ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

СІЧКАР СВІТЛАНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 547:579.887.852:455

Вуглеводи поверхневих структур клітин молікутів та філогенетично
споріднених з ними родів bacillus-lactobacillus-streptococcus

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі загальної та ґрунтової мікробіології Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії
Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАНУ Скрипаль Іван Гаврилович, Інститут мікробіології
і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, головний науковий
співробітник відділу мікоплазмології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила
Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН
України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор біологічних наук, професор, Руденко Ада Вікторівна, Інститут
урології та нефрології АМН України, завідувач відділу мікробіології,
вірусології та мікології

Провідна організація: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет
Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “21” грудня 2005 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “ 16 “ листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Філогенетична класифікація організмів звичайно
розглядається в зв`язку з їх еволюційним походженням. Так, сучасні
уявлення про походження молікутів і їх можливих філогенетичних зв`язків
з іншими прокаріотами частково обгрунтовані за даними повних структур
консервативних ділянок молекул ДНК і РНК (Fox et al., 1980;
Neimark,1979). Також було показано відносну близкість первинних структур
16S рРНК молікутів і бактерій родів Clostridium, Bacillus, Lactobacillus
та Streptococcus (Woese et al., 1980). Проте, остаточно це питання так і
не вивчено. Тому важливим завданням є пошук додаткових ознак
диференціації мікробних культур. Для достовірної їх ідентифікації, а
також для встановлення взаємовідносин між видами всередині родів
необхідне вивчення якомога більшої кількості властивостей. При
порівнянні різних видів пропонується брати до уваги комплекс ознак,
оскільки діагностичне значення окремих властивостей мікроорганізмів
дискутується.

До таких фенотипних ознак, які б підтверджували спільність
філогенетичних попередників у тих чи інших груп мікроорганізмів, що
еволюційно віддалились одна від одної, не остання роль відводиться
поверхневим структурам мікроорганізмів. Як свідчать дані літератури,
поверхневий клітинний поліглікановий комплекс (глікокалікс) відіграє
значну роль у функціонуванні бактерій. Так, він обумовлює здатність
мікроорганізму взаємодіяти з поверхнями інших клітин і адгезуватись на
тканинах живих організмів. Адгезія мікроорганізмів – збудників інфекцій
до клітин макроорганізму розглядається як початковий етап патологічного
процесу, що забезпечує колонізацію слизових оболонок або шкіри і передує
інвазивним ушкодженням. Оскільки в розвитку інфекційного процесу
вирішальна роль належить етапу адгезії, то цукри привертають до себе
увагу як антиадгезивні засоби, які в тій чи іншій мірі мімікрують
рецептори і тим самим можуть попередити інфекцію або навіть вилікувати
захворювання.

Як свідчать дані літератури, глікокалікс мікроорганізмів філогенетично
стабільний (Скрипаль та ін., 1995). При з`ясуванні моноcахаридного
складу вуглеводної частини глікокаліксу бактерій можна не тільки виявити
ймовірні родинні зв`язки, а й уточнити афінність мікроорганізмів до
поверхонь об`єктів взаємодії. Всебічне вивчення складу вуглеводів
глікокаліксу молікутів і споріднених з ними бактерій відкриває нові
можливості пізнання тонких механізмів взаємодії мікро- і
макроорганізмів, що в подальшому можна використовувати при відборі і
конструюванні принципово нових екологічно безпечних пробіотиків з чітко
спрямованою дією.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась згідно плану наукових робіт Інституту мікробіології
і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України м. Київ (ІМВ) за темою
“Пошук фенотипових ознак, спільних для представників класу Mollіcutes та
бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus”, номер
держреєстрації 0196V0.18114 (1998-2002р.), яка була включена в програму
“Підтримка та розвиток Української Колекції Мікроорганізмів”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було виділити глікокалікс у
окремих представників класу Mollicutes та бактерій, що відносяться до
родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, дослідити його
моносахаридний склад та вивчити імунохімічні властивості поверхневих
клітинних антигенів представників цих родів.

Для досягнення зазначеної мети були сформульовані такі задачі:

1. Вивчити приклітинні вуглеводні компоненти за допомогою лектинів
рослин, мічених колоїдним золотом.

2. Отримати глікокалікс окремих представників молікутів, бацил та
молочнокислих бактерій.

3. Дослідити поверхневий клітинний вуглеводний склад у представників
класу Mollicutes та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus
за допомогою біохімічних методів для відображення їх загального
походження.

4. Вивчити певні імунохімічні властивості глікокаліксів деяких
представників бацил, молочнокислих бактерій та молікутів.

Об`єктом дослідження були: Mycoplasma fermentans PG — 18,
Achleplasma laidlawii PG — 8, A. laidlawii var. granulum 118, Bacillus
licheniformis 49, B.licheniformis 31, B.subtilis 1/2, B. subtilis 3, В.
subtilis 668, B.cereus 89, B.cereus ДМ 423 та представники молочнокислих
бактерій – Lactobacillus plantarum 11/16, Streptococcus thermophilus S1,
S. thermophilus S5 й Enterococcus faecium К-50.

Предметом дослідження були склад та деякі властивості глікокаліксів
(серологічні та здатність до антитілоутворення) перелічених вище штамів
мікроорганізмів.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань
використовували мікробіологічні, біохімічні, імунологічні та біометричні
методи.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше виділено глікокалікси бацил, молочнокислих бактерій та молікутів;

вперше охарактеризовано різними методами (біохімічними, імунохімічними
та за допомогою рослинних лектинів, мічених колоїдним золотом)
полігліканові комплекси (глікокалікси) представників філогенетично
споріднених мікроорганізмів родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus
та класу Mollicutes. Доведено, що для глікокаліксів всіх досліджених
мікроорганізмів характерна присутність досить широкого спектру
вуглеводів (рамнози, фукози, рибози, арабінози, ксилози, манози,
галактози, глюкози, галакозаміну, глюкозаміну), з певними відмінностями
в їх кількісному складі;

вивчено склад нейтральних моносахаридів полігліканових комплексів як
фенотипну ознаку представників зазначених вище родів. Показано, що
якісний склад нейтральних моносахаридів глікокаліксів у всіх вивчених
мікроорганізмів майже був однаковим і містив переважно глюкозу та
галактозу;

вперше за допомогою імунохімічних методів досліджено серологічні
властивості глікокаліксів мікроорганізмів, що вивчалися. Показано, що
вони містять спільні поверхневі антигени;

вперше досліджено вплив глікокаліксу на індукцію антитілоутворення
представників класу Mollicutes та бактерій групи Bacillus –
Lactobacillus– Streptococcus. Доведено, що поліглікановий комплекс
лактобацил індукує антитілоутворення в два рази з вищим титром, ніж
подібні імуногени бацил та ахолеплазм.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в результаті
проведених досліджень дані про вуглеводний склад глікокаліксу та
вивчення деяких його властивостей можуть бути використані для:

пошуку нових фенотипних ознак;

визначення систематичних положень мікроорганізмів.

Глибоке вивчення складу термінальних вуглеводів глікокаліксу молікутів і
споріднених з ними бактерій створює можливості пізнання тонких
механізмів взаємодії мікро- і макроорганізмів, і в подальшому ці
результати можна буде використовувати при вирішенні фундаментальних
питань філогенії мікроорганізмів, що вивчалися, їх систематики і
класифікації та при відборі і конструюванні принципово нових екологічно
безпечних пробіотиків з чітко спрямованою дією.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Автором дисертації критично опрацьовані дані літератури, проведено
більшість експериментальної роботи (особисто виконано експериментальні
дослідження по виділенню глікокаліксу молікутів та бактерій групи
Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus, визначено поверхневий склад
моносахаридів цих бактерій біохімічними методами, проведено
електронно-мікроскопічний метод візуалізації поверхневих вуглеводів
клітин за допомогою мічених колоїдним золотом рослинних лектинів, а
також проведено імунізацію кролів глікокаліксами бацил, молочнокислих
бактерій та ахолеплазм, отримано антисироватки проти даних антигенів та
для з`ясування серологічної спорідненості вивчених представників і титру
антисироваток застосовано реакцію преципітації в гелі методом подвійної
дифузії за Оухтерлоні та зворотню реакцію радіальної імунодифузії),
проаналізовано та узагальнено результати досліджень, здійснена
статистична обробка експериментальних даних, проведена підготовка
публікацій за результатами досліджень і здійснено їх представлення на
наукових конференціях. Дослідження вуглеводного складу глікокаліксу за
допомогою мічених колоїдним золотом рослинних лектинів проведено спільно
з к.б.н. А.М. Онищенко. Планування експериментів, методичні підходи,
обговорення результатів та написання наукових статей здійснювалося під
керівництвом член-кореспондента НАН України, д.б.н., проф. І.Г.
Скрипаля.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та
положення дисертації доповідались та обговорювались на конференції
молодих вчених ІМВ НАН України (Київ, 25-26 листопада 2003р.);
Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та
молодих вчених “Шевченківська весна” (Київ, 13-14 травня 2004р.); ІІІ
(Х) з`їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 15-17 вересня
2004р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені в 4 статтях,
опублікованих у профільних журналах та в 2 тезах, опублікованих за
матеріалами з`їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 129
сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд
літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень”,
“Обговорення результатів досліджень”, “Висновки”, “Список використаних
джерел”, який містить 155 посилань (з них 85 іноземних авторів). Робота
містить 8 таблиць та 12 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури представлений двома підрозділами, які містять сучасні
уявлення щодо філогенетичних зв`язків представників класу Mollicutes із
спорідненими їм мікроорганізмами, а також викладена інформація останніх
років щодо структури, властивостей, значення поверхневих клітинних
антигенів.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для досліджень нами використано окремі представники роду
Bacillus:

B. licheniformis 31, B. subtilis 3, які входять до складу пробіотика
“Біоспорин” (Україна); B. cereus ДМ 423, який є компонентом біопрепарату
“Цереобіоген” (Китай) та B. licheniformis 49, B. cereus 89, B. subtilis
1/2 отримані з колекції відділу антибіотиків ІМВ ім. Д.К. Заболотного
НАН України; штам B.subtilis 668, отриманий з колекції відділу
фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ, виділений з
шлунково-кишкового тракту щойно народженого здорового теляти. Бацили
вирощували при 37 0С на качалках (160 об/хв) протягом 19-20 год на
рідкому середовищі Гаузе, що містило 1% гліцерину як джерело вуглецю.
Клітини збирали центрифугуванням при 8000g протягом 20 хв.

В роботі використано культури молочнокислих бактерій одержані з колекції
відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і
вірусології НАН України, які відносяться до різних таксономічних груп.
Штам Lactobacillus plantarum 11/16 є мешканцем епіфітної мікрофлори
дикорослих рослин Центральної Азії, належить до роду Lactobacillus і
використовується у складі біоконсерванта “Літосил”. Штам Enterococcus
faecium K-50 був виділений з травного тракту курчат, належить до роду
Enterococcus і використовується у складі пробіотичного препарату
“Лактин”. Два штами належать до роду Streptococcus – S.thermophilus S1
(неслизова раса) і S.thermophilus S5 (слизова раса), і є компонентами
бактеріальної закваски “Геросан”. Молочнокислі бактерії вирощували на
середовищі МРС при 370С протягом 72 год (Коваленко и др., 1990), потім
збирали центрифугуванням при 5000g протягом 20 хв.

Об`єктами досліджень були також штами молікутів, одержані з колекції
Інституту медичної мікробіології м. Орхус (Данія): Mycoplasma fermentans
PG-18, Acholeplasma laidlawii PG–8 та A.laidlawii var. granulum шт.118
– фітопатогенний збудник блідо-зеленої карликовості зернових, виділений
у відділі мікоплазмології ІМВ НАНУ. Молікути вирощували на середовищі СМ
ІМВ-72 протягом 72 годин при 33оС (Cкрипаль и др., 1984). Клітини
збирали центрифугуванням при 10000g протягом 20 хв.

Біомасу всіх досліджених мікроорганізмів збирали в фазі експоненційного
росту. Виділення глікокаліксу проводили за наступною схемою. Нарощену
біомасу бацил та молочнокислих бактерій центрифугували 10 хв при 6000
об/хв, а молікутів – 20 хв при 10000 об/хв; осад відмивали двічі
?-буфером (NaCl 0.156 M; Tris 0.05 M; 2-меркаптоетанол 0.01 М;
дистильована вода; pH 7.4) (Razin et al., 1965). До осаду додавали
??буфер в співвідношенні клітини : буфер – 1 : 5 і трипсин з розрахунку
0.1 мг/г осаду, контролюючи рН середовища, яке повинно бути 8,0, і
ставили на 2 год при 370С на качалки (160 об/хв). Потім
центрифугували при певному режимі відповідні штами мікроорганізмів, як
описано вище. Осад знову промивали двічі ?-буфером, безклітинні рідини
об`єднували і ліофільно висушували.

Склад приклітинних вуглеводів вивчали електронно-мікроскопічним методом
за допомогою рослинних лектинів мічених колоїдним золотом (Скрипаль та
ін., 1994). Інтенсивність взаємодії поверхневих моносахаридів у складі
глікополімерів мікроорганізмів з відповідними лектинами оцінювали в
умовних балах від 0 до 5 залежно від кількості часточок золота на
поверхні клітин. Нейтральні моносахариди у вигляді ацетатів поліолів
ідентифікували на газовому хроматографі марки “Chrom-5” (Чехія).
Визначення вмісту амінокислот глікокаліксів проводили на аналізаторі
амінокислот KLA-5 (“Hitachi”, Японія). Імунохімічні властивості
приклітинних вуглеводних комплексів вивчали, застосовуючи метод
подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні (Ouchterloni, 1962) (для
визначення серологічної їх активності) та зворотню реакцію радіальної
імунодифузії (Кэтти, 1991) (для вивчення титру та специфічності
антисироваток), де виділені з клітин глікокалікси досліджуваних штамів
бактерій, були використані як антигени, а антисироватки кролів, отримані
до цих компонентів, як антитіла. У дослідах використовували самців
кролів віком 6 місяців та вагою 1,8 кг.

Статистичне опрацювання проводили з використанням комп`ютерної програми
– прикладний пакет Microsoft Excel 2000 та Sigma Stat 2.0 за
загальноприйнятими методиками, використовуючи коефіциент Ст`юдента
(Плохинский, 1978).

РОЗДІЛ 3. ВІЗУАЛІЗАЦІЯ ПРИКЛІТИННИХ ВУГЛЕВОДІВ ЗА ДОПОМОГОЮ МІЧЕНИХ
КОЛОЇДНИМ ЗОЛОТОМ ЛЕКТИНІВ РОСЛИН

Розмір частинок колоїдного золота складав близько 12 нм. Використання
лектинів, кон`югованих з колоїдним золотом дозволив виявити локалізацію
окремих моносахаридів на поверхні бактеріальних клітин деяких
представників родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus та класу
Mollicutes.

У дослідах були використані лектини з певною специфічністю: арахісу
підземного (Arachis hypogaea L.) – до ?-D-галактози; купини
багатоквіткової (Polygonatum multiflorum L./A 11.) – до ?-D-манози;
золотого дощу (Laburnum anagyroides Medik.) – до L-фукози; сої
щетинистої (Glycine hispida Moenh./Maxim.) – до
?-N-ацетил-D-галактозаміну та до ?-D- i ?-D-галактози; гороху посівного
(Pisum sativum L.) – до ?-D-глюкози і ?-D-манози; зародків пшениці
(Triticum vulgare L.) – до N-ацетил- D-глюкозаміну і сіалової кислоти;
бузини чорної (Sambucus nigra L.) – до сіалової кислоти (специфічність
наведена за інструкцією фірми виробника лектинів). Лектини, мічені
колоїдним золотом, були одержані з науково-виробничого кооперативу
“Лектинотест” (м.Львів, Україна).

За даними електронно-мікроскопічних досліджень показано, що за якісним
вуглеводним складом глікокалікси молікутів, бацил, молочнокислих
бактерій майже не відрізнялися і були представлені широкою палітрою
цукрів (?-D-глюкозою, ?-D- не відрізнялися і були представлені широкою
палітрою цукрів (?-D-глюкозою, ?-D- і ??D- галактозою, ?-D- манозою,
L-фукозою, ?-N-ацетил-D-галактозаміном, N-ацетил-D-глюкозаміном та
сіаловою кислотою), проте можна спостерігати і незначні родові, видові
та штамові відмінності. Залежно від наявності певних моносахаридів у
складі полісахаридних комлексів глікокаліксу мікроорганізму, кожен штам
молікута чи бактерії реагував індивідуально з відповідним лектином
(Табл. 1).

Так, встановлено, що для приклітинних вуглеводів глікокаліксу окремих
молікутів (Mycoplasma fermentans PG-18, Acholeplasma laidlawii PG-8,
A.laidlawii var.granulum 118) характерна взаємодія із всіма
досліджуваними лектинами та чітко можна спостерігати родові та штамові
відмінності. Відомо, що прикріплення мікроорганізмів до поверхневих
клітин тканин уражуваних органів забезпечує їм колонізацію і захищає їх
від видалення з органів під час природних процесів (Скрипаль та ін.,
1996). Можна допустити, що такий склад реакційноздатних груп вуглеводів
може бути частиною молекул гліколіпідів або глікопротеїнів, які мають
особливе значення у формуванні поверхневих антигенів молікутів.

Є дані, що залишки сіалових кислот у складі глікополімерів мембран
клітин теплокровних проявляють себе як специфічні рецептори для деяких
молікутів (Скрипаль із співавт. 1993, 1994). Згідно одержаних нами
даних, A.laidlawii PG-8 i M.fermentans PG-18 утворюють значну кількість
глікополімерів, які містять кінцеві сіалові кислоти та L-фукозу. У
порівняно меншій кількості ці цукри виявлені у складі глікокаліксу
A.laidlawii var.granulum 118. Слід зазначити, що наявність сіалових
кислот та фукози у складі глікокаліксу патогенних та умовно-патогенних
молікутів свідчать про їх додаткову роль у стабілізації адгезії цих
мікроорганізмів на поверхні уражуваних тканин (Коробкова із співавт.,
2001).

При вивченні вуглеводних складових глікокаліксу молочнокислих бактерій
(Lactobacillus plantarum 11/16, Streptococcus thermophilus – штами S1 і
S5, Enterococcus faecium K-50) була зареєстрована наявність сіалових
кислот, N-ацетил-D-глюкозаміну, ?-N-ацетил-D-галактозаміну, ?-D-,
?-D-галактози, ?-D-глюкози, ?-D-манози, L-фукози. Показано, що для
поверхневих вуглеводів глікокаліксу молочнокислих бактерій характерна
відносно висока активність взаємодії з лектинами, специфічними до
?-D-галактози, L-фукози та сіалових кислот. Це узгоджується з даними
Sakellaris із співавт. (1988). Біологічна роль сіалових кислот, на думку
авторів, полягає у впливові на фізико-хімічні властивості цих
макромолекул або регуляції тривалості їх існування (Sakellaris
et al., 1988).

L-фукоза, як відомо, має велике значення при захисті глікокаліксів
мікроорганізмів від дії ферментів організму-хазяїна, що дозволяє
молочнокислим бактеріям пристосовуватись до існування у порожнині
шлунково-кишкового тракту людини чи теплокровних тварин. Присутність
всіх інших тестованих моносахаридів у складі глікокаліксу молочнокислих
бактерій, можливо, свідчить про додаткову роль їх у процесі підсилення
адгезії мікроорганізмів на слизовій оболонці кишкового тракту людей та
тварин і забезпеченні її специфічності. Це узгоджується з припущенням,
що наявність певних вуглеводів у складі поверхневих глікополімерах
молочнокислих бактерій пов`язано з їх адгезивними властивостями та
умовами існування (Коробкова та ін., 2001).

Таблиця 1.

Інтенсивність взаємодії окремих рослинних лектинів з клітинами

представників класу Mollicutes та родів Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus,

Enterococcus (в умовних балах)

Вид та штам мікроорга-нізмів Вугвуглеводна специфічність лектину

N-ацетил-D-глюкозамін, сіалова кислота

сіалова кислота

?-N-ацетил-D-галактоз-амін, ?-D-,

?-D-галактоза

?-D-глюкоза,

?-D-маноза

?-D-галак-тоза

L-фуко-за

?-D-мано-за

Mycoplasma fermentans PG-18

2

4

2

0-1

5

5

2

Acholeplas-ma laidlawii

PG-8

2

3

4

1

3

4

0-1

А.laidlawii var.gran. 118

5

2

1-2

4

3

3

1

Lactobacillus plantarum 11/16

3-4

2

5

1

5

5

5

Streptococc-us thermophi-lus S1

1-2

2

3-4

3-4

5

4-5

2

S.thermophi-lus S5 0-1 5 0 1 3 4 1

Enterococcus faecium K-50 0 0-1 1 4 5 4-5 4

Bacillus subtilis1/2 5 5 4 0 4-5 2 4

B. subtilis 3 1-2 2 2 0-1 4-5 2-3 1-2

B. subtilis 668 1 2-3 2-3 0-1 4 1-2 3

B. lichenifor-mis 31 0-1 2 1 1-2 4 3 2-3

B. lichenifor-mis 49 5 1 4 0 1-2 2 4-5

B. cereus 89 1 4-5 5 0 4 1 2

B. cereus DM 423 2 0-1 0-1 0 0-1 0-1 1

Примітка: 5, 4-5 – найвища ступінь взаємодії; 4, 3-4 – значна; 3, 2-3 –
середня; 2, 1-2 – слабка; 1, 0-1 – майже відсутня; 0 – відсутня.

Для представників роду Bacillus (Bacillus subtilis 1/2, B. subtilis 3,
В.subtilis 668, B.licheniformis 31, B.licheniformis 49, B.cereus 89,
B.cereus DM423) властива наявність у глікополімерах всіх зазначених
моносахаридів, окрім ?-D-глюкози, що є родовою ознакою цієї групи
мікроорганізмів. Отримані нами дані, показали, що для поверхневих
вуглеводів умовно-патогенних штамів роду Bacillus (B.licheniformis 49,
B.cereus 89) найбільша взаємодія відзначалась з лектинами,
специфічними до

??N-ацетил-D-галактозаміну????D-,???D-галактози, сіалової кислоти.
Можливо, дані моносахариди в складі рецепторів вище зазначених бацил є
додатковим фактором адгезії на епітелію шлунково-кишкового тракту
теплокровних. Наявність значної кількості сіалових кислот в глікокаліксі
B.licheniformis 49, B.cereus 89 дає можливість припустити головну роль
даного кінцевого моносахариду в механізмі захисту цих мікроорганізмів
від дії імунної системи людини, оскільки відомо, що сіалові кислоти
здатні маскувати поверхневі рецептори бактерій від розпізнавання
макрофагами при ендоцитозі. Можливо наявність сіалових кислот в складі
глікокаліксу цих бацил корелює з ознакою патогенності. У порівнянні з
ними, штами бацил, які є основою біопрепаратів, (B. subtilis 3,
B.licheniformis 31, B.cereus DM423) відзначались наявністю слабкої
взаємодії лектинів специфічних до сіалової кислоти, L-фукози,
??N-ацетил-D-галактозаміну?? N-ацетил-D-глюкозаміну, ??D-,???D-галактози
у складі вуглеводів поверхневих структур їх клітин, що свідчить про
відсутність патогенних властивостей у даних культур. Оскільки адгезивні
властивості бацил слабко виражені, вони не формують біоплівки, і їх
активність в кишечнику пов`язана, перш за все, не з конкурентним
взаємовідношенням за місця прикріплення до слизової, а з високою
антагоністичною активністю у відношенні багатьох патогенних та
умовно-патогенних мікроорганізмів. В той же час бактерії роду Bacillus
не виявляють пригнічуючої дії на мікрофлору, що є визначальним при
створенні нових біопрепаратів на основі живих культур бацил для медицини
та ветеринарії.

? Ue V

?

/:/AE/uiaOIuIEAEEAEEAEIui»iu?I®IuIuIuIuIuIuIuIu?®Y®I®I®?I?®?®?®?®?®?®uI

O

»

$

< >

@

B

D

F

H

v

ooooooeoooooooooooooooeoooooooeoTHoTHoeoTHoUOoooooooooooooooTHoTHoTHoTHo
THoTHoTHooooooooooooo

O

O

O

$

O

O

O

O

$

O

O

$

O

O

$

O

O

$

O

O

$

O

O

$

O

O

$

O

O

Hвим проявом спільних генетичних зв’язків зазначених мікроорганізмів.
Дані наших досліджень про моносахаридний склад поверхневих вуглеводів
споріднених видів мікроорганізмів можуть бути використані як додаткова
ознака при визначенні таксономічного положення цих мікроорганізмів, а
також при відборі і конструюванні принципово нових екологічно безпечних
пробіотиків з чітко спрямованою дією.

РОЗДІЛ 4. ВИВЧЕННЯ СКЛАДУ НЕЙТРАЛЬНИХ МОНОСАХАРИДІВ ГЛІКОКАЛІКСУ
МІКРООРГАНІЗМІВ БІОХІМІЧНИМИ МЕТОДАМИ

Спорідненість досить віддалених гілок філогенетичного древа бактерій
роду Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus і класу Mollicutes, а також
те, що клостридіальна

гілка є їх спільним попередником – питання цікаве, дискусійне і ще досі
до кінця не вивчене. Тому в нашій роботі було проведено пошук нових
таксономічних підходів та критеріїв, а саме пошук спільних
консервативних філогенетичних маркерів, які могли б відбиватись у
спільних фенотипних ознаках. На наш погляд, серед комплексу таких ознак,
які б підтверджували спільність філогенетичних попередників (бацил,
лактобацил та стрептококів) з молікутами може виступати поверхневий
поліглікановий клітинний комплекс – глікокалікс, який вважається
консервативною частиною клітин (Онищенко та ін., 1999).

За методикою, розробленою нами, було виділено глікокалікси B.subtilis 3,
B.subtilis 668, B.licheniformis 31, L.plantarum 11/16, S.thermophilus
S1, S.thermophilus S5, E.faecium K-50, M.fermentans PG-18, A. laidlawii
PG-8, A. laidlawii var. granulum 118.

Біохімічні методи досліджень ізольованих глікокаліксів зазначених вище
представників групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus, як і
електронно-мікроскопічні дослідження, показали, що поверхневі
полігліканові комплеки вміщують широку палітру цукрів: рамнозу, фукозу,
рибозу, арабінозу, ксилозу, манозу, галактозу, глюкозу, галактозамін та
глюкозамін (Рис. 1).

а) б)
в)

Рис.1. Моносахаридний склад глікокаліксів:

а) B.subtilis 3; б) L.plantarum 11/16; в) E.faecium K-50.

Примітка: 1– рамноза, 2– фукоза, 3– рибоза, 4– арабіноза, 5– ксилоза, 6–
маноза, 7– галактоза,
8– глюкоза, х–неідентифіковані цукри.

Звертає увагу на себе той факт, що для всіх вивчених штамів
мікроорганізмів характерна наявність в значних кількостях галактози
(31.7-49.4%) та глюкози (17.9-

41.3%), за виключенням бацил, у яких кількість глюкози лише 10.1-13.7%,
і незначний вміст аміноцукрів: глюкозаміну (0.85-1.6%) та галактозаміну
(0.5-2.3%), хоча штам L.plantarum 11/16 містив їх майже у тричі більше,
ніж S.thermophilus S1 і майже у 6 разів більше, в порівнянні з іншими
представниками (Табл.2). У штаму

Таблиця 2.

Вміст моносахаридів в глікокаліксі бактерій

групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus

Вид та штам мікроорганіз-мів Вуглеводи ( % від загальної суми площ
піків)

Аміноцукри*

(% від сухої ваги препара- ту)

рамноза

фукоза

рибоза

арабіноза

ксилоза

маноза

галактоза

глюкоза

невизначені

галактозамін

глюкозамін

Bacillus

subtilis 3 1.7

±0.01 4.1

±

0.01 4.6

±0.01 17.0

±0.01 6.1

±

0.01 1.7

±

0.01 49.4

±

0.01 10.1

±

0.01 5.3

±

0.01 1.01

±0.01 1.46

±0.01

B.subtilis 668 3.7

±0.01 2.8

±

0.01 2.5

±0.01 7.4

±0.01 4.8

±

0.01 15.5

±

0.01 42.4

±

0.01 13.7

±

0.01 7.2

±

0.01 1.22

±0.01 1.31

±0.01

B.lichenifor-mis 31 2.7

±0.01 4.0

±

0.01 3.7

±0.01 13.8

±0.01 4.0

±

0.01 11.2

±

0.01 40.6

±

0.01 11.8

±

0.01 8.2

±

0.01 1.7

±0.01 1.4

±0.01

Lactobacillus

plantarum

11/16 – 6.4

±

0.01 4.6

±0.01 14.5

±0.01 1.9

±

0.01 9.7

±

0.01 42.2

±

0.01 17.9

±

0.01 2.8

±

0.01 8.4

±0.01 7.1

±0.01

Streptococ-cus thermo-philus S1 7.9

±0.01

16.4

±

0.01

– – – 4.0

±

0.01 35.4

±

0.01 31.7

±

0.01 4.6

±

0.01 2.3

±0.01 0.85

±0.01

Streptococ-cus thermo-philus S5 3.1

±0.01 13.6

±

0.01

– – – 1.6

±

0.01 36.2

±

0.01 41.3

±

0.01 4.2

±

0.01 0.5

±0.01 1.14

±0.01

Enterococ-cus faecium

K-50 – 4.2

±

0.01 4.3

±0.01 9.6

±0.01 2.0

±

0.01 9.4

±

0.01 31.7

±

0.01 34.8

±

0.01 4.0

±

0.01 1.72

±0.01 –

Примітка: * визначали на амінокислотному аналізаторі;

– відсутність цукру.

E.faecium K-50 глюкозамінів зовсім не виявлено. За даними літератури
(Скрипаль та ін., 1995; Онищенко та ін., 1999), було висунуто
припущення, що певні поверхневі цукри, які присутні у значній кількості
різних споріднених груп бактерій, можуть бути спільними філогенетичними
маркерами. Наші дані узгоджуються з даними літератури щодо наявності в
домінуючих кількостях глюкози та галактози у глікокаліксі всіх
зазначених штамів бактерій, що може свідчити про консервативність цієї
ознаки і можливість використання її як додаткового філогенетичного
маркеру при вивченні еволюційних зв`язків.

Щодо вивчених представників молочнокислих бактерій, то згідно наших
даних, їх глікокалікс бідніший за різноманітністю моносахаридів в
порівнянні з глікокаліксом бацил. Так, в поверхневому поліглікановому
комплексі лактобацил і ентерококів не виявлено рамнози і у останніх –
глюкозаміну, а ксилоза складала лише 2% від загального складу
нейтральних моносахаридів. Відмінності у моносахаридному складі саме цих
двох родів, на нашу думку, пояснюються, з одного боку, різними
екологічними нішами існування, а з іншого – їх різною біологічною
активністю, що знайшло відображення в практичному застосуванні
зазначених штамів.

Вуглеводний склад поверхневого полігліканового комплексу представників
роду Streptococcus виявився ще більш одноманітним. Так, у останніх не
виявлено рибози, арабінози і ксилози, а вміст манози не перевищував 4%.
Причому, при порівнянні двох їх представників, слизового і неслизового
штамів, можна побачити, що для останнього (S.thermophilus S1) всі
показники вищі, за виключенням вмісту галактози, глюкози, галактозаміну
та глюкозаміну. Більша кількість глюкози і глюкозаміну у глікокаліксі
штаму S. thermophilus S5, може бути пов`язана із здатністю останнього
утворювати слизову оболонку (капсулу) на поверхні клітин, а наявність
рамнози, фукози і манози можна використовувати для уточнення
філогенетичної класифікації і ідентифікації бактерій, що узгоджується з
даними літератури (Ряпис и др., 2002).

Щодо представників роду Bacillus, то значної різноманітності в
кількісному складі цукрів досліджуваних глікокаліксів не відмічено.
Вони містили у домінуючих кількостях глюкозу та галактозу. Проте, слід
зазначити, що для штаму B.subtilis 668 відмічено низький вміст в
глікокаліксі арабінози та рибози, а для штаму B.subtilis 3 – незначний
вміст манози та рамнози, в порівнянні з іншими досліджуваними
бактеріями.

Результати наших досліджень показують, що для бацил, які знайшли
застосування у складі пробіотичних препаратів, характерно більше
розмаїття поверхневих клітинних моносахаридів порівнянно з іншими
штамами досліджуваних бактерій. Такий факт ще раз підтверджує вірний
вибір B.subtilis 3, B.licheniformis 31 для виготовлення пробіотику.

У поверхневих структурах вивчених нами молікутів були виявленні певні
моносахариди, кількісний склад яких дещо відрізнявся в залежності від
штаму. Слід зазначити, що за якісним складом картина їх розподілу була
досить різноманітна така ж, як і для бацили та молочнокислих бактерій,
до якої входили: галактозамін, глюкозамін, рамноза, фукоза, рибоза,
арабіноза, ксилоза, маноза, галактоза, глюкоза та неідентифіковані цукри
(Рис. 2; Табл. 3.).

Рис.2.Моносахаридний склад глікокаліксу

M.
fermentans PG-18.

Примітка: 1– рамноза, 2– фукоза, 3– рибоза, 4–

арабіноза, 5– ксилоза, 6– маноза, 7–
галактоза, 8– глюкоза, х–неідентифіковані цукри.

З даних таблиці 3 видно, що для представників класу Mollicutes
характерно присутність у домінуючій кількості галактози та глюкози.
Наявність останніх є підтвердженням припущення, що певні цукри можуть
вважатися додатковими філогенетичними маркерами при вивченні еволюції
молікутів (Скрипаль та ін., 1994).

Таким чином, аналіз вуглеводного складу глікокаліксу всіх вивчених нами
представників класу Mollicutes та бактерій родів Bacillus,
Lactobacillus, Streptococcus, за виключенням роду Streptococcus, досить
різноманітний і представлений широким спектром цукрів. Одержані
результати сприяють відбору мікроорганізмів з заданими властивостями при
створенні нових пробіотиків та лікувально-профілактичних продуктів
харчування. Крім того, відомості про моносахаридний склад
мікроорганізмів надають можливість впливати на хід інфекційного процесу.
При відомій вуглеводній специфічності рецепторів етіологічних агентів
захворювань з`являється можливість блокувати проявлення адгезивних
властивостей патогенів шляхом внесення природних або синтетичних
аналогів лектинів-адгезинів.

Таблиця 3.

Моносахаридний склад глікокалісу деяких представників класу Mollicutes

Вид та штам мікроорганізмів Аміноцукри (% від сухої ваги препа-рату) *

Вуглеводи ( % від загальної суми площ піків)

галактозамін

глюкозамін

рамноза

фукоза

рибоза

арабіноза

ксилоза

маноза

галактоза

глюкоза

невизначені

Mycoplasma

fermentans PG-18

3,13

±0.01

3,2

±0.01

1,7

±0.01

22,6

±0.01

1,9

±0.01

2,5

±0.01

2,2

±0.01

12,7

±0.01

32,3

±0.01

20,0

±0.01

4,1

±0.01

Acholeplasma

laidlawii PG-8

7,32

±0.01

3,01

±0.01

1,5

±0.01

20,3

±0.01

2,1

±0.01

0,8

±0.01

1,9

±0.01

12,1

±0.01

27,4

±0.01

28,4

±0.01

5,2

±0.01

A.laidlawii

var. granulum

штам 118

2,5

±0.01

8,51

±0.01

1,8

±0.01

20,1

±0.01

0,6

±0.01

1,6

±0.01

2,5

±0.01

12,2

±0.01

27,6

±0.01

30,1

±0.01

4,5

±0.01

Примітка: “+” – наявність цукру, * – визначали на амінокислотному
аналізаторі. РОЗДІЛ 5. ВИВЧЕННЯ ІМУНОХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ГЛІКОКАЛІКСІВ
МОЛІКУТІВ ТА БАКТЕРІЙ ГРУПИ BACILLUS-LACTOBACILLUS-STREPTOCOCCUS

Виділені глікокалікси із штамів B. subtilis 668, L. plantarum 11/16 та
A. laidlawii var. granulum 118 використовували в якості антигенів, а
антитілами були антисироватки кролів, одержані при імунізації
відповідними антигенами. Необхідною умовою вивчення динаміки гуморальної
імунної відповіді є підбір оптимальної дози антигену для імунізації
кролів. Тому, нами було підібрано оптимальну дозу імуногену, яка
складала 200мкг на тварину (Табл.4).

Таблиця 4.

Підбір оптимальної дози антигену для імунізації кролів

Види мікроорганізмів,

глікокалікси яких

були використані для імунізації тварин: Титри антитіл

Доза глікокаліксу, мкг/тварина

7 доба

14 доба

0,02

2

20

200

0,02

2

20

200

B.subtilis 668 –– –– –– 16 –– –– –– 32

L.plantarum 11/16 –– –– –– 32 –– –– –– 64

A.laidlawii var. granulum 118 –– –– –– 16 –– –– –– 32

Примітка: “–” – відсутність титру антитіл.

Застосування реакції преципітації в гелі методом подвійної дифузії за
Оухтерлоні дозволило нам виявити спільні антигени серед представників
бацил, лактобацил та ахолеплазм, які полідетермінантні, а антитіла, у
відповідь на них – поліклональні. Також антисироватки проти
глікокаліксів L. plantarum 11/16,

B. subtilis 668 i A. laidlawii var. granulum 118 неповністю ідентичні і
поліспецифічні, а контрольні антисироватки (одна проти бичачого
імуноглобуліну, друга – неімунізованого кроля) не реагували взагалі.

Для подальшого з`ясування питання щодо серологічної активності антигенів
та антитіл використовували зворотню реакцію радіальної імунодифузії, в
результаті якої підтвердили виявлену раніше антигенну спорідненість між
молекулами в розчині. Також, ми отримали дані, при проведенні вище
вказаного методу, котрі показали, що поліглікановий комплекс лактобацил
індукує антитілоутворення з вищим титром (1: 512), ніж подібні імуногени
бацил та ахолеплазми, титр сироваток до яких становив 1: 256 (Табл. 5).

Таблиця 5.

Характеристика імунних сироваток, отриманих до глікокаліксів окремих
представників бацил, молочнокислих бактерій та ахолеплазм

Вид та штам мікроорганізмів Титр антисироватки

Дні відбору антисироватки:

6

13

20

B.subtilis 668 16 128 256

L.plantarum 11/16 32 256 512

A.laidlawii var. granulum 118 16 128 256

За результатами серологічних методів виявлено наявність одних і тих же
вуглеводних компонентів (які перехресно реагують та мають серологічну
спорідненість) на поверхні клітин представників різних мікроорганізмів
(родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus та класу Mollicutes) і тим
самим доводять їх можливу філогенетичну спорідненість.

Таким чином, підсумовуючи дані, отримані при використанні імунохімічних
методів, можна сказати, що вони є підтвердженням та доповненням
електронно-мікроскопічних та біохімічних досліджень щодо спільних,
подібних поверхневих клітинних полігліканових комплексів у еволюційно
віддалених груп бактерій і можуть бути використані, як ще одна додаткова
ознака при вивченні їх філогенетичного походження.

ВИСНОВКИ

1. Вперше отримано та охарактеризовано різними методами поліглікановий
комплекс (глікокалікс) клітин окремих представників молікутів та
філогенетично споріднених з ними родів Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus.

2. За допомогою мічених колоїдним золотом лектинів рослин вивчено
вуглеводний склад поверхневих структур клітин представників молікутів,
бацил та молочнокислих бактерій і встановлено, що він варіював залежно
від роду, виду та штаму мікроорганізмів. Наявність у глікокаліксі всіх
досліджених представників ??D — галактози, L-фукози, ??D-манози і
сіалових кислот є новою фенотипною ознакою у спільних генетичних
зв`язках цих мікроорганізмів.

3. Біохімічними методами досліджено глікокалікси представників молікутів
та філогенетично споріднених з ними родів Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus і вперше показано присутність в їх складі рамнози, фукози,
рибози, арабінози, ксилози, манози, галактози, глюкози, галакозаміну і
глюкозаміну. У кількісному складі домінуючими були глюкоза (10.1 – 41.3
%) та галактоза (27.4 – 49.4 %).

4. Вперше досліджено індукцію антитілоутворення глікокаліксами
представників класу Mollicutes та бактерій групи Bacillus –
Lactobacillus – Streptococcus. Доведено, що поліглікановий комплекс
лактобацил індукує антитілоутворення у два рази з вищим титром, ніж
подібні імуногени бацил та ахолеплазм.

5. Вперше за допомогою імунохімічних методів досліджено серологічні
властивості глікокаліксів бацил, молочнокислих бактерій та молікутів.
Встановлено, що ці мікроорганізми мають спільні поверхневі антигени, що
свідчить на користь їх філогенетичної спорідненості

6. На основі порівняльного вивчення електронно-мікроскопічним,
біохімічними та імунохімічними методами вуглеводних компонентів
глікокаліксу представників класу Mollicutes та родів Bacillus,
Lactobacillus, Streptococcus встановлено подібний їх склад. Показано, що
вони можуть виступати як додаткові фенотипні ознаки при виявленні
ймовірних родинних зв`язків.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Січкар С.В. Склад нейтральних моносахаридів глікокаліксу бактерій
групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus // Мікробіол. журн. – 2004. –
Т. 66, № 2. – С. 57-62.

2. С.В.Січкар, А.М.Онищенко. Порівняльне вивчення складу моноцукрів
глікокаліксу бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus
біохімічними та електронномікроскопічним методами // Мікробіол. журн. –
2004. – Т. 66, № 5. – С. 40-47. (Здобувач особисто провів
експериментальні дослідження по виділенню та визначенню моносахаридного
складу глікокаліксів бацил та молочнокислих бактерій, безпосередньо
приймав участь в підготовці зразків мікроорганізмів для проведення
електронно-мікроскопічних досліджень, підготовлено матеріали статті до
друку).

3. Січкар С.В. Поверхневий моносахаридний склад деяких молікутів //
Мікробіол. журн. – 2004. – Т. 66, № 6. – С. 18-23.

4. Січкар С.В. Вивчення імунохімічних властивостей глікокаліксів
представників молікутів та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-
Streptococcus // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія:
Медицина. – 2005. – Випуск 25. – С. 48–52.

5. Січкар С.В. Вивчення вуглеводних компонентів глікокаліксу Mollicutes
та філогенетично спорідненої групи бактерій Bacillus-Lactobacillus-
Streptococcus / Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції
студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченої 190-річчю з дня
народження Тараса Шевченка та 170-річчю заснування Київського
університету. (13-14 травня 2004р., м. Київ). – С. 23-24.

6. С.В.Січкар, А.М.Онищенко. Приклітинні вуглеводні компоненти
глікокаліксу деяких молікутів та філогенетично споріднених їм бактерій
/Тези доповідей учасників Х (ІІІ) з`їзду Товариства мікробіологів
України.(15-17 вересня 2004р., м. Одеса). – С. 237.

АНОТАЦІЯ

Січкар С.В. Вуглеводи поверхневих структур клітин молікутів та
філогенетично споріднених з ними родів
Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus.

Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних
наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології
і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2005.

В роботі проведено дослідження поверхневих клітинних полігліканових
комплексів (глікокаліксів) окремих представників класу Mollicutes та
родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus. Виділено глікокалікси у
окремих представників молікутів, бацил та молочнокислих бактерій.
Досліджено їх моносахаридний склад електронно-мікроскопічним,
біохімічними методами та вивчено імунохімічні властивості поверхневих
клітинних антигенів представників цих родів. Методом візуалізації
приклітинних вуглеводних компонентів за допомогою лектинів рослин,
мічених колоїдним золотом, показано досить широкий спектр вуглеводів,
який відрізнявся залежно від роду, виду та штаму мікроорганізмів.

Біохімічними методами досліджено глікокалікси окремих представників
молікутів та філогенетично споріднених з ними родів Bacillus,
Lactobacillus, Streptococcus і показано присутність широкого спектру
вуглеводів (рамнози, фукози, рибози, арабінози, ксилози, манози,
галактози, глюкози, галакозаміну, глюкозаміну), у кількісному складі
якого домінуючими були глюкоза (10.1 – 41.3 %) та галактоза (27.4 –
49.4 %).

При дослідженні імунохімічної активності методами подвійної імунодифузії
в агарі за Оухтерлоні та зворотньою реакцією радіальної імунодифузії
серед досліджених штамів виявлено спільні антигени, які перехресно
реагували, та визначено титри антитілоутворення. Результати серологічних
методів досліджень можуть бути використанні як ще одна додаткова ознака
при вивченні філогенетично споріднених родів мікроорганізмів.

Ключові слова: глікокалікс, філогенетичні маркери,
електронно-мікроскопічні, біохімічні, серологічні методи, Bacillus,
Lactobacillus, Streptococcus, Mollicutes.

АННОТАЦИЯ

Сичкарь С.В. Углеводы поверхностных структур клеток молликутов и
филогенетически родственных с ними родов
Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus.

Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата
биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт
микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев,
2005.

В работе проведено исследование поверхностных клеточных полигликановых
комплексов (гликокаликсов) отдельных представителей класса Mollicutes и
родов Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus. Выделены гликокаликсы у
отдельных представителей молликутов, бацилл и молочнокислых бактерий,
исследовано их моносахаридный состав электронно-микроскопическим,
биохимическими методами и изучено иммунохимические свойства
поверхностных клеточных антигенов представителей этих родов.

Методом визуализации приклеточных углеводных компонентов с помощью
лектинов растений, меченых коллоидным золотом показан широкий спектр
углеводов, который отличался в зависимости от рода, вида и штамма
микроорганизмов. В то же время представители этой группы микроорганизмов
в гликокаликсе содержали общие моносахариды: глюкозамин, сиаловые
кислоты, галактозамин, галактозу, глюкозу, маннозу, фукозу, которые
могут рассматриваться как фенотипическое проявление общих генетических
связей. Изучение углеводного состава поверхностных структур клеток
представителей молликутов, бацилл и молочнокислых бактерий дает
возможность познания тонких механизмов взаимодействия микро- и
макроорганизмов.

Газохроматографический анализ нейтрального моносахаридного состава и
аминокислотный анализ заряженных сахаров гликокаликсов выше указаных
микроорганизмов показали присутствие одних и тех же компонентов
(рамнозы, фукозы, рибозы, арабинозы, ксилозы, маннозы, галактозы,
глюкозы, галактозамина, глюкозамина). Колличественный состав углеводов
гликокаликсов бацилл, лактобацилл, стрептококков, энтерококков и
молликутов отличался, но доминирующими были глюкоза (10.1 – 41.3%) и
галактоза (27.4 – 49.4%), что может свидетельствовать о консервативности
этих моносахаридов и возможности использования данного признака в
качестве филогенетического маркера.

Изучение иммунохимических свойств гликокаликсов, B.subtilis 668,
L.plantarum 11/16, A.laidlawii var. granulum 118 проводили используя
выделенные гликокаликсы в качестве антигенов, а антителами были
антисыворотки кролей, полученные при иммунизации определенными
антигенами.

Методом двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони выявлены общие
антитела, которые перекрестно реагировали и были поликлональными.
Обратной реакцией радиальной иммунодиффузии показано, что гликокаликсы
исследованых штаммов проявляли серологическую активность в отношении
антисывороток в разных титрах (наибольшее разведение антигена или
антисыворотки, при которых наблюдались четко положительные реакции
составляли 1:512 для лактобациллы и 1:256 для бациллы и ахолеплазмы).
Результаты серологических методов исследования частично подтверждают
данные электронно-микроскопических и биохимических анализов относительно
наличия одних и тех же углеводных компонентов (которые перекрестно
реагируют и имеют серологическое родство) на поверхности клеток
представителей разных микроорганизмов (родов Bacillus, Lactobacillus и
класса Mollicutes) и тем самым подтверждают их возможные
филогенетические связи.

Ключевые слова: гликокаликс, филогенетические маркеры,
электронно-микроскопические, биохимические, иммунохимические методы,
Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Mollicutes.

SUMMARY

Sichkar S.V. Carbohydrates of surface structures of cells of Mollicutes
and phylogenetically related to them genera of
Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus.

Manuscript. The candidate degree thesis by speciality 03.00.07 —
microbiology. — Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

Surface polyglicane complexes (glycocalyxes) of some representatives of
a Mollicutes class and genera of Bacillus, Lactobacillus and
Streptococcus were studied. Glycocalyxes of some representatives of
Mollicutes, Bacillus and Lactobacillus were allocated. Their
monosaccharide composition was investigated with electron-microscopic
and biochemical methods. And the immunochemical properties of surface
cellular antigens of the representatives of these genera were
investigated too. Shown the wide spectrum of carbohydrates, which
differs depending on the genera and the strains of microorganisms, by
method of visualization of extracellular carbohydrate components with
the plants’ lectins marked with colloid gold.

Glycocalyxes of some representatives of Mollicutes and phylogenetically
related to them genera of Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus were
investigated by biochemical methods. Shown the presence of a wide
spectrum of carbohydrates (rhamnose, fucose, ribose, arabinose, xylose,
mannose, galactose, glucose, galactosamine, glucosamine), in which
quantitative structure glucose (10.1 – 41.3%) and galactose (27.4 –
49.4%) were dominant.

Research of immunochemical activity by the methods of Ouchterloni of
double immunodiffusion in agar and reverse reaction of radial
immunodiffusion among investigated strains, revealed common antigens
with good reaction. The titers of antibody-forming are determined too.
The results of serological methods of investigations can be used as
additional attribute at study of phylogenetically related genera of
microorganisms.

Key words: glycocalyx, phylogenetic markers, electron-microscopic,
biochemical, serological methods, Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus, Mollicutes.

PAGE \* Arabic 2

Похожие записи