярної біології і генетики,
20.09-22.09 2001 р., Київ, Україна; 3-й международной научно-технической
конференции “Микроэлектронные преобразователи и приборы на их основе.
Баку-Сумгаит 16.10-19.10 2001 г; Biology and taxonomy of green algae IV,
International Symposium, Smolenice-Castle, Slovakia, 24.06-28.06 2002;
Euresco Conference “Computational Biophysics: Integrating Theoretical
Physics and Biology”, 7.09-12.09 2002, San Feliu de Guixols, Spain.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 робіт, серед яких
7 статей у профільних журналах та 11 тез доповідей на вітчизняних і
міжнародних конференціях.

Структура і об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної
частини, висновків і списку цитованої літератури, який містить 200
джерел. Робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту, містить
69 рисунків і 3 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Наведений огляд літератури, присвяченої методам вивчення взаємодій
вірусів зі специфічними антитілами і рецепторами. Розглянуті основні
підходи до іммобілізації рецепторних центрів білків на поверхні сенсора.
Особлива увага приділена оптичним недеструктивним методам дослідження,
зокрема, методу поверхневого плазмонного резонансу і його застосуванню
для дослідження біоспецифічних взаємодій, а саме, взаємодій вірусів і
вірусних білків зі специфічними рецепторами і антитілами. Виходячи з
аналізу даних літератури, зроблено висновок про те, що метод ППР не
знайшов ще достатньо широкого застосування для детекції вірусів і
вивчення їх взаємодії зі специфічними антитілами.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Описані досліджувані матеріали, методи їх отримання, обробки і
дослідження. Викладено фізичний принцип методу ППР, який полягає в тому,
що в результаті процесів адсорбції-десорбції молекул на поверхні
металевої плівки змінюється кут мінімальної інтенсивності відбитого
плоскополяризованного світла. Фізичними параметрами, вимірюваними при
протіканні реакції, є зміна коефіцієнту заломлення (n і товщина
реакційного шару d, знаючи які, можна визначити концентрацію речовини на
поверхні за формулою

Г=d(na-n0)((dn/dc)-1,

де Г – концентрація речовини на поверхні, що виражається в одиницях маси
на одиницю площі, na і n0 – ефективні коефіцієнти заломлення
адсорбованого шару і розчину відповідно, ?n= na — n0, d – товщина
адсорбованого шару і інкремент dn/dc складає (0,19 см3/м для більшості
шарів, утворених біологічними молекулами. Представлено загальний хід
експерименту з вивчення білок-білкової взаємодії методом ППР (рис.1). На
першому етапі досліду на поверхні сенсора іммобілізуються молекули –
носії рецепторних центрів, що спостерігається як збільшення QSPR.
Надлишок молекул, що не зв’язалися з поверхнею, видаляється промиванням
поверхні буфером. На другому етапі здійснюється взаємодія між
іммобілізованими носіями рецепторних центрів і досліджуваними
молекулами. Утворення комплексу детектується як повторне збільшення
QSPR, при якому рівень сигналу лишається стабільним після промивання
поверхні буфером. Зв’язок

між молекулами у комплексі розривається гліциновим буфером (рН 2.2).
Зміна сигналу ППР (?QSPR), а, отже, і зміна концентрації (чи маси)
молекул на поверхні сенсорного елемента представляється як графік
залежності ?QSPR від часу. Досліди здійснювалися за допомогою
ППР-спектрометра “ПЛАЗМОН” (джерело збудження GaAs лазер, ?=670 нм).

Проаналізовані тривимірні моделі білків були отримані за допомогою
аналізу відповідних *.pdb файлів, доступних на сайті The Protein Data
Bank ( HYPERLINK «http://www.rcsb.org/pdb/index.html»
http://www.rcsb.org/pdb/index.html ) з використанням програмам
SWISS-MODEL 3.5 і WebLab ViewerPro 3.7. Моделювання кінетики

Рис.1. Загальний хід експерименту з вивчення білок-білкової взаємодії
методом ППР на моделі IgG-антивидові IgG (б), (QSPR — зсув мінімуму
відбитого світла, к.с. – кутові секунди, t – час, с – секунди, Г –
поверхневе покриття.

іммобілізації антивірусних IgG на модифіковану поверхню сенсора, а
також взаємодії ВТМ з іммобілізованими специфічними IgG проводилося з
допомогою комп’ютерної програми “Microcal Origin 6.0”.

В роботі використовувався очищений диференційним центрифугуванням
препарат типового штаму ВТМ. Крім того, вірус був визначений у
гомогенаті клітин зеленої водорості Br. minor, інфікованих ВТМ на стадії
зооспор. В експерименті використовувались: культура Bracteаcoccus minor
(Br. minor), інфікована ВТМ на стадії зооспор і культура Br. minor,
інфікована ВТМ на стадії зооспор і двічі пересіяна (через 4 і 1 міс.).
Також вірус визначався у гомогенатах листя Nicotiana tabacum,
інфікованого ВТМ, взятого на різних стадіях інфекції. В роботі також був
використаний структурний білок ХВК, отриманий гуанідин-хлоридним методом
з виділеного методом диференційного центрифугування Х-вірусу картоплі.
Джерелом гексону Ад2 слугував препарат очищеного в градієнті CsCl
аденовірусу після дезінтеграції віріонів лужним діалізом. Були
використані гіперімунні поліклональні сироватки кроля проти гексону і
структурного білка ХВК. Робоче розведення сироваток визначалося методом
преципітації в агарі і непрямим методом флюоресцюючих антитіл.

Імуноферментний аналіз досліджуваного матеріалу проводився за
загальноприйнятими методиками з використанням мічених пероксидазою
антитіл. Дослідження клітин Br. minor, інфікованих ВТМ на стадії
зооспор, здійснювалися з допомогою світлового мікроскопа “Біолам” при
збільшенні окуляра 7х, об’єктива – 90х.

РОЗДІЛ 3. ІММОБІЛІЗАЦІЯ СОЄВОГО ІНГІБІТОРА ТРИПСИНУ

НА МОДИФІКОВАНІЙ ПОВЕРХНІ СЕНСОРА

ЯК МОДЕЛЬНА СИСТЕМА

ДЛЯ ОРІЄНТОВАНОЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БІЛКІВ

Описаний процес формування на поверхні золота тонкого шару молекул
тіоціанату, солі якого у водному розчині дисоціюють на позитивно
заряджений іон металу і іон NCS-. Оскільки сірка в складі різних сполук
здатна взаємодіяти із золотом, при цьому утворюється мономолекулярний
шар з ефективним зарядом, зумовленим CN- групами, що дозволяє припустити
можливість орієнтованої іммобілізації білкових молекул на поверхні
сенсора через позитивно заряджені амінокислотні залишки шляхом
іонообміну з відповідними малими протийонами.

Як модельна система був розглянутий процес взаємодії іммобілізованого на
модифікованій тіоціанатом поверхні золота STI з його специфічним
партнером Т у залежності від рН зовнішнього середовища. Як показано на
рис.2а, при рН<4,6 на поверхні адсорбується велика кількість STI. З огляду на те, що для STI рI=4,6, це можна пояснити тим, що при рН 2 = PAGE 23 -2 21 «»

малі

протийони

Похожие записи