.

Вплив кверцетину(корвітину) на функціональну активність нейтрофілів та ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексемії (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 3061
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ВАЛЬЧУК ІННА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 616.-56.3-092:612.017-08

Вплив кверцетину(корвітину) на функціональну активність нейтрофілів та
ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексемії

14.03.08 – імунологія та алергологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені
Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор

ЧОП’ЯК Валентина Володимирівна,

Львівський національний медичний університет

імені Данила Галицького МОЗ України,

завідувач кафедри клінічної імунології та алергології,

керівник Медичного центру клінічної імунології та алергології МОЗ
України

Офіційні опоненти доктор медичних наук, професор

БЕРЕЖНА Нінель Михайлівна,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені
Р.Є. Кавецького НАН України,

завідувач лабораторії імунології та алергології

доктор медичних наук, професор

ДРІЯНСЬКА Вікторія Євгенівна,

Інститут нефрології АМН України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач лабораторії імунології

Провідна установа Інститут фтизіатрії і пульмонології імені Ф. Г.
Яновського АМН України

Захист відбудеться “1” березня 2007 року о 1530 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному
університеті імені О.О. Богомольця за адресою: 01023, м. Київ, вул.
Шовковична, 39/1, Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2,
аудиторія кафедри шкірних та венеричних хвороб.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул.
Зоологічна, 3.

Автореферат розісланий “25” січня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02

доктор медичних наук, професор
Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення механізмів розвитку імунокомплексного
ушкодження тканин залишається актуальним питанням клінічної імунології
та алергології (Stokol T., 2004; Fernandes N., 2004; Jancar C., 2005;
Nangaku M.; 2005). Гіперімунокомплексний синдром (ХГІС) супроводжує в
клінічній практиці такі захворювання як васкуліти, альвеоліти,
ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, гломерулонефрити тощо
(Драннік Г.М., 1999, Ройт А., 2000, Sell S., 1996) Попри велику
кількість вивчених механізмів розвитку імунокомплексного ушкодження
судин та внутрішніх органів, науково-дослідні роботи останнього часу
засвідчують, що в основі розвитку ХГІС лежать також порушення процесів
синтезу оксиду азоту (NO) та розвиток внутрішньоклітинного оксидативного
стресу, індукторами якого можуть бути як активні форми кисню, так і
активні форми азоту (Сагач В.Ф., Маянский А.Н., 2004, Gomez-Cuerrero C.,
2002; Kanashiro A., 2004; Jancar C., 2005). До найбільш імовірних джерел
активних кисневих та азотовмісних метаболітів при ХГІС відносять
поліморфноядерні лейкоцити, а основними мішеневими клітинами цих речовин
є ендотеліоцити (Бережная Н.М., 2005; Jones S., 2001; Chilcoat C., 2002;
Montovani B., 2003). Саме посилення нейтрофільно-ендотеліальних
взаємодій є одним із важливих аспектів оксидативного ушкодження судин
(Galkina S., 2004; Norman M., 2005). Підтвердження імунорегуляторної
ролі NО в імунокомплексних процесах, його впливу на взаємодію ефекторних
та мішеневих клітин за цих умов, послужило поштовхом для з’ясування
участі NO-залежних механізмів у розвитку нейтрофільно-ендотеліальних
взаємодій за умов ХГІС (Оkayama N., 1998; McIntyre T., 2003). Оцінка
ролі цих механізмів може мати велике значення у з’ясуванні процесів
розвитку порушень судинної стінки за умов ХГІС, а їх поглиблене вивчення
сприяє пошукові речовин, здатних попереджувати і коригувати ці
пошкодження.

Дослідження останніх років показують перспективність використання
біофлавоноїдів в корекції ХГІС (Kanashiro A., 2004 ). У цьому сенсі
цікавим є природний флавоноїд – кверцетин, а саме – його нова
водорозчинна лікарська форма – корвітин. Біологічна активність цього
препарату зумовлена його здатністю хелатувати іони із змінною
валентністю, взаємодіяти з вільними радикалами та запобігати утворенню
гіпохлорит аніону (Мойбенко О.О., Максютіна Н.П., 2000; Потапович А.І.,
2003; Kostjuk V., 2003). Позитивна дія корвітину обумовлена також його
модулюючим впливом на продукцію лейкотрієнів, циклооксигенази 1, 2 та
аніонів оксиду азоту (Пархоменко О.Н., Коваль С.Б., Chakravorty M.,
2001; Chen J., 2005; Sanches M. 2006; Morales A., 2006). Таким чином,
з’ясування особливостей нейтрофіло- та ендотеліоцитопосередкованих
NO-залежних механізмів за умов застосування корвітину дозволить
розширити наші уявлення про процеси розвитку ХГІС та можливості
попередження і терапії цих імунопатій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота є фрагментом планової міжкафедральної науково-дослідної роботи на
тему “Імуно-ендотеліально-епітеліальнозалежні механізми в розвитку
гіперімунокомплексного синдрому в експерименті і клініці”, яка
виконувалась на кафедрах клінічної імунології та алергології,
патологічної фізіології та ендоскопії і малоінвазивної хірургії
Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького
(№ держреєстрації 0101U009233). Тема дисертаційної роботи затверджена
проблемною комісією МОЗ та АМН України “Клінічна імунологія та
алергологія” 20 квітня 2004 р. (протокол №3).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було вивчення впливу
корвітину на імунологічні, NO-залежні механізми та структуральні зміни
нейтрофілів та ендотеліоцитів при ХГІС в умовах in vitro та in vivo.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

Вивчити вплив корвітину на захоплювальну та ферментативну активність
нейтрофілів у нормі та за умов ХГІС при їх інкубації з ендотеліоцитами.

Оцінити in vitro вплив корвітину на особливості синтезу NO та циклічних
нуклеотидів у нейтрофілах та ендотеліоцитах при їх сумісній інкубації в
нормі та за умов ХГІС.

Дослідити фагоцитарну та кисневозалежну, окисно-відновну ферментативну
активність нейтрофілів у нормі та за умов ХГІС, а також вплив на ці
процеси корвітину.

Проаналізувати вплив корвітину на процеси синтезу оксиду азоту та
циклічних нуклеотидів у ендотеліоцитах, нейтрофілах та сироватці крові в
нормі та за умов ХГІС.

Охарактеризувати та інтерпретувати електронно-мікроскопічні зміни в
ендотеліоцитах та нейтрофілах у нормі, при ХГІС та за умов застосування
корвітину.

Об’єкт дослідження – нейтрофіли, ендотеліоцити та сироватка крові
інтактних щурів та щурів із змодельованим ХГІС до та після введення їм
корвітину, а також нейтрофіли та сироватка крові хворих із
гіперімунокомплексним синдромом.

Предмет дослідження – показники захоплювальної, кисневозалежної та
окисно-відновної активності нейтрофілів, ізоформи NO-синтаз –
конститутивна (сNOS) та індуцибельна (iNOS), метаболіти оксиду азоту
NO2- – та NO3– аніони, циклічні нуклеотиди (цАМФ і цГМФ),
ультраструктура нейтрофілів та ендотеліоцитів інтактних щурів та щурів
із змодельованим ХГІС до та після введення їм корвітину

Методи дослідження – визначення вмісту ЦІК, гемолітичної активності
комплементу сироватки крові та функціональної здатності нейтрофілів –
захоплювальної здатності, спонтанного та стимульованного НСТ-тесту,
активності мієлопероксидази, катіонно-білкового тесту; визначення
інтенсивності процесів синтезу оксиду азоту за рахунок оцінки активності
ферментів NO-синтаз, рівня його стабільних метаболітів – NO2– та
NO3–аніонів та рівня циклічних нуклеотидів; дослідження ультратонкої
структури нейтрофілів та ендотеліоцитів за допомогою методу електронної
мікроскопії.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше досліджено вплив корвітину
за умов in vitro на показники синтезу NO та рівня циклічних нуклеотидів
у нейтрофілах та ендотеліоцитах інтактних і дослідних тварин при їх
сумісній інкубації, що проявлялось його селективним інгібуючим впливом
на активність iNOS та підвищенням рівнів цАМФ і цГМФ, як в нейтрофілах,
так і в ендотеліоцитах. Уперше на основі отриманих результатів
встановлено порушення процесів синтезу оксиду азоту, зокрема
NO-синтазного його шляху, в нейтрофілах та ендотеліоцитах при ХГІС.
Встановлено, що застосування корвітину коригує процеси синтезу NO за
рахунок зменшення активності iNOS та нормалізації активності cNOS у
нейтрофілах, ендотеліоцитах та сироватці крові щурів і гальмуючого
впливу на окисно-відновні процеси та активність мієлопероксидази в
нейтрофілах щурів з ХГІС. Уперше встановлено, що розвиток ХГІС
супроводжується зниженням синтезу цАМФ і цГМФ в нейтрофілах та
ендотеліоцитах та підвищенням рівня цГМФ в сироватці крові щурів.
Введення корвітину значною мірою регулює рівень їх синтезу. Уперше
показано коригуючий ефект корвітину на морфологічний стан нейтрофілів та
ендотеліальних клітин при ХГІС.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень
інкубації нейтрофілів і ендотеліоцитів у присутності корвітину
доповнюють відомості про його участь в регуляції процесів синтезу оксиду
азоту, однієї з ланок механізмів розвитку ендотеліальної дисфункції за
умов ХГІС. Отримані дані підтверджуть перспективність застосування
корвітину з метою корекції порушень процесів синтезу NO в нейтрофілах та
ендотеліоцитах при ХГІС, що дозволить попереджати пошкодження тканин за
цих умов.

Отримані результати дають можливість рекомендувати корвітин як
ендотеліопротектор та стимулятор фагоцитозу для застосування в
комплексній терапії хворих з ХГІС.

Теоретичні і практичні узагальнення роботи викладені у інформаційному
листі (№227-2004), деклараційному патенті на корисну модель (№ 13287) та
актах впровадження, які використовуються у клінічній практиці
Львівського обласного клінічного діагностичного центру, Центрального
клінічного військового госпіталю 1120 Західного оперативного
командування, Львівській обласній дитячій клінічній лікарні, 1-й міській
клінічній лікарні м. Львова ім. Князя Лева, Чернівецькій обласній
клінічній лікарні, Тернопільській обласній комунальній клінічній лікарні
та навчальному процесі кафедр клінічної імунології та алергології,
патологічної фізіології Львівського національного медичного
універсистету ім. Данила Галицького, кафедрі внутрішньої медицини з
курсом клінічної імунології та алергології Тернопільського державного
медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедрі клінічної
імунології та алергології Кримського державного медичного університету
ім. С.І. Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим
дослідженням. На основі проведеного інформаційного пошуку та
літературного огляду спільно з науковим керівником автором сформульовано
мету і завдання дослідження та вибрано адекватні моделі і методики. Під
час виконання експериментальної частини здобувач брала участь у
моделюванні ХГІС та проведенні його корекції. Самостійно проводила
імунологічні методи дослідження, підготувала зразки для проведення
електронної мікроскопії. Автор висловлює подяку ст.н.сп Інституту
біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, к.б.н. Коцюрубі А.В. за
сприяння у виконанні біохімічних досліджень, к.б.н. Ковалишину В.І.
співробітнику лабораторії електронної мікроскопії Львівського
національного медичного університету ім. Данила Галицького за допомогу
при проведенні електронно-мікроскопічних досліджень, академіку НАН
України Мойбенку О.О. за надання препарату – корвітину для досліджень.
Автор самостійно провела статистичну обробку результатів дослідження та
проаналізувала і узагальнила отримані результати, підготувала публікації
до друку. Висновки сформульовано спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
представлені на VI Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих
учених (Тернопіль, 2002), Пленумі наукового товариства патофізіологів
України (Одеса, 2002), Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004), науково-практичному семінарі з
міжнародною участю “Клінічна імунологія та алергологія: погляд у
майбутнє (Львів-Трускавець, 2004), IV національному конгресі
патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004),
науково-практичній конференції “Стан і перспективи розвитку медичної
генетики, алергології та клінічної імунології” (Трускавець, 2005), VIII
науково-практичній звітно-виборчій конференції Українського товариства
фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації “Сучасні аспекти
діагностики та лікування імуно- та алергопатології” (Київ, 2006),
спільному засіданні Львівської обласної філії НМТ патофізіологів і
кафедр клінічної імунології та алергології, патологічної фізіології та
ендоскопії і малоінвазивної хірургії Львівського національного медичного
університету ім. Данила Галицького (Львів, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт, з яких 5 статтей
– у фахових наукових журналах, 1 інформаційний лист, 1 деклараційний
патент на корисну модель, 5 тез доповіді у матеріалах наукових з’їздів,
конференцій та конгресів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках
друкованого тексту, з яких 33 сторінки становить список використаних
джерел, містить 11 таблиць та 30 рисунків, з яких 16 є мікрофото.
Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та
методів дослідження, 4 розділів результатів власних досліджень, їх
узагальнення, висновків та списку використаних джерел. Перелік
використаних джерел – 333 посилання, з яких 104 є вітчизняними і 231 –
зарубіжними.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані
на статевозрілих білих щурах-самцях масою 200-250 г. Позаяк показники
імунної системи змінюються залежно від пори року, дослідження проводили
в осінньо-зимовий період протягом 2001-2004 років. Експериментальні
втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних
принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які
використовуються для експериментальних наукових цілей (Страсбург, 1985),
ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією
з питань біоетики Львівського національного медичного університету ім.
Данила Галицького (протокол № 8 від 15.12.2004р.) порушень вимог не
виявлено. У процесі дослідження використано 280 тварин, яких розподіляли
на групи: перша – інтактні щури, які отримували плацебо і служили
контролем; друга – тварини із змодельованим ХГІС; третя – інтактні щури,
які отримували корвітин; четверта – щури з ХГІС, які отримували
корвітин.

Модель ХГІС створювали за допомогою класичної моделі C. Cohrane та
D.Kofler (1973) у модифікації R. Williams (1980) та посилаючись на праці
попередніх досліджень Чоп’як В.В.(1998). Для цього у хвостову вену щура
кожні 7 днів упродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін
(НВФ “Simko Lpd”, Україна) з розрахунку 100 мг/кг маси тіла. Розчин
корвітину (виробництва ЗАТ НВЦ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний
завод”, Україна) вводили внутрішньоочеревинно в дозі 40мг/кг раз на добу
впродовж 10 днів.

Отримання клітин нейтрофілів проводили на подвійнoму градієнті щільності
розчинів фікол (Ficoll-400-“Pharmacia Fine Hemical”, Швеція) –
урографіну (Urografin – “Schering”, Німеччина) (с1=1,095 г/см3 та
с2=1,077 г/см3) (Фрімель Г., 1987). Ендотеліальні клітини виділяли із
черевної аорти щура за допомогою методу ферментативного диспергування з
використанням 0,1% розчину колагенази (“Fluka Chemic A.G” Німеччина)
(Коваленко Т.М., 1999). Життєздатність клітин визначали за допомогою
0,1% розчину трипанового синього.

Інкубацію ізольованих нейтрофільних гранулоцитів та ендотеліальних
клітин проводили у середовищі 199 (РАМН Институт полиомиелита и вирусных
энцефалитов, Москва) з 20% вмістом телячої ембріональної сироватки (НВП
“Сангва”, Україна) в 24 лункових пластикових планшетах (“Sigma”, США).
Для запобігання змішування клітин нейтрофілів та ендотеліоцитів
використовували вставки з напівпроникними мембранами з діаметром пор 3(м
(“Sigma”, США). У кожну лунку планшети вносили виділені ендотеліоцити та
нейтрофіли у концентрації 3?106/мл у співвідношенні 1:1. Клітини
інкубували в термостаті при 370С в атмосфері з 5% вмістом СО2 впродовж 1
год (Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., 2000). Після інкубації клітини відбирали
і використовували для подальших досліджень. Для визначення впливу
корвітину на функціональну активність нейтрофілів та ендотеліоцитів
інтактних та тварин із змодельованою ХГІС в умовах in vitro в лунку
планшети вносили розчин корвітину в дозі 1?10-4г/л. Дозу застосування
корвітину визначали на підставі літературних даних (Мойбенко О.О., 2000;
Караванская И.Л., 2002).

Окрім цього, для дослідження використовували нейтрофіли і сироватку
крові 90 хворих (чоловіків – 25, жінок – 65, середній віх хворих
становив 40,2±17,2 роки) із підтвердженим гіперімунокомплексним синдром,
які знаходились на тривалому моніторному спостереженні у Львівському
регіональному медичному центрі клінічної імунології та алергології.

Визначення вмісту ЦІК у сироватці крові проводили за допомогою методу
преципітації в поліетиленгліколі – 6000 (Осипов С.Г., 1983, Логинский
В.Е., 1983). Комплементарну активність сироватки крові визначали за
методом 50% гемолізу еритроцитів (Фрімель Г., 1987). Для оцінки
нейтрофільного статусу проводили визначення захоплювальної здатності
нейтрофілів (латексний тест) – із підрахунком фагоцитарного показника
(ФП) – відсоток клітин, які беруть участь у фагоцитозі та фагоцитарного
числа (ФЧ) – середня кількість частинок латексу, захоплених однією
клітиною (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003). Для визначення здатності
нейтрофілів генерувати супероксиданіон радикали використовували
нітросиній тетразолієвий тест (НСТ), спонтанний (НСТсп) і стимульованний
(НСТст) зимозаном (Нагоев Б.С., Шубич М.Ф., 1981), що ґрунтується на
відновленні нітротетразолію синього супероксидними радикалами до
нітроформазану. Активність мієлопероксидази визначали за швидкістю
розкладу пероксиду водню (Klеbanoff S.I., 1968). Для оцінки показників
протеазних ферментативних процесів у нейтрофілах використовували
лізосомально-катіонний тест -ЛКТ (Шубич М.Ф., 1975).

Активність індуцибельної (iNOS) і конститутивної (сNOS) NO-синтаз
визначали колориметричним методом (Selter M., 1991) за визначенням
вмісту кінцевих метаболітів NO – нітрит-аніонів. Вміст нітрит-аніонів
визначали за допомогою методу Гріна в модифікації Коцюруби А.В. (Green
L.C., 1982, Коцюруба А.В., 2000), нітрат-аніонів (Bank N.R., 1993).

Вміст цАМФ та цГМФ визначали радіоімунним методом за допомогою
стандартних наборів реактивів “[3H]-cAMP RIA kit” і “[3H]-cGMP RIA kit”
(“Amersham”, Великобританія).

Дослідження ультратонкої структури нейтрофільних гранулоцитів та
ендотеліальних клітин проводили методом трансмісійної електронної
мікроскопії за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100.

Статистичну обробку результатів дослідження проводили із застосуванням
статистичного пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windows. Для
оцінки достовірності відмінностей виборок використовували
непараметричний метод за критерієм Wilcoxona.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для реалізації поставленої мети проводили сумісну інкубацію ізольованих
клітин нейтрофілів та ендотеліоцитів без корвітину і за умов його
присутності в інкубаційному середовищі. Дослідження проводили в
контрольній групі щурів та в щурів із змодельованим ХГІС. Результати
отримані в умовах in vitro за умов сумісної інкубації нейтрофілів і
ендотеліоцитів показали вірогідне зниженням захоплювальної здатності
(Р 2 : >

@

Fj?aet

?

u

(

*

,

.

&

F1

>

acQза умов ХГІС співвідношення концентрації нітрит- і нітрат-аніонів у 4
рази нижче цього показника в контролі (Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020