МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ВАЛЬЧУК ІННА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 616.-56.3-092:612.017-08

Вплив кверцетину(корвітину) на функціональну активність нейтрофілів та
ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексемії

14.03.08 – імунологія та алергологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені
Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор

ЧОП’ЯК Валентина Володимирівна,

Львівський національний медичний університет

імені Данила Галицького МОЗ України,

завідувач кафедри клінічної імунології та алергології,

керівник Медичного центру клінічної імунології та алергології МОЗ
України

Офіційні опоненти доктор медичних наук, професор

БЕРЕЖНА Нінель Михайлівна,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені
Р.Є. Кавецького НАН України,

завідувач лабораторії імунології та алергології

доктор медичних наук, професор

ДРІЯНСЬКА Вікторія Євгенівна,

Інститут нефрології АМН України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач лабораторії імунології

Провідна установа Інститут фтизіатрії і пульмонології імені Ф. Г.
Яновського АМН України

Захист відбудеться “1” березня 2007 року о 1530 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному
університеті імені О.О. Богомольця за адресою: 01023, м. Київ, вул.
Шовковична, 39/1, Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2,
аудиторія кафедри шкірних та венеричних хвороб.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул.
Зоологічна, 3.

Автореферат розісланий “25” січня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02

доктор медичних наук, професор
Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення механізмів розвитку імунокомплексного
ушкодження тканин залишається актуальним питанням клінічної імунології
та алергології (Stokol T., 2004; Fernandes N., 2004; Jancar C., 2005;
Nangaku M.; 2005). Гіперімунокомплексний синдром (ХГІС) супроводжує в
клінічній практиці такі захворювання як васкуліти, альвеоліти,
ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, гломерулонефрити тощо
(Драннік Г.М., 1999, Ройт А., 2000, Sell S., 1996) Попри велику
кількість вивчених механізмів розвитку імунокомплексного ушкодження
судин та внутрішніх органів, науково-дослідні роботи останнього часу
засвідчують, що в основі розвитку ХГІС лежать також порушення процесів
синтезу оксиду азоту (NO) та розвиток внутрішньоклітинного оксидативного
стресу, індукторами якого можуть бути як активні форми кисню, так і
активні форми азоту (Сагач В.Ф., Маянский А.Н., 2004, Gomez-Cuerrero C.,
2002; Kanashiro A., 2004; Jancar C., 2005). До найбільш імовірних джерел
активних кисневих та азотовмісних метаболітів при ХГІС відносять
поліморфноядерні лейкоцити, а основними мішеневими клітинами цих речовин
є ендотеліоцити (Бережная Н.М., 2005; Jones S., 2001; Chilcoat C., 2002;
Montovani B., 2003). Саме посилення нейтрофільно-ендотеліальних
взаємодій є одним із важливих аспектів оксидативного ушкодження судин
(Galkina S., 2004; Norman M., 2005). Підтвердження імунорегуляторної
ролі NО в імунокомплексних процесах, його впливу на взаємодію ефекторних
та мішеневих клітин за цих умов, послужило поштовхом для з’ясування
участі NO-залежних механізмів у розвитку нейтрофільно-ендотеліальних
взаємодій за умов ХГІС (Оkayama N., 1998; McIntyre T., 2003). Оцінка
ролі цих механізмів може мати велике значення у з’ясуванні процесів
розвитку порушень судинної стінки за умов ХГІС, а їх поглиблене вивчення
сприяє пошукові речовин, здатних попереджувати і коригувати ці
пошкодження.

Дослідження останніх років показують перспективність використання
біофлавоноїдів в корекції ХГІС (Kanashiro A., 2004 ). У цьому сенсі
цікавим є природний флавоноїд – кверцетин, а саме – його нова
водорозчинна лікарська форма – корвітин. Біологічна активність цього
препарату зумовлена його здатністю хелатувати іони із змінною
валентністю, взаємодіяти з вільними радикалами та запобігати утворенню
гіпохлорит аніону (Мойбенко О.О., Максютіна Н.П., 2000; Потапович А.І.,
2003; Kostjuk V., 2003). Позитивна дія корвітину обумовлена також його
модулюючим впливом на продукцію лейкотрієнів, циклооксигенази 1, 2 та
аніонів оксиду азоту (Пархоменко О.Н., Коваль С.Б., Chakravorty M.,
2001; Chen J., 2005; Sanches M. 2006; Morales A., 2006). Таким чином,
з’ясування особливостей нейтрофіло- та ендотеліоцитопосередкованих
NO-залежних механізмів за умов застосування корвітину дозволить
розширити наші уявлення про процеси розвитку ХГІС та можливості
попередження і терапії цих імунопатій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота є фрагментом планової міжкафедральної науково-дослідної роботи на
тему “Імуно-ендотеліально-епітеліальнозалежні механізми в розвитку
гіперімунокомплексного синдрому в експерименті і клініці”, яка
виконувалась на кафедрах клінічної імунології та алергології,
патологічної фізіології та ендоскопії і малоінвазивної хірургії
Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького
(№ держреєстрації 0101U009233). Тема дисертаційної роботи затверджена
проблемною комісією МОЗ та АМН України «Клінічна імунологія та
алергологія» 20 квітня 2004 р. (протокол №3).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було вивчення впливу
корвітину на імунологічні, NO-залежні механізми та структуральні зміни
нейтрофілів та ендотеліоцитів при ХГІС в умовах in vitro та in vivo.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

Вивчити вплив корвітину на захоплювальну та ферментативну активність
нейтрофілів у нормі та за умов ХГІС при їх інкубації з ендотеліоцитами.

Оцінити in vitro вплив корвітину на особливості синтезу NO та циклічних
нуклеотидів у нейтрофілах та ендотеліоцитах при їх сумісній інкубації в
нормі та за умов ХГІС.

Дослідити фагоцитарну та кисневозалежну, окисно-відновну ферментативну
активність нейтрофілів у нормі та за умов ХГІС, а також вплив на ці
процеси корвітину.

Проаналізувати вплив корвітину на процеси синтезу оксиду азоту та
циклічних нуклеотидів у ендотеліоцитах, нейтрофілах та сироватці крові в
нормі та за умов ХГІС.

Охарактеризувати та інтерпретувати електронно-мікроскопічні зміни в
ендотеліоцитах та нейтрофілах у нормі, при ХГІС та за умов застосування
корвітину.

Об’єкт дослідження – нейтрофіли, ендотеліоцити та сироватка крові
інтактних щурів та щурів із змодельованим ХГІС до та після введення їм
корвітину, а також нейтрофіли та сироватка крові хворих із
гіперімунокомплексним синдромом.

Предмет дослідження – показники захоплювальної, кисневозалежної та
окисно-відновної активності нейтрофілів, ізоформи NO-синтаз —
конститутивна (сNOS) та індуцибельна (iNOS), метаболіти оксиду азоту
NO2- — та NO3— аніони, циклічні нуклеотиди (цАМФ і цГМФ),
ультраструктура нейтрофілів та ендотеліоцитів інтактних щурів та щурів
із змодельованим ХГІС до та після введення їм корвітину

Методи дослідження – визначення вмісту ЦІК, гемолітичної активності
комплементу сироватки крові та функціональної здатності нейтрофілів –
захоплювальної здатності, спонтанного та стимульованного НСТ-тесту,
активності мієлопероксидази, катіонно-білкового тесту; визначення
інтенсивності процесів синтезу оксиду азоту за рахунок оцінки активності
ферментів NO-синтаз, рівня його стабільних метаболітів — NO2— та
NO3—аніонів та рівня циклічних нуклеотидів; дослідження ультратонкої
структури нейтрофілів та ендотеліоцитів за допомогою методу електронної
мікроскопії.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше досліджено вплив корвітину
за умов in vitro на показники синтезу NO та рівня циклічних нуклеотидів
у нейтрофілах та ендотеліоцитах інтактних і дослідних тварин при їх
сумісній інкубації, що проявлялось його селективним інгібуючим впливом
на активність iNOS та підвищенням рівнів цАМФ і цГМФ, як в нейтрофілах,
так і в ендотеліоцитах. Уперше на основі отриманих результатів
встановлено порушення процесів синтезу оксиду азоту, зокрема
NO-синтазного його шляху, в нейтрофілах та ендотеліоцитах при ХГІС.
Встановлено, що застосування корвітину коригує процеси синтезу NO за
рахунок зменшення активності iNOS та нормалізації активності cNOS у
нейтрофілах, ендотеліоцитах та сироватці крові щурів і гальмуючого
впливу на окисно-відновні процеси та активність мієлопероксидази в
нейтрофілах щурів з ХГІС. Уперше встановлено, що розвиток ХГІС
супроводжується зниженням синтезу цАМФ і цГМФ в нейтрофілах та
ендотеліоцитах та підвищенням рівня цГМФ в сироватці крові щурів.
Введення корвітину значною мірою регулює рівень їх синтезу. Уперше
показано коригуючий ефект корвітину на морфологічний стан нейтрофілів та
ендотеліальних клітин при ХГІС.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень
інкубації нейтрофілів і ендотеліоцитів у присутності корвітину
доповнюють відомості про його участь в регуляції процесів синтезу оксиду
азоту, однієї з ланок механізмів розвитку ендотеліальної дисфункції за
умов ХГІС. Отримані дані підтверджуть перспективність застосування
корвітину з метою корекції порушень процесів синтезу NO в нейтрофілах та
ендотеліоцитах при ХГІС, що дозволить попереджати пошкодження тканин за
цих умов.

Отримані результати дають можливість рекомендувати корвітин як
ендотеліопротектор та стимулятор фагоцитозу для застосування в
комплексній терапії хворих з ХГІС.

Теоретичні і практичні узагальнення роботи викладені у інформаційному
листі (№227-2004), деклараційному патенті на корисну модель (№ 13287) та
актах впровадження, які використовуються у клінічній практиці
Львівського обласного клінічного діагностичного центру, Центрального
клінічного військового госпіталю 1120 Західного оперативного
командування, Львівській обласній дитячій клінічній лікарні, 1-й міській
клінічній лікарні м. Львова ім. Князя Лева, Чернівецькій обласній
клінічній лікарні, Тернопільській обласній комунальній клінічній лікарні
та навчальному процесі кафедр клінічної імунології та алергології,
патологічної фізіології Львівського національного медичного
універсистету ім. Данила Галицького, кафедрі внутрішньої медицини з
курсом клінічної імунології та алергології Тернопільського державного
медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедрі клінічної
імунології та алергології Кримського державного медичного університету
ім. С.І. Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим
дослідженням. На основі проведеного інформаційного пошуку та
літературного огляду спільно з науковим керівником автором сформульовано
мету і завдання дослідження та вибрано адекватні моделі і методики. Під
час виконання експериментальної частини здобувач брала участь у
моделюванні ХГІС та проведенні його корекції. Самостійно проводила
імунологічні методи дослідження, підготувала зразки для проведення
електронної мікроскопії. Автор висловлює подяку ст.н.сп Інституту
біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, к.б.н. Коцюрубі А.В. за
сприяння у виконанні біохімічних досліджень, к.б.н. Ковалишину В.І.
співробітнику лабораторії електронної мікроскопії Львівського
національного медичного університету ім. Данила Галицького за допомогу
при проведенні електронно-мікроскопічних досліджень, академіку НАН
України Мойбенку О.О. за надання препарату — корвітину для досліджень.
Автор самостійно провела статистичну обробку результатів дослідження та
проаналізувала і узагальнила отримані результати, підготувала публікації
до друку. Висновки сформульовано спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
представлені на VI Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих
учених (Тернопіль, 2002), Пленумі наукового товариства патофізіологів
України (Одеса, 2002), Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004), науково-практичному семінарі з
міжнародною участю “Клінічна імунологія та алергологія: погляд у
майбутнє (Львів-Трускавець, 2004), IV національному конгресі
патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004),
науково-практичній конференції «Стан і перспективи розвитку медичної
генетики, алергології та клінічної імунології» (Трускавець, 2005), VIII
науково-практичній звітно-виборчій конференції Українського товариства
фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації «Сучасні аспекти
діагностики та лікування імуно- та алергопатології» (Київ, 2006),
спільному засіданні Львівської обласної філії НМТ патофізіологів і
кафедр клінічної імунології та алергології, патологічної фізіології та
ендоскопії і малоінвазивної хірургії Львівського національного медичного
університету ім. Данила Галицького (Львів, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт, з яких 5 статтей
– у фахових наукових журналах, 1 інформаційний лист, 1 деклараційний
патент на корисну модель, 5 тез доповіді у матеріалах наукових з’їздів,
конференцій та конгресів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках
друкованого тексту, з яких 33 сторінки становить список використаних
джерел, містить 11 таблиць та 30 рисунків, з яких 16 є мікрофото.
Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та
методів дослідження, 4 розділів результатів власних досліджень, їх
узагальнення, висновків та списку використаних джерел. Перелік
використаних джерел – 333 посилання, з яких 104 є вітчизняними і 231 –
зарубіжними.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані
на статевозрілих білих щурах-самцях масою 200-250 г. Позаяк показники
імунної системи змінюються залежно від пори року, дослідження проводили
в осінньо-зимовий період протягом 2001-2004 років. Експериментальні
втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних
принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які
використовуються для експериментальних наукових цілей (Страсбург, 1985),
ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією
з питань біоетики Львівського національного медичного університету ім.
Данила Галицького (протокол № 8 від 15.12.2004р.) порушень вимог не
виявлено. У процесі дослідження використано 280 тварин, яких розподіляли
на групи: перша – інтактні щури, які отримували плацебо і служили
контролем; друга – тварини із змодельованим ХГІС; третя – інтактні щури,
які отримували корвітин; четверта – щури з ХГІС, які отримували
корвітин.

Модель ХГІС створювали за допомогою класичної моделі C. Cohrane та
D.Kofler (1973) у модифікації R. Williams (1980) та посилаючись на праці
попередніх досліджень Чоп’як В.В.(1998). Для цього у хвостову вену щура
кожні 7 днів упродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін
(НВФ “Simko Lpd”, Україна) з розрахунку 100 мг/кг маси тіла. Розчин
корвітину (виробництва ЗАТ НВЦ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний
завод”, Україна) вводили внутрішньоочеревинно в дозі 40мг/кг раз на добу
впродовж 10 днів.

Отримання клітин нейтрофілів проводили на подвійнoму градієнті щільності
розчинів фікол (Ficoll-400-«Pharmacia Fine Hemical», Швеція) –
урографіну (Urografin — “Schering”, Німеччина) (с1=1,095 г/см3 та
с2=1,077 г/см3) (Фрімель Г., 1987). Ендотеліальні клітини виділяли із
черевної аорти щура за допомогою методу ферментативного диспергування з
використанням 0,1% розчину колагенази (“Fluka Chemic A.G” Німеччина)
(Коваленко Т.М., 1999). Життєздатність клітин визначали за допомогою
0,1% розчину трипанового синього.

Інкубацію ізольованих нейтрофільних гранулоцитів та ендотеліальних
клітин проводили у середовищі 199 (РАМН Институт полиомиелита и вирусных
энцефалитов, Москва) з 20% вмістом телячої ембріональної сироватки (НВП
“Сангва”, Україна) в 24 лункових пластикових планшетах (“Sigma”, США).
Для запобігання змішування клітин нейтрофілів та ендотеліоцитів
використовували вставки з напівпроникними мембранами з діаметром пор 3(м
(“Sigma”, США). У кожну лунку планшети вносили виділені ендотеліоцити та
нейтрофіли у концентрації 3?106/мл у співвідношенні 1:1. Клітини
інкубували в термостаті при 370С в атмосфері з 5% вмістом СО2 впродовж 1
год (Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., 2000). Після інкубації клітини відбирали
і використовували для подальших досліджень. Для визначення впливу
корвітину на функціональну активність нейтрофілів та ендотеліоцитів
інтактних та тварин із змодельованою ХГІС в умовах in vitro в лунку
планшети вносили розчин корвітину в дозі 1?10-4г/л. Дозу застосування
корвітину визначали на підставі літературних даних (Мойбенко О.О., 2000;
Караванская И.Л., 2002).

Окрім цього, для дослідження використовували нейтрофіли і сироватку
крові 90 хворих (чоловіків — 25, жінок — 65, середній віх хворих
становив 40,2±17,2 роки) із підтвердженим гіперімунокомплексним синдром,
які знаходились на тривалому моніторному спостереженні у Львівському
регіональному медичному центрі клінічної імунології та алергології.

Визначення вмісту ЦІК у сироватці крові проводили за допомогою методу
преципітації в поліетиленгліколі — 6000 (Осипов С.Г., 1983, Логинский
В.Е., 1983). Комплементарну активність сироватки крові визначали за
методом 50% гемолізу еритроцитів (Фрімель Г., 1987). Для оцінки
нейтрофільного статусу проводили визначення захоплювальної здатності
нейтрофілів (латексний тест) – із підрахунком фагоцитарного показника
(ФП) – відсоток клітин, які беруть участь у фагоцитозі та фагоцитарного
числа (ФЧ) – середня кількість частинок латексу, захоплених однією
клітиною (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003). Для визначення здатності
нейтрофілів генерувати супероксиданіон радикали використовували
нітросиній тетразолієвий тест (НСТ), спонтанний (НСТсп) і стимульованний
(НСТст) зимозаном (Нагоев Б.С., Шубич М.Ф., 1981), що ґрунтується на
відновленні нітротетразолію синього супероксидними радикалами до
нітроформазану. Активність мієлопероксидази визначали за швидкістю
розкладу пероксиду водню (Klеbanoff S.I., 1968). Для оцінки показників
протеазних ферментативних процесів у нейтрофілах використовували
лізосомально-катіонний тест -ЛКТ (Шубич М.Ф., 1975).

Активність індуцибельної (iNOS) і конститутивної (сNOS) NO-синтаз
визначали колориметричним методом (Selter M., 1991) за визначенням
вмісту кінцевих метаболітів NO — нітрит-аніонів. Вміст нітрит-аніонів
визначали за допомогою методу Гріна в модифікації Коцюруби А.В. (Green
L.C., 1982, Коцюруба А.В., 2000), нітрат-аніонів (Bank N.R., 1993).

Вміст цАМФ та цГМФ визначали радіоімунним методом за допомогою
стандартних наборів реактивів “[3H]-cAMP RIA kit” і “[3H]-cGMP RIA kit”
(“Amersham”, Великобританія).

Дослідження ультратонкої структури нейтрофільних гранулоцитів та
ендотеліальних клітин проводили методом трансмісійної електронної
мікроскопії за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100.

Статистичну обробку результатів дослідження проводили із застосуванням
статистичного пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windows. Для
оцінки достовірності відмінностей виборок використовували
непараметричний метод за критерієм Wilcoxona.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для реалізації поставленої мети проводили сумісну інкубацію ізольованих
клітин нейтрофілів та ендотеліоцитів без корвітину і за умов його
присутності в інкубаційному середовищі. Дослідження проводили в
контрольній групі щурів та в щурів із змодельованим ХГІС. Результати
отримані в умовах in vitro за умов сумісної інкубації нейтрофілів і
ендотеліоцитів показали вірогідне зниженням захоплювальної здатності
(Р<0,05) та збільшення протеазної активності (Р<0,05) нейтрофілів лише тварин з ХГІС. За умов інкубації клітин інтактних тварин у присутності корвітину в інкубаційном середовищі, встановлено вірогідне збільшення показників “раннього” (P<0,01) і “пізнього” фагоцитозу (P<0,01) та зниження активності протеазних ферментативних процесів у нейтрофілах (P<0,05). При інкубації нейтрофілів і ендотеліоцитів тварин з ХГІС корвітин також проявляв виражений активізуючий вплив на показники захоплювальної здатності нейтрофілів (P<0,01) з одночасним зниженням протеазної активності (P<0,05) і активності мієлопероксидази (P<0,01) у нейтрофілах дослідних тварин. Отримані результати представляють інтерес і в зв’язку з виявленим впливом кооперативної взаємодії нейтрофілів і ендотеліоцитів на характер синтезу NO і циклічних нуклеотидів у цих клітинах. Такий взаємовплив прослідковується в експериментах із клітинами інтактних тварин і тварин з ХГІС, де ця взаємодія мала більш виражений характер. Результати дослідження засвідчують, що в нейтрофілах, при їх інкубації з ендотеліальними клітинами інтактних тварин, спостерігається зниження на 40% вмісту NO2--аніонів (Р(0,01) та зниження активності іNOS (на 53%) (Р(0,01), тоді як вміст стабільних метаболітів NO і активність ферментів NО-синтаз у ендотеліальних клітинах, за цих умов, не змінювалися. Встановлено лише підвищення рівня цГМФ (Р(0,01). У той час як за умов інкубації нейтрофілів та ендотеліоцитів тварин із ХГІС у нейтрофілах різко, в 9 разів, підвищується рівень NO2--аніонів (Р(0,01) та спостерігається тенденція до збільшення активність iNOS. Такі зміни синтезу NO в нейтрофілах, можливо, зумовлювали їх вплив на характер синтезу NO і в ендотеліальних клітинах. Дослідження в ендотеліальних клітинах показали зниження вмісту NO2--аніонів на 50% (Р(0,01), збільшення вмісту NO3--аніонів на 61% (Р(0,01) та активацію iNOS у 2,8 рази (Р(0,01). Зміни активності cNOS не виявлено. Рівень циклічних нуклеотидів у ендотеліальних клітинах вірогідно не змінювався. Очевидно за умов ХГІС підвищення синтезу NO в активованих нейтрофілах прямо або опосередковано призводить до порушення процесів синтезу NO в ендотеліальних клітинах і може спровокувати порушення функціональної здатності ендотелію та ушкодження судин унаслідок розвитку нітрозативного стресу в цих клітинах, що призводить до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії. Дослідження дії корвітину in vitro на процеси синтезу NO в нейтрофілах та ендотеліоцитах інтактних тварин показали його вплив на зниження активності іNOS (Р<0,05), без впливу на активність сNOS, зменшення на 47% вмісту NO2-- (Р<0,05) та на 69% - NO3--аніонів (Р<0,05), зниження рівня цАМФ (Р<0,05) та підвищення рівня цГМФ (Р<0,05) лише у нейтрофілах. Аналогічні дослідження, проведені в ендотеліальних клітинах інтактних тварин не виявили вірогідних змін показників як синтезу NO, так і рівня циклічних нуклеотидів. Також було встановлено, що корвітин виявляє інтенсивну коригуючу дію в системі NO і у клітинах тварин з ХГІС. Інкубація з корвітином призвела до зниження активності іNOS на 71% (Р<0,05), зниження вмісту NO2--аніонів на 48% (Р<0,05) та підвищення рівня цГМФ (Р<0,05) у нейтрофілах. Активність сNOS вірогідно не змінювалась. У ендотеліоцитах активність іNOS у 4 рази знижувалась (Р<0,05), рівень NO2--аніонів у 4 рази зростав (Р<0,05) та підвищувався на 66% рівень цАМФ (Р<0,05) і на 121% - цГМФ (Р<0,05). Отримані результати в умовах in vitro стали основою для подальшого дослідження дії препарату на функціональний стан нейтрофілів та ендотеліальних клітин за умов ХГІС при його парентеральному введенні. У результаті проведених досліджень в експерименті встановлено, що ХГІС у білих щурів супроводжувався вірогідним зростанням рівня “великих” (Р<0,01) і “середніх” (P<0,01) ЦІК. Встановлено, що імунокомплексоутворення за цих умов іде зі споживанням комплементу (Р<0,05) та зниженням фагоцитарної активності нейтрофілів (Р<0,05). Отримані результати засвідчують, що введення корвітину призводить до зниження рівня "середніх" і "малих" ЦІК (Р<0,01), збільшення активності системи комплементу (Р<0,05) та посиленя нейтрофілозалежних процесів фагоцитозу (Р<0,01), про що детально викладено нижче. 2 : >

@

F j ? ae t

?

u

(

*

,

.

&

F1

>

acQза умов ХГІС співвідношення концентрації нітрит- і нітрат-аніонів у 4
рази нижче цього показника в контролі (Р<0,01). Це може свідчити про те, що в умовах ХГІС у ланцюгу перетворень NO. (Реутов В.П., 1995) рівновага зсунута в бік утворення NO2--аніонів. Досліджено, що саме NO2--, а не NO3--аніони здатні посилювати процеси імунокомплексоутворення в присутності пероксиду водню та мієлопероксидази (Uesugi M., 1998). При дослідженні процесів синтезу NO в клітинах зафіксовано зниження рівнів його метаболітів - NO2-- і NO3--аніонів на 68% і 51%, відповідно – як в нейтрофілах (Р<0,01), так і в ендотеліоцитах (Р<0,01), що може бути пов’язане із підвищеним вивільненням їх з клітин у кров’яне русло та і з підвищеним метаболізмом NO. Дослідження впливу корвітину на вміст метаболітів NO показали його різнохарактерний вплив на рівень як NO2--аніонів, так і NO3--аніонів у інтактних тварин. Одночасно дослідження вмісту метаболітів NO у групі тварин із ХГІС, яким вводили корвітин, показали, що введення корвітину супроводжувалось збільшенням концентрації NO2--аніонів на 61% у нейтрофілах (Р<0,05) та на 94% в ендотеліоцитах (Р<0,01), тоді як у сироватці крові спостерігали зниження його рівня на 41% (Р<0,05). Рівень NO3--аніонів вірогідно зростав на 143% у нейтрофілах (P<0,01) та на 108% в ендотеліоцитах (P<0,001), без вірогідних змін його вмісту в сироватці крові. Зміни у вмісті метаболітів NO значною мірою можуть залежати від активності ферметів NO-синтаз. При проведенні досліджень, встановлено, що в нейтрофілах (P<0,05), ендотеліоцитах (P<0,05) та сироватці крові (P<0,05) за умов ХГІС різко зростає активність iNOS (на 187%, 104%, 132%, відповідно) та пригнічується активність cNOS (рис.1). Інгібування активності сNOS може призводити до активації сімейства транскрипційних факторів NF-кB, АР-1, які зв’язують сайти в промоторних регіонах багатьох генів, залучених у запальну та імунну відповідь (Зенков Н.К, 2001, Шебенко В.І., 2000). Отримані експериментальні дані засвідчують, що протекторні особливості водорозчинної форми корвітину пов’язані, перш за все, із його здатністю специфічно пригнічувати активність іNOS та нормалізувати активність сNOS у нейтрофілах, де спостерігається відновлення активності ферменту до показників в нормі. Меншою мірою під впливом введення препарату знижується активність іNOS в ендотеліоцитах та сироватці крові, однак активність сNOS вірогідно зростає на 141% і 195% (P<0,05). Отже, виявлені ефекти корвітину можуть засвідчити, що цей препарат гальмує надмірне утворення оксиду азоту і, таким чином, запобігає глибоким метаболічним порушенням у досліджуваних клітинах. Відомо, що дія NO на клітини залежить і від співвідношення внутрішньоклітинних концентрацій NO і активних форм кисню (Malinski T., 2004). При вивченні інтенсивності вільнорадикальних процесів нейтрофілів крові модельних щурів, встановлено, що розвиток ХГІС супроводжувався підвищенням спонтанного НСТ-тесту на 59% (Р<0,05), що свідчить про інтенсивність утворення О2·-, однак їх резервні можливості були невеликими, на що вказувала слабка стимуляція НСТ-тесту. Активація нейтрофілів проявлялась посиленням активності мієлопероксидази в 4 рази (Р<0,05). Дегрануляція, якою супроводжується активація гранулоцитів, призводить до вивільнення мієлопероксидази з клітин, що проявлялось збільшенням активності цього фермента в сироватці крові в 2 рази (Р<0,05). Збільшення синтезу О2·- та Н2О2 може поєднуватися із зменшенням біоактивності NO та формуванням реакційно здатних токсичних сполук, надмірний синтез яких призводить до дисфункції ендотелію (Zhang, 2001). До того ж, ХГІС характеризувалася й активацією катіонно-білкового тесту (Р<0,05). Це може свідчити про спрямованість факторів цитотоксичності нейтрофілів на ядерні структури клітин-мішеней. Отримані дані підтверджують цитотоксичну і деструктивну дію полінуклерних фагоцитів. Вивільнені при активації нейтрофілів протеази і активні форми кисню можуть спричинити окисне ушкодження ендотеліоцитів, а також підсилювати цитотоксичну дію на клітини протеїназ, трипсину і колагенази і розвитку системного запалення (Galkina S.I., 2004). Введення щурам корвітину зменшувало “агресивність” полінуклеарів, що проявлялось його імунокоригуючою дією. Ферментативні процеси в нейтрофілах зазнали певних змін, що проявлялося зменшенням на 19% активності спонтанного НСТ-тесту (Р<0,05) та збільшеннм їх резервних можливостей (Р<0,01), зниженням на 61% активності мієлопероксидази (Р<0,05) та стабілізацією протеазних механізмів фагоцитозу – про це свідчили показники катіонно-білкового тесту (Р<0,05). Врегулювання процесів синтезу NO та зниження продукції активних метаболітів кисню, внаслідок застосування корвітину, можуть бути основними механізмами покращення ендотеліальної функції при ХГІС. Доведено, що дія NO на судини, в основному, опосередковується через систему циклічних нуклеотидів (Турпаев К.Т, 2002). Зміна рівнів циклічних нуклеотидів за умов ХГІС має певні особливості. Встановлено, що в нейтрофілах за умов ХГІС спостерігається зниження вмісту цАМФ на 50% (Р<0,05) і цГМФ на 53% (Р<0,05). Така ж закономірність прослідковувалась і в ендотеліальних клітинах. На відміну, в сироватці крові спостерігали різнонаправлені зміни вмісту циклічних нуклеотидів із вірогідним збільшенням на 310% вмісту цГМФ (Р<0,01). Введення корвітину інтактним тваринам супроводжувалось вірогідними змінами рівня лише цГМФ у нейтрофілах (Р<0,05) та сироватці крові (Р<0,05). При введенні корвітину тваринам із ХГІС зафіксовано, що в нейтрофілах, на тлі введення препарату, підвищуються на 248% рівень цАМФ (Р<0,01) та на 91% - цГМФ (Р<0,05). Значення показника цГМФ досягало значень цього показника в нормі. Така ж тенденція зафіксована в ендотеліальних клітинах і сироватці крові щурів із ХГІС, які отримували корвітин, встановлено, що корвітин значною мірою нормалізує рівні цАМФ і цГМФ. Імунологічні та біохімічні зміни у тварин за умов ХГІС спричинили морфологічні зміни полінуклеарів та ендотеліальних клітин. Проведені електронно-мікроскопічні дослідження поліморфноядерних лейкоцитів і ендотелію судин підтвердили розвиток ХГІС. Реакція нейтрофілів на розвиток патологічного процесу характеризувалась типовими ознаками при розвиткові запального процесу – тотальним набряком цитоплазми, перинуклеарним набряком, структурованістю хроматину та погіршенням ультраструктури мітохондрій. Однак, з іншого боку, спостерігали підвищення функціональної активності нейтрофілів, свідченням чого було збільшення кількості як первинних, так і вторинних гранул. Морфологічна дія корвітину на нейтрофільні гранулоцити проявлялась відновленням його ультраструктури та ознак нормального функціонування. Проведений аналіз дає підстави для висновку про вплив корвітину на функціональну, зокрема автофагічну, активність нейтрофілів. Електронно-мікроскопічні дослідження зрізів черевної аорти білих щурів показали, що ХГІС характеризується значними порушеннями ендотеліального шару судинної стінки. Значна частина ендотеліального шару утворена сплощеними ендотеліальними клітинами, які своїми закінченнями часто не контактували із сусідніми клітинами. Плазматична мембрана ендотеліальних клітин була розпушеною та перерваною, до внутрішньої сторони якої прилягала значна кількість електроннощільних утворів у формі депозитів, які також виявлялися у субендотеліальному шарі та на поверхні внутрішньої еластичної мембрани. Плазма крові, що прилягала до люмінальної поверхні ендотеліальних клітин аорти, була електроннощільною, вміщувала частково гемолізовані еритроцити, преципітати та коагуляти. Окремі ділянки базальної мембрани стінки аорти були деендотелізованими. Виявлені порушення і в гладком’язових клітинах, а саме: дезорганізовані цитоплазма, базальна та цитоплазматична мембрана клітин, міжклітинні простори вміщували скупчення підвищеної електронної щільності колагенових та еластичних волокон, серед яких виявлялись електроннощільні депозити. Виявлені зміни засвідчують, що відкладені імунні комплекси призводять до значних структурних змін у всіх шарах стінки аорти. За умов введення модельним тваринам корвітину подекуди ще зустрічалися окремі ділянки ендотелію, сформовані ендотеліальними клітинами що контактували між собою лише віддаленими ділянками цитоплазми, однак не утворювали перфорацій. Плазматична мембрана була цілісною, а у цитоплазмі присутня велика кількість рибосом, полісом і мітохондрій, що засвідчує посилені регенеративні процеси у внутрішній оболонці аорти тварин. Гладком’язові клітини зберігали свою морфологічну структуру та мало відрізнялись від таких, як у контрольних тварин. В міжклітинних просторах присутні в помірній кількості пучки колагенових волокон. Такі зміни ультраструктури клітин судинної стінки за умов застосування корвітину підтверджують його цитопротекторний та ендотелійстабілізуючий вплив. Отримані результати дозволяють зробити висновок, що корвітин може виступати в ролі ендотеліопротектора за умов гіперімунокомплексемії – як за рахунок відновлення синтезу оксиду азоту в ендотеліальних клітинах, так і за рахунок зниження ушкоджувального впливу на ендотелій активованих ПМЯЛ. Застосування цього препарату дозволить удосконалити фармакологічну корекцію вільнорадикальних процесів, які інтенсивно розвиваються за умов гіперімунокомплексного синдрому і шкодять, в першу чергу, судинам мікроциркуляторного русла. У зв’язку з цим метою подальшого нашого дослідження було оцінка активності системи комплементу та стану функцій нейтрофілів, а саме їх захоплюючої здатності, окисно-відновних процесів з оцінкою їх потенціалу в хворих з гіперімунокомплексним синдромом. В результаті проведених досліджень встановлено, що в обстеженних хворих ХГІС супроводжувався послабленням захоплюючої активності полінуклеарів (у 70%), тоді як підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів не спостерігалось взагалі, та порушенням комплементрної активності, що проявлось як її зниженням (у 45,5%), так і підвищенням (у 25,6%). У 28,9 % обстежених хворих окисно-відновна активність нейтрофілів була пригнічена як спонтанна, так і стимульованна, знаходилась у межах норми в 44,4% та 61,1% та була активованою у 26,7% та 10% хворих відповідно. Встановлено, що значну кількість хворих – 32,2% становить група хворих, у якої одночасно спостерігається зниження активності комплементу та захоплюючої здатності полінуклеарів, що розцінюється як найбільш сприятливий фактор для розвитку ХГІС. Група хворих із гіпокомплементемією у яких захоплююча здатність нейтрофілів знаходилась в межах норми становила 13,3%. Особливо загрозливою, щодо прогнозу розвитку імунокомплексних ускладнень становила група хворих у яких на тлі гіперімунокомплексемії одночасно спостерігали зниження активності комплементу, захоплюючої здатності нейтрофілів та окисно-відновних процесів у них, що становило 16,5% від усіх обстежуваних хворих. Отже, отримані дані свідчать про те, що в більше 70% хворих з гіперімунокомплексемією існують сприятливі фактори для формування гіперімунокомплексного синдрому і підтримання автоімунного синдрому, що потребує корекції цих процесів з перспективою використання корвітину. ВИСНОВКИ У дисертаційній роботі наведено узагальнення та нові підходи в оцінці розвитку оксидативних та нітрозативних механізмів у нейтрофілах та ендотеліальних клітинах за умов ХГІС та можливості корекції цих процесів шляхом застосування корвітину. Зроблено наукові та прикладні висновки, а саме: Інкубація нейтрофілів та ендотеліоцитів із корвітином за умов in vitro в експерименті характеризувалась його стабілізуючим впливом на функціональну активність нейтрофілів, а саме: збільшенням фагоцитарної активності (в 1,5 рази), гальмуванням кисневозалежних (у 2 рази) та стимульованних кілінгових процесів (у 2 рази). Корвітин в умовах in vitro проявляє інгібуючий вплив на активність іNOS в нейтрофілах (в 3,5 рази) і ендотеліоцитах (в 4 рази) без вірогідного впливу на активність cNOS, що свідчать про селективний інгібуючий вплив корвітину на активність iNOS, особливо за умов ХГІС. Розвиток ХГІС супроводжувався посиленням NO-залежних та кисневозалежних процесів, що характеризувалось зменшенням вмісту нітрит- і нітрат-аніонів у нейтрофілах та ендотеліоцитах, зростанням (у 9 разів) рівня нітрат-аніону в сироватці крові, активацією iNOS, зниженням активності сNOS у нейтрофілах та ендотеліоцитах, активацією окисно-відновних процесів та активності мієлопероксидази. Застосування корвітину призводить до врегулювання цих змін, що засвідчує його гальмуючий вплив на розвиток нітрозативного стресу особливо в нейтрофілах та сироватці крові. Аналіз показників рівня цАМФ та цГМФ за умов ХГІС довів, що корвітин підвищує рівень цАМФ і цГМФ в ендотеліоцитах та нормалізує рівень цГМФ у нейтрофілах та сироватці крові в умовах як in vivo, так in vitro. Застосування корвітину коригує морфологічний стан нейтрофілів та ендотеліоцитів, що підтверджує його цитопротекторну і мембраностабілізуючу дію за умов ХГІС. Уобстежених хворих з стійким гіперімунокомплексним синдромом спостерігається послаблення захоплюючої здатності нейтрофілів (у 70%), порушення їх кілінгової (у 55,6% - спонтанного НСТ-тесту, у 38,9% - стимульованного НСТ-тесту) та комплементарної активності (у 71,1%), що є сприятливим фактором у його розвитку і формуванні та потребує терапевтичної корекції з перспективою використання корвітину. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Чоп’як В.В., Потьомкіна Г.О., Вальчук І.В. Ендотеліоцит: фізіологія та патологія // Серце і судини.-2004.-№1.-С.105-109. NO-залежні та месенджерні процеси в нейтрофілах та ендотеліоцитах в умовах хронічної гіперімунокомплексемії та вплив на них біофлавоноїду кверцетину // Вальчук І.В., Чоп’як В.В., Павлович С.І., Коцюруба А.В., Мойбенко О.О. // Серце і судини.-2005.-№4.-С.49-57. Вальчук І.В. Ультраструктурна характеристика нейтрофільних гранулоцитів крові білих щурів при хронічній гіперімунокомплексемії та за умов застосування корвітину // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика.-Київ.-2005.-Вип.14-.Книга2.-С11-19. Вальчук І.В., Чоп’як В.В., Мойбенко О.О. Процеси синтезу оксиду азоту при хронічній гіперімунокомплексемії та їхні зміни під впливом кверцетину в умовах in vitro // Серце і судини.-2006.-№1.-С.50-57. Гіперімунокомплексний синдром в експерименті та клініці / Чоп’як В.В., Вальчук І.В., Гайдучок І.Г., Садляк О.В., Качмарська М.О., Никитюк Г.П. // Вісн. наук. дослідж.-2007.-№1.-С. 5-6. Деклараційний патент на корисну модель 13287, Україна МПК А61К 31/33. Застосування корвітину як ендотеліопротектора за умов гіперімунокомплексного синдрому: Пат.13287 МПК А61К 31/33 / Чоп’як В.В., Мойбенко О.О., Вальчук І.В., Качмарська М.О., Бідюк М.М., Любінець Л.А., Садляк О.В., Павлович С.І. (Україна).- № u200509991; Заяв. 24.10.2005; Опубл.15.03.06. Бюл.№3.- 2 с. Застосування препарату “Корвітин” у хворих із гіперімунокомплексним синдромом / Чоп’як В.В, Мойбенко О.О., Вальчук І.В., Павлович С.І. / Інформ. лист.-№ 227-2004. NO-залежні та мієлопероксидазні механізми за умов гіперімунокомплексного синдрому в експерименті / Вальчук І.В., Чоп’як В.В., Потьомкіна Г.О., Гаврилюк А.М., Колодяжна О.М., Каганяк В.Й. // Мат. Пленуму наукового товариства патофізіологів України.-Одеса.-Фізіол. журн.-2002.-Т.48, №4.-С.93-94. Вальчук І., Синенький О. Нейтрофільно-ендотеліальні процеси метаболізму оксиду азоту за умов гіперімунокомплексного синдрому в експерименті // Мат. VI міжнародного медичного конгресу студентів та молодих учених.-Тернопіль.-2002.-С.306. Вплив корвітину на ультраструктури синусоїдних гемокапілярів печінки білих щурів за умов хронічного гіперімунокомплексного процесу / Качмарська М.О., Чоп’як В.В., Ковалишин В.І., Садляк О.В., Вальчук І.В. // IV національний конгрес патофізіологів України з міжнародною участю. - Чернівці. - Клін. та експер. патологія.-2004.-Т.3, №2.-С.363-364. Вальчук І.В., Чоп’як В.В. Синтез оксиду азоту в нейтрофілах білих щурів за умов норми і хронічної гіперімунокомплексемії // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології.-Львів.-2004.-С.287. Чоп’як В.В., Вальчук І.В., Садляк О.В. Вплив корвітину на рівень циклічних нуклеотидів у щурів за умов хронічної гіперімунокомплексемії // VIII науково-практична звітно-виборча конференція Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації "Сучасні аспекти діагностики та лікування імуно- та алергопатології".-Київ.- Імунологія та алергологія.-2006.-№2.-С.127. АНОТАЦІЯ Вальчук І.В. Вплив кверцетину (корвітину) на функціональну активність нейтрофілів та ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексемії.-Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.08.-імунологія та алергологія.- Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2007. Дисертація присвячена проблемі пошуку шляхів фармакологічної корекції NO-залежних та кисневозалежних процесів у нейтрофілах, ендотеліоцитах та сироватці крові за умов експериментального хронічного гіперімунокомплексного синдрому. Встановлено, що в основі порушень функціонального стану нейтрофілів та ендотеліоцитів, за умов ХГІС, лежать значні порушення у синтезі оксиду азоту. Зміни вмісту оксиду азоту за умов ХГІС спричинені пригніченням активності конститутивної NO-синтази та активацією індуцибельної NO-синтази, інтенсивністю утворення активних форм кисню та рівня циклічних нуклеотидів. Отримані дані підтверджують розвиток оксидативного та нітрозативного стресу, що спричиняє активацію вільнорадикальних процесів та акумуляцію значних кількостей активних форм кисню, які ініціюють трансформацію ефектів NO із захисних у цитотоксичні за умов ХГІС. Застосування корвітину виявляє інтенсивну коригуючу дію в системі NO та функціональній активності нейтрофілів і ендотеліоцитів щурів з ХГІС в умовах in vitro і in vivo. Нормалізуючий ефект корвітину на систему оксиду азоту особливо проявлявся в його селективній дії на активність індуцибельної NO-синтази. Результати електронно-мікроскопічних досліджень показали, що корвітин проявляє протекторні властивості і на морфологічний стан нейтрофілів та ендотеліоцитів. Ключові слова: гіперімунокомплексний синдром, корвітин, нейтрофіли, ендотеліоцити, оксид азоту. АННОТАЦИЯ Вальчук И.В. Влияние кверцетина (корвитина) на функциональную активность нейтрофилов и эндотелиоцитов в условиях хронической гипериммунокомплексемии.-Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.08. – иммунология и аллергология.-Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца МОЗ Украины, Киев, 2007. Диссертация посвящена проблеме поиска путей фармакологической коррекции NO-зависимых и кислородзависимых процессов в нейтрофилах, эндотелиоцитах и сыворотке крови белых крыс в условиях хронического гипериммунокомплексного синдрома (ХГИС). В результате проведенных исследований установлено, что в основе нарушений функционального состояния нейтрофилов и эндотелиоцитов в условиях ХГИС, лежат изменения процессов синтеза оксида азота. Изменения уровня оксида азота в условиях ХГИС обусловлены снижением активности конститутивной NO-синтазы, активацией индуцибельной NO-синтазы, интенсивностью синтеза активных форм кислорода и уровня циклических нуклеотидов. Полученные результаты подтверждают развитие оксидативного и нитрозативного стресса, что индуцирует активацию свободнорадикальных процессов и аккумуляцию большого количества активных форм кислорода, которые инициируют трансформацию эффектов NO из защитных у цитотоксические в условиях ХГИС. Исследования свойств корвитина в условиях in vitro на функциональную активность нейтрофилов и эндотелиоцитов при их совместной инкубации показало, что корвитин способствует активации фагоцитарной активности, снижению повышенной активности миелопероксидазы и показателей спонтанного НСТ-теста нейтрофилов крыс с ХГИС. Установлено селективное ингибирующее действие корвитина и на активность индуцибельной NO-синтазы нейтрофилов и эндотелиоцитов крыс с ХГИС. Корвитин в условиях in vitro способствовал снижению уровня нитрит-анионов в нейтрофилах и повышал их уровень в эндотелиоцитах крыс с ХГИС. Исследование влияния корвитина на уровень циклических нуклеотидов показал, что корвитин в условиях in vitro стимулирует синтез цАМФ и цГМФ в эндотелиоцитах и цГМФ в нейтрофилах крыс с ХГИС. Проведенные исследования при парентеральном введении корвитина показали, что под влиянием корвитина отмечается снижение, практически до нормы, уровней циркулирующих имунных комплексов, повышение комплементарной активности сыворотки крови, а также нормализация показателей фагоцитоза крыс с ХГИС. Применение корвитина оказывает интенсивное коррегирующее действие и в системе синтеза оксида азота в нейтрофилах и эндотелиоцитах крыс с ХГИС. Установлено ингибирующее действие корвитина на активность индуцибельной NO-синтазы и активацию конститутивной NO-синтазы в нейтрофилах, эндотелиоцытах и сыворотке крови крыс с ХГИС. Под влиянием корвитина отмечается также восстановление уровней метаболитов оксида азота – нитратов и нитритов, и уровней циклических нуклеотидов. Результаты электронно-микроскопических исследований подтвердили протекторные свойства корвитина и на морфологическое состояние нейтрофилов и эндотелиоцитов. Влияние корвитина на морфологическое состояние нейтрофилов характеризировалось восстановлением их ультраструктуры и признаков нормального функционирования. Введение корвитина также способствовало востановлению ультраструктуры базальной, плазматической и внутренней эластической мембраны эндотелиальных клеток и целостности эндотелиального шара. Присуствие в эндотелии плотно упакованых эндотелиальных клеток, которые имели среднюю электронную плотность ядра и цитоплазмы багатой на рибосомы, полисомы и митохондрии, свидетельствуют о повышенных регенеративных процесах в внутренней оболонке аорты крыс с ХГИС при введении им корвитина. Экспериментальные исследования подтвердили, что в услових ХГИС корвитин выявляет цитопротекторный и эндотелийстабилизирующий эффект. Применение этого препарата даст возможность улучшить фармакологическую коррекцию гипериммунокомплексного синдрома, который сопровождается усилением свободнорадикальных процессов способных, в первую очередь, повреждать эндотелиоциты микроциркуляторного русла. Ключевые слова: гипериммунокомплексный синдром, корвитин, нейтрофилы, эндотелиоциты, оксид азота. SUMMARY Valchuk I.V. Quercetin (Corvitin) influence on functional activity neutrophils and endothelial sells due to chronic hyperimmunocomplexemia.-Manuscript. Ph.D. thesis in medical science majoring 14.03.08 – Immunology and Allergology.- Academic A. Bogomolec National Medical University, Ukraine, Kiev, 2007. The thesis is devoted to the problem of searching the ways of pharmacological correction of NO-dependent and oxygendependent processes in neutrophils, endotheliосytes and blood serum due to experimental chronic hyperimmunocomplex syndrom (CHIS). Due to CHIS considerable disorders in the synthesis of nitric oxide were determined to be the cause of functional disorders of neutrophils and endotheliocytes. The change in nitric oxide content due to CHIS were induced by the activity inhibition of constitutive NO-synthase and activaton inducible NO-synthase, intensity of formation of active oxygen forms and the levels of cyclic nucleotides. The obtained data confirmed the development of oxidative and nitrozative stress that causes the activation free radical processes and accumulation of a considerable number of active oxygen forms, which initiate transformation of NO protective effects into cytotoxic ones due to CHIS. Administration of corvitin reveals intensive corrective action in NO system and functional activity neutrophils and endotheliocytes of rats with CHIS in case in vitro and in vivo. Normalizing effect of corvitin on the nitric oxide system especially was revealed in its selective action on the iNOS activity. The results of electronic-microscopic studies showed that corvitin revealed protective properties on neutrophils and endotheliocytes. Key words: hyperimmunocomplex syndrom, corvitin, nitric oxide, neutrophils, endotheliocytes. PAGE 1

Похожие записи