.

Вплив режимів кріоконсервування шкіри на склад водно–сольових екстрактів та їх ефективність при різних ураженнях шкіри (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2830
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Шкодовська Наталія Юріївна

УДК: 615.361.77.014.41.451.2:616.5

Вплив режимів кріоконсервування шкіри на склад водно–сольових екстрактів
та їх ефективність при різних ураженнях шкіри

03.00.19- кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: Доктор медичних наук, Заслужений діяч науки і техніки
України, професор, завідувач відділу експериментальної кріомедицини,
Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН Укрїни, м. Харків

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, заступник директора з наукової
роботи Малова Наталія Георгіївна, Інститут проблем ендокринноі патології
ім. В.Я. Данилевського АМН України, м. Харків

Доктор біологічних наук, професор, завідуюча лабораторією
морфології сполучної тканини Дєдух Нінель Василівна, Інститут патології
хребта та суглобів ім. проф. М.І Сітенка АМН України, м. Харків

Провідна установа: Харківський національний університет
ім. В.Н. Каразіна, Міністерство освіти і науки

Захист відбудеться “_18___” __квітня___________2006 р. о 13-30____
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул.
Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул.
Переяславська, 23)

Автореферат розісланий “_16___” __березня_______________ 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор

член – кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема лікування ран, зокрема опікових і холодових,
була і залишається однією з актуальних в сучасній медицині. Разом з
традиційними методами лікування було запропоновано методи клітинної
терапії, направлені на оптимізацію репараційних процесів.

У клінічній медицині клітинна терапія займає все більш міцні позиції.
Особливістю клітинної терапії є надходження в організм пацієнта
інформації від живих полівалентних або спеціалізованих клітин і їх
елементів [Белоцький С., Бреагман Р., Григор’єва Т.Г., Грищенко В.І.,
Сандомирський Б.П., 2000] .

В зв’язку з цим вважалося, що чим вища життєздатність матеріалу, тим
більш ефективна і результативна клітинна терапія. Даний напрям
реалізується шляхом заміщення і доповнення природних функцій тканин і
клітин хворого, відновлення нейрогуморальних систем і зв’язків, а також
імунокорекції. Разом з тим, є дані, що біологічну активність проявляють
не тільки живі тканини, але і їх гомогенати і екстракти з них.

На даний час в багатьох країнах відбувається бурхливий розвиток
біотехнологій, присвячених одержанню біологічно активних сполук,
зокрема, створенню препаратів на основі фетальної сировини, а також
ксеноорганів: селезінки, печінки, наднирників і т.д [Гальченко С.Є.,
Сандомирський Б.П. та ін., 2003]. Це пов’язано із збільшенням останніми
роками інтересу до різноманіття і можливостей біологічно активних
речовин, які можна отримати з такого матеріалу. Одним з напрямів в
клітинній терапії травм шкіри може бути використовування екстрактів
нормальної шкіри, які містять біологічно активні речовини. Ці речовини
можуть проявляти регуляторний вплив як на епітеліальну, так і на
сполучну тканини.

Не дивлячись на свою відносно просту будову, шкіра виконує численні,
важливі для організму функції. Проте велике функціональне навантаження,
несприятлива дія факторів зовнішнього середовища можуть приводити до
різного роду травматизації шкіри, а також до розвитку в ній патологічних
процесів. Найпоширенішими травмами, що приводять до пошкодження шкірного
покриву, є термічні і холодові. Сильні подразники, викликаючи порушення
цілісності епідермісу і дерми на певній ділянці шкіри, індукують
природні захисні реакції, що протікають з явищами запалення і направлені
на видалення тканин, що омертвіли, та подальшу заміну їх новоутвореними
клітинами.

При запаленні, що супроводжується загоєнням опіків і відморожень одними
з перших реагують судини, лейкоцити, макрофаги та епідермальні клітини
[Clarke D., 1998]. Останні швидко мігрують від країв пошкодженої шкіри і
заповнюють рану. Цей утворений епідермальний шар товщає, в кератиноцитах
активуються протеази, які виводять фібрин і інші білки, тим самим
готують умови для відновлення дерми [Castagnoli C., 1999, Kuyven C.R.,
2003]. У зв’язку з цим є передумови, які дозволяють припустити, що
екстракти, одержувані з нормальної кріоконсервованої шкіри, можуть
містити біологічно активні речовини, необхідні для регуляції процесів
загоєння та ефективнішої терапії патологічних процесів. Можна
припустити, що екстракти шкіри новонароджених поросят можуть проявляти
позитивний вплив при різних ураженнях і травмах шкіри, а також на
репараційно-регенераційні процеси.

Кріобіологічні технології дозволяють одержувати біологічно активний
матеріал, що має саме той ступінь деструктивних змін, який необхідний і
достатній для максимального виходу потрібних нам біологічно активних
речовин з тканини при екстрагуванні [Гальченко С.Є., 2004].

Проте в даний час відсутні відомості про вплив режимів кріоконсервування
шкіри на склад одержуваних екстрактів. Не вивчено також вплив біологічно
активних речовин, які одержані із використанням режимів
заморожування–відігріву зі шкіри, на динаміку запального і
регенераційного процесів в пошкодженій шкірі.

З’вязок роботи з науковими програмами, планами, темами, Дисертація
виконана відповідно до плану науково – дослідних робіт по темі
„Дослідження впливу і механізму дії кріоконсервованих тканинних
препаратів з ксеногенних органів на перебіг ряду патологічних процесів в
організмі” Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
(шифр 2.2.6.05 номер державної реєстрації 0102U002027).

Мета і задачі дослідження. Отримання водно–сольового екстракту з
кріоконсервованих фрагментів шкіри новонароджених поросят з високим
вмістом речовин пептидної природи, визначення впливу екстракту на
репараційні процеси в експериментальних опікових і холодових ранах.

Відповідно до поставленої мети передбачалось:

Вивчити вплив режимів і умов кріоконсервування на якісний і кількісний
склад екстракту шкіри новонароджених поросят (ЕШНП).

Визначити вплив ЕШНП на процеси репарації в експериментальних опікових
ранах.

Визначити вплив ЕШНП на процеси репарації після кріопошкодження шкіри.

Дослідити цитологічні та бактеріологічні характеристики ран при
використовуванні ЕШНП.

Об’єкт дослідження. Режими кріоконсервування шкіри, водно–сольові
екстракти, призначені для парентерального уведення при лікуванні
експериментальних опікових і холодових пошкоджень.

Предмет дослідження. Кріоконсервована шкіра новонароджених поросят,
водно–сольовий екстракт шкіри новонароджених поросят.

Методи дослідження. Реалізація поставлених задач розв’язувалась за
допомогою методів кріоконсервування фрагментів шкіри, отримання
водно–сольових екстрактів, моделювання опікових і холодових ран, а також
хроматографічного, планіметричного, мікробіологічного, гістологічного і
цитологічного методів.

Наукова новизна одержаних результатів. Основні результати роботи
одержано вперше. Проведені дослідження дозволили визначити вплив різних
режимів кріоконсервування фрагментів шкіри новонароджених поросят на
якісний і кількісний склад отриманих з них водно-сольових екстрактів.
Встановлено, що водно–сольові екстракти містять низькомолекулярні
пептиди і їх концентрація достовірно більша в екстракті, який отримано з
фрагментів шкіри після кріоконсервування в присутності 10%-го ПЕО-1500 з
повільними швидкостями охолодження в порівнянні з екстрактом, отриманим
з нативних фрагментів шкіри.

Пказано, що отримані екстракти стимулюють репараційні процеси в опікових
і холодових ранах: внаслідок оптимізації процесу загоєння ран
відбувається відновлення структури шкіри, а також загоєння ран при
мінімальному розвитку грануляційної тканини.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження
показують перспективність використовування водно–сольових екстрактів при
розробці препаратів для лікування ран різного генезу. Дані обставини
дозволяють використовувати запропонований метод одержання водно–сольових
екстрактів кріоконсервованої шкіри в практиці лікування опіків і
відморожень з мінімальним розвитком грануляційної тканини.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено:
патентно–інформаційний пошук, підготовку аналітичного огляду літератури,
експериментальні дослідження на тваринах, статистичну обробку і аналіз
експериментальних даних. Розроблено основні положення і висновки
дисертації. В наукових працях, виконаних у співавторстві, здобувачу
належить планування дослідницької роботи, організація експерименту та
участь в його реалізації. Співавторами робіт, опублікованих за темою
дисертації, є: Сандомирський Б.П. – консультації щодо вибору методик
досліджень в роботах [1, 2, 3, 5. 6, 7, 8, 9], Гальченко С.Є.-
консультації з методів дослідження біологічної дії екстракту шкіри
новонароджених поросят [1, 2, 3, 5. 6, 7, 8, 9], Мамонтова А.В. –
допомога у підготовці експериментів з тваринами [5], Висеканцев І.П. –
консультації з проведення мікробіологічних досліджень [9], Гойденко
Н.І., – консультація та допомога у виготовленні гістологічних препаратів
[8].

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на
міжнародної конференції “Cryobiomol, Low temperature biology” Коімбра,
Португалія 14-18 вересня 2003 р., конференції „Ліки–людині,” Харків,
2004 р., на щорічній конференції молодих вчених “Холод в біології і
медицині”, ІПКіК НАН України, Харків 2003,2004,2005р., на Х Конгресі
Світової Федерації Українських Лікарських Товариств, м. Чернівці, 2004
р, на VIII з’їзді ВУЛТ (Всеукраїнського лікарського товариства),
Івано–Франківськ, 21-22 квітня 2005 р, на конференції з міжнародною
участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини.
Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії
низьких температур”, Харків 22-24 листопада 2005р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 друкованих робіт, з
них 3–статті у фахових наукових журналах, 1 патент на винахід, 5 тез
доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 157 сторінках
друкарського тексту і включає вступ, огляд літератури, матеріали і
методи досліджень, результати власних досліджень і їх обговорення,
аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки і список
літератури. Основній текст дисертації викладено на 130 сторінках. Текст
ілюстровано 53 рисунками і 19 таблицями. Бібліографія включає 193
найменування на 25 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи експериментальних досліджень

Дослідження проводилися в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України у відділі експериментальної кріомедицини. Екстракт
одержували, інкубуючи здрібнені фрагменти шкіри у фізіологічному розчині
(рН – 7,4) у співвідношенні 1:10 при 20-23°С протягом 60 хв. Білки з
екстракту видаляли фільтруванням після його кип ятіння протягом 15 хв.
Зберігали екстракт у морозильній камері побутового холодильника при
температурі -6°С. Загальну концентрацію білків в екстракті визначали за
допомогою модифікованого методу Лоурі. Концентрацію пептидів і
нуклеотидів визначали спектрофотометричним методом при довжині хвиль 280
нм та 260 нм відповідно. У екстракті вивчали молекулярно–масовий
розподіл речовин пептидної природи. Для цього використовували метод
високоефективної гельпроникаючої хроматографії – ВЕГПХ.

Експерименти проведено на 180 лабораторних щурах лінії Вістар.

Щури є лабораторними тваринами, що найчастіше використовуються при
вивченні патологічних процесів, які викликаються експериментальними
впливами на організм, зокрема тими з них, які пов’язані з різними
пошкодженнями тканин. В організмі щурів спостерігаються явища, схожі з
тими, що відбуваються при аналогічних впливах і в організмі людини.

Як контроль порівняння було взято екстракт плаценти офіцинальний
Державного Київського підприємства з виробництва бактерійних препаратів
“Біофарма”, серія Р.12.99/01311. Екстракт плаценти (ЕПл) є препаратом
біологічного походження, який включає фракції пептидів і застосовується
як терапевтичний препарат у лікуванні різних патологічних станів, а
також лікування ран різної етіології. ЕПл також проявляє деяку
стимулюючу дію на процеси репарації.

При моделюванні опікових ран тварини були розділені на 6 груп. Кожна
група складалась з 30 тварин. 1-а група – контрольна, тваринам уводили
фізіологічний розчин, 2-а група – тварини, яким уводили екстракт
плаценти офіцинальний (Епл), 3-я група – тварини, яким уводили ЕШНП. При
моделюванні холодових травм тварини розподілялися аналогічно. Для
моделювання експериментальних опіків і відморожень використовували
мідний аплікатор діаметром 10 мм з температурою 100°С і -196°С
відповідно і часом експозиції 60 с. Експерименти проводили згідно з
правилами “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що
використовуються в експериментальних та інших дослідних цілях” (м.
Страсбург, 1985р).

Перед нанесенням травм під інгаляційним ефірним наркозом епілювали
шерсть в області стегна. Фізіологічний розчин, ЕПл і ЕШНП уводили щодня,
один раз на день впродовж усього експерименту (28 діб) по 0,5 мл від
периферії до центру рани підшкірно. Для дослідження темпу загоєння ран
нами було використано планіметричний метод. При дослідженні
мазків–відбитків в роботі використовували метод “раневих відбитків”. З
поверхні рани заздалегідь знімався гній, якщо такий організовувався, або
ж фібрінний наліт, але не верхній лейкоцитарний шар, який підлягав
дослідженню, і стерильним склом торкалися до поверхні рани. Після цього
на склі залишаються клітини, що пристали до нього. Мазки–відбитки
відбирали і досліджували на 3, 7, 14 – у добу спостереження. Препарати
фіксували етанолом протягом 15хв. Потім висушували. Забарвлення
проводили стандартним розчином азур-еозина за методом Романовського.

Для виготовлення гістологічних препаратів тварин під ефірним наркозом
декапітували. Матеріал забирали на 3, 7, 14 і 28-у добу після нанесення
рани. Зразки шкіри фіксували в 10%-му розчині формаліну, зневоднювали в
спиртах і поміщали в целоїдин. Диференціювання препаратів проводили під
світловим мікроскопом “Біолам”–Р-11.

Для дослідження мікрофлори гомогенати раневого ексудату суспендіювали в
1 мл тіогліколієвого середовища. Одержану суспензію висівали на живильні
середовища відповідно до методик з виділення і ідентифікації
мікроорганізмів. Ідентифікацію ентеробактерій проводили з використанням
набору “Ентеротест- 16”, стрептококів – “Streptoтест-16”, анаеробів –
“Анаеротест-23” (всі тест- системи виробництва PLIVA- Lachema, Брно,
Чехія). Бактеріологічні препарати досліджували за допомогою мікроскопа
Zeiss Laboval.

Статистична обробка результатів досліджень проводилася за методом
Стьюдента–Фішера з використанням пакета комп’ютерних програм EXCEL XP.
Як критерій статистичної достовірності різниці приймали рівень 95%
(р10000, 4800, 1300, 1100, 800. Отже, в екстракті
присутній широкий спектр пептидів, які можуть проявляти регуляторні
властивості на репараційні процеси в експериментальних ранах.

Вплив ЕШНП на процеси регенерації в експериментальних опікових ранах. В
результаті контролю за динамікою загоєння експериментальних опікових ран
на 3-ю добу з моменту нанесення травми, а також після введення ЕПл
офіцинального і ЕШНП опікова поверхня мало чим відрізнялася від такої в
контролі. Поверхня рани контрольних тварин сірого кольору, темнішого в
центрі, відмічалися нерівності, а також дрібні точкові геморагії по
периферії.

На 7-у добу дослідження в контрольній групі тварин рани були покриті
зеленувато-сірою плівкою фібрину, під якою намічалася грануляція,
відмічалась плазморея, переважно в центрі. У тварин, яким уводили ЕПл,
ранева поверхня являла собою різко гіпереміровані грануляції, з
елементами пастозності і залишками тканинного детриту. У тварин, яким
уводили ЕШНП, рана набувала рівномірно рожевого забарвлення, набряклість
зменшувалася, відмічалася значна контракція рани.

На 14-у добу спостереження відмінності в загоєнні опікових ран між 1,2 і
3 групами тварин ставали виразнішими. На 28-у добу спостерігалось повне
загоєння ран. Слід зазначити, що некроз після контактного опіку завжди
носив коагуляційний характер, відторгнення його починалося на периферії
після утворення лінії демаркації і відбувалося самостійно.
Підтвердженням більш високого темпу загоєння опікової рани при введенні
екстрактів, особливо ЕШНП, можуть служити результати динамічної
планіметрії ран в трьох групах спостереження (Рис. 1).

Рис.1.Площа опікових ран в залежності від умов експерименту

Примітки: *- відмінності статистично достовірні в порівнянні з
контролем, p ue4 A ae e D F TH a 3/4 A e & & 4у добу в 1-й групі спостерігали епітелізацію раневого дефекту, сітчатий шар містив сформовані сальні залози та волосяні фолікули. У 2-й групі тварин відмічали стратифікацію шарів епідермісу, волосяні фолікули с ознаками росту шерсті. У 3-й групі тварин відмічали по краю рани відростання шерсті, сітчатий шар мав розпушовану структуру. Таким чином, застосування для лікування холодових ран ЕШНП зменшує вторинні ішемічні пошкодження дерми. ЕШНП стимулює регенерацію епітеліального пласта з утворенням дериватів шкіри з мінімальним розвитком грануляційної тканини в порівнянні з контрольною групою, де регенерація була неповною при утворенні рубця, а відновлення нормальної будови шкіри спостерігалося лише на межі із здоровою тканиною. Цитологічна характеристика експериментальних ран. При цитологічному дослідженні раневих відбитків опікових ран на 3-ю добу переважав деструктивно-запальний тип, що відображає початкові ознаки запальної реакції. На контрольних препаратах містилася значна кількість нейтрофільних лейкоцитів, а також відмичали наявність лімфоцитів, обсіменіння мікрофлорою, нитки фібрину, фагоцитарна активність слабка (поодинокі макрофаги). Аналогічна картина виявлялась і в групах тварин, яким вводилися ЕПл і ЕШНП. На 7-у добу в контрольних опікових ранах проявлявся виражений лейкоцитоз. При введенні ЕПл в мазках-відбитках відмічали зменшення кількості нейтрофілів. Після введення ЕШНП до цього терміну в раневому відокремлюваному ще виявляли деяку кількість лейкоцитів. Лейкоцити при цьому проявляли фагоцитуючі властивості. Відмічали наявність недиференційованих клітин, макрофагів. Міжклітинна речовина мала дрібнозернистий вигляд, з'являлися волоконні структури. На 14-у добу спостереження в опікових ранах 1-ї групи тварин мазки-відбитки характеризувалися макрофагами. У ці ж терміни в 2-й і 3-й групах відзначали зменшення кількості лейкоцитарних елементів в полі зору, спостерігали появу молодих клітин грануляційної тканини, таких як багатоядерні клітини, плазматичні клітини, клітини молодого епітелію, що відповідає фазі проліферації (у групі тварин при введенні ЕШНП) (Табл. 1). Таблиця 1 Цитологічна характеристика опікових ран Клітинні елементи Група тварин 7 доба 14 доба Контр ЕПл ЕШНП Контр ЕПл ЕШНП Нейтрофіли 60±5 55±7 47±6 47±5 43±4 40±6 Лімфоцити 2,7±,2 2,2±0,3 2,0±0,2 5,2±0,2 5,6±0,3 5,8±0,2 Недиференційовані сполучнотканинні клітини 4,0±0,2 6,2±0,2* 9,2±0,3* 14,2±0,2 5,6±0,3 14,5±0,2* Макрофаги 4,3±0,3 5,3±0,2* 6,2±0,2* 13,3±0,3 13,6±0,2 11,2±0,2* Клітини фібробластичного ряду - 1,5±0,2* 2,4±0,3* 7,3±0,3 8,7±0,3* 12,2±0,3* Багатоядерні клітини - 2,4±0,3* 3,3±0,2* 7,6±0,2 8,2±0,4 12,2±0,3* Молодой епітелій - - поодинокі клітини групи клітин групи клітин пласти клітин Примітка. 1 Відмінності в порівнянні з контролем статистично достовірні, р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020