.

Вплив різних методів інактивації токсинів сальмонел на продукцію цитокінів і циклічних нуклеотидів моноцитами, нейтрофілами та ентероцитами in vitro (

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2475
Скачать документ

Міністерство охорони здоров’я України

Луганський державний медичний університет

Шабельник Олег Іванович

УДК 579:[612. 336.3+612.112.95

Вплив різних методів інактивації токсинів сальмонел на продукцію
цитокінів і циклічних нуклеотидів моноцитами, нейтрофілами та
ентероцитами in vitro

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Луганськ-2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ
України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки
і техніки України Гайдаш Ігор Славович, Луганський державний медичний
університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський
державний медичний університет, завідувач кафедри клінічної імунології,
алергології та ендокринології

доктор медичних наук, професор Абрамов Андрій Володимирович, Запорізький
державний медичний університет, професор кафедри патологічної фізіології

Провідна установа: Кафедра загальної та клінічної патологічної
фізіології ім. В.В. Підвисоцького, Одеський державний медичний
університет МОЗ України, м. Одеса

Захист відбудеться 07 жовтня 2005р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 29.622.01 при Луганському державному
медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного
медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1)

Автореферат розісланий 02.09. 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько
В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сальмонельоз – це гостре інфекційне захворювання, яке
викликають різні серотипи бактерій роду Salmonella. Захворюваність на
сальмонельоз в Україні в 2004 р. складала 17,52 випадків на 100 000
населення (Сенченко В.С., 2004). Основними джерелами збудників
сальмонельозу є синантропні гризуни, велика рогата худоба, свині, кури,
індики і водоплавна птиця (Beach J.C. et al., 2002; Dargatz D.A. et al.,
2003). Сальмонели викликають в домашньої птиці гострі захворювання, які
особливо тяжко протікають в пташенят віком до 1 місяця і призводять
нерідко до падежу, який сягає 80 %. У дорослої птиці інфекція часто
протікає в формі безсимптомного носійства, яке триває місяцями (Сидорова
Л.В. та співавт., 1992). Встановлено, що сальмонели, які викликають
захворювання у тварин і птиці, нерідко є збудниками окремих захворювань
у людей і навіть причиною спалахів. При цьому фактором передачі
збудників сальмонельозу є переважно інфіковані м’ясо і яйця (Baron F. et
al., 2004).

Патогенез сальмонельозу обумовлений рядом факторів, результат взаємодії
яких призводить до розвитку того або іншого ступеня вираження
інфекційного процесу. Ці фактори, з одного боку, обумовлені збудником
(патогенністю та антигенною чужорідністю для макроорганізму сальмонел та
їх токсинів), з іншого боку – макроорганізмом (станом гомеостазу даного
конкретного індивідуума і, в першу чергу, імунної системи) (Бунін К.В.,
1980). Сальмонели виділяють 2 види токсинів: ендотоксин і ентеротоксин
(ЕТ); ендотоксин входить до складу клітинної стінки бактерій і
виділяється в навколишнє середовище при їх дезінтеграції і лізисі.
Структурним компонентом ендотоксину є ліпополісахарид (ЛПС), первинною
мішенню в механізмі дії якого є моноцити і тканинні макрофаги, які
виробляють медіатори (інтерлейкіни (ІЛ), фактор некрозу пухлини (ФНП),
простагландини (ПГ), лейкотрієни (ЛТ) та ін.), відповідальні за розвиток
ендотоксичних реакцій (Iankov L. et al., 2004). Зазначені медіатори
викликають лихоманку, ранню гіпотонію, інфекційно-токсичний шок,
агрегацію тромбоцитів, скорочення гладенької мускулатури; активують
аденілатциклазу, що призводить до посиленої секреції води та
електролітів ентероцитами та до розвитку діареї (Андрейчин М.А., Ивахив
О.Л., 1998).

Сальмонельозний ЕТ є екзотоксином, який продукується бактеріями в
навколишнє середовище в процесі життєдіяльності. Механізм дії ЕТ
зводиться до стимуляції через систему ПГ активності аденілатциклази
ентероцитів і власної платівки слизової оболонки тонкої кишки, що
призводить до накопичення циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) і, як
наслідок, до розвитку діареї (Камзолкіна Н.Б., 1983). Дотепер секреторна
функція моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів під дією сальмонельозних
токсинів вивчена недостатньо, що потребує більш глибокого дослідження
цієї проблеми (Gabriel P. et al., 2002).

Сальмонели здатні зберігатись в навколишньому середовищі і протистояти
впливу багатьох фізичних і хімічних факторів. В різних харчових
продуктах сальмонели можуть залишатись життєздатними від декількох днів
до місяців, а при сприятливих умовах – і розмножуватись. Накопичення в
сировині, харчових продуктах й обладнанні вегетативних форм сальмонел та
їх токсинів обумовлює потенційну загрозу виникнення окремих випадків і
спалахів сальмонельозу в людей (Logue C.M. et al., 2003).

Встановлення ступеня резистентності сальмонел до впливу фізичних і
хімічних факторів має велике практичне значення, насамперед, для
наукового обгрунтування заходів, спрямованих на переривання шляхів
передачі збудника. При виробництві м’ясних напівфабрикатів важливою
складовою виробничого процесу є дезинфекція і санітарна обробка
сировини, готових продуктів та обладнання. Особливу актуальність подає
використання бактерицидів для зменшення або знищення бактеріального
обсіменіння на тушах тварин і птиць. Дослідження останніх років
сконцентровані на використанні певних речовин, таких, як окислений
хлористий натрій, перекис водню, тринатрієвий фосфат і цетилпіридиніум
хлорид, а також на застосуванні активованого електрохімічного розчину.
Кожний з них має власний механізм впливу на мікрофлору, тільки йому
властиву ефективність і відповідну перевагу (Botteldoorn N. et al.,
2004). Можливими засобами дезинфекції та інактивації токсинів є слабкі
розчини органічних кислот, гідроперекису (ГП), етилового спирту та їх
суміші. Проте в науковій літературі даних про їх бактеріцидний та
антитоксичний потенціал немає.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом
наукової роботи кафедри патологічної фізіології Луганського державного
медичного університету № 0198U005713 “Запалення як наслідок дії
бактерій”.

Мета роботи: Розробити патогенетично обгрунтовані способи інактивації
токсинів сальмонел на основі вивчення продукції медіаторів та циклічних
нуклеотидів моноцитами, нейтрофілами і ентероцитами in vitro.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

Вивчити вплив сальмонельозних ЛПС та ентеротоксину на секрецію
моноцитами, нейтрофілами та ентероцитами медіаторів (ІЛ-1?, -6, -8,
ФНО-?, ПГЕ2 і ЛТС4).

Дослідити вплив сальмонельозних токсинів на синтез циклічних нуклеотидов
в моноцитах, нейтрофілах та ентероцитах.

Визначити ефективність інактивації ЛПС і ентеротоксину сальмонел
розчинами 1 % оцтової кислоти, 3 % гідроперекису та їх сумішшю на
підставі вивчення секреції цитокінів моноцитами, нейтрофілами та
ентероцитами.

Визначити ефективність інактивації сальмонельозних токсинів 1 % оцтовою
кислотою, 3 % гідроперекисом та їх сумішшю на основі дослідження
циклічних нуклеотидов в моноцитах, нейтрофілах та ентероцитах.

Провести порівняльний аналіз ефективності інактивації сальмонельозних
токсинів розчинами 1 % оцтової кислоти, 3 % гідроперекису та їх сумішшю.

Об’єкт дослідження: моноцити і нейтрофіли периферійної крові людини,
ентероцити кишечника курей in vitro.

Предмет дослідження: (1) вплив ЛПС і ентеротоксину сальмонел in vitro на
секреторну функцію і стан внутрішньоклітинної системи циклічних
нуклеотидов моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів; (2) вплив розчинів
оцтової кислоти, гідроперекису та їх суміші на токсичну активність ЛПС і
ентеротоксину.

Методи дослідження: бактеріологічні (виділення ЛПС, вивчення
бактерицидної дії розчинів оцтової кислоти, перекису водню та їх
суміші), біологічні (встановлення половинної летальної дози ЛПС й ЕТ),
імунологічні (виділення моноцитів і нейтрофілів з периферійної крові,
визначення вмісту медіаторів і циклічних нуклеотидів).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлена здатність
сальмонельозного ентеротоксину стимулювати секрецію моноцитами і
нейтрофілами ІЛ-1?, -6, -8, ФНП-?, ПГЕ2 і ЛТС4 і впливати на
внутрішньоклітинний вміст циклічних нуклеотидів (викликати переважне
збільшення цАМФ). Встановлена здатність ентероцитів секретувати ІЛ-1?,
-6, -8, ФНП-?. Секреція медіаторів ентероцитами посилюється під впливом
сальмонельозних ЛПС та ентеротоксину. Встановлений дозозалежний вплив
токсинів сальмонел на секреторну функцію і внутрішньоклітинну систему
циклічних нуклеотидов ентероцитів, моноцитів і нейтрофілів. Встановлена
переважна чутливість моноцитів до ЛПС, а ентероцитів – до ентеротоксину.
Вперше показано, що розчини 1 % оцтової кислоти (ОК), 3 % ГП та їх суміш
викликають дозозалежну інактивацію сальмонельозних токсинів, що
супроводжується зменшенням або повною втратою їх здатності стимулювати
секреторну функцію моноцитів, нейтрофілів та ентероцитів; найбільш повну
інактивацію ЛПС й ЕТ викликає суміш розчинів оцтової кислоти і
гідроперекису.

Практичне значення отриманих результатів. Дано патогенетичне
обгрунтування використання суміші розчинів 1 % оцтової кислоти і 3 %
гідроперекису для інактивації токсинів сальмонел в курячому м’ясі та
м’ясопродуктах. Отримані дані використовуються в навчальному процесі
двох медичних ВНЗ України: Луганського і Донецького ім. М. Горького
державних медичних університетів, що підтверджено відповідними актами
впровадження.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, планування
експерименту були здійснені науковим керівником роботи. Автором
самостійно проведений: інформаційний пошук, аналіз літератури, виконана
експериментальна частина роботи (виділення сальмонел, імунологічні
дослідження), написані всі розділи дисертації та автореферат.

Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації були викладені та
обговорені на: наукової конференції “Четверті читання ім. В.В.
Підвисоцького” (Одеса, 26-27 травня 2005 р.), а також на засіданнях
Луганського обласного товариства патофізіологів в 2001-2005 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 наукові статті в
фахових часописах та 1 тези.

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 121 сторінці
машинописного тексту (комп’ютерний набір) та складається з вступу,
огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу одержаних
результатів, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 54
таблицями (загальний обсяг – 6 сторінок), 2 малюнками. Список літератури
включає 122 джерела вітчизняних та іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Об’єктом дослідження служили 1109 культур
моноцитів, 1145 культур нейтрофілів периферійної крові здорових донорів,
а також 1090 культур ентероцитів тонкої кишки курей. Культури моноцитів
і нейтрофілів були виділені з периферійної крові 35 дорослих практично
здорових чоловіків і 45 жінок віком 30-45 років за допомогою
центрифугування на градієнті щільності 1,077 і 1,093 фіколу-верографіну.
Суспензію ентероцитів одержували з кишечників здорових курей, забитих
перед дослідом.

ЛПС одержували з культур Salmonella gallinarum-pullorum, S. typhimurium,
S. enteritidis водно-феноловою екстракцією. Ідентифікацію сальмонел
проводили з використанням діагностичних наборів “Ентеротест-24” (АТ
“Лахема”, Чехія). Для визначення концентрацій токсинів, призначених для
стимуляції клітин, було проведено встановлення ЛД50 ЛПС (2 мкг/мл) та
ЛД50 ЕТ (1,5 мл супернатанту).

З метою вивчення ефективності інактивації ЛПС і ЕТ були використані
наступні речовини: 1 % розчин ОК; 3 % розчин ГП; суміш розчинів 1,0 % ОК
і 3 % ГП. Бактеріцидну дію кожної концентрації ОК, ГП та їх суміші
визначали на живих культурах S. gallinarum-pullorum.

Визначення ІЛ-1?, -6, -8 ? ФНП-? проводили в супернатантах моноцитів,
нейтрофілів та ентероцитів (концентрація 6 lg клітин/мл) з допомогою
комерційних наборів ELISA (Medgenix Diagnostics, Бельгія). Визначення
ПГЕ2, ЛТС4, цАМФ і цГМФ в клітинах-мішенях проводили радіоімунним
методом з використанням тест-систем (Amersham, Велика Британія).
Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної
статистики на ЕОМ.

Результати дослідження та їх аналіз. Вплив ЛПС та ЕТ на секреторну
активність моноцитів. Моноцити in vitro без дії на них ЛПС продукували
певні кількості медіаторів, які були прийняті в якості референтної
норми. Додавання до моноцитів ЛПС викликало посилення секреції
зазначених монокінів: при використанні дози ЛПС 0,001 мкг/л кратність
збільшення секреції ІЛ-1? порівняно з референтною нормою склала 1,7
рази, ІЛ-6 – 1,5 рази, ІЛ-8 – 1,8 рази, ФНП-?, ПГЕ2 і ЛТС4 – 1,4, 1,6 і
1,35 раз відповідно (р0,05), внаслідок чого коефіцієнт цАМФ/цГМФ мав
чітко виражену спрямованість до збільшення.

Аналогічна динаміка змін цАМФ під впливом ЛПС зареєстрована і в
нейтрофілах. При дозі ЛПС 2,0 мкг/л вміст цАМФ був в 1,72 рази вищим
норми і в 1,19 рази нижчим порівняно з аналогічним показником для
моноцитів (р0,05 в усіх випадках).

Навпаки, 1 % розчин ОК істотно знижував токсичність ЕТ, що виражалось у
вірогідному зменшенні секреторної активності моноцитів відносно групи
порівняння й у відсутності розходжень порівняно з показниками норми (при
розчиненні 1 ЛД50 ЕТ 1:100 і 1:10). Контакт інактивованого ЕТ в
розчиненні 1:1 з моноцитами супроводжувався зниженням секреції ІЛ-1? в
6,9 разів (порівняно з ефектом нативного ЕТ), ІЛ-6 – в 6,0 разів, ІЛ-8 –
в 5,7 разів, ФНП-? – в 8,1 разів, ПГЕ2 і ЛТС4 – в 6,3 і 3,9 разів
відповідно.

Секреція медіаторів нейтрофілами під дією інактивованого 1 % розчином ОК
ЛПС порівняно з нативним ЛПС вірогідних відмінностей не мала навіть при
використанні останнього в концентрації 0,001 мкг/л. ЕТ, оброблений 1 %
розчином ОК, втрачав здатність стимулювати секреторну функцію
нейтрофілів, найбільша інактивація була відзначена при використанні ЕТ в
розчиненні 1:100 – секреторна активність нейтрофілів не відрізнялась від
такої в групі референтної норми. При використанні ЕТ, розведеного 1:10 і
обробленого 1 % розчином ОК, кратність зниження секреції ІЛ-1? та -6
була в 1,5 рази нижчою такої для клітин, стимульованих нативним ЕТ,
секреція ІЛ-8 і ФНП-? знижувалась в 1,8 раз, ПГЕ2 і ЛТС4 – в 1,55 і 2,8
раз відповідно (р?0,05 порівняно з групою зіставлення в усіх випадках).
ЕТ в розчиненні 1:1, оброблений розчином ОК, частково зберігав здатність
стимулювати секреторну функцію нейтрофілів.

:

@

B

D

F

H

J

???J

L

j

l

n

?

?

68^E

@

@

@

@

ph

$

&

^

`

AE

E

?????ся незалежно від його концентрації. Про це свідчила відсутність
вірогідних відмінностей між показниками секреції медіаторів
ентероцитами, стимульованими нативним та інактивованим ЛПС (р>0,05 у
всіх серіях). ЕТ, оброблений 1 % розчином ОК, не стимулював секрецію
ентероцитів. Ефект 1 % розчину ОК був тим вищим, чим нижчою була
концентрація ЕТ, найбільш повна інактивація наступала при дії на ЕТ в
розведенні 1:100.

Вплив ЛПС, обробленого 1 % ОК, на вміст ЦН в клітинах-мішенях не
відрізнявся від такого при використанні нативного ЛПС у всіх
концентраціях. Це, можливо, пов’язано з тим, що 1 % розчин ОК не
інактивував ЛПС, внаслідок чого останній впливав на клітини-мішені
аналогічно нативному ЛПС.

ЕТ, інактивований 1 % ОК, частково втрачав здатність викликати зміни
вмісту ЦН в клітинах-мішенях: при дії його в розведенні 1:100 на
моноцити вірогідних змін вмісту цАМФ і цГМФ порівняно з референтною
нормою не виявлено. В межах нормативних значень залишався і коефіцієнт
цАМФ/цГМФ, але абсолютний показник цАМФ був вірогідно нижчим, ніж при
використанні нативного ЕТ. Показники цГМФ і цАМФ/цГМФ в групах
порівняння вірогідних відмінностей не мали.

При використанні інактивованого ЕТ в розчиненні 1:10 вміст ЦН і
співвідношення між ними також вірогідно не відрізнялись від таких
порівняно з нормою. Однак показники вмісту ЦН вірогідно перевищили
нормативні (р0,05), ІЛ-6 – в 1,17 рази (р?0,05), ІЛ-8 – в
1,4 рази (р?0,05), ФНП-? – в 1,3 рази (р?0,05), ПГЕ2 і ЛТС4 – в 1,2 і
1,1 рази відповідно (р?0,05 та р>0,05).

Повністю інактивовані ЛПС і ЕТ не викликали змін вмісту ЦН в моноцитах,
нейтрофілах й ентероцитах. Навпаки, неповна інактивація токсинів
супроводжувалась зсувами в системі ЦН клітин, проте ці зсуви були менш
значними, ніж у клітинах, підданих дії нативних ЛПС і ЕТ. Дія на клітини
інактивованим ЛПС в дозі 0,001 мкг/л не супроводжувалась значними
змінами вмісту цАМФ, цГМФ і співвідношення між ними порівняно з
контролем. Аналогічна ситуація мала місце і при дії на моноцити і
нейтрофіли інактивованим ЛПС в концентрації 0,1 мкг/л. В культурах
ентероцитів подібна дія супроводжувалась достовірним збільшенням вмісту
цАМФ при тенденції до збільшення цГМФ, внаслідок чого коефіцієнт
цАМФ/цГМФ в ентероцитах вірогідно не відрізнявся від показника
референтної норми. При дії на ЛПС в дозі 1,0 мкг/л 3 % розчином ГП
повної інактивації ЛПС не наступало, що супроводжувалось збільшенням
рівнів ЦН і співвідношення між ними у клітинах-мішенях. В моноцитах
рівень цАМФ і показник цАМФ/цГМФ були вищими в 1,44 і 1,34 разів
аналогічних показників контролю (p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020