.

Вплив постнатальної тимектомії у мишей лінії сва/са на клітини-попередники кісткового мозку і формування кістки в зрілому віці (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3156
Скачать документ

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УСТИМЕНКО АЛІНА МИКОЛАЇВНА

УДК: 612.753-017.1:612.67

Вплив постнатальної тимектомії у мишей лінії сва/са на
клітини-попередники кісткового мозку і формування кістки в зрілому віці

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті геронтології АМН України, лабораторії
патофізіології та імунології

Науковий керівник: академік АМН України, чл.-кор. НАН України,

чл.-кор. РАМН, доктор медичних наук, професор,

БУТЕНКО Геннадій Михайлович,

завідувач лабораторії патофізіології та імунології,

зам. директора Інституту з наукової роботи,

Інститут геронтології АМН України, м. Київ

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

РОДІОНОВА Наталія Василівна,

завідувач відділу цитології та гістогенезу,

Інститут зоології імені І. І. Шмальгаузена НАН України,

м. Київ

доктор біологічних наук, професор

ДЄДУХ Нінель Василівна,

завідувач лабораторії морфології сполучної тканини,

Інститут патології хребта і суглобів імені М. І. Ситенка АМН України, м.
Харків

Провідна установа: Інститут ендокринології та обміну речовин

імені В. П. Комісаренка АМН України, м. Київ

Захист відбудеться “17” січня 2007 року о 14:00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2,
біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ – 33, вул.
Володимирська, 58)

Автореферат розісланий “14” грудня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Цимбалюк О. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збільшення випадків патологій опорно-рухового
апарату, особливо остеопорозу, є великою проблемою для суспільства. За
даними ВООЗ, остеопорозу притаманна надзвичайно висока і постійно
зростаюча розповсюдженість, що дає підставу для ствердження про
наявність епідемії цієї патології, яка охопила світ. З ініціативи ВООЗ,
Європейської антиревматичної ліги й ініціативної групи ортопедів перша
Декада третього тисячоріччя присвячена поглибленому вивченню патології
кісток і суглобів (The Bone and Joint Decade, 2000-2010) (Риггз Б. Л.,
Мелтон ІІІ Л. Дж., 2000; Корж Н. А. и соавт., 2002).

За даними сучасних досліджень, кісткова тканина є активною метаболічною
системою, яка постійно оновлюється за рахунок процесів резорбції та
формування (Manolagas S.C., 2000; Seeman E., 2003) і перебуває в
нерозривному зв’язку з кровотворною тканиною, як за походженням, так і
за взаємним розташуванням (Sharrock W.J. 1998; Kale S., Long M.W., 2000;
Астахова В. С., 2000). Цей зв’язок очевидний, оскільки клітини
кісткового мозку, маючи остеогенні властивості, локалізуються в
кістковій тканині, а головні учасники ремоделювання кістки – остеокласти
та остеобласти, походять з гемопоетичних попередників, подібних
гранулоцитарно-макрофагальним колонієутворюючим клітинам (КУК-ГМ) і
мезенхімальним стовбуровим клітинам, які входять до складу строми
кісткового мозку, подібних колонієутворюючим клітинам фібробластів
(КУК-Ф) (Бутенко Г. М., 1999; Lorenzo J. 2000). Разом з тим,
функціонування вищезгаданих систем здійснюється в тісному взаємозв’язку
з ендокринною та імунною системами, оскільки їх об’єднує не тільки
спільність походження, але й спільність регуляторних механізмів, що
діють як на системному, так і на локальному рівнях (Manolagas S.C.,
Kousteni S., 2002).

Відомо, що імунна та кісткова системи функціонально взаємопов’язані і
цей взаємозв’язок відбивається в спільності регуляторних молекул, які
впливають на клітини обох систем (Lorenzo J. A., 2000; Grиeviж D. et
al., 2001).Тимус є центральним органом імунної системи, в якому
відбуваються дозрівання і диференцировка Т–лімфоцитів, які, в свою
чергу, приймають участь в метаболізмі кісткової тканини через локальну і
системну продукцію цитокінів, а баланс процесів ре- зорбції і
формування кістки забезпечує збереження нормальної кісткової маси
(Базарный В. В. и соавт., 1994; Бутенко Г. М., 1999; Бутенко Г. М. и
соавт., 2001; Кащенко С. А., 2001, 2003, 2004; Lorenzo J. A., 2000).
Видалення тимусу у новонароджених мишей, щурів, мурчаків та інших тварин
призводить до розвитку так званого wasting-синдрому (виснаження), для
якого є характерними відставання у масі, лімфоцитопенія, уповільнений
ріст кісток і всього організму (Teixeira D. et al., 1978; Кемилева З.,
1984). Також знижується рівень статевих гормонів, які є потужними
протекторами кісткової тканини (Manolagas S. C., 1999, 2000). Відомо, що
брак гормональних речовин тимусу, які впливають на функцію багатьох
органів і систем, негативно впливає і на стан кісткової тканини як
людей, так і тварин (Лабунец И. Ф., Максюк Т. В., Бутенко Г. М., 2000;
Кащенко С. А., 2004).

Вважається, що основними факторами, які специфічно впливають на розвиток
і диференціацію клітин кісткового мозку, а саме, остеокластів, є:
рецептор, активуючий ядерний фактор NF-кВ (RANK), остеопротегерін (OPG)
і остеопротегерін-ліганд (ОPGL, RANKL), які були незалежно відкриті в
кістковій та імунній системах (Wong B.R. et al.,1997; Theill L. E.,
2002; Yamazaki H., 2005). Ремоделювання кістки контролюється балансом
між RANK-RANKL зв’язуванням і/або продукцією OPG, оскільки відношення
RANKL/OPG визначає біологічну активність RANKL (Gori F., 2000; Rogers
G., 2002). Існує дуже велика кількість системних і локальних
остеотропних факторів, в тому числі, які продукуються і клітинами
імунної системи, що регулюють експресію одного або двох компонентів
відношення RANKL/OPG остебластно/стромальними клітинами. Відомо, що
остеобласти секретують велику кількість білків, які беруть участь у
формуванні кісткового матриксу (Sims N., 1997; Mizuno M., 2001).
Остеокласти не можуть диференціюватися з гематопоетичних
клітин-попередників, якщо блоковано продукцію Т-лімфоцитами основних
факторів остеокластогенезу (RANKL і М-КСФ). Все це доводить, що
специфічні сигнали мікрооточення необхідні для остеокластогенезу, а
продуковані імунними клітинами RANKL і OPG можуть діяти на кісткові
клітини, і, навпаки (Kong Y. Y., 1999).

Якщо роль гемопоетичної, та нейроендокринної систем у функціонуванні
кісткової тканини досить добре відома, то вплив імунної системи на
кісткову тканину висвітлено недостатньо. Дослідження щодо вивчення
кісткової тканини при тимектомії, показують тільки порушення швидкості
росту кісток, а питання щодо функціональних змін основних учасників
ремоделювання кісткової тканини: остеобластів і остеокластів та ролі
міжклітинних взаємодій залишається відкритим. Всі ці обставини
виступають в якості відправної точки у виборі даного дослідження, що
продиктовано медичною і соціальною значущістю зазначеної проблеми.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана згідно з планом науково-дослідної теми лабораторії
патофізіології і імунології Інституту геронтології АМН України “Вивчення
ролі імунних механізмів у формуванні структурно–функціональних порушень
кісткової тканини при старінні”, номер державної реєстрації 0102U001417,
в якій дисертант приймала участь як виконавець окремих фрагментів.

Мета дослідження. Встановити особливості впливу тимектомії у мишей лінії
СВА/Са в різні вікові періоди і трансплантації тимусу від донорів
різного віку тимектомованим тваринам на формування кістки, а також
функціональні особливості клітин-попередників кісткового мозку в зрілому
віці.

Задачі дослідження:

Дослідити вплив тимектомії в різних вікових періодах (у віці 3-х, 20-ти
і 45 діб) на щільність стегнової кістки.

Визначити вплив трансплантації тимусу від донорів 5-ти добового та 24-х
місячного віку реципієнтам, яким було видалено тимус у віці 3-х діб
(неонатальна тимектомія) на щільність стегнової кістки.

Вивчити можливі кількісні зміни стромальних і гемопоетичних
клітин-попередників кісткового мозку в різних вікових періодах, в умовах
неонатальної тимектомії та трансплантації тимусу від донорів різного
віку.

Визначити функціональну активність клітин кісткового мозку в умовах
неонатальної тимектомії та трансплантації тимуса від донорів різного
віку, індукованих в культурах до остеобластогенезу та остеокластогенезу.

Визначити рівень експресії гену остеокальцину в умовах неонатальної
тимектомії та трансплантації тимуса від донорів різного віку у клітинах
кісткового мозку, індукованих в культурах до остеобластогенезу.

Визначити вплив неонатальної тимектомії та трансплантації тимусу від
донорів різного віку на рівень статевих гормонів в сироватці крові.

Об’єкт дослідження. Особливості функціонального стану
клітин-попередників кісткового мозку та щільність стегнової кістки у
мишей лінії СВА/Са різного віку в умовах тимектомії та з
трансплантованим тимусом від донорів 5-ти добового (молодого) і 24-х
місячного (старого) віку.

Предмет дослідження. Щільність стегнової кістки, клітини-попередники
кісткового мозку, тестикули, матка, наднирники, кров мишей.

Методи дослідження. Дослідження здатності стовбурових клітин кісткового
мозку утворювати in vitro колонії стромальних клітин–попередників
фібробластів (КУК–Ф) та колонії клітин–попередників
гранулоцитів–макрофагів (КУК–ГМ) за допомогою культурального методу, а
також під впливом специфічних індукторів в культурах диференціюватися у
клітини остеобластного і остеокластного ряду; визначення активності
лужної фосфатази в колонієутворюючих клітинах остеобластів та кислої
фосфатази в колонієутворюючих клітинах остеокластів цитохімічним
методом; визначення рівню статевих гормонів в сироватці крові
радіоімунним методом; визначення рівню експресії гену остеокальцина в
культурах клітин кісткового мозку за допомогою полімеразної ланцюгової
реакції; визначення щільності стегнової кістки гравіметричним методом;
визначення певних маркерів на клітинах кісткового мозку з використанням
моноклональних антитіл; визначення маси тестикул, матки, наднирників
органометричним методом.

Наукова новизна одержаних результатів. Доведено, що тимектомія мишей
лінії СВА/Са тільки у віці 3-х діб негативно впливає на стан кісткової
тканини у зрілому віці, що проявляється у зниженні щільності стегнової
кістки. На тлі тимектомії в трьохдобовому віці у тварин виявили зниження
функціональної активності остеобластів і підвищення функціональної
активності остеокластів, що, можливо, призводить до посилення процесу
резорбції і порушення процесу формування кістки. Встановлено, що рівень
експресії гену остеокальцину, який експресується тільки в
диференційованих остеобластах, значно нижчий в групах тимектомованих
тварин, що може свідчити про порушення процесу мінералізації кісткового
матриксу. Визначена різниця у відновлюючій дії молодого і старого тимусу
на стан кісткової тканини.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження
особливостей впливу видалення тимусу у мишей лінії СВА/Са в різних
вікових періодах, а також при трансплантації молодого та старого тимусів
на формування кісткової тканини розширюють і поглиблюють знання про
вплив імунної системи на процес остеогенезу, вивчення якого є основою
розуміння низки як фізіологічних, так і патологічних процесів. Одержані
дані мають важливе значення для встановлення механізмів старіння
кісткової тканини.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконані дослідження та
аналіз наукової інформації за темою дисертації, визначена мета та
поставлені задачі дослідження, розроблено протокол реєстрації
результатів дослідження, проведений відбір тварин, виконані тимектомія
та трансплантація тимусу від донорів різного віку у навколонирковий
простір декапсульованої нирки, статистична обробка, аналіз та
інтерпретація результатів, сформульовані висновки, розроблено дизайн
рукопису дисертації, а також підготовлені матеріали до друку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
оприлюднені на V Українській конференції молодих вчених, присвяченої
пам’яті академіка Володимира Веніаміновича Фролькіса (Київ, 23 січня
2004); на ІV національному конгресі геронтологів і геріатрів України
(Київ, 11 – 13 жовтня 2005); на науковій конференції молодих вчених з
міжнародною участю “Актуальні проблеми геронтології та геріатрії”,
присвяченої пам’яті академіка Володимира Веніаміновича Фролькіса (Київ,
27 січня 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з
них – 4 журнальних статі у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК
України, 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 165 сторінках
машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів
досліджень, 3 розділи власних досліджень, узагальнення одержаних
результатів, висновки, список використаної літератури, який містить 252
джерела, з них 204 – латиницею. Робота ілюстрована 35 таблицями та 58
рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Роботу виконано на 213 самцях і самках
мишей лінії СВА/Ca. При роботі з тваринами керувалися “Європейською
конвенцією щодо захисту хребетних тварин, які використовуються з
експериментальними та іншими науковими цілями” (Страсбург, 18.03.86 р.).
Проведено дві серії дослідів. Перша серія була присвячена дослідженню
впливу тимектомії в різних вікових періодах на щільність стегнової
кістки та кількісні зміни колонієутворюючих клітин фібробластів (КУК-Ф)
і колонієутворюючих клітин гранулоцитарно-макрофагального ряду (КУК-ГМ).
Було обрано тварин трьох вікових груп: новонароджених, двадцяти діб від
народження та півторамісячного віку. Контролем для тимектомованих тварин
були псевдооперовані самці та самки відповідного віку.

У другій серії дослідів використовували модель неонатальної тимектомії з
трансплантацією тимусу від 5-ти добового (молодого) та від 24-х
місячного (старого) донорів у навколонирковий простір декапсульованої
нирки 5-ти добових мишенят (Tubiana A. Dardenne, 1979; Харази А., 1982).
Самцям та самкам проводилась трансплантація тимусу від донорів
відповідної статі. Тимектомія проводилась мишенятам у проміжку 48–72
години від моменту народження хірургічним способом відповідно
рекомендаціям Cohn (1976). Контролем для тимектомованих тварин були
псевдооперовані самці та самки; для тварин з трансплантованими тимусами
від молодого та старого донорів – тимектомовані тварини. Повноту
видалення тимусу оцінювали візуально. Його приживлення після
трансплантаціїї оцінювали гістологічним методом.

Через 3,5 місяці тварин забивали під ефірним наркозом. Відразу після
забою тварин зважували, видаляли в стерильних умовах одну стегнову
кістку для отримання клітин кісткового мозку з метою подальшого
культивування in vitro для визначення кількості колонієутворюючих клітин
фібробластів (КУК-Ф), колонієутворюючих клітин
гранулоцитарно-макрофагального ряду (КУК-ГМ), колонієутворюючих клітин
остеобластів (КУК-ОБ), колонієутворюючих клітин остеокластів (КУК-ОК),
другу стегнову кістку брали для визначення її щільності. Також визначали
масу тестикул, матки, наднирників.

Здатність клітин кісткового мозку утворювати in vitro колонії
стромальних клітин–попередників фібробластів оцінювали в моношарових
культурах кісткового мозку на 12 добу культивування: підраховували
кількість колоній КУК-Ф, що вміщували не менш 50 клітин, а потім
перераховували на загальну кількість ядровміщуючих клітин кісткового
мозку стегнових кісток (Friedenstein A. J. et al., 1974).

Здатність гемопоетичних клітин–попередників кісткового мозку утворювати
гранулоцитарно–макрофагальні колонії оцінювали в напіврідких агарових
культурах на 9 добу культивування: підраховували кількість колоній
КУК–ГМ (до складу яких входило не менше 50 клітин), що виросли, а потім
перераховували на загальну кількість ядровміщуючих клітин кісткового
мозку стегнових кісток (Bradley T.R., Metcalf D., 1966).

Методи in vitro по визначенню кількості КУК-Ф і КУК-ГМ в культурах
кісткового мозку дозволяють отримати тільки кількість ранніх
клітин-попередників, а не самих остеокластів і остеобластів. Тому, була
застосована стимуляція клітин кісткового мозку в культурах до
остеобластогенезу і остеокластогенезу специфічними індукторами
(в-гліцерофосфат і аскорбінова кислота – для індукції КУК-ОБ і віт.D3 –
для індукціі КУК-ОК (Jilka R.L. et al., 1998).

Для дослідження функціональної активності КУК-ОБ та КУК-ОК
використовували цитохімічний метод. Визначали цитохімічну активність
лужної (по Kaplow L. S., 1955) та кислої фосфатаз (по Лойда З., 1982).
Ступінь інтенсивності цитохімічної реакції кожного з вивчених ферментів
характеризувалася середнім цитохімічним показником, що був розрахований
по напівкількісному методу, заснованому на принципі метода Kaplow
(1955). Відповідно до даного методу інтенсивність ферментативної реакції
оцінювалася в балах від 0 до 3: 0 – відсутність активності ферменту; 1 –
незначна активність; 2 – помірна активність; 3 – висока активність. Далі
визначали процент колоній з певною інтенсивністю цитохімічної реакції і
множили на відповідний бал. Отримані добутки складалися і їх сума
ділилася на 100 (Kaplow L. S., 1955).

Для визначення остеогеного потенціалу клітин кісткового мозку оцінювали
рівень експресії гену остеокальцину в культурах клітин, індукованих до
остеобластогенезу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції
(Херрингтон С., Макги Дж., 1999).

Частку CD4+, CD8+, CD4+CD8+ та CD4-CD8- клітин в кістковому мозку
оцінювали за допомогою моноклональних антитіл до маркерів лімфоцитів
миші: до маркеру CD8 – фірми “Bioscience”, мічених ФІТЦ; до маркеру CD4
– фірми “Bioscience”, мічених фікоеритрином. Кількість клітин з певними
маркерами визначали на цитофлюориметрі “FACStar Plus” (“Becton
Dickinson”, США).

Радіоімунним методом визначали концентрацію статевих гормонів в
сироватці крові.

Для визначення щільності стегнової кістки використовували гравіметричний
метод з урахуванням об’єму внутрішньої порожнини кістки (Пашинян Л. Н.,
Устименко А. М., Пішель І. М., 2005).

Експериментальні дані оброблялися загальноприйнятими методами
варіаційної статистики. Розраховувалися значення середніх арифметичних
величин (М), їх середньоквадратичне відхилення (д) і помилка середньої
(m). Розрахунки проводилися за допомогою комп’ютерних програм
“Statgraphics” та “Exell”. Для визначення вірогідних відмінностей між
середніми величинами використовували критерій Ст’юдента (t) та
Вілкоксона-Манна-Уітні (U). Зміни показників вважали вірогідними при
р ( * V X Z ?o2 ? o ! ? ? ? ? ? ???F?????? ? ???r??????&? ???r??????&? ???r??????&? ???r??????&? ???r??????&? Ykdu Ykdf в кісткового мозку, індукованих в культурах in vitro. Для цього визначали активність лужної і кислої фосфатаз в колонієутворюючих клітинах остеобластів і остеокластів (КУК-ОБ і КУК-ОК), відповідно. Цікавим виявився факт, що не відбулося кількісних змін в КУК-ОБ і КУК-ОК кісткового мозку ні у тимектомованих тварин, ні з трансплантованим молодим і старим тимусами. Але, визначення їх функціональної активності показало, що середній цитохімічний показник активності лужної фосфатази в культурах клітин кісткового мозку, стимульованих до остеобластогензу у тимектомованих тварин, був вірогідно меншим у порівнянні з контрольною групою. Трансплантація як молодого, так і старого тимусів сприяла нормалізації показників середнього цитохімічного показника активності лужної фосфатази, який збільшувався у порівнянні з тимектомованими тваринами (рис.2). Активність лужної фосфатази в живих організмах може змінюватись при патологічних станах. Відомо, що вона є необхідною для процесу мінералізації кісткового матриксу (Akbari M. et al., 2001; Вовк А. И. и соавт., 2003). Так, у мишей, нокаутних за геном лужної фосфатази, розвивались дефекти мінералізації кісткової тканини невдовзі після народження, що може свідчити про важливу її роль у підтримці вказаного вище процесу (Waymire K. G. et al., 1995; Narisawa S. et al., 1997; Hessle L., 2002). Рис. 2. Цитохімічна активність ЛФ в клітинах кісткового мозку, стимульованих до остеобластогенезу у самців і самок з видаленим тимусом, трансплантованим тимусом від 5-ти добового (молодого) або від 24-х місячного (старого) донорів: * - р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020