НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

ПОНОМАРЕНКО ОЛЬГА ВІКТОРІВНА

УДК 577.352.4

Вплив сперміну на транспорт іонів Са В мітохондріях міометрія

03.00.04 — біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

член-кореспондент НАН України,

КОСТЕРІН Сергій Олексійович,

завідувач відділу біохімії м’язів
Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,

керівник лабораторії молекулярної
генетики

Інституту геронтології АМН України;

доктор біологічних наук, професор

МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,

професор кафедри біохімії

Київського національного
університету

імені Тараса Шевченка.

Провідна установа – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

відділ фізіології кровообігу

(м. Київ).

Захист відбудеться 2 квітня 2007 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В.
Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ — 30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії
ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий 1 березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Іон Са (Са2+) є важливим клітинним месенджером, який
здатний регулювати різноманітні біохімічні, біофізичні та фізіологічні
процеси, в тому числі скорочення м’язів [Bеrridge M. et.al.,2003; Костюк
П. та ін.,2005; Belkacemi L. et.al.,2005].

Са2+-залежний контроль скоротливої відповіді гладеньких м’язів (ГМ)
здійснюється завдяки різноманітності внутрішньоклітинних Са2+-сигналів,
які забезпечуються суперпозицією функціонування систем пасивного і
активного транспорту даного катіона, що локалізовані як у плазматичній
мембрані (ПМ), так і у внутрішньоклітинних мембранних структурах —
саркоплазматичному ретикулумі (СР) та мітохондріях (МХ) [Poburko D.
et.al.,2004; Wray S. et.al.,2005].

МХ є внутрішньоклітинними кальцієвими депо, які здатні акумулювати іони
Са у великих кількостях [Maтишевська O. та ін.,2002; Duchen M.,2004].
Акумуляція Са2+ в МХ здійснюється за рахунок електрофоретичного
накопичення Са2+ за градієнтом електрохімічного потенціалу, ДШ = -180
мВ, який має протонне походження [Литошенко А.,2001; Carafoli E.,2003].
Вихід Са2+ з МХ може відбуватися шляхом електронейтрального обміну
Ca2+/2Н+ та Ca2+/2Na+ [Gunter T. et.al.,2004; Saris N. et.al.,2005], а
також завдяки формуванню у внутрішній мембрані МХ неселективної пори —
так званої мітохондріальної пори перехідної проникності (МППП)
[Halestrap A.et.al.,2002; Акопова O., Сагач В.,2005]. Встановлено, що
відкривання МППП відбувається при критичному накопиченні Са2+ в
мітохондріальному матриксі та певному зниженні трансмембранної різниці
електричних потенціалів. МППП, як вважають, належить важлива роль у
процесах загибелі клітини [Gottlieb R. et.al.,2002]. Циклоспорин А (ЦсА)
є одним із перших лікарських засобів, який застосували для блокування
MППП [Belyaeva E. et.al.,2002; Schinzel A. et.al.,2005]. ЦсА здатен
захищати клітини мозку та серця від пошкоджень, спричинених реперфузією
та ішемією [Weiss J. et.al.,2003; Di Lisa F. et.al.,2006]. Проте, не
дивлячись на очевидну здатність ЦсА бути антиішемічним лікарським
засобом, його фармакокінетичні параметри не свідчать на користь його
активного клінічного використання у перспективі [Szewczyk A.
et.al.,2002]. У зв’язку з цим важливим є пошук речовин природного
походження, здатних спрямовано модулювати акумуляцію Са2+ в МХ та
відкривання МППП. Такими природними речовинами можуть бути поліаміни
(спермін, спермідин, путресцин) та іони Mg (Mg2+), яким притаманна
важлива роль у забезпеченні життєдіяльності всіх прокаріотичних та
евкаріотичних клітин [Wang R. et.al.,2003; Janne J. et.al.,2004].
Тестування ЦсА-чутливої МХ пори можливо з використанням різноманітних
експериментальних підходів, зокрема – із залученням ізотопної техніки
(45Са2+), реєстрації набухання цих субклітинних структур та т.і.
[Kosterin S.,2003; Halestrap A.,2006].

Поліаміни є важливими полікатіонами клітини, вони беруть участь у
процесах росту та диференціювання клітин [Wallace H. et.al.,2003],
регуляції білкового синтезу [Janne J. et.al.,2004], запрограмованій
загибелі клітини [Seiler N. et.al.,2005], а також відіграють суттєву
роль у регуляції транспорту Са2+ МХ [Nitta T. et.al.,2002]. Поліаміни
здатні зворотньо зв’язуватись із внутрішньою мембраною МХ [Hoshino K.
et.al.,2005]. Спермін відіграє важливу регуляторну роль у функціонуванні
такого репродуктивного органу, як матка [Houlihan D. et.al.,2002]. Він
проявляє потужний релаксуючий ефект на спонтанні та викликані агоністом
скорочення ізольованих смужок міометрія людини, К+-, Са2+-, метахолін-
та ванадат-індуковані скорочення міометрія щурів [Revuelta M.
et.al.,1998], але механізм релаксуючої дії цього поліаміну на міоцити
поки що не з’ясовано.

Дані щодо ефектів поліамінів на трансмембранний обмін Са2+ в МХ, зокрема
на Са2+-уніпортер та Са2+-залежну МППП, є досить суперечливими [Igarashi
K. et.al.,2000].

Беручи до уваги, що іони Mg необхідні для забезпечення АТР-залежної
акумуляції іонів Са в МХ клітин міометрія, важливим також є питання щодо
з’ясування закономірностей трансмембранного обміну Са2+ в МХ ГМ за умов
сумісного використання Mg2+ та сперміну.

Таким чином, можна стверджувати, що подальші дослідження щодо з’ясування
закономірностей регуляції активності Са2+-транспортуючих систем МХ
поліаміном сперміном є особливо важливими для розробки ефективних
методів спрямованої корекції трансмембранного обміну іонів Са у
зазначених субклітинних структурах зворотними ефекторами у випадку його
порушень [Kristian T. et.al.,1996].

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана відповідно до плану науково — дослідних робіт
відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ за
темами: “Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного
спряження у гладеньких м’язах та ролі систем енергозалежного транспорту
Са2+ у забезпеченні цього процесу” (держ. реєстр. № 0199И000270) і
“Вивчення властивостей та регуляції АТP-залежних кальцієвих помп
мембранних структур гладеньких м’язів” (держ. реєстр. № 0104И003281).

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідити закономірності
впливу поліаміну сперміну на Mg2+,АТР – залежну акумуляцію іонів Са та
пору перехідної проникності в МХ міометрія.

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

Вивчити кінетику та Mg2+-чутливість АТР-залежної акумуляції Са2+ в МХ.

Дослідити закономірності впливу сперміну на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію
іонів Са в МХ.

Вивчити дію сперміну на Са2+-залежну ЦсА-чутливу мітохондріальну пору
перехідної проникності.

Об’єкт дослідження: системи транспорту іонів Са в МХ ГМ матки.

Предмет дослідження: вплив сперміну на транспорт Са2+ в МХ міометрія та
на Са2+- залежне набухання цих субклітинних структур.

Методи дослідження: препаративна біохімія, біохімічна мембранологія,
ізотопна техніка (45Са2+), спектрофотометрія, лазерно-кореляційна
спектроскопія (ЛКС), проточна цитофлуориметрія, кінетичний аналіз,
математичне моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Із використанням методів
радіоактивної мітки (45Са2+), ЛКС, проточної цитофлуориметрії та
математичного моделювання одержані нові дані щодо властивостей
Са2+-акумулюючої системи та ЦсА-чутливої, Са2+-залежної пори перехідної
проникності МХ ГМ матки, впливу поліаміну сперміну на транспорт Са2+ в
них.

Вперше продемонстровано, що дія сперміну на швидкість Mg2+,АТР-залежної
акумуляції Са2+ в МХ міометрія є двофазною: за малих (фізіологічних)
концентрацій сперміну (?1 мМ) спостерігається активація транспортного
процесу, а за великих (1-10 мМ) – його інгібування. У той же час,
спермін (до 10 мМ) практично не впливає на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію
Са2+ в СР міометрія. Розроблено та апробовано у дослідах кінетичну
модель біфазного впливу сперміну на швидкість Mg2+,АТР-залежної
акумуляції іонів Са в МХ. Встановлено, що спрямованість дії ЦсА на
акумуляцію іонів Са в МХ міометрія (стимуляція чи інгібування) залежить
від концентрації іонів Mg.

Доведено, що у разі збільшення неспецифічної проникності мембрани МХ,
але за присутності сперміну (1 мМ) та іонів Mg у насичувальних (щодо
функціонування Са2+-уніпортера) концентраціях (7 мМ), спостерігається
повне відновлення рівня Mg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ у цих
субклітинних структурах. Показано наявність Са2+-чутливої пори
перехідної проникності у МХ міометрія, яка інгібується ЦсА та
регулюється сперміном.

Практичне значення одержаних результатів. Із використанням методів ЛКС
та проточної цитофлуориметрії розроблено методичні підходи до
ідентифікації та вивчення властивостей ЦсА-чутливої Са2+- залежної пори
перехідної проникності в МХ міометрія. Ці підходи можуть бути
застосовані в інших лабораторіях при дослідженні трансмембранного обміну
іонів Са в МХ.

Експериментальні дані, що були одержані при вивченні впливу сперміну на
транспорт Са2+ в МХ, є перспективними для подальшого з’ясування
біохімічних та фізико-хімічних аспектів дії поліамінів на Са2+-уніпортер
та МППП. Кінетична модель впливу сперміну на акумуляцію іонів Са в МХ ГМ
матки може бути корисною для розуміння молекулярних та мембранних
механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньком’язових
клітинах (ГМК).

Особистий внесок здобувача. Головна ідея та задачі досліджень були
сформульовані науковим керівником – д.б.н., проф., чл.-кор. НАНУ С.О.
Костеріним. Дисертанткою самостійно здійснено аналіз відповідних
літературних даних, одержано фракцію МХ та суспензію ГМК матки щурів,
проведено досліди по вивченню акумуляції іонів Са в МХ клітин міометрія
(деякі із таких експериментів виконано разом з к.б.н. Л.Г. Бабіч та
к.б.н. С.Г. Шликовим), проведено кінетичний та статистичний аналіз
результатів та експериментальну апробацію кінетичної моделі дії сперміну
на акумуляцію Са2+ в МХ. Особисто були проведені дослідження методом
проточної цитофлуориметрії і разом із к.б.н. Л.Г. Бабіч було розроблено
робочий протокол для реєстрації набухання МХ. Досліди з використанням
лазерного кореляційного спектрометру виконані разом із к.ф.-м.н. В.Ф.
Горчевим. Аналіз експериментальних результатів та формулювання висновків
роботи проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації було представлено
на науково-практичній конференції студентів та молодих вчених
Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною
участю «Актуальні проблеми сучасної медицини» МОЗ України (отримала
диплом за найкращу наукову роботу) (Київ, Україна, 2003 р.);
Міждународному симпозіумі «Smooth muscle physiology and biophysics»
(Київ, Україна, 2003 р.); Міжнародній Парнасівській конференції
«Molecular mechanisms of cellular signalling» (Київ, Україна, 2005 р.);
ІХ Міжнародній конференції «Cеll biology», (Лодзь, Польща, 2005 р.).
Результати експериментів також доповідались на наукових семінарах
відділу біохімії м’язів та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім.
О.В.Палладіна НАН України. Матеріали досліджень було представлено на
конкурсах молодих вчених Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАНУ: у
2003 р. (премія за активну участь) та у 2005 р. (посіла ІІ місце) та на
здобуття стипендії імені видатних вчених-біохіміків, де роботу
відзначено премією ім. член-кор. АН СРСР та АН УРСР Д.Л. Фердмана (2004
р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових
наукових журналах та 11 тез доповідей у матеріалах міжнародних та
всеукраїнських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 155
сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”,
“Огляд літератури”, “Експериментальна частина” (4 підрозділи),
“Заключний розділ”, “Висновки”, “Додаток” та “Список використаних
джерел”, який містить 275 посилань. Робота ілюстрована 25 рисунками та 4
таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури висвітлено сучасні уявлення про мембранні механізми
регуляції концентрації Са2+ в цитоплазмі, шляхи та механізми транспорту
Са2+ в МХ, структуру та функціональну роль неспецифічної пори перехідної
проникності в них. Охарактеризовано вплив Mg2+ на
структурно-функціональні властивості біологічних мембран та обмін Са2+ у
тканинах. Наведено дані щодо впливу поліамінів на транспорт Са2+ у
субклітинних мембранних структурах, закономірності впливу поліамінів на
скоротливу активність скелетних м’язів, міокарду та ГМ, а також
безпосередньо на скоротливу функцію матки.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження АТР-залежної акумуляції Са2+ у МХ та СР, що були проведені
за допомогою радіоізотопної техніки (45Са2+) на суспензії ГМК матки,
оброблених розчином дигітоніну.

Суспензію ГМК матки невагітних щурів, естрогенізованих за 16 год до
забору тканини [Rao et al.,1986], отримували за допомогою методу
[Mollard et al.,1986] з деякими модифікаціями.

Транспортну активність електрофоретичного енергозалежного
Са2+-уніпортера МХ та Mg2+,АТР-залежної Са2+-помпи СР тестували в
експериментах, які було здійснено на суспензії клітин міометрія,
оброблених розчином дигітоніну, що мали порушену бар’єрну функцію ПМ.
Середовище інкубації (об’єм — 0,5 мл) містило (мМ): 20 Hереs-NaOH буфер
(рН 7,4; 37єC), 3 MgCl2, 3 АТР, 3 сукцинат Na, 125 KCl, 25 NaCl, 2
фосфат K та 10 мкМ (45СаCl2+ 40CaCl2) (0,5 мкКі/мл); вміст дигітоніну —
0,1 мг/мл (0,01%). У попередніх дослідах було визначено оптимальну
вищезазначену концентрацію дигітоніну. Доведено, що дигітонін у цій
концентрації порушує цілісність ПМ, але не впливає на
структурно-функціональні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих депо
[Fiskum et al.,1985; Шлыков и др.,1997]. Середня кількість міоцитів у
пробі — 2·105. Енергозалежну акумуляцію Са2+ у СР пригнічували
селективним інгібітором Са2+-помпи СР тапсигаргіном (100 нМ). Для
селективного пригнічення накопичення Са2+ у МХ використовували
протонофор СССР (1 мкМ) чи рутенієвий червоний (10 мкМ). Енергозалежний
транспорт Са2+ в МХ та СР міоцитів, оброблених розчином дигітоніну,
досліджували за допомогою ізотопної методики з використанням 45Са2+.
Акумуляцію Са2+ ініціювали внесенням у середовище інкубації суспензії
клітин. Кількість Са2+ (пмоль Са2+/106 клітин), що надійшла до МХ та СР
в енергозалежному процесі, обчислювали за різницею між загальним його
накопиченням із середовища інкубації та адсорбцією із середовища
інкубації, що не містило АТР (або Mg2+). Транспортний процес зупиняли
шляхом швидкого фільтрування інкубаційної суміші крізь мембранні фільтри
(«Millipore», США, діаметр пор 0,45 мкм) під вакуумом з наступною
разовою промивкою їх охолодженим ізотонічним розчином (об’єм — 5 мл), що
містив (мМ): 20 Hереs-NaOH буфер (рН 7,4; 8?C), 150 KCl, 5 CoCl2.
Радіоактивність мембранних фільтрів вимірювали за допомогою рідинного
сцинтиляційного спектрометра Intertechnique SL-4000 (Франція).

МХ міометрія у разі використання такої експериментальної моделі, як
суспензія міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, були функціонально
активні: вони забезпечували Mg2+,ATP-залежну акумуляцію іонів Са
(початкова швидкість V0 акумуляції Са2+ у МХ дорівнювала 1324 ( 174
пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв., n=5), яка пригнічувалась протонофором
СССР (1 мкМ) та рутенієвим червоним (10 мкМ), але не була чутливою до
дії селективного інгібітора Са2+-помпи СР тапсигаргіну (100 нМ).
Mg2+,ATP-залежна акумуляція іонів Са у СР міометрія характеризувалася
значенням початкової швидкості V0=188(47 пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв
(n=5). У цьому випадку транспорт Са2+ пригнічувався тапсигаргіном (100
нМ), але не був чутливим до дії СССР (1 мкМ) та рутенієвого червоного
(10 мкМ).

При вивченні концентраційних залежностей впливу сперміну та ЦсА на
енергозалежний транспорт Са2+ у МХ ці речовини безпосередньо вносили до
середовища інкубації у відповідних концентраціях.

Дію іонів Mg та сперміну на Mg2+,АТР — залежну Са2+- транспортуючу
систему МХ та СР клітин міометрія досліджували таким чином. Суспензія
ГМК матки щурів була проінкубована з Mg2+ чи сперміном за різних
концентрацій у середовищі інкубації (склад наведено вище) протягом 5
хв., у цих дослідах контролем були клітини, які “проходили” усі етапи
інкубації, що наведені вище, але без внесення Mg2+ чи сперміну (вносили
аліквоту Н2О).

У дослідженнях, які були проведені за умов комплексного використання
сперміну, іонів Mg та ЦсА на Mg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ у МХ,
використовували 6 груп дослідів – А, Б, В, Г, Д та Є. Кожні дві групи
мають свої умови дослідження.

Для групи дослідів А, В та Д концентрація Mg2+ у середовищі інкубації
складала 3 мМ, а для групи дослідів Б, Г та Є – 7 мМ. Для групи дослідів
В та Г середовище передінкубації містило 10 мкМ Са2+, 2 мМ фосфат К, 1
мМ спермін або 5 мкМ ЦсА, а також 3 мМ (група дослідів В) або 7 мМ
(група дослідів Г) Mg2+ відповідно, однак це середовище не містило АТР
(моделювали відкривання неспецифічної пори перехідної проникності
мітохондріальної мембрани, що призводить до падіння величини
електрохімічного протонного потенціалу на внутрішній мембрані МХ і, як
наслідок, до інгібування акумуляції Са2+ у цих структурах
[Crompton,1999]). Через 5 хв. вносили аліквоту розчину АТР (об’єм — 50
мкл, кінцева концентрація – 5 мМ). Для групи дослідів Д та Є середовище
передінкубації містило: 10 мкМ Са2+, 2 мМ фосфат К, 1 мМ спермін або 5
мкМ ЦсА, але у відсутності не тільки АТР, але і іонів Mg. Через 5 хв. в
це середовище вносили аліквоту розчину, який містив АТР та Mg2+. У всіх
дослідах час інкубації становив 5 хв. Контролем були клітини, які
“проходили” усі етапи інкубації, але без внесення розчину сперміну та
ЦсА (вносили аліквоту Н2О).

При розробці моделі біфазної дії сперміну на акумуляцію іонів Са в МХ
були використані методи хімічної та біохімічної кінетики, які
ґрунтувались на використанні закону діючих мас, принципу збереження
загальної концентрації речовин у реакції, принципу незалежного
протікання реакцій. До аналізу моделі був також застосований закон
збереження енергії (незалежність зміни вільної енергії Гіббса Д G від
шляху переходу) між окремими станами Са2+-уніпортера.

Дослідження, що були проведені за допомогою ЛКС та проточної
цитофлуориметрії на фракції ізольованих МХ міометрія.

Фракцію ізольованих МХ одержували із міометрія щурів, як описано раніше
[Костерин и др.,1985] з деякими модифікаціями складу середовища
інкубації. Кількість білка визначали за методом Бредфорда [Bradford
M.,1976].

Функцію розподілу МХ за розмірами вивчали за допомогою лазерного
кореляційного спектрометра “ZetaSizer –3” Malvern Instrument, який був
обладнаний корелятором multi computing correlator, type 7032 ce.
Досліджувану суспензію МХ (об’єм 1 мл) розташовували в циліндричній
оптичній кюветі із скла діаметром 10 мм, яку вводили в термостатовану
лунку лазерного кореляційного спектрометра. Реєстрацію та статистичну
обробку розсіяного від суспензії під кутом 90? лазерного випромінювання
(гелій-неоновий лазер ЛГ-111, потужність 25 мВт, довжина хвилі 633 нм)
проводили протягом 60 – 180 сек. Потім отриману автокореляційну функцію
(АКФ) аналізували за допомогою стандартної комп’ютерної програми PCS —
Size mode v 1.61 та розраховували функцію розподілу фракції МХ за
гідродинамічним діаметром.

Згідно отриманого розподілу середній гідродинамічний діаметр МХ складає
680±20 нм (n=6) (рис.1).

Рис. 1. Функція розподілу гідродинамічного діаметру для фракції МХ
міометрія (одержано із використанням методу ЛКС).

Са2+-залежне набухання МХ досліджували із використанням методу проточної
цитофлуориметрії. Аналіз зразків на проточному цитометрі COULTER EPICS
XL™ (Beckman Coulter) з аргоновим лазером (вихідна довжина хвилі, л=488
нм) проводили на основі використання таких параметрів: пряме (мале
кутове) світлорозсіювання (forward scatter — FS) та бічне (під кутом
90єС) світлорозсіювання (side scatter — SS), а також одного з показників
флуоресценції: FL-1, л=525 нм. Дослідження процесу набухання МХ було
розпочато зі створення робочого протоколу [Mattiasson G.-2004]. У
протокол уводилось логічне обмеження для реєстрації зразків за прямим та
бічним світлорозсіюванням. Аналіз проб припинявся за умов реєстрації
10000 подій в межах логічного обмеження. Вимірювання проводили на
середній швидкості потоку.

МХ „фарбували” акридин оранжем 10-N-ноніл бромідом (NAO), 100 нМ,
лзбуд.- 488 нм, лфл.- 525 нм. Як відомо, NAO селективно зв’язується з
кардіоліпіном МХ незалежно від величини їхнього потенціалу, що дає
можливість реєструвати зміни параметру бічного світлорозсіювання саме в
МХ [Mileykovkaya E.et.al.,2000; Fernandez G.et.al,2004]. Експерименти
проводили при кімнатній температурі та розпочинали внесенням аліквоти
фіксованої кількості препарату фракції МХ (25 мкг білка) до середовища
інкубації, яке містило: 10 мМ HEPES (рН 7,4), 250 мМ сахарозу. Набухання
МХ реєстрували після введення в середовище інкубації 100 мкМ Са2+ у
присутності 1 мкМ кальцієвого іонофору А23187. Для тестування
максимального набухання використовували аламетицин у концентрації 7,5
мкг/мл. Зразки аналізували за зміною положення піка бічного
світлорозсіювання у NAO-“позитивних” частинках. Набухання МХ
розраховували за формулою [Mattiasson G. et.al.,2003]: набухання у
відсотках = [(a-b)/(a-c)]·100 %, де a – положення піка бічного
світлорозсіювання до додавання Са2+, b – положення піка бічного
світлорозсіювання після додавання Са2+, c – положення піка бічного
світлорозсіювання після додавання аламетицину.

Експериментальні дані було оброблено загальноприйнятими методами
кінетичного аналізу та варіаційної статистики. Окрім того, із
використанням методів ЛКС та проточної цитофлуориметрії було
продемонстровано, що Са2+-залежні ефекти зміни гідродинамічного діаметру
та набухання ізольованих МХ є чутливими до дії блокатора неспецифічної
пори – ЦсА.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

І. Вивчення кінетики та Mg2+-чутливості АТР-залежної акумуляції іонів Са
в МХ.

ГМК матки, які обробили розчином дигітоніну, мали здатність накопичувати
1900(450 пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв. (n=5) при 37оС (рис.2) із
середовища інкубації, склад якого наведено у розділі “Методи
дослідження”. При цьому накопичення іонів Са максимально пригнічувалося
протонофором СССР (1 мкМ) та рутенієвим червоним (10 мкМ). Інгібуючий
вплив протонофору СССР на енергозалежну акумуляцію Са2+ у ГМК, які
оброблені розчином дигітоніну, був значно ефективнішим, ніж рутенієвого
червоного, величини уявних констант інгібування І0,5 становили 5·10-8 М
для СССР та 5·10-7 М для рутенієвого червоного (n = 5) (рис.2, криві 1
та 2 відповідно). Ці результати свідчать про наявність у клітинах
міометрія чутливої до дії протонофору та рутенієвого червоного системи
енергозалежної акумуляції Са2+, яка локалізована у МХ. Втім, протонофор
СССР та рутенієвий червоний повністю не пригнічували енергозалежну
акумуляцію Са2+ у міоцитах матки. При цьому за своєю величиною
резистентна до дії протонофору та рутенієвого червоного компонента
включення Са2+ в міоцити була практично однаковою і складала 300-400
пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв., тобто 15-20% від значення накопичення
Са2+ у відсутності вищевказаних ефекторів (рис.2). Наведені факти
свідчать про те, що у внутрішньоклітинних структурах ГМ матки тестується
ще одна система Mg2+,АТР- залежної акумуляції Са2+, яка не є чутливою до
дії протонофору чи рутенієвого червоного і немає відношення до МХ. Ця
система особливо наочно виявляється у присутності Са2+-преципітуючого
аніону оксалату (10 мМ), який здатний дуже добре проникати крізь
мембрану ретикулума [Костерин C.,1990] та гальмується специфічним
інгібітором кальцієвої помпи СР тапсигаргіном (100 нМ) [Бабич Л. и
др.,1994], але не є чутливою до дії СССР (1 мкМ) та рутенієвого
червоного (10 мкМ) (рис.2).

Рис. 2. Концентраційні залежності впливу різних ефекторів на акумуляцію
Са2+ в суспензії клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну
(ізотопна техніка – 45Са2+).

1 – дія СССР;

2– дія рутенієвого червоного.

Надалі було проведено порівняльний аналіз динаміки Mg2+,ATP-залежної
акумуляції іонів Са у СР та МХ. Слід звернути увагу на такі особливості
(рис.3): по-перше, початкова швидкість V0 накопичення іонів Са у МХ у
середньому у 7-8 разів перевищує таку, яка є властивою для
Са2+-акумулюючої системи СР (1324±174 та 188±47 пмоль Са2+/106 клітин за
1 хв. відповідно; n=5). По-друге, кінетика акумуляції іонів Са у МХ
характеризується фазою плато (починаючи з 5-ої хв. інкубації), що
відзеркалює наявність стаціонарності трансмембранного кальцієвого обміну
у зазначених субклітинних структурах. Втім, кінетика акумуляції іонів Са
у СР задовольняє закономірностям реакції нульового порядку (лінійність
між кількістю накопиченого Са і часом інкубації).

Рис. 3. Кінетика Mg2+,ATР-залежної акумуляції Са2+ у МХ (1) та СР (2)
клітин міометрія (ізотопна техніка — 45Са2+) (M+m; n = 5).

1 – акумуляція Са2+ у присутності тапсигаргіну (100 нМ), але у
відсутності рутенієвого червоного та оксалату;

2 – акумуляція Са2+ у відсутності тапсигаргіну, але у присутності
рутенієвого червоного (10 мкМ) та оксалату (10 мМ).

Отже, отримані результати свідчать про те, що, у випадку ГМ матки МХ
характеризуються значно більшою початковою швидкістю та рівнем
акумуляції іонів Са, ніж СР.

Приймаючи до уваги важливу роль іонів Mg у регуляції трансмембранного
обміну Са2+ у клітинах [Romani A. et al.,2000] у подальших дослідженнях
було вивчено концентраційну залежність впливу цього катіона на
Mg2+,ATP-залежну акумуляцію іонів Са у МХ та СР (рис. 4 А та Б). У
випадку МХ концентраційна залежність стимулюючого впливу іонів Mg на
акумуляцію Са2+ була практично лінійною у діапазоні концентрації Mg2+ до
5 мМ, подальше ж підвищення концентрації цього катіона до 7 мМ практично
не призводило до збільшення вмісту накопиченого Са2+. Значення уявної
константи активації КMg складає 2,8+0,4 мМ (n=5), насичувальна
концентрація Mg2+- 5-7 мМ (рис. 4 А).

Що ж стосується СР, то концентраційна залежність стимулюючого впливу
іонів Mg найбільш значно проявлялась у діапазоні концентрації до 1 мМ,
подальше ж підвищення концентрації цього катіона до 5 мМ проявляло менш
наочний стимулюючий ефект; значення уявної КMg складає 0,6 мМ (рис.4 Б).

Рис. 4. Концентраційна залежність впливу Mg2+ на ATP-залежну акумуляцію
Са2+ в МХ (А) та СР (Б) клітин міометрія (ізотопна техніка – 45Са2+).

Як можна бачити (рис.4), зміна концентрації Mg2+ в діапазоні від 0 до 5
мМ індукувала значно більш суттєве збільшення Mg2+,ATP-залежної
акумуляції іонів Са в МХ, ніж у СР: дійсно, у першому випадку середня
крутизна концентраційної залежності становила 800-900 пмоль Са2+/106
клітин за 5 хв. · мМ, а у другому – лише 120-140 пмоль Са2+/106 клітин
за 5 хв.· мМ. Таким чином, дві АТР-залежні Са2+-транспортуючі системи
внутрішньоклітинних кальцієвих депо міометрія демонструють наочну Mg2+-
залежність, проте у випадку Са2+-уніпортера МХ при підвищенні
концентрації Mg2+ від (0 – 5 мМ) стимуляція акумуляції Са2+ була значно
більш вираженою, ніж у випадку Са2+-помпи СР.

ІІ. Дослідження закономірностей впливу сперміну на Mg2+,АТР-залежну
акумуляцію Са2+ в МХ.

Було вивчено закономірності впливу сперміну на Mg2+,ATP-залежну
акумуляцію іонів Са у МХ міометрія. Важливість таких досліджень
обумовлена наступним: поліамін спермін є потужним релаксантом міометрія
людини, здатен підтримувати механічну напругу матки у стані спокою
впродовж вагітності, але механізм його розслаблюючої дії на міоцити не
з’ясований [Houlihan D.et. al.,2002].

Показано, що спермін, який був використаний у концентрації 1 мМ,
стимулював Mg2+,ATP-залежну нечутливу до дії тапсигаргіну (100 нМ), але
чутливу до дії СССР (1 мкМ) акумуляцію іонів Са у МХ клітин міометрія,
оброблених розчином дигітоніну (рис.5).

Рис. 5. Вплив сперміну на кінетику Mg2+,АТP-залежного накопичення Са2+ в
МХ клітин міометрія (ізотопна техніка – 45Са2+).

1 — контроль;

2 — контроль + 1мМ спермін;

3 — контроль + 1мкМ СССР.

b

h

j

ae

ae

. 0 : J „ ? ? E I I u

`

?`

b

d

f

h

j

ae

ae

: ? ‚ „ † ? ? I I ue ?

?

?

?

u

&

&

!ум спостерігається при фізіологічній концентрації сперміну 1 мМ.

Рис. 6. Концентраційні залежності впливу сперміну на Mg2+,ATP-залежну
акумуляцію Са2+ в МХ та СР клітин міометрія (ізотопна техніка – 45Са2+)
(M+m; n = 5).

1 — акумуляція іонів Са у МХ;

2 — акумуляція іонів Са у СР.

Отже, зазначена залежність характеризується фазами активації
(концентрація сперміну – до 1 мМ, константа активації Ка = 0,3-0,5 мМ)
та інгібування (концентрація сперміну > 1 мМ; константа інгібування Кі =
5,2±0,6 мМ) (рис.6, крива 1). У випадку ж Mg2+,ATP-залежного накопичення
Са2+ в СР тестується дуже слабко виражена фаза інгібування транспортного
процесу (при концентраціях поліаміну > 1 мМ) (рис.6, крива 2). Отже, у
порівняльному аспекті, при використанні одного і того ж самого діапазону
концентрації сперміну його гальмуючий вплив на Mg2+,ATP-залежний
транспорт Са2+ в МХ був виражений більш суттєво, ніж у СР, при цьому
значення уявних констант інгібування Кі були практично однаковими –
5,2±0,6 мМ та 5,7±0,7 мМ відповідно (n=5). Таким чином, у випадку клітин
міометрія, при фізіологічній концентрації сперміну (? 1мМ) об’єктом його
регуляторної дії є, перш за все, активний транспорт Са2+ в МХ, а не в
СР.

Приймаючи до уваги складний концентраційний ефект дії сперміну на
Mg2+,ATP-залежне накопичення іонів Са у МХ міометрія (рис.6, крива 1), а
також дані літератури [Salvi M.et.al.,2004], було запропоновано,
проаналізовано та апробовано у дослідах кінетичну модель комплексної дії
сперміну на накопичення Са2+ у цих субклітинних структурах, модель
базується на уявленні про існування двох типів центрів зворотного
зв’язування сперміну з мембраною МХ – S1 та S2, адсорбція поліаміну на
яких зв’язана з активацією (високоафінний центр) та інгібуванням
(низькоафінний центр) транспортної активності Са2+-уніпортера
відповідно.

При кінетичному аналізі куполоподібної концентраційної залежності впливу
сперміну на Mg2+,АТР-залежне накопичення іонів Са у МХ ГМ (рис.6, крива
1) можна ґрунтуватись на схемі (рис. 7), згідно з якою Са2+-уніпортер
(F) МХ є „двохвалентним” стосовно молекули сперміну (А). Ця
„двохвалентність” має причину саме у наявності двох сайтів зв’язування
поліамінів – S1 та S2, які відрізняються афінітетом до нього [Salvi M.
et.al.,2004]. Отже, мова йде за наступну сукупність реакцій:

Рис. 7. Кінетична модель біфазного впливу сперміну на
Mg2+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са в МХ міометрія.

Як можна бачити із схеми (рис.7), припускається, що комплекс
„Са2+-уніпортер” FCa забезпечує трансмембранне накопичення іонів Са у МХ
у відсутності сперміну у середовищі інкубації (константа швидкості k)
(“нульова точка” у випадку рис.6, крива 1). На рівні „моновалентного”
(стосовно сперміну) потрійного комплексу уніпортера FAСа (задіяний
високоафінний сайт зв’язування сперміну S1) відбувається активація
акумуляції Са2+ (константа швидкості k* = гk > k). У той же час
„бівалентний” (стосовно сперміну) комплекс уніпортера FA2Са (задіяні як
високоафінний, так і низькоафінний сайти зв’язування сперміну S1 та S2)
практично не є здатним до транспорту іонів Са.

Із використанням методу кінетичної лінеаризації, застосованого у випадку
двох фаз куполоподібної залежності акумуляції іонів Са в МХ міометрія
від концентрації сперміну (рис.6, крива 1), вдалося продемонструвати, що
вищезазначена кінетична модель (рис.7) добре описує цю залежність.
Розроблена модель дії сперміну на транспортування іонів Са МХ міометрія
дала можливість обчислити деякі важливі кількісні параметри, які
характеризують вплив сперміну на акумуляцію іонів Са в МХ матки.
Запропонована модель може бути корисною для подальшого дослідження ролі
поліамінів у забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в ГМ.
В цілому ж вищенаведені дані (рис. 5 — 7) вказують на те, що сперміну
належить суттєве значення у контролі активності Са2+-уніпортера МХ
міометрія.

Згідно літературних даних спермін може модулювати не лише активність
Са2+ уніпортера МХ, але й впливати на неспецифічну проникність
мітохондріальної мембрани, яка, як вважають, опосередковується чутливою
до дії ЦсА порою перехідної проникності МХ [Halestrap A. et al.,2002].
Одна з головних проблем при вивченні МППП — пошук коректного
експериментального методу, який дозволяє її тестувати.

Було створено умови для тестування ЦсА-чутливої неспецифічної
проникності внутрішньої МХ мембрани (із використанням ізотопної техніки
45Са2+). Важливим також було вивчення закономірностей дії сперміну та
ЦсА на Mg2+,ATP-залежну акумуляцію Са2+ у МХ ГМ матки в умовах зміни
концентрації іонів Mg у середовищі інкубації. З літератури відомо, що
передінкубація МХ у середовищі, яке містить 10 мкМ Са2+, 1-2 мМ фосфат
калію, але не містить АТР, призводить до збільшення неспецифічної
проникності внутрішньої мітохондріальної мембрани та відкривання МППП
[Crompton M.,1999].

Встановлено, що спермін (1 мМ) стимулює Mg2+,ATР-залежну акумуляцію
іонів Са у МХ незалежно від того, у якій концентрації Mg2+ був присутній
у середовищі інкубації (3 мМ = КMg чи 7 мМ – насичувальна концентрація,
де КMg – константа активації за іонами Mg) (рис.8, групи стовпчиків А та
Б). У той же час спрямованість дії блокатора МППП ЦсА (5 мкМ) на
Mg2+,ATР-залежну акумуляцію Са2+ у МХ залежала від концентрації іонів Mg
у середовищі інкубації: за концентрації Mg2+ 3 мМ спостерігався
стимулюючий ефект, а за концентрації Mg2+ 7 мМ – інгібуючий (рис.8,
групи стовпчиків А та Б).

За умов, які призводять до збільшення неспецифічної проникності МХ
мембрани (5-ти хвилинна передінкубація клітин міометрія у середовищі, що
не містить АТР [Crompton M.,1999]), спостерігалось значне пригнічення
Mg2+,ATР-залежної акумуляції іонів Са у МХ, яка індукувалась наступним
додаванням аліквоти розчину нуклеозидтрифосфату (3 мМ) як за
відсутності, так і у присутності сперміну (1 мМ) чи ЦсА (5 мкМ) (рис.8,
групи стовпчиків В, Г). Ще у значній мірі таке пригнічення спостерігали
у випадку, якщо у середовищі передінкубації одночасно були відсутні як
АТР, так і Mg2+ (рис.8, групи стовпчиків Д, Є). Як у першому, так і у
другому випадках, спрямованість дії сперміну (1 мМ) на акумуляцію іонів
Са зберігалась: стимуляція у присутності у середовищі інкубації як 3,
так і 7 мМ Mg2+. У випадку ж середовища передінкубації, що не містило
АТР, але містило 3 мМ Mg2+ та 1 мМ спермін, відновлення акумуляції іонів
Са, що спостерігалось за умов внесення у це середовище на 5 хв.
інкубації аліквоти розчину АТР, не досягало контрольного рівня (рис.8,
група стовпчиків В). Втім, якщо у такому середовищі містилось 7 мМ Mg2+
та 1 мМ сперміну, відбувалось практично повне (відносно контрольного
рівня) відновлення акумуляції іонів Са (рис.8, групи стовпчиків Г та А).
У той же час за інших рівних умов таке відновлення не спостерігалось у
випадку одночасної відсутності у середовищі передінкубації як АТР, так і
Mg2+ (рис.8, групи стовпчиків Д та Є).

Рис. 8. Вплив сперміну (1 мМ) та ЦсА (5 мкМ) на Mg2+,ATР-залежну
акумуляцію Са2+ в МХ клітин міометрія, за різних концентрацій іонів Mg
(3 та 7 мМ) (ізотопна техніка – 45Са2+) (M+m; n = 6).

Групи стовпчиків: А, В, Д – 3 мМ Mg2+; Б, Г, Є – 7 мМ Mg2+; В, Г –
середовище передінкубації (час — 5 хв.) містило Mg2+, але не містило АТР
(транспортний процес ініціювали аліквотою розчину АТР (3 мМ)); Д та Є —
середовище передінкубації (час — 5 хв.) не містило як Mg2+, так і АТР
одночасно (транспортний процес ініціювався внесенням аліквоти розчину,
яке містило АТР та Mg2+, кінцева концентрація цих реагентів – 3 мМ). У
випадку груп стовпчиків А та Б передінкубація не мала місця. У випадку
стовпчиків В-Є спермін та ЦсА були присутні безпосередньо у середовищі
передінкубації (час — 5 хв.) та у середовищі інкубації.

Отже, спермін у фізіологічних концентраціях (? 1 мМ) є ефективним
активатором Mg2+,ATР-залежної акумуляції іонів Са в МХ (але не в СР!)
міометрія. У дослідах, проведених із використанням ізотопної техніки
(45Са2+), нам вдалося ідентифікувати чутливе до дії ЦсА накопичення
іонів Са у МХ міометрія.

ІІІ. Вивчення дії сперміну на Са2+-залежну ЦсА-чутливу мітохондріальну
пору перехідної проникності.

Протягом останніх років у багатьох роботах було показано, що, за певних
умов, у мембранах МХ вікривається особлива пора – так звана
мітохондріальна пора перехідної проникності (МППП), яка є чутливою до
дії ЦсА, і крізь яку відбувається не тільки масивний викид Са2+, а й
вивільнення інших речовин, що може призводити до загибелі клітини
[Gottlieb R. et.al.,2002;Borutaite V. et.al.,2003; Halestrap А.,2004].
Відомо, що відкривання МППП супроводжується розсіюванням електричного
потенціалу на мембрані МХ та високоамплітудним набуханням органел [Kanno
M. et.al.,2002]. Наші дослідження були спрямовані на вивчення процесу
набухання ізольованих МХ міометрія із використанням методу
лазерної-кореляційної спектроскопії (ЛКС) (вимірювання гідродинамічного
діаметру МХ).

Як продемонстровано на рис.9, передінкубація МХ з 100 мкМ Са2+ та
Са2+-іонофором А23187 (1 мкМ) призводить до збільшення гідродинамічного
діаметру МХ міометрія майже на 30 % (n=5). За умов передінкубації
препарату МХ з 5 мкМ ЦсА наступне додавання Са2+ не призводило до
збільшення гідродинамічного діаметру МХ міометрія (рис.9). Отже, метод
ЛКС дає змогу тестувати чутливу до дії ЦсА зміну гідродинамічного
діаметру ізольованих МХ міометрія.

Рис. 9. Са2+-залежна зміна середнього гідродинамічного діаметру МХ
міометрія (метод ЛКС) (М ± m, n=5).

1 – контроль;

2 – передінкубація з Са2+ (100 мкМ) та Са2+ — іонофором А23187 (1 мкМ);

3 – передінкубація з ЦсА (5 мкМ) та внесення Са2+(100 мкМ) з А23187 (1
мкМ).

Рис. 10. Са2+-залежне набухання МХ міометрія (метод проточної
цитофлуориметрії, флуоресцентний зонд — акридин оранж 10-N-ноніл бромід
(NAO)) (М ± m, n=15).

1 – передінкубація без Са2+;

2 – передінкубація з Са2+ (100 мкМ), у присутності А23187 (1 мкМ);

3 – аламетицин (7,5 мкг/мл);

4 – ЦсА (5 мкМ) + АDP (40 мкМ) + Са2+ (100 мкМ) у присутності А23187 (1
мкМ).

Останнім часом для дослідження різних аспектів метаболізму МХ досить
широко використовується метод проточної цитофлуориметрії [Lecoeur H.
et.al.,2004]. Отримані експериментальні дані показали, що набухання МХ у
відповідь на додавання Са2+ (100 мкМ) у присутності А23187 (1 мкМ)
складало 86±4 % (n=15) у порівнянні з максимальним (за умов присутності
у середовищі інкубації аламетицину у концентрації 7,5 мкг/мл).
Передінкубація препарату МХ з 5 мкМ ЦсА разом з 40 мкМ АDP (максимальне
інгібування Са2+- чутливої МППП) [Hansson M.et.al.,2004]), в умовах
додавання Са2+ не призводило до набухання вищезазначених субклітинних
структур (рис.10).

Таким чином, з використанням методу проточної цитофлуориметрії було
встановлено, що іони Са спричиняють набухання МХ, якому можна запобігти
за рахунок передінкубації органел у присутності ЦсА (5мкМ) разом з АDP
(40 мкМ).

ЦсА був одним із перших лікарських засобів, який застосували для
інгібування МППП. Показано, що ЦсА може запобігати смерті клітини або
затримувати її та захищати мозок та серце від пошкоджень, спричинених
реперфузією та ішемією [Morin D. et.al.,2001]. Одначе не дивлячись на
очевидний потенціал ЦсА як антиішемічного засобу, відповідні
фармакокінетичні характеристики свідчать проти його клінічного
використання при ішемії. У клітині ідентифіковані щонайменше 8 різних
циклофілінів, роль яких у значній мірі не відома і які, вірогідно,
зв’яжуть більшу частину ЦсА. Тому реальну концентрацію ЦсА у МХ важко
передбачити, отже потрібно використовувати відносно високі його
концентрації [Morin D. et.al.,2001]. Таким чином, пошук
речовин-модуляторів пори перехідної проникності залишається актуальним
питанням. Однією з таких речовин, відповідно до літературних даних, може
бути природний поліамін спермін.

Рис.11. Концентраційна залежність впливу сперміну на Са2+-індуковане
набухання МХ міометрія (метод проточної цитофлуориметрії, флуоресцентний
зонд — акридин оранж 10-N-ноніл бромід (NAO)) (М±m, n=8).

МХ попередньо інкубували з сперміном у різних концентраціях, а потім
додавали Са2+ (100 мкМ) та А23187 (1 мкМ).

Було показано, що спермін у кількості 0,1 мкмоль/мг білка МХ пригнічує
чутливе до дії ЦсА набухання МХ міометрія. Підвищення кількості сперміну
до 10 мкмоль/мг білка МХ, навпаки, викликає 100 % набухання МХ (рис.11).
За цієї концентрації сперміну ефект був подібний до ефекту аламетицину
на набухання МХ; можливо це пов’язано з тим, що спермін у високих
концентраціях індукує відкривання МППП, та, як наслідок, набухання
матрикса МХ. Адже є літературні дані, які одержані на МХ печінки, мозку,
і які свідчать про те, що спермін у високих концентраціях індукує
вивільнення білків з мітохондріального матриксу (цитохром с,
проапоптичні білки Bax та Bid) за рахунок стимуляції його набухання
внаслідок відкривання пори перехідної проникності [Toninello A., et.
al.2004].

Отже, із використанням методів ЛКС та проточної цитофлуориметрії (із
залученням флуоресцентного зонду NAO) було продемонстровано явище
Са2+-індукованого набухання МХ міометрія, яке гальмувалося блокатором
МППП ЦсА та модулювалося поліаміном сперміном. Одержані результати дають
підставу стверджувати, що спермін є природним регулятором чутливої до
дії ЦсА (рис.10) пори неспецифічної проникності мембрани МХ клітин
міометрія. Можна припустити, що спермін у фізіологічних концентраціях (?
1 мМ) стимулює акумуляцію Са2+ в МХ клітин міометрія на фоні гальмування
ним неспецифічної проникності мітохондріальної мембрани. Фізіологічний
сенс такого “подвійного” ефекту сперміну на трансмембранний обмін іонів
Са у МХ може полягати у більш ефективному (в енергетичному відношенні)
забезпеченні накопичення Са2+ у матриксі на фоні блокування
неспецифічної проникності мітохондріальної мембрани.

Результати, що були одержані, мають значення для подальшого тлумачення
іонних та мембранних механізмів, задіяних у регуляції концентрації Са2+
в міоцитах матки, з’ясування ролі сперміну у забезпеченні електро- та
фармакомеханічного спряження в них.

Відповідно до одержаних даних перспективними, зокрема, є наступні
наукові питання, що потребують вирішення у майбутніх дослідженнях.

1. З чим пов’язані, при використанні сперміну у високих концентраціях,
його інгібуючий ефект на Mg2+,ATР-залежну акумуляцію іонів Са в МХ та
активуюча дія на чутливе до дії ЦсА набухання мітохондріального
матриксу?

2. Який механізм Mg2+-залежності спрямованості дії Цс А на акумуляцію
іонів Са в МХ?

3. Що відбувається з енергетикою МХ (ефективність спряження, мембранний
потенціал, дихання) у випадку дії на них сперміну та ЦсА?

ВИСНОВКИ

У біохімічних дослідженнях гладеньких м’язів, у тому числі міометрія,
актуальним є питання щодо вивчення кінетичних закономірностей
трансмембранного обміну Са2+ у мітохондріях, особливостей регуляції
цього процесу фізіологічно-активними сполуками, зокрема поліамінами. У
даній роботі із використанням методів ізотопної техніки (45Са2+),
лазерної кореляційної спектроскопії, проточної цитофлуориметрії та
біохімічної кінетики досліджували властивості Mg2+,ATР-залежної
Са2+-акумулюючої системи та Са2+-залежної пори перехідної проникності
мітохондрій клітин міометрія, вплив іонів Mg та поліаміну сперміну на
транспорт Са2+ в них.

На оброблених розчином дигітоніну (0,01%) клітинах міометрія показано,
що нечутлива до тапсигаргіну Mg2+,АТР-залежна акумуляція Са2+ в них є
результатом функціонування Са2+-уніпортера мітохондрій, оскільки вона
повністю пригнічується протонофором СССР та рутенієвим червоним.
Акумуляція Са2+ збільшується із зростанням концентрації Mg2+ (0-7 мМ):
константа активації КMg становить 2,8±0,4 мМ. Mg2+ є більш ефективним
регулятором акумуляції Са2+ в мітохондріях, ніж у саркоплазматичному
ретикулумі.

Вперше доведено, що залежність швидкості СССР-чутливої акумуляції Са2+ у
мітохондріях міометрія від концентрації поліаміну сперміну є двофазною.
Константи активації Ка та пригнічення Кі становлять 0,3 — 0,5 та 5,2 мМ
відповідно. Спермін дуже слабко впливав на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію
Са2+ у саркоплазматичному ретикулумі міометрія, яка пригнічувалась
тапсигаргіном, але не була чутлива до дії рутенієвого червоного.

Вперше розроблено та апробовано у дослідах кінетичну модель двофазного
впливу сперміну на швидкість Mg2+,АТР-залежного накопичення іонів Са в
мітохондріях міометрія. Модель ґрунтується на уявленні щодо існування
двох типів ділянок зворотного зв’язування сперміну з мітохондріальною
мембраною – високо- та низькоафінної.

Дія циклоспорину А – блокатора мітохондріальної пори перехідної
проникності – на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ у мітохондріях
міометрія залежить від концентрації Mg2+: стимулюючий ефект за 3 мМ,
інгібуючий — за 7 мМ (насичувальна концентрація щодо Са2+-уніпортера).

При збільшенні неспецифічної проникності мітохондріальної мембрани
(відсутність у середовищі передінкубації АТР чи АТР разом з Mg2+)
відбувається пригнічення Mg2+,АТР-залежного накопичення Са2+ в
мітохондріях за стандартних умов, як за відсутності, так і в
присутності, сперміну (1 мМ) або циклоспорину А (5 мкМ). В обох випадках
режиму передінкубації спрямованість дії сперміну на акумуляцію Са2+
зберігається: стимуляція за наявності в суспензії як 3, так і 7 мМ Mg2+.

Вперше продемонстровано, що, при насичувальних (щодо Са2+- уніпортера)
концентраціях іонів Mg (7 мМ), спермін у фізіологічній концентрації (1
мМ) відновлює акумуляцію Са2+ в деенергізованих мітохондріях клітин
міометрія до контрольного рівня.

У комплексних дослідах, що були проведені із використанням методів
лазерної кореляційної спектроскопії та проточної цитофлуориметрії,
вперше продемонстровано явище циклоспорин А — чутливого, Са2+-залежного
набухання мітохондрій міометрія, що свідчить про існування пори
перехідної проникності в них. Спермін у низьких концентраціях (0,1
мкмоль/мг білка) блокує відкривання пори, а у високих (10 мкмоль/мг
білка) – активує її.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Вадзюк О.Б., Борисова Л.А., Тітус О.В. (Пономаренко О.В.), Костерін С.О.
Чутлива до протонофору СССР зміна флуоресценції тетрацикліну за умов
моделювання Mg2+, АТР — залежного транспортування іонів Са в
мітохондріях гладенького м’яза. // Укр.біохім.журн. — 2003. — Т.75, № 4.
— С. 64- 74.

Бабич Л.Г., Борисова Л.А., Шлыков С.Г., Титус О.В. (Пономаренко О.В.),
Костерин С.А. Влияние ионов Мg и спермина на АТР-зависимый транспорт
Са2+ во внутриклеточных структурах миометрия. І.Сравнительное изучение
аккумуляции Са2+ в митохондриях и саркоплазматическом ретикулуме. //
Укр. биохим. журн. — 2004.- Т. 76, № 5. — C. 52-61.

Бабич Л.Г., Борисова Л.А., Шлыков С.Г., Титус О.В. (Пономаренко О.В.),
Костерин С.А. Влияние ионов Мg и спермина на АТР-зависимый транспорт
Са2+ во внутриклеточных структурах миометрия. II. Сравнительное изучение
действия спермина, ионов Мg и циклоспорина А на транспорт Са2+ в
митохондриях. // Укр. биохим. журн. — 2004.- Т. 76, № 6. — C. 55-63.

Костерін С.О., Бабіч Л.Г., Шликов С.Г., Тітус О.В. (Пономаренко О.В.),
Борисова Л.А. Кінетична модель впливу сперміну на Mg2+, ATP-залежний
транспорт іонів Са у мітохондріях гладенького м’яза. // Укр. біохім.
журн. — 2005.- Т. 77, № 3. — C. 76-86.

Пономаренко О.В., Бабіч Л.Г., Горчев В.Ф., Костерін С.О. Дослідження
Са2+-залежного набухання мітохондрій гладенького м’яза за допомогою
методу проточної цитометрії та вплив сперміну на цей процес. // Укр.
біохім. журн. — 2006.- Т. 78, № 6. — C.38-45.

Борисова Л.А., Шликов С.Г., Бабіч Л.Г., Тітус О.В. (Пономаренко О.В.)
Вплив сперміну та Mg2+ на акумуляцію Са2+ у внутрішньоклітинних пулах
міометрія. VIII Укр. біохім. з’їзд. Тези доповідей. // Укр. біохім.
журн. — 2002. –Т. 74, № 4а (додаток 1) — С.27.

Пономаренко О.В., Бабіч Л.Г., Шликов С.Г. Використання методу проточної
цитофлуориметрії з метою вивчення Са2+-індукованої пори мітохондрій
гладеньких м’язів. Конференція-конкурс молодих вчених,
Конференція-конкурс молодих учених, присвяченої 100-річчю з Дня
народження М.Ф. Гулого «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-
2005» Київ-2005 Тези доповідей С.41-42

Тітус О.В. (Пономаренко О.В.), Борисова Л.А., Чутлива до дії протонофору
акумуляція Са2+ у мітохондріях міометрія і вплив сперміну та іонів Mg на
цей процес. Конференція-конкурс молодих учених, присвяченої 100-річчю з
Дня народження Д. Л.Фердмана «Актуальні проблеми біохімії та
біотехнології- 2003» Київ-2003 Тези доповідей С.18

Тітус О.В. (Пономаренко О.В.), Борисова Л.А Трансмембранний обмін іонів
Са в мітохондріях міометрія та вплив сперміну на цей процес // 58-ма
науково-практична конф. cтуд. та мол. вчених Національного медичного
університету ім. О.О. Богомольця «Актуальні проблеми сучасної медицини»
МОЗУ. Київ -2003. Тези доп. С.17-18

Тітус О.В. (Пономаренко О.В.), Борисова Л.А. Взаємний ефект сперміну та
іонів Мg на систему акумуляції іонів Са мітохондріями міометрія // ІХ
Міжнародна конференція Інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне
застосування» м.Київ -2003 р. Тези доп. С.115.

Babich L.G., Shlykov S.G., Titus O.V. (Ponomarenko О.V.), Borisova L.A.,
Kosterin S.A. The concentration dependence of the spermine effect on the
Ca2+ accumulation in the myometrium mitochondria. 5th Parnas Conference
Molecular Mechanisms of cellular signaling. Ukr Biokhim Zh. 2005,- 77
-(2) — Р. 48.

Borisova L.A., Babich L.G., Shlykov S.G., Titus O.V. (Ponomarenko
О.V.), Kosterin S.A. Effect of spermin on Ca2+ transport in the
mitochondria of the rat myometrium // The Second International Symposium
» Smooth muscle Physiology and Biophysics» Neurophysiology. – 2003. V.
35, № 3/4. – Р. 374.

Borisova L. A., Babich L. G., Shlykov S. G., Titus O. V. (Ponomarenko
О.V.), Kosterin S. O. Spermine effects on the Ca2+ transport in
mitochondria of uterine smooth muscle cells. Journal of Thrombosis and
Haemostasis 2003; 1 Supplement 1 July: abstract number P.4.9-05.

Borisova L.A., Babich L.G., Shlykov S.G., Titus O.V. (Ponomarenko О.V.),
Kosterin S.A. Spermine effect on the Ca2+ transport in mitochondria of
uterine smooth muscle cells. 29th Meeting of the Federation on the
European Biochemical Societies, EJB 2004, 271, Supplement 1: 184.

Ponomarenko O.V., Babich L.G., Shlykov S.G. Comparative studying of
spermine and Mg ions effect on Ca2+ transport in the myometrium
mitochondria // IX Conference on Cell Biology Folia Histochemica et
Cytobiologica 2005, 43 (1) P. 23.

Пономаренко О.В., Бабіч Л.Г., Костерін С.О. Са2+-індуковане збільшення
неспецифічної проникності мембран мітохондрій міометрія щурів та її
регуляція сперміном // Тез. доп. ІХ Укр. біохім. з’їзду. — Матеріали ІХ
Укр. біох. з’їзду. — 2006. – Т. 1.- с.167.

АНОТАЦІЯ

Пономаренко О.В. Вплив сперміну на транспорт іонів Са в мітохондріях
міометрія. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна
НАН України, Київ, 2007.

Із використанням методів радіоактивної мітки (45Са2+),
лазерної-кореляційної спектроскопії, проточної цитофлуориметрії та
математичного моделювання одержані нові дані щодо властивостей
Са2+-акумулюючої системи та Са2+-залежної пори перехідної проникності
мітохондрій клітин міометрія, впливу іонів Mg та поліаміну сперміну на
транспорт Са2+ в них. Досліджена дія сперміну на Mg2+,АТР-залежну
акумуляцію Са2+ в мітохондріях: за малих концентрацій сперміну (?1 мМ)
спостерігається активація транспортного процесу, а за великих (1-10 мМ)
– його інгібування. На Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в
саркоплазматичному ретикулумі міоцитів матки спермін (до 10 мМ)
практично не впливає. Розроблено кінетичну модель біфазного впливу
сперміну на початкову швидкість акумуляції Са2+ в мітохондріях.
Встановлено, що спрямованість дії циклоспорину А на Mg2+,АТР-залежну
акумуляцію іонів Са в мітохондріях міометрія (стимуляція чи інгібування)
залежить від концентрації іонів Mg. Доведено, що у разі збільшення
неспецифічної проникності мембрани мітохондрій, але за умов використання
сперміну (1 мМ) у присутності Mg2+ у насичувальних (щодо функціонування
Са2+-уніпортера) концентраціях (7 мМ), спостерігається повне відновлення
рівня Mg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ у цих субклітинних структурах.
Із застосуванням методів лазерної кореляційної спектроскопії та
проточної цитофлуориметрії продемонстровано існування Са2+- залежної
пори перехідної проникності в мітохондріях клітин міометрія., яка
гальмується циклоспорином А та регулюється сперміном.

Ключові слова: транспорт Са2+, мітохондрії, неспецифічна пора перехідної
проникності, спермін, циклоспорин А, міометрій, гладенькі м’язи.

АННОТАЦИЯ

Пономаренко О.В. Влияние спермина на транспорт ионов Са в митохондриях
миометрия. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина
НАН Украины, Киев, 2007.

С использованием методов радиоактивной метки (45Са2+),
лазерной-корреляционной спектроскопии, проточной цитофлуориметрии и
математического моделирования получены новые данные свойств
Са2+-аккумулирующей системы и Са2+-зависимой поры неспецифической
проницаемости митохондрий гладких мышц матки, влияния ионов Mg и
полиамина спермина на транспорт Са2+ в этих субклеточных структурах.
Продемонстрировано, что действие спермина на Mg2+,АТР-зависимую
аккумуляцию Са2+ в митохондриях миометрия есть комплексным: при малых
концентрациях спермина (?1 мМ) наблюдается активация транспортного
процесса, а при больших (1-10 мМ) – его ингибирование. При этом спермин
(0-10 мМ) практически не влияет на Mg2+,АТР-зависимую аккумуляцию Са2+ в
саркоплазматическом ретикулуме миометрия. Разработана кинетическая
модель бифазного влияния спермина на начальную скорость аккумуляции
ионов Са в митохондриях. Установлено, что направленность действия
циклоспорина А на Mg2+,АТР-зависимую аккумуляцию ионов Са в митохондриях
миометрия (стимуляция или ингибирование) зависит от концентрации ионов
Mg. Доказано, что в случае увеличения неспецифической проницаемости
мембраны митохондрий, но в условиях использования спермина (1 мМ) в
присутствии ионов Mg в насыщающих (относительно функционирования
Са2+-унипортера) концентрациях (7 мМ), наблюдается полное восстановления
уровня Mg2+,АТР-зависимой аккумуляции Са2+ в этих субклеточных
структурах. С использованием методов лазерной корреляционной
спектроскопии и проточной цитофлуориметрии разработаны експериментальные
подходы для идентификации и изучения свойств Са2+-зависимой поры
переходной проницаемости в митохондриях миометрия. Показано
существование этой поры в митохондриях миометрия, которая ингибируется
циклоспорином А и регулируется спермином.

Ключевые слова: транспорт Са2+, митохондрии, неспецифическая пора
переходной проницаемости, спермин, циклоспорин А, миометрий, гладкие
мышцы.

SUMMARY

Ponomarenko O.V. Effect of spermin on Ca2+ transport in the mitochondria
of myometrium. – Manuscript.

The PhD thesis in biology by speciality 03.00.04– biochemistry.
O.V.Palladin Institute of Вiochemistry of the National Academy of
Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

In the experiments, with the use of methods of a radioactive label
(45Ca2+), HYPERLINK
«http://www.multitran.ru/c/m.exe?t=3047626_1_2&ifp=1»
laser correlation spectroscopy , flow cytometry and mathematical design
was gotten new information of properties of Ca2+-transporting system and
mitochondrial permeability transition pore of smooth muscles of uterus,
influence of Mg ions and spermine on Са2+ transport in these subcellular
structures. It is shown, that action of spermin on Mg2+,ATP-dependent
Ca2+ transport in mitochondria of myometrium is complex: spermin at the
small concentrations (?1 мМ) — stimulates and at large (1-10 mM) – its
inhibition. Thus spermine (0-10 mM) practically does not influence on
Mg2+,ATP-dependent Ca2+ accumulation in sarcoplasmic reticulum of
myometrium. The kinetic model of the biphasic influencing of spermin is
developed on initial speed of Ca2+ accumulation in mitochondria. It is
set that orientation of action of cyclosporine A on Mg2+,ATP-dependent
Ca2+ accumulation in mitochondria of myometrium (stimulation or
inhibition) depends on the concentration of Mg ions. It is proved that
in the case of increasing of unspecific permeability of membrane of
mitochondria, but using spermine (1 mM) in presence of Mg ions in
HYPERLINK «http://www.multitran.ru/c/m.exe?t=2605894_1_2» saturating 
(in relation to functioning of Са2+-uniporter) concentrations (7 mM),
there is complete renewals of level of Mg2+,ATP-dependent Ca2+ transport
in mitochondria. Using methods of laser correlation spectroscopy and
flow cytometry experimental approaches are developed for identification
and study of properties of Са2+-dependent mitochondrial permeability
transition pore in myometrium. Existence of mitochondrial permeability
transition pore in myometrium is shown, which is inhibited by
cyclosporine A and regulated by spermin.

Key words: Са2+ transport, mitochondria, mitochondrial permeability
transition pore, spermine, cyclosporine A, myometrium, smooth muscles.

PAGE 16

Похожие записи