.

Вплив сполук йоду на біологічні властивості мікроорганізмів, продукуючих водень пероксид (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2539
Скачать документ

Академія медичних наук України

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова

ВАЛЬЧУК СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ

УДК 578.651.63:576.8.095.38

“Вплив сполук йоду на біологічні властивості мікроорганізмів,
продукуючих водень пероксид”

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології
Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений
працівник народної освіти України Кременчуцький Геннадій Миколайович,
Дніпропетровська державна медична академія МОЗ Україні, завідувач
кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий
співробітник Бабич Євген Михайлович, Інститут мікробіології та
імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, завідувач лабораторії
специфічної профілактики краплинних інфекцій;

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська
державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри імунології,
алергології та ендокринології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних захворювань

ім. Л.В.Громашевського АМН України

Захист відбудеться “19” лютого 2004 року о 12 годині на засіданні
спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та
імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057: м. Харків,
вул. Пушкінська, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та
імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: м. Харків, вул.
Пушкінська, 14.

Автореферат розісланий ” 3 січня ” 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

к.мед.н., пров.н.с.
Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Макроорганізм сумісно з його мікробіоценозами
(бактеріями, вірусами, бактеріофагами, тощо) являє собою саморегулюючу
біоасоціативну систему (Г.М. Кременчуцький та співавт., 2003).
Мікроорганізми беруть участь майже у всіх біохімічних та фізіологічних
процесах, що протікають на слизових оболонках і шкірному покрові
(С.І.Климнюк, 2002). Достатньо вивчена також роль мікробів в регуляції і
підтримці імунного статусу та фізіологічної рівноваги (гомеостазу)
організму людини (А.А. Журило, 1999). Дещо гірше вивчено інформаційний
статус мікроорганізмів (А.В.Алескин, 1999).

Біопрепарати з мікроорганізмів (пробіотики) сьогодні вже достатньо
широко застосовуються в медичній практиці (В.В. Смирнов, В.С.
Подгорський, Н.К. Коваленко, 2003). Однак, терапевтичний і
профілактичний ефект пробіотиків опосереджується вельми складною
системою ензимів, біологічно активних речовин, мікро- і макроелементів,
рецепторних взаємодій з елементами імунної системи (А.Н. Бондаренко,
1996). Вплив мікро- і макроелементів на біологічні властивості
пробіотиків (антагонізм, біохімічні, антигенні властивості, здатність
щодо синтезу біологічно активних речовин, трансформації молекул
макроорганізму) вивчено недостатньо.

Одним з найважливіших мікроелементів, що відіграють суттєву роль у
біохімічних процесах макро- і мікроорганізмів, є йод і його сполуки
(R.K. Мurray et al., 1999). Препарати йоду володіють дезинфікуючими
властивостями із широким спектром антимікробної дії. Спиртові розчини
йоду, окрім бактерицидної дії, проявляють також виражений спороцидний
ефект, однак вони мають ряд недоліків, дещо знецінюючі їх практичне
застосування. Основним з них є подразнююча дія на шкіру і слизові
оболонки, здатність викликати опіки і алергійні реакції. Крім того, йод
має обмежену розчинність у воді, він летючий і вельми токсичний.

В останні роки усе більш широке застосування знаходять так звані
йодоформ – комплексні сполуки йоду з розчинними у воді полімерами.
Йодофори, зберігаючи високі антисептичні властивості йоду, позбавлені
більшості перерахованих вище недоліків. Вони володіють також миючими
властивостями, що значно прискорює процес знезаражування. Однією з
позитивних властивостей йодофорів є збереження ними високої
бактерицидної активності в присутності органічних речовин – білку,
крові, гною.

Бактерицидна дія йоду у вигляді вказаного комплексу значно пролонгується
в порівнянні з неорганічними його сполуками. Бактерицидну дію
елементного йоду з однією позитивною валентністю пояснюють гальмуванням
ензимних процесів або прямим галоїдуванням протеїнів мікробної клітини
(Г.К. Палій та ін., 1997). Відомі дві основні системи, що перетворюють
галогени (аніони) J і СІ у біологічно активні гіпогалоїди з різними
біологічними властивостями. Перша – органний рівень – щитовидна залоза,
в якій у процесі окислювання НАДН2 утворюється водень пероксид, який
використовується КІ-пероксидазою для окислювання КJ і утворення ді-,
трийодтироніну і тироксину (R.К. Мurrау еt аl., 1999). Друга – клітинний
рівень – фагоцити, що використовують реакцію окислювання НАДРН2 для
одержання водню пероксиду та синтезу за допомогою хлорпероксидази
бактерицидного гіпохлориду (А.Ф.Панченко, А.М. Герасимов, В.Д.
Антоненков, 1981).

У попередніх дослідженнях показано, що представники нормальної
мікрофлори організму людини – аерококи, – що живуть на слизових
оболонках порожнини рота, тонкого і товстого кишківнику, продукують
водень пероксид у результаті окислювання молочної кислоти (Г.M.
Кременчуцький, П.Я. Аренков, 1989), піровиноградної кислоти (С.А.
Черняєв, 2002) і ?-гліцерофосфату (С.А. Риженко, 2000). Аерококи
використовують продукуємий водень пероксид для пригнічення росту інших
мікроорганізмів і глутатіонпероксидазу – для захисту від ендогенного
водню пероксиду.

Аерококи як мікроаерофіли позбавлені гемвмістних каталази і пероксидази
(J.В.Еvans , 1953). Антиоксидантний захист клітин здійснюється
функціонуванням глутатіонпероксидази, супероксиддисмутази, а також за
допомогою хімічної реакції між піровиноградною кислотою і воднем
пероксидом. Зроблено припущення, що окрім глутатіонпероксидазної
активності мікроаерофіли можуть проявляти й інші види пероксидазної дії,
наприклад, за рахунок ферментів типу І- пероксидази. Таким чином,
мікроорганізми роду Аегососсиз володіють самими різними антагоністичними
властивостями щодо інших членів мікробіоценозів, та механізми вказаної
дії далеко ще не розкриті. Вказане диктує необхідність виконання нашого
дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи
кафедри мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської
державної медичної академії “Біотехнологія отримання асоційованого
препарату із Aerococcus viridans і Вacillus subtilis, які входять до
складу А-бактерину і Субаліну, та дослідження його біологічних
властивостей “in vitro” і “іn vivo” (номер державної реєстрації – 0100V
003058)”, Інституту мікробіології і імунології ім.І.І.Мечнікова
“Вивчення чутливості до дії сучасних антибіотиків та інші біологічні
властивості госпітальних штамів-збудників гнійно-запальних інфекцій”
(шифр ЦФ.4.28.99, № державної реєстрації 0199М003170), Дисертант є
співвиконавцем фрагментів цієї наукової роботи.

Мета дослідження: визначити вплив йоду і його сполук на антагоністичну
властивість та біохімічну активність мікроорганізмів, продукуючих водень
пероксид.

Задачі дослідження:

1. Вилучити і охарактеризувати охаректеризувати продуценти водню
пероксиду різного походження, означити їх місце в таксономії
мікроорганізмів;

2. Означити субстрати, при окисленні яких продукується водень
пероксид, і дослідити кореляцію цього процесу з антагоністичною
активністю продуцента;

3. Дослідити вплив сполук йоду на біологічні властивості продуцентів
водню пероксиду;

4. Встановити вплив біологічно активних речовин у комплексі з
сполуками йоду на рівень антагоністичної активності і окислення молочної
кислоти аерококами та їх ферментними комплексами;

5. Дати комплексну порівняльну оцінку ефективності застосування
аерококів сумісно з сполуками йоду та біологічно активними речовинами
при експериментальній стафілококовій інфекції;

6. Визначити можливість йодування органічних речовин за допомогою
бактерій, продукуючих водень пероксид;

7. Вивчити антигіпоксичну дію лізату аерококів на моделі гіпоксії
мишей.

Об’єкт дослідження. Мікроорганізми, які продукують водень пероксид.

Предмет дослідження. Сполуки йоду й їхній вплив на біологічні
властивості продуцентів водню пероксиду. Біологічно активні речовини й
їхній вплив на антагоністичні властивості представників нормальної
мікрофлори. Терапевтична дія препарату з аерококів у комплексі з
препаратами йоду та хімічно чистого водню пероксиду на моделі
експериментальної стафілококової інфекції білих мишей.

Методи дослідження. Мікробіологічні (виділення продуцентів водню
пероксиду з організму людини і тварин, їх морфологічна, біохімічна і
фізіологічна ідентифікація). Біохімічні (визначення ферментативної
активності продуцентів водню пероксиду, вилучення ферментних комплексів
бактерій і визначення їх оксидазної активності).

Наукова новизна одержаних результатів.

Доведена наявність у доброякісних та злоякісних пухлинах продуцентів
водню пероксиду. Вперше встановлено стимулюючий вплив KJ, доданого до
живильного середовища, на антагоністичну активність аерококів,
продукуючих водень пероксид. За аналогією з приведеними вище механізмами
використання аніонів на тканинному і клітинному рівнях макроорганізму
висловлено припущення, що аерококи також володіють KJ-пероксидазною
активністю і використовують продукуємий водень пероксид для окислення KJ
до гіпойодиду, що призводить до значного посилення протимікробної дії (в
порівнянні з пероксидом водню).

Означено субстрати окислення продуцентів водню пероксиду, до яких
відносяться: молочна кислота, ?-гліцерофосфат, піруват, гліцин,
глутатіон, валін, цистін, пролін.

Показана антигіпоксична дія лізату аерококів на моделі гіпоксії білих
мишей. Виявлено стимулюючу дію сполук йоду на профілактичний та
лікувальний ефект препарату з аерококів. Встановлена можливість
йодування органічних речовин за допомогою продуцентів водню пероксиду,
володіючих KJ-пероксидазною активністю.

Практичне значення одержаних результатів.

На підставі аналізу результатів експериментів зроблено висновок, що
аерококи, введені підшкірно у вогнище поразки, розмножуючись там,
проявляють профілактичний та лікувальний ефект за рахунок своїх
продуктів метаболізму, у тому числі і пероксиду водню. Антагоністичну
активність аерококів підсилюють треонін, глутамінова та аспарагінова
кислоти, валін, глутатіон відновлений і цистеїн. Висловлено припущення і
доведено, що амінокислоти відіграють значну регуляторну роль в
окислювальному метаболізмі аерококів.

Визначено, що сполуки йоду підвищують лікувальний ефект і захисну дію
препарату з аерококів. Дані про йодування органічних речовин за
допомогою продуцентів водню пероксиду відкривають новий шлях боротьби з
йоддефіцитними захворюваннями.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснив пошук літературних
джерел та аналіз літературних даних. Вилучення продуцентів перекису
водню з організмів людини та тварин, їх ідентифікацію і мікробіологічну
характеристику повністю виконано автором. Дисертант особисто дослідив
вплив сполук йоду на антагоністичну та біохімічні властивості
продуцентів пероксиду водню. Статистична обробка дослідів, висновки та
практичні рекомендації зроблені особисто автором.

Апробація результатів дисертації. Результати виконаних досліджень
оприлюднені в доповідях на симпозіумі “Синтез, експериментальне вивчення
та клінічне застосування четвертинних амонієвих сполук”, Чернівці, 1995;
на Міжнародній конференції “Стратегія і тактика використання
антисептиків в медицині”, Вінниця, 2000; на науковій конференції
“Розвиток санітарної мікробіології в Україні”, Чернівці, 2002; на
міжнародній конференції “Новые информационные технологии в медицине и
экологии”, Ялта-Гурзуф, 2003; на міжнародній науковій конференції ”
Актуальные вопросы борьбы с инфекционными болезнями”, м. Харків, 2003;
підсумкових конференціях Дніпропетровської обласної СЕС,
Дніпропетровськ, 2000 – 2003.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, з
них 3-у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, два розділи у
монографії, 2 роботи у матеріалах і збірниках конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 127 сторінках і
складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи
досліджень”, 3 розділів власних досліджень, аналізу та обговорення
результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних
літературних джерел (всього 214 найменувань). Робота ілюстрована 36
таблицями та 19 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі роботи подано огляд літератури, в якому наведено дані
щодо вмісту перекисводнюутворюючих бактерій в організмі людини, їх
біологічних властивостей, впливу макро- і мікроелементів на
мікроорганізми. Висвітлено недоліки вивчення взаємодії сполук йоду та
біологічно активних речовин з мікроорганізмами – продуцентами перекису
водню, обґрунтовано доцільність цього дослідження.

Матеріал і методи дослідження. Вилучено, ідентифіковано і
охарактеризовано 102 штами аерококів і стрептококів різного походження,
штами з вираженою антагоністичною активністю, яка вивчалася методом
відстроченого посіву тест-культур через 24 години вирощування
антагоністів (С.А.Риженко, 2001). Охарактеризовано також штам Vibrio NAG
р-6078, позбавлений каталазної і пероксидазної активності, чутливий до
H2O2 і тест культури, що мають каталазну і пероксидазну активність.
Окислювання КJ визначалося на індикаторному середовищі по кольоровій
реакції окисленого J2 з розчинним крохмалем. Зони окислювання KJ
зіставлялися з зонами пригнічення росту Vibrio NAG р-6078, S.flexneri,
S.aureus, P. aeruginosa, С.albicans, К. pneumonіае, Е.соlі, S.
typhimurium. Продукти окислювання визначали згідно методики В.Е. Каган
та ін. (1986).

Для визначення ступеню антагоністичної дії аерококів на стафілококи в
дослідах in vivo використано модель місцевої стафілококової інфекції
білих мишей (Еlек S.D., 1956).

Вилучення і часткове очищення ферментного комплексу аерококів проводили
шляхом висалювання сульфатом амонію білків з лізатів клітин, розчиненням
осаду в 0,01 М фосфатному буфері (рН 7,4) і діалізом розчину через
целофанову мембрану проти 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4), як описано
Р. Скоупсом (1985). НАД – незалежна лактатдегідрогеназна активність
аерококів визначалась згідно з Н.W.Dоеllе (1971). Глутатіонредуктазна
активність досліджена за методом, описаним Ю.І. Губським із співавт.
(1983). Супероксиддисмутазна активність аерококів визначалась за
методикою Є.В.Макаренка (1988).

Результати дослідження та їх аналіз. Результати власних досліджень
наведено в 3-ому – 5-ому розділах.

Продуценти водню пероксиду вилучено з молозива породіль, узятого в них
до і після пологів. Масовому обстеженню піддалися 291 матір шляхом
однократного посіву незбираного молока на звичайний простий живильний
агар. Для виявлення продуцентів водню пероксиду чашки Петрі з колоніями
аерококів запилювали в герметичній камері тест-мікробом – V. NAG p-6078.
Усього вилучено 88 штамів продуцентів. Продуценти водню пероксиду
виділено також з доброякісних пухлин 32 хворих і злоякісних новоутворень
26 пацієнтів. В подальшому в роботі використано 14 штамів продуцентів
водню пероксиду, вилучених з пухлин.

З усіх виділених штамів продуцентів водню пероксиду 97 відносилися до
роду Аerococcus і 5 до роду Enterococcus.

На рисунку1 представлена зона інгібіції росту тест-культури V. NAG
p-6078 колонією продуцента водню пероксиду, рисунку 2 ілюструє колонії
аерококів на живильному середовищі, що містить KJ і розчинний крохмаль
при окислюванні молочної кислоти.

Рис. 1. Зона інгібіції росту Рис. 2. Індикаторне
фарбування при

тест-культури V. NAG p-6078 рості продуцентів на
середовищі, що

колонією продуцентів Н2 О2 містить KJ і розчинний
крохмаль

У таблиці 1 проведено зіставлення зон пригнічення росту V. NAG p-6078 з
діаметрами зон індикаторного фарбування, що виникають при продукції
різними штамами бактерій Н2О2.

Статистично в усіх варіантах експерименту визначено повний збіг зон
пригнічення росту V. NAG p-6078 з діаметрами зон індикаторного
фарбування, що виникають при продукції різними штамами мікробів Н2О2.

Таблиця 1

Результати зіставлення зон пригнічення росту Vіbrio NAG р-6078

з діаметрами зон індикаторного фарбування

з.п.

Куль-тури

Антагоністична та оксидазна активність аерококів в

індикаторному середовищі ІС

Діаметр (мм) зони

пригнічення росту

Vіbrio NAG р-6078М±м

Діаметр (мм) зони

індикаторного фарбування

М±м

1 2 3 4

1

167

25,3±1,2

25,6±0,8

2

201

31,5±1,2

29,0±1,2

3

79

15,3±1,2

13,0±0,8

4

87

28,6±2,5

29,6±2,6

5

89

22,0±2,9

19,3±2,6

6

90

30,6±2,6

27,0±2,6

7

93

19,6±1,2

18,6±1,2

8

77

17,8±0,8

17,0±0,8

9

80

24,0±2,2

21,6±0,8

10

81

30,3±2,1

28,6±2,4

11

118

29,0±1,6

28,6±1,8

12

94

28,3±2,8

28,0±2,8

13

95

16,6±2,2

16,2±2,4

14

127

27,3±0,9

26,6±0,5

15

128

32,6±1,2

31,3±3,3

16

123

25,0±0,8

24,6±1,2

17

124

17,3±1,2

17,0±0,8

18

125

21,0±1,6

20,3±1,2

Р

> 0,05

Вивчено вплив різних концентрацій основного субстрату окислювання
аерококами молочної кислоти. Раніше встановлено, що аерококи однаково
добре окислюють D- и L-ізомери молочної кислоти (Кременчуцький Г.М.,
Аренков П.Я., 1989). Показником окислювання молочної кислоти служили
зони індикаторного фарбування в середовищі, що містить KJ і крохмаль,
під впливом продукуємої Н2О2.

Дані таблиці 2 підтверджують пряму дозову залежність ступеня продукції
аерококами водню пероксиду від вмісту лактату в живильному середовищі.

Таблиця 2

Діаметр пофарбованих зон, ініціюємих різними штамами продуцентів водню
пероксиду в залежності від концентрації лактата, що вводиться у
середовище

Діаметри зон індикаторного фарбування (М±м, мм)

Культури

?

1/4

.

a$

?

?в залежності від концентрації лактату (мМ)

з.п.

аерококів

90

9

0,9

1

2

3

4

5

1

167

58,5±2,5

35,1±1,7

11,2±0,7

Р

Отримані дані свідчать, що гліцерофосфат, як попередник дигідрооксиацетону, метилгліоксалю і молочної кислоти, достовірно активує процес окислювання калію йодиду й суттєво підвищує антагоністичну активність аерококів. Оптимальна концентрація гліцерофосфату в живильному середовищі знаходиться в межах 200-400 мкг/мл. Заслуговують на увагу результати отримані при додаванні в живильне середовище тіаміну. Починаючи з концентрацій тіаміну 100 мкг/мл у деяких випадках спостерігалося пригнічення окислювання калію йодиду й антагоністичної активності. Рибофлавін стимулював вказані властивості аерококів у концентрації 10 мкг/мл; при підвищенні його дози ефект був зворотнім. Додавання в живильне середовище тіаміну і рибофлавіну сумісно в концентраціях 10 мкг/мл не привело до достовірних змін ступеня окислювання калію йодиду та підвищення антагоністичної активності аерококів. Додатково перевірено вплив калію броміду на антагоністичну активність аерококів та достовірних її змін при цьому також не виявлено. У процесі підбору амінокислотного складу селективно-індикаторного середовища визначеного біохімічного складу для аерококів відмічено, що зміна концентрацій деяких амінокислот, наприклад, глутамінової кислоти, або введення до складу середовища інших амінокислот, необхідних для росту аерококів, призводило або до посилення індикаторної реакції середовища на оксидазну активність, або ж до зменшення. По цьому вивчено вплив різних амінокислот на оксидазну активність ферментного комплексу, виділеного з штаму № 167 аерококів. Діаметр кольорової зони, що утворюється при окислюванні молочної кислоти, порівнювали з рівнем поглинання кисню (табл. 3). Таблиця 3 Вплив амінокислот на окислювання калію йодиду ферментним комплексом аерококів № з.п. Амінокислоти Діаметр кольрової зони в індикаторному гелі (мм) МкМ О2 за 1 хв на 1 мг білку ферментного комплексу 1 2 3 4 1 Контроль 9,3±0,36 227,6±19,7 р - - 2 Тирозин 14,3±0,36 209,7±15,6 р 0,05

3

Триптофан

0

95,3±7,3

Р

0,05

5

Лейцин

8,3±0,36

206,0±12,8

Р

>0,05

>0,05

6

Лізин

12,3±0,36

450,3±12,6

Р

0,05

>0,05

8

Треонін

13,6±0,36

523,7±13,8

Р

0,05

0,05

>0,05

10

Глутамін

0

1 12,2±3,8

Р

0,05

0,05

>0,05

14

Р – феніл – ? –

8,6±0,67

190,6±4,01

аланін

Р

>0,05

>0,05

15

Ізолейцин

11,6±0,36

210,15±6,3

Р

0,05

16

Р – аланін

0

98,6±4,1

Р

0,05

0,05

>0,05

19

Метіонін

0

391,9±38,02

Р

0,05

21

? – аланін

21,3±1,36

589,5±30,3

Р

0,05

>0,05

27

Цистеін

11,3±0,67

11,3±0,67

Р

>0,05

>0,05

28

Цистін

14,6±0,89

14,6±0,89

Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020