КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ДВОРЩЕНКО КАТЕРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 577.23/.346:57.044:54-39

Вплив іонізуючої радіації та пероксиду водню на показники
окисно-антиоксидантної рівноваги та енергетичного обміну в тимоцитах і
гепатоцитах in vitro

03.00.04 — біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ — 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти: кандидат біологічних наук

Петрова Галина Вадимівна,

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна

НАН України,

старший науковий співробітник

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології,

онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького

НАН України,

провідний науковий співробітник

Провідна установа: Чернівецький національний університет імені Юрія
Федьковича, м. Чернівці

Захист відбудеться “23” лютого 2004 р. о 1400 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, проспект
Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.433 (конференцзал).

Поштова адреса: 01017, Київ-17, вул. Володимирська, 64.

Спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “20“ січня 2004 року

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради
Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протягом останніх років інтенсивно досліджуються
біохімічні механізми підтримання клітинного гомеостазу за умов дії
стресорних та пошкоджуючих факторів. Одним з таких механізмів, який
забезпечує вибіркове видалення окремих ушкоджених клітин у випадку
значного порушення стабільності геному, є апоптоз. Індукція цієї форми
клітинної загибелі залежить від поєднання багатьох факторів, таких, як
тип клітини, ступінь диференціації, експресія відповідних рецепторів на
поверхні клітини, природа апоптогенного чинника, тривалість та
інтенсивність його дії та ін. Насьогодні недостатньо дослідженим
залишається так званий “безрецепторний” шлях апоптозу, який може
активуватись після дії нефізіологічних факторів — ультрафіолетового
випромінювання, іонізуючої радіації, цитотоксичних агентів, окисного
стресу та ін. Припускається, що у цьому випадку відповідь клітин на дію
чинника контролюється на рівні сигналів, які виникають внаслідок
ушкодження ядерної ДНК або вивільнення з мітохондріального матриксу або
міжмембранного простору апоптогенних факторів (Lowe S., 1993, Zamzami
N., 2001). Важливу роль у ініціації такої форми відповіді клітин
відіграють неконтрольоване утворення активних форм кисню (АФК) у
клітині, порушення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, кальцієвого
гомеостазу, структурно-функціонального стану мітохондрій, бар’єрних
властивостей мітохондріальних мембран, розриви ДНК (Sun X., 1994,
Crompton M., 1999, Владимиров Ю., 2002), однак причинно-наслідкові
взаємозв’язки та динаміку цих процесів остаточно не з’ясовано.

Ефективним підходом до вивчення впливу екзогенних чинників різної
природи на підтримання клітинного гомеостазу є моделювання їх дії in
vitro з використанням суспензії ізольованих клітин, зокрема, тимоцитів
та гепатоцитів, які розрізняються за ступенем диференціації,
стабільністю генома, метаболічною активністю. Це дозволяє вивчати
біохімічні зміни, не опосередковані процесами, які відбуваються на
органному та організменному рівнях, уникнути небажаних наслідків
зміненої експресії багатьох генів, як це має місце у випадку клітинних
ліній, а також проводити дослідження на рівні цілої клітини та її
окремих компартментів.

Особливо актуальним є дослідження біохімічних механізмів апоптогенної
дії таких чинників, як іонізуюча радіація та пероксид водню. Хоча
безпосередньою мішенню радіації вважається ДНК, опромінення
супроводжується також значним утворенням активних форм кисню вздовж
треку іонізації та змінами у проведенні регуляторних сигналів (Mydgley
C., 1995). Пероксид водню є універсальним індуктором окисного стресу,
здатним ініціювати міжнуклеосомну фрагментацію ДНК у клітинах різних
типів (Oyama Y., 1999, Kanno S., 2000). Виявлення відмінностей та
спільних ланок у проявленні ушкоджуючої дії цих чинників є важливим для
розуміння загальних закономірностей механізмів загибелі та адаптації
клітин.

Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану
науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана
у рамках теми № 01 БФ 036-04 “Розробка наукових основ пошуку
біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ державної реєстрації
0101U002291).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи — у модельних експериментах на
суспензіях ізольованих тимоцитів та гепатоцитів щурів провести
порівняльне дослідження показників структурного стану ДНК клітин,
активності антиоксидантної системи та структурно-функціонального стану
мітохондрій на ранньому етапі після дії іонізуючої радіації та пероксиду
водню для з’ясування закономірностей проявлення апоптогенного ефекту цих
чинників.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1. оцінити життєздатність клітин у суспензії та структурний стан ДНК
клітин за інкубації після дії радіації та пероксиду водню;

2. дослідити електроктрофоретичну рухомість клітин та визначити величину
їх електрокінетичного потенціалу у контролі та після дії досліджуваних
чинників;

3. дослідити супероксиддисмутазну та каталазну активність клітин у
ранній період після дії радіації та та визначити вміст первинних та
кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів у мітохондріальній та
ядерній фракціях;

4. визначити інтенсивність поглинання кисню тимоцитами та гепатоцитами у
суспензії у контролі та після опромінення чи додавання пероксиду водню;

5. визначити вміст аденілових нуклеотидів, аденозину та аденіну у
тимоцитах і гепатоцитах після дії досліджуваних чинників;

6. оцінити вплив ротенону та циклоспоріну А на структурний стан ДНК
клітин, піданних дії радіації та пероксиду водню.

Об’єкт дослідження — біохімічні шляхи ініціації апоптозу у клітинах під
дією радіації та пероксиду водню.

Предмет дослідження — життєздатність клітин, міжнуклеосомна фрагментація
хроматину, електрокінетичний потенціал клітин, супероксиддисмутазна та
каталазна активність, інтенсивність поглинання кисню клітинами, вміст
дієнових кон’югатів та шиффових основ у ядерній та мітохондріальній
фракціях, вміст АТФ, АДФ, АМФ, аденозину та аденіну у клітинах.

Методи дослідження — світлова мікроскопія, МТТ-тест, спектрофотометрична
оцінка вмісту полідезоксирибонуклеотидів, електрофоретичне визначення
електрокінетичного потенціалу клітин, спектрофотометричне визначення
супероксиддисмутазної та каталазної активності, оцінка інтенсивності
поглинання кисню клітинами полярографічним методом, визначення вмісту
дієнових кон’югатів за УФ-поглинанням гептанових екстрактів та вмісту
шиффових основ флуориметричним методом, розділення та оцінка вмісту АТФ,
АДФ, АМФ, аденозину та аденіну методом тонкошарової хроматографії та
прямої денситометрії пластин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльну
оцінку впливу іонізуючої радіації та пероксиду водню на структурну
цілісність ДНК та показники стану антиоксидантної і аденілової систем
тимоцитів та гепатоцитів щурів і обгрунтовано використання суспензій
ізольованих тимоцитів та гепатоцитів як моделі для вивчення механізмів
апоптозу, індукованого радіацією та окисним стресом. Встановлено
однотипність змін досліджуваних показників у підданих дії 0,1 мМ Н2О2
тимоцитах та гепатоцитах, які передують міжнуклеосомній фрагментації ДНК
та виявляються у прискоренні поглинання кисню клітинами, зростанні їх
електрокінетичного потенцаілу, підвищенні супероксиддисмутазної
активності, інтенсифікації процесів ПОЛ у мітохондріальній фракції.
Вперше виявлено порушення стаціонарного стану системи АТФ-АДФ-АМФ та
раннє зниження вмісту АТФ та АДФ у опромінених тимоцитах та підданих дії
Н2О2 тимоцитах та гепатоцитах. Вперше встановлено, що блокатор
мітохондріальної неселективної пори циклоспорін А пригнічує фрагментацію
ДНК у клітинах, підданих дії пероксиду водню.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють
уявлення про шляхи формування відповіді клітин на дію стрес-агентів та
про механізми ініціації апоптозу в умовах дії іонізуючої радіації та
окисного стресу. Результати роботи можуть бути використані для
моделювання апоптозу in vitro у клітинах різних типів. Одержані дані
можуть бути корисними для розробки методів корекції патологічних змін
клітинного гомеостазу, а також для направленого пошуку препаратів,
здатних ініціювати або пригнічувати загибель клітин.

Особистий внесок здобувача. Текст дисертації, формулювання основних
положень та оформлення роботи виконано безпосередньо автором.
Дисертантом особисто здійснено підбір та аналіз літературних даних,
інтерпретацію одержаних результатів та їх статистичну обробку,
оформлення рисунків і таблиць. Усі експериментальні результати отримані
дисертантом особисто або за його безпосередньої участі. Результати
розділу 3.3., отримано за участі с.н.с. інституту експериментальної
патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького Яніша Ю.В. і
опубліковано у спільній статті.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи
були представлені на: Міжнародному екологічному конгресі “Новое в
экологии и безопасности жизнедеятельности” (Санкт-Петербург, Россия. —
2000), Міжнародній науковій конференції “Conference for students, PhD
students and young scientists on molecular biology and genetics” (Kyiv,
Ukraine. — 2001), Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні
проблеми гастроентерології” (Київ, Україна. — 2001), IV з’їзді по
радіаційним дослідженням (Москва, Россия. — 2001), ХVI з’їзді
Українського фізіологічного товариства (Вінниця, Україна. — 2002), VIII
Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, Україна. — 2002), III з’їзді
Українського біофізичного товариства (Львів, Україна. — 2002),
науково-практичній конференції “Актуальні питання гігієни та екологічної
безпеки України” (Київ, Україна. — 2003).

Публікація матеріалів. Основні положення дисертаційної роботи
опубліковано в 16 наукових публікаціях (7 статей і 9 тез) у профільних
вітчизняних журналах та збірниках матеріалів з’їздів і конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 145
сторінках друкованого тексту, містить 26 рисунків, 5 таблиць. Робота
складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів
дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключення,
висновків, списку використаних джерел (235 посилань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Досліди проводили на щурах лінії Вістар
обох статей вагою 120–150 г, яких утримували на стандартному раціоні
віварію.

Тимоцити отримували шляхом протирання тимуса через нейлонову сітку у
середовище RPMI-1640. Для отримання морфологічно та фукціонально
інтактних гепатоцитів було використано методику неферментативного
отримання гепатоцитів з печінки, перфузованої in situ розчином Хенкса
(Кравченко Л.П. та ін., 1989). Оцінку життєздатності клітин проводили за
тестом з МТТ (Carmichael J., et al, 1987) та сукцинатом (Петренко А.Ю.,
1991). Інкубацію клітин (2–4·106 клітин/мл) здійснювали у термостаті при
37оС у середовищі RPMI-1640, що містило 5% ембріональну телячу
сироватку.

Опромінення клітинної суспензії здійснювали на установці РУМ-17 за таких
умов: експозиційні дози — 2,58·10–2 Кл/кг (1 Гр) та 11,61·10–2 Кл/кг
(4,5 Гр), потужність дози — 0,24 Гр/хв, фільтри 0,5 мм (Сu + Аl),
напруга 200 кВ, сила струму 10 мА, фокусна відстань — 50 см. Пероксид
водню додавали у середовище інкубації клітин до кінцевої концентрації
0,1 або 1 мМ.

Клітини руйнували гомогенізацією у 10-кратному об’ємі буфера (мМ):
сахароза — 250, KCl — 50, NaH2PO4 — 2,5, MgCl2 — 2, HEPES — 10, pH 7,4,
у гомогенізаторі Поттера. Гепатоцити перед гомогенізацією переводили у
гіпоосмотичний ТМК-буфер (мМ): трис НСl — 10, МgCl2 — 3, КСІ — 25, рН
7,4. Гомогенат центрифугували 1500 g, 10 хв. Надосадову використовували
для отримання мітохондріальної фракції (15000 g,15 хв при +4оС), а осад
(грубу ядерну фракцію) — для отримання очищеної ядерної фракції методом
центрифугування у градієнті сахарози (15000 g, 45 хв) у присутності
інгібітора протеїназ фенілметилсульфанілфториду (0,1 мМ) (Борисов С.І.
та ін., 1999).

Кількість високомолекулярної та фрагментованої ДНК визначали за методом
Бартона (Burton K., 1956). Для встановлення характеру фрагментів ДНК
проводили їх розділення у 1,5% агарозному гелі. ДНК з депротеїнізованих
проб екстрагували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (Коваль Т.В. та
ін., 2001).

Розрахунок величини електрокінетичного потенціалу клітин проводили після
їх електрофоретичного розділення у фосфатному буфері (Иенсен Г.Л.,
1979).

Екстракцію шиффових основ та дієнових кон’югатів ненасичених жирних
кислот з клітинних фракцій проводили сумішшю гептан/ізопропіловий спирт
у співвідношенні 1:1. Гептанову фазу відбирали для визначення вмісту
шиффових основ на флуориметрі RF-510, Shimаdzu (Японія) за умов
?збуд=360 нм і ?еміс=420 нм. (Колесова О.Е. та ін., 1984). Для
визначення дієнових кон’югатів до гептанової фази додавали 96% етиловий
спирт у співвідношенні 1:5 та вимірювали поглинання при ?==233 нм на
спектрофотометрі СФ-46 (Гаврилов В.Б. та ін., 1988).

Супероксиддисмутазну активність визначали за відновленням нітросинього
тетразолію (НСТ) (Чевари С., та ін., 1985), каталазну активність — за
швидкістю розкладу пероксиду водню (Королюк М.А. та ін., 1988).

Інтенсивність поглинання кисню клітинами оцінювали полярографічним
методом (Петренко А.Ю., 1991).

Розділення та кількісне визначення аденіннуклеотидів, аденозину та
аденіну проводили методом тонкошарової хроматографії клітинних
екстрактів на пластинах Silufol-UV254 (Чехія) та прямої денситометрії
пластин при л=260 нм на швидкісному сканері денситометра CS-920
“Shimadzu” (Японія) (Зарубина И.В. та ін., 1982).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили загальноприйнятими
методами варіаційної статистики (Плохинский М., 1981). Розрахунки та
побудову графіків виконували на комп’ютері з використанням прикладних
програм: “Origin 5,0” та “Microsoft Excel 98”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження життєздатності клітин та структурного стану ДНК після
опромінення або додавання пероксиду водню. За інкубації опроміненої
суспензії тимоцитів спостерігалось зниження кількості клітин, яке
залежило від дози радіації і розвивалось пропорційно до часу інкубації.
Кількість життєздатних тимоцитів у суспензії знижувалась через 5 год
після опромінення у дозі 1 Гр на 32%, а у дозі 4,5 Гр — на 45% порівняно
з контролем. Після рентгенівського опромінення суспензії гепатоцитів ми
не виявили достовірних змін у кількості клітин навіть за підвищення дози
опромінення до 10 Гр. Ці дані узгоджуються з літературними щодо високої
чутливості лімфоцитів у суспензії та культурі до дії іонізуючої радіації
(Lowe S.W., et al., 1993, Meyn R.E., et al., 1993) та щодо зниження
кількості гепатоцитів у суспензії лише після г-опромінення у високих
дозах (Солдатенков В.А. та ін., 1987, Kroll B., 1998).

Як показник структурної цілісності ДНК досліджували вміст
полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) — низькомолекулярних фрагментів ДНК,
які накопичуються у випадку утворення розривів ДНК та екстрагуються з
хроматину у розчин з низькою іонною силою. Вміст ПДН у тимоцитах за
інкубації після опромінення у дозах 1 Гр та 4,5 Гр зростав і через 5 год
становив 44% та 56% від загального вмісту ДНК у клітинах відповідно
(рис. 1А).

Після рентгенівського опромінення суспензії гепатоцитів спостерігається
зниження вмісту низькомолекулярних фрагментів ДНК у клітинах порівняно з
контролем (рис. 1Б). Після рентгенівського опромінення у дозі 4,5 Гр
зменшення кількості накопичених ПДН у гепатоцитах відмічено через 5 год,
а після дії у дозі 10 Гр — через 3 год. Можливо, що після опромінення
гепатоцитів у більш високих дозах пороговий рівень ушкоджень ДНК, за
якого активуються репаративні системи, досягається у більш ранній термін
(Zaalishvili T.M., 2000).

За інкубації суспензії тимоцитів та гепатоцитів у присутності 0,1 мМ
Н2О2 достовірних змін у кількості життєздатних клітин виявлено не було.
При підвищенні концентрації Н2О2 до 1 мМ спостерігалось зниження
кількості тимоцитів на 36%, а гепатоцитів — на 33% порівняно з контролем
через 5 год після початку інкубації.

Структурна цілісність ДНК у тимоцитах та гепатоцитах, інкубованих у
присутності пероксиду водню, порушувалась — вміст ПДН зростав упродовж
перших 3-х годин інкубації і через 5 год досягав 37% та 42% від
загального вмісту ДНК у клітинах відповідно незалежно від концентрації
доданого Н2О2.

Для встановлення характеру фрагментів ДНК, накопичених у тимоцитах та
гепатоцитах після додавання Н2О2 та у тимоцитах після дії радіації, було
проведено електрофоретичне розділення ДНК клітин у 1,5% агарозному гелі
(Коваль Т.В. та ін., 2001). Накопичені фрагменти були кратними довжині
нуклеосомної ДНК — 200 п. о. і розподілялись на електрофореграмі у
вигляді “драбини”. Такий міжнуклеосомний характер розщеплення ДНК є
загальновизнаним маркером апоптозу.

Отримані результати узгоджуються з літературними даними щодо апоптичної
загибелі клітин під дією досліджуваних чинників. Так, процес
міжнуклеосомної фрагментації ДНК тимоцитів за радіаційного апоптозу
характеризується наявністю лаг-періоду довжиною 0,5-2 год та
пропорційністю між вмістом накопичених фрагментів ДНК і величиною дози
опромінення у діапазоні 0,5-6 Гр (Zhivotovsky B., 1982, Уманский С.Р.,
1996). Виявлений у клітинах різних типів ефект пероксиду водню залежить
від його концентрації — за присутності у середовищі Н2О2 у
концентраціях, що перевищують 1 мМ, спостерігається некротична загибель
клітин, тоді як після впливу 30-200 мкМ Н2О2 спостерігаються типові
ознаки апоптозу (Oyama Y., 1999, Akao M., 2001).

Виявлена динаміка міжнуклеосомної фрагментації ДНК та зниження кількості
життєздатних клітин після дії іонізуючої радіації та пероксиду водню
дозволили оцінити тривалість періоду, що передує незворотній,
“виконавчій” стадії апоптозу, на якій відбувається конвергенція
різноманітних сигнальних шляхів апоптозу до такого універсального
механізму, як розщеплення хроматину ендонуклеазами. Для з’ясування
ранніх біохімічних порушень, які можуть ініціювати апоптоз, нами було
обрано період до 3-х год інкубації клітин після дії радіації у дозі 4,5
Гр та додавання пероксиду водню у кінцевій концентрації 0,1 мМ.

Зміна величини електрокінетичного потенціалу клітин після дії радіації
та пероксиду водню. Хоча дія радіації та пероксиду водню не
опосередкована специфічним впливом на рецептори клітинної поверхні, вона
може проявлятись на рівні плазматичної мембрани як однієї з мішеней.
Показником структурного стану плазматичної мембрани клітин може бути
електрофоретична рухомість клітин та величина електрокінетичного
потенціалу (ЕКП), що залежить, насамперед, від співвідношення величин
зарядів фосфоліпідів на поверхні клітини. Суспензія контрольних
тимоцитів представлена клітинами, величина ЕКП яких коливається від 6,2
до 24,5 мВ, біля 50% клітин характеризуються середнім значенням ЕКП
14,05±0,5 мВ (рис. 2). Такий характер розподілу за електрофоретичною
рухливістю зберігався упродовж 3-годинної інкубації контрольних клітин.

Через 1 год після рентгенівського опромінення суспензії тимоцитів
середнє значення ЕКП клітин зростало до 24,5±0,8 мВ. Через 3 год
виявляється ще одна субпопуляція клітин із середнім значенням ЕКП
35,7±0,5 мВ (рис. 2А). Після додавання пероксиду водню до суспензії
спостерігалась більш значна зміна величини ЕКП тимоцитів — вже через 1
год виявлялись дві субпопуляції клітин зі значенням ЕКП вищим, ніж у
контролі (рис. 2Б). Виявлені особливості зміни ЕКП клітин відбивають, на
нашу думку, наявність різних за чутливістю до дії досліджуваних чинників
пулів тимоцитів, що перебувають на різних етапах диференціації або
клітинного циклу.

Після додавання Н2О2 до суспензії гепатоцитів також спостерігалось
підвищення величини ЕКП клітин порівняно з контролем — через 1 год
виявляються дві приблизно однакові за кількістю клітин субпопуляції із
середнім значенням ЕКП 36,93±0,84 мВ та 46,08±0,69 мВ. Після
рентгенівського опромінення суспензії гепатоцитів достовірних змін
величини ЕКП не виявлено, що підтверджує резистентність гепатоцитів до
дії радіації у досліджуваній дозі.

Виявлене збільшення величини ЕКП клітин, підданих дії радіації або
пероксиду водню, свідчить про зростання загальної кількості від’ємно
заряджених груп на поверхні плазматичної мембрани. Причиною цього може
бути селективне окиснення мембранних фосфоліпідів та порушення їх
асиметричності, зокрема, екстерналізація фосфатидилсерину після його
взаємодії з позитивно зарядженим активним відновлювачем цитохромом с,
який вивільнюється з мітохондрій (Crompton М., 1999, Kagan V.E. еt al.,
2000). Так, посилена експресія фосфатидилсерину на поверхні тимоцитів,
підданих дії 30 мкМ Н2О2, була доведена у експериментах з використанням
флуоресцентного зонду — анексина V (Oyamma Y., 1999). Оксидативне
ушкодження клітин може мати місце лише за умов виникнення дисбалансу між
активністю антиоксидантної системи та продукцією АФК. Інформативним
показником стану антиоксидантної системи клітин на ранніх етапах після
дії стрес-агентів є активність таких ферментів, як супероксиддисмутаза
та каталаза.

Оцінка супероксиддисмутазної та каталазної активності тимоцитів та
гепатоцитів після дії іонізуючої радіації та пероксиду водню. До
активних форм кисню, що виникають як внаслідок спричиненого іонізуючим
випромінюванням радіолізу води, так і внаслідок інтенсифікації реакцій
Фентона під дією пероксиду водня, відносять, насамперед, супероксид- та
гідроксил-радикали, швидкість утворення яких обмежується
супероксиддисмутазою та каталазою. Нами не було виявлено достовірних
змін активності цих ферментів у клітинах обох типів через 30 хв та 1 год
після рентгенівського опромінення.

Додавання пероксиду водню до середовища інкубації клітин призводило до
раннього підвищення супероксиддисмутазної активності —
супероксиддисмутазна активність тимоцитів зростала порівняно з контролем
на 60% через 30 хв, а гепатоцитів — на 145% через 1 год (рис. 3) і
залишалась на підвищеному рівні впродовж 3 год. Через 3 год після
додавання пероксиду водню виявляються зміни каталазної активності —
пригнічення у тимоцитах та підвищення у гепатоцитах (рис. 3), що може
пояснюватись різною активністю каталази та величиною “буферної ємності”
антиоксидантних систем у клітинах різних типів.

Відомо, що активність пероксиду водню, який легко проникає крізь
біологічні мембрани, є недостатньо високою для окиснення біологічних
молекул у водному середовищі. Проте виявлене під дією цього чинника
раннє підвищення супероксиддисмутазної активності клітин свідчить про
посилення неметаболічного утворення первинного продукту реакцій
іонно-радикального окиснення — супероксиду, біологічні ефекти якого
реалізуються опосередковано — через посилення процесів ПОЛ та
накопичення ліпідних радикалів і гідропероксидів у товщі та на поверхні
ліпідного шару мембрани. Оскільки ці процеси можуть відігравати важливу
роль у каскаді реакцій, що призводять до апоптозу, ми дослідили вміст
продуктів ПОЛ у мітохондріальній та ядерній фракціях клітин після дії
досліджуваних чинників.

Дослідження вмісту дієнових кон’югатів та шиффових основ у
мітохондріальній та ядерній фракціях клітин після дії радіації та
пероксиду водню. Незважаючи на те, що у підданих дії Н2О2 тимоцитах та
гепатоцитах спостерігається рання активація такого компонента
антиоксидантної системи, як супероксиддисмутаза, у мітохондріальній
фракції клітин посилюються процеси вільнорадикального переокиснення та
зростає вміст продуктів ПОЛ. Так, у мітохондріальній фракції тимоцитів,
інкубованих протягом 1 год у присутності Н2О2, не тільки підвищується
вміст дієнових кон’югатів (на 35% порівняно з контролем), але й
накопичуються кінцеві продукти ПОЛ — шиффові основи, вміст яких через 1
год перевищує контрольний на 110% і залишається підвищеним через 3 год
(рис. 4Б). Раннє накопичення продуктів ПОЛ спостерігається також у
мітохондріальній фракції гепатоцитів, інкубованих з Н2О2 через 1 год
підвищується вміст як дієнових кон’югатів, так і шиффових основ — на 43%
та 28% порівняно з контролем (рис. 4В).

Раннє посилення процесів ПОЛ у мітохондріальній фракції тимоцитів
спостерігається також після рентгенівського опромінення клітин, проте
воно носить інший характер — вміст шиффових основ зростає через 1 год і
повертається до контрольного рівня через 3 год на фоні незмінного рівня
дієнових кон’югатів (рис. 4А). Достовірних змін досліджуваних показників
у мітохондріальній фракції гепатоцитів після опромінення виявлено не
було. Нами показано також незначне підвищення вмісту шиффових основ у
ядерній фракції тимоцитів та вмісту дієнових кон’югатів у ядерній
фракції гепатоцитів після впливу як іонізуючої радіації, так і Н2О2
однак ці зміни виявлялись лише через 3 год після дії чинників.

Отримані результати вказують на посилення генерації активних форм кисню
та реакцій вільнорадикального переокиснення у мітохондріях опромінених
тимоцитів та у мітохондріях тимоцитів і гепатоцитів, підданих дії
пероксиду водню, у період часу, який передує міжнуклеосомній
фрагментації ДНК у клітинах.

† I ?

U

»

$

&

(

*

B

n

p

N

N

|

°

?

?

Визначення інтенсивності поглинання кисню клітинами після дії
рентгенівського опромінення та пероксиду водню. Інтенсивність поглинання
кисню клітинами тісно корелює зі швидкістю дихання, рівнем
окисно-відновних процесів та утворенням активних форм кисню. Оскільки
переважна кількість (85-90%) кисню, що надходить у клітину, споживається
мітохондріями, інтенсивність поглинання кисню може бути використана для
оцінки структурно-функціонального стану мітохондрій (Дубинина Е.Е.,
1989, Гончаренко Е., 1998). Інтенсивність поглинання кисню гепатоцитами
була вищою порівняно з тимоцитами (табл. 1), що узгоджується з високою
метаболічною активністю гепатоцитів.

Через 1 год після інкубації клітин у присутності пероксиду водню
інтенсивність поглинання кисню клітинами обох типів значно зростала
(табл. 1). Менш значне прискорення поглинання кисню порівняно з
контролем спостерігалось у суспензії тимоцитів, підданих дії радіації,
тоді як після опромінення гепатоцитів цей показник достовірно не
змінювався.

Споживання кисню клітинами у експерименті — це інтегральний параметр,
який залежить від співвідношення процесів синтезу АТФ у дихальному
ланцюгу та електрогенного витоку через мітохондріальну мембрану. У
випадку порушення функціонування дихального ланцюга мітохондрій частина
поглинутого кисню може зазнавати одноелектронного відновлення з
утворенням супероксид-радикалу та інших АФК.

Для того, щоб перевірити припущення, що мітохондрії можуть бути місцем
посиленої генерації активних форм кисню у клітинах на ранньому етапі
після дії Н2О2 та радіації і що ця подія є складовою каскаду реакцій,
які призводять до фрагментації ДНК, ми провели експерименти із
застосуванням ротенону — інгібітора комплекса I дихального ланцюга
мітохондрій, де може генеруватись супероксид-радикал. Вплив ротенону на
фрагментацію ДНК у тимоцитах досліджували, вводячи його у середовище
інкубації клітин або відразу, або через 1 год після початку інкубації
(табл. 2). В обох випадках додавання ротенону не впливало на кількість
ПДН, накопичених у контрольних клітинах упродовж 3-годинної інкубації.

Більшою мірою у присутності ротенону знижувався вміст ПДН, накопичених у
клітинах після додавання Н2О2 (у 2,2 рази), ніж після опромінення (у 1,5
разів). Фрагментація ДНК у підданих дії пероксиду водню тимоцитах
пригнічувалась у випадку додавання інгібітору на початку інкубації, тоді
як за умови його додавання через 1 год після дії Н2О2 достовірного
пригнічення фрагментації ДНК не виявлено. Такий результат можна пояснити
тим, що ротенон пригнічує викликану дією пероксиду водню генерацію
супероксиду у мітохондріях і запобігає посиленню неспецифічної
проникності мітохондріальної мембрани та ініціації апоптозу. З іншого
боку, ротенон може знижувати вміст АТФ, необхідного для реалізації більш
пізніх етапів апоптозу і тоді його захисний ефект може проявитись і за
умови додавання до клітинної суспензії у більш пізній термін після дії
апотогенного чинника. Саме такий ефект виявляється у випадку додавання
ротенона через 1 год після опромінення тимоцитів (табл 1).

Отже, внаслідок інтенсифікації процесів вільнорадикального переокиснення
на ранньому етапі після дії пероксиду водню у клітинах порушується
функціональний стан мітохондрій та знижується вміст АТФ у клітинах. Ці
процеси можуть відігравати певну роль і у проявленні ефекту іонізуючої
радіації, однак для реалізації апоптозу у цьому випадку необхідне
підтримання АТФ на рівні, достатньому для експресії певних білків
(зокрема, р53 та каспази-2) після виникнення розривів ДНК (Li P. et al.,
1999, Orrenius S. et al., 2003).

Дослідження вмісту аденіннуклеотидів, аденозину та аденіну у клітинах
після дії іонізуючого випромінювання та пероксиду водню. Для оцінки
стану аденілової системи було досліджено вміст аденілових нуклеотидів,
аденозину та аденіну у тимоцитах та гепатоцитах за інкубації у контролі
та після дії радіації чи пероксиду водню.

Через 1 год після опромінення суспензії тимоцитів спостерігається
зниження вмісту АТФ та АДФ на 30% та 38% та зростання вмісту аденозину
на 42% відносно контролю відповідно (рис. 5А). Однією з причин зниження
вмісту АТФ у опромінених тимоцитах може бути споживання нуклеотиду у
поліАДФ-полімеразній реакції, необхідній для репарації ушкоджень ДНК.
Проте одночасне зниження вмісту АДФ та виявлене у цей термін посилення
поглинання кисню тимоцитами вказують на вірогідність м’якого роз’єднання
процесів окиснення та фосфорилування, направленого на пригнічення
генерації супероксиду у мітохондріях (Скулачев В., 2001). Через 3 год у
опромінених тимоцитах спостерігається нормалізація вмісту аденозину,
зростання вмісту АМФ та АДФ, що є можливою причиною повернення вмісту
АТФ до контрольного рівня (рис. 5А). Ми не виявили достовірних змін
вмісту метаболітів аденілової системи через 1 год після опромінення
суспензії гепатоцитів. Через 3 год спостерігалось зниження вмісту АДФ на
19% відносно контролю.

У клітинах, підданих дії пероксиду водню, спостерігаються більш значні
порушення стаціонарного стану системи АТФ-АДФ-АМФ. Так, через 1 год
після додавання Н2О2 до середовища інкубації тимоцитів вміст АТФ і АДФ
знижується на 62% та 70% відносно контролю відповідно, а утворений АМФ
розщеплюється, оскільки підвищеним виявляється вміст не тільки
аденозину, але й аденіну (рис. 5Б). Хоча через 3 год після дії Н2О2
рівень АТФ у тимоцитах починає відновлюватись, проте вміст АДФ
залишається на низькому рівні. Це означає, що у клітині переважають не
синтетичні реакції, направлені на відновлення рівня АДФ через
фосфорилування АМФ, а катаболічні — розщеплення АМФ до аденозину, вміст
якого залишається підвищеним відносно контролю. Такий же характер
порушення балансу аденілової системи виявлено у гепатоцитах через 3 год
після додавання Н2О2 до середовища інкубації — вміст АТФ та АДФ був
зниженим на 20% та 41%, а вміст аденозину та аденіну — підвищеним
відносно контролю (рис. 6).

Таким чином, порушення стаціонарного стану системи АТФ-АДФ-АМФ у
клітинах на ранньому етапі після дії Н2О2 є більш глибоким і подовженим,
ніж після дії радіації. Аналіз направленості цих змін вказує на
створення у клітинах умов, за яких зростає вірогідність порушення
бар’єрних властивостей мітохондріальної мембрани — відомо, що
неселективні пори внутрішньої мембрани мітохондрій заблоковані лише за
умови незміненого рівня АТФ у клітині, якщо ж вміст АТФ вичерпується,
але не більше, ніж на 75% від нормального, зростає вірогідність
відкривання неселективної пори та ініціації апоптозу, у випадку більш
значного падіння вмісту АТФ спостерігається некроз (Crompton M., 1999,
Hirai K., 2002). Зниження вмісту АТФ у клітинах за апоптозу співпадає з
експозицією фосфатидилсерину на зовнішній поверхні плазматичної мембрани
(Gleiss B. et al., 2002).

Для з’ясування можливої ролі мітохондріальних неселективних пор у
ініціації апоптозу у клітинах ми провели експерименти з використанням
циклоспоріну А — специфічного блокатора, який зв’язується з циклофіліном
D — компонентом мітохондріальної пори і попереджає падіння
внутрішньомембранного потенціалу та втрату АТФ (Huser J. et al., 1998,
Rizzuto R. et al., 1998). Циклоспорін А вводили у середовище інкубації
клітин до опромінення або додавання Н2О2 та оцінювали його вплив на
фрагментацію ДНК. За присутності 2 мкМ циклоспоріну А процес
фрагментації ДНК у опромінених тимоцитах частково пригнічувався — вміст
ПДН, накопичених упродовж 3-годинної інкубації, знижувався на 36% (табл.
3). Значно більшою мірою ефект циклоспоріну А проявлявся у клітинах,
підданих дії Н2О2 — інгібітор майже повністю пригнічував процес
фрагментації ДНК як у тимоцитах, так і у гепатоцитах, вміст ПДН
знижувався на 82% та 75% відповідно.

Таким чином, аналіз отриманих даних дозволяє виявити спільні та відмінні
риси у формуванні ранньої відповіді клітин на дію іонізуючої радіації та
пероксиду водню in vitro. Обидва чинники можуть ініціювати шляхи, які
ведуть до міжнуклеосомної фрагментації ДНК у клітині. Очевидно, що вплив
іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр залежить від типу клітин і
опосередковується, перш за все, розривами ДНК, оскільки не виявляється у
гепатоцитах — клітинах зі стабільним геномом, але призводить до
ендонуклеолізу ДНК у тимоцитах. Проте виявлене на ранньому етапі після
опромінення тимоцитів зворотнє зниження вмісту АТФ та АДФ, а також
часткове пригнічення фрагментації ДНК циклоспоріном А вказують на
можливість часткового залучення мітохондрій до ініціації радіаційного
апоптозу. Виявлена однотипність змін досліджуваних показників у
тимоцитах і гепатоцитах у відповідь на дію 0,1 мМ Н2О2 дозволяє
припустити таку послідовність подій, що передують міжнуклеосомній
фрагментації ДНК: активація шляхів неметаболічного та метаболічного
утворення активних форм кисню ? інтенсифікація процесів ПОЛ у
мітохондріальних мембранах ? роз’єднання процесів окиснення та
фосфорилування у дихальному ланцюгу, падіння вмісту АТФ та АДФ ?
підвищення неселективної проникності внутрішньої мембрани мітохондрій ?
вивільнення у цитозоль апоптогенних факторів та цитохрому с,
екстерналізація фосфатидилсерину ? активація каскаду каспаз. Такі події
можуть носити ранній і тимчасовий характер, призводячи до елімінації тих
клітин у популяції, у яких внаслідок розвитку окисного стресу відбулись
значні порушення структурно-функціонального стану мітохондрій.

ВИСНОВКИ

1. У експериментах з використанням суспензій ізольованих тимоцитів та
гепатоцитів щура встановлено відмінності у формуванні відповіді клітин
на дію іонізуючої радіації in vitro. Після рентгенівського опромінення
суспензії гепатоцитів у дозі 4,5 Гр не виявлено змін у кількості
життєздатних клітин та фрагментації ДНК, тоді як за інкубації
опроміненої суспензії тимоцитів кількість клітин через 5 год була
зниженою на 45% порівняно з контролем, а вміст продуктів міжнуклеосомної
деградації ДНК зростав до 56% від загального вмісту ДНК у клітинах.

2. Встановлено однотипні зміни структурного стану ДНК тимоцитів та
гепатоцитів за інкубації у присутності 0,1 мМ пероксиду водню — у
клітинах обох типів спостерігалась міжнуклеосомна фрагментація ДНК,
вміст ПДН через 5 год зростав до 37% та 42% від загального вмісту ДНК
відповідно.

3. Показано, що супероксиддисмутазна активність тимоцитів та гепатоцитів
за інкубації у присутності 0,1 мМ Н2О2, підвищується. Через 1 год після
додавання 0,1 мМ Н2О2 спостерігаються прискорення поглинання кисню
клітинами, підвищення величини електрокінетичного потенціалу клітин,
зумовлене зростанням загальної кількості від’ємно заряджених груп
фосфоліпідів на поверхні плазматичної мембрани, зростання вмісту як
дієнових кон’югатів, так і шиффових основ у мітохондріальній фракції
клітин, що вказує на раннє порушення оксидантно-антиоксидантної
рівноваги під дією пероксиду водню.

4. За умови додавання інгібітору дихального ланцюга мітохондрій 2 мкМ
ротенону до суспензії тимоцитів на початку інкубації з пероксидом водню
спостерігалось пригнічення індукованої Н2О2 фрагментації ДНК у 2,2 рази.

5. У ранній період після рентгенівського опромінення тимоцитів змін
супероксиддисмутазної активності не виявлено, спостерігається менше за
величиною порівняно з виявленим після дії пероксиду водню посилення
поглинання кисню клітинами та зростання величини їх електрокінетичного
потенціалу, у мітохондріальній фракції підвищується вміст шиффових
основ.

6. Ротенон у 1,5 разів пригнічував індуковану радіацією фрагментацію ДНК
у тимоцитах, ефект інгібітора проявлявся за умови його внесення як
відразу, так і через 1 год після початку інкубації опромінених клітин.

7. Виявлене через 1 год після опромінення суспензії тимоцитів зниження
вмісту АТФ на фоні зниження АДФ (на 30% та 38% відносно контролю
відповідно) та посилення поглинання кисню клітинами вказує на
вірогідність м’якого роз’єднання процесів окиснення та фосфорилування,
направленого на пригнічення генерації супероксиду у мітохондріях після
дії радіації.

8. У клітинах, інкубованих у присутності пероксиду водню,
спостерігається значне раннє порушення стаціонарного стану аденілової
системи — вміст АТФ і АДФ у гепатоцитах знижується на 20% та 41%, а у
тимоцитах — на 62% та 70% відносно контролю відповідно, зростає вміст
аденозину та аденіну. За присутності 2 мкМ циклоспоріну А у середовищі
інкубації клітин, підданих дії Н2О2, фрагментація ДНК пригнічується.

9. Підтверджено гіпотезу щодо ролі мітохондрій у ініціації апоптозу та
запропоновано схему шляхів залучення мітохондрій до апоптозу,
індукованого радіацією чи пероксидом водню.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ковальова В.А., Дворщенко К.О., Матишевська О.П. Вміст продуктів
вільнорадикального переокислення ліпідів у різних за радіочутливістю
клітинах щурів // Вісник Київського ун-ту ім. Тараса Шевченка. Серія:
Біологія. — 2000. — №32. — С. 17-19. (Розроблено метод отримання
гепатоцитів, проведено підрахунок, опромінення і визначення у
гепатоцитах і тимоцитах вмісту дієнових кон’югатів та шиффових основ,
супероксиддисмутазної та каталазної активності, брала участь у
математичній обробці та аналізі отриманих результатів).

2. Порівняльне дослідження загибелі in vitro тимоцитів за дії іонізуючої
радіації та перекису водню / Т.В. Коваль, В.А. Ковальова, К.О.
Дворщенко, С.П. Імідадзе, О.П. Матишевська, М.Є. Кучеренко // Проблеми
екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: Зб. наук. пр. —
Київ–Луганськ–Харків. — 2001. — №7(39). — С. 119–125. (Особисто виконано
опромінення тимоцитів, вимірювання вмісту полідезоксирибонуклеотидів,
брала участь у математичній обробці та аналізі отриманих результатів).

3. Оцінка життєздатності та фрагментації ДНК гепатоцитів за дії
іонізуючої радіації та пероксиду водню / О.О. Капралов, К.О. Дворщенко,
І.І. Гринюк, О.П. Матишевська // Вісник Київського ун-ту ім. Тараса
Шевченка. Серія: Біологія. — 2001. — №34. — С. 17-20. (Особисто
проведено виділення гепатоцитів, опромінення, підрахунок клітин,
визначення фрагментації ДНК, брала участь у математичній обробці та
аналізі отриманих результатів).

4. Інтенсифікація реакцій переокислення в мітохондріях тимоцитів, що
передує фрагментації ДНК за радіаційного апоптозу / К.О. Дворщенко, І.І.
Гринюк, О.О. Капралов, О.П. Матишевська // Вісник Київського ун-ту ім.
Тараса Шевченка. Серія: Біологія. — 2002. — №36. — С. 10-14. (Особисто
проведено отримання гепатоцитів, виділення мітохондріальної фракції
тимоцитів і гепатоцитів, визначення в ядерній та мітохондріальній
фракції тимоцитів та гепатоцитів дієнових кон’югатів і шиффових основ,
брала участь у математичній обробці та аналізі отриманих результатів).

5. Вплив іонізуючого випромінювання та пероксиду водню на поверхневий
потенціал та інтенсивність дихання тимоцитів та гепатоцитів щурів / К.О.
Дворщенко, В.І. Миронюк, Ю.В. Яніш, О.П. Матишевська // Гигиена
населенных мест. Зб. наук. пр. — К. — 2002. — №39, Т. 2. — С. 228-233.
(Особисто проведено отримання тимоцитів та гепатоцитів, підрахунок
клітин, їх інкубація, визначення інтенсивності дихання клітин,
визначення поверхневого потенціалу тимоцитів та гепатоцитів. Особисто
проведено математичну обробку та аналіз отриманих результатів).

6. Майданюк А.В., Імідадзе С.П., Дворщенко К.О. Хроматографічний аналіз
аденілових нуклеотидів для вивчення біохімічних процесів апоптозу //
Вісник Київського ун-ту ім. Тараса Шевченка. Серія: Біологія. — 2003. —
№39. — С. 19-21. (Особисто виконано розділення стандартів аденілових
нуклеотидів на силуфолових пластинах, брала участь у аналізі отриманих
результатів).

7. Дворщенко К.О. Стан супероксиддисмутазної та каталазної активності
тимоцитів та гепатоцитів щурів при дії іонізуючої радіації та пероксиду
водня // Гигиена населенных мест. Зб. наук. пр. — К. — 2003. — № 41. —
С. 292-296.

8. Окислительный стресс в развитии индуцированного радиацией апоптоза
клеток / О.П. Матышевская, С.И. Борисов, В.А. Ковальова, Е.А. Дворщенко
// Тр. междунар. еколог. конгр. “Новое в экологии и безопасности
жизнедеятельности”. — Санкт-Петербург, 2000. — Т. 2. — С.331.

9. Koval T.V., Dvorschenko K.O., Grebinik D.M. Complex study of DNA
lesions during radiation- and H2O2 — induced apoptosis in cells
population // Conference for students, PhD students and young scientists
on molecular biology. — Kyiv, 2000. — P. 46.

10. Вплив окислювального стресу на життєздатність гепатоцитів і
фрагментацію їх ДНК / К.О. Дворщенко, І.І. Губенко, О.О. Капралов, О.П.
Матишевська, М.Є. Кучеренко // Тези доп. Всеукр. наук. конф. “Актуальні
проблеми гастроентерології”. — Київ, 2001. — С. 17.

11. Различия в адаптивном ответе тимоцитов и гепатоцитов на апоптогенное
действие радиации и перекиси водорода / А.А. Капралов, Е.А. Дворщенко,
Т.В. Коваль, В.А. Ковалева, О.П. Матышевская // IV Съезд по радиацион.
исслед. — Москва, 2001. — Т. 1. — С. 293.

12. Відмінності у механізмах апоптозу, викликаного окиснювальним стресом
у гепатоцитах і тимоцитах / О.О. Капралов, К.О. Дворщенко, Т.В. Коваль,
О.П. Матишевська, М.Є. Кучеренко // ХVI з’їзд Укр. фізіол. тов. —
Вінниця, 2002. — Фізіол. жур. — Т. 48, №2. — С. 135.

13. Коваль Т.В., Дворщенко К.О., Імідадзе С.П. Комплексне дослідження
фрагментації ДНК у тимоцитах за дії радіації // VIII з’їзд Укр. біохім.
з’їзду. — Чернівці, 2002. — Укр. біохім. жур. — Т. 74, №4б. — С. 224.

14. Порівняльне дослідження відповіді тимоцитів та гепатоцитів in vitro
на дію апоптогенних факторів / О.П. Матишевська, К.О. Дворщенко, Т.В.
Коваль, М.Є. Кучеренко // VIII з’їзд Укр. біохім. з’їзду. — Чернівці,
2002. — Укр. біохім. жур. — Т. 74, №4б. — С.228–229.

15. Ранні прояви апоптозу тимоцитів, викликаного іонізуючим
випромінюванням у дозі 1 Гр / К.О. Дворщенко, І.І. Гринюк, В.І. Миронюк,
Ю.В. Яніш, О.П. Матишевська // Тези доп. ІІІ з’їзду укр. біофіз. тов. —
Львів, 2002. — С.287.

16. Дворщенко К.О. Дія іонізуючої радіації та пероксиду водню на стан
супероксиддисмутазної та каталазної активності тимоцитів щурів //
Наук.-практ. конф. “Актуал. питання гігієни та екологічної безпеки
України”. — Київ, 2003. — Вип. 5. — С. 49-50.

АНОТАЦІЯ

ДВОРЩЕНКО К.О. Вплив іонізуючої радіації та пероксиду водню на показники
окисно-антиоксидантної рівноваги та енергетичного обміну в тимоцитах та
гепатоцитах in vitro. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженню дії іонізуючої радіації
та пероксиду водню на структурну цілісність ДНК та показники активності
антиоксидантної системи і структурно-функціонального стану мітохондрій у
тимоцитах та гепатоцитах щурів in vitro.

Виявлено однотипні зміни структурного стану ДНК у тимоцитах і
гепатоцитах за інкубації клітин у присутності 0,1 мМ Н2О2, які
виявляються у накопиченні продуктів міжнуклеосомної деградації ДНК. У
період, що передує фрагментації ДНК, спостерігається підвищення величини
електрокінетичного потенціалу клітин, посилення поглинання кисню,
зростання супероксиддисмутазної активності, у мітохондріальній фракції,
підвищується вміст дієнових кон’югатів та шиффових основ, виявлено
зниження вмісту АТФ та порушення стаціонарного стану аденілової системи.
За присутності 2 мкМ циклоспоріну А у середовищі інкубації клітин,
підданих дії Н2О2, фрагментація ДНК значно пригнічується. Встановлено
відмінності у відповіді клітин на дію іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр
— за інкубації опромінених тимоцитів спостерігається міжнуклеосомна
фрагментація ДНК, ранні зміни показників стану антиоксидантної та
аденілової системи є подібними до виявлених після дії пероксиду водню,
але менш вираженими, тоді як у опромінених гепатоцитах ці параметри не
порушуються. Отримані дані вказують на різні шляхи залучення мітохондрій
до ініціації апоптозу у популяціях досліджуваних клітин за умов окисного
стресу та дії радіації.

Ключові слова: тимоцити, гепатоцити, іонізуюча радіація, пероксид
водню, апоптоз, міжнуклеосомна фрагментація ДНК, супероксиддисмутаза,
електрокінетичний потенціал, поглинання кисню, ПОЛ, система АТФ-АДФ-АМФ,
мітохондрії, циклоспорін А.

АННОТАЦИЯ

ДВОРЩЕНКО Е.А. Влияние ионизирующей радиации и перекиси водорода на
показатели окислительно-антиоксидантного равновесия и энергетического
обмена в тимоцитах и гепатоцитах in vitro. — Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 — биохимия. — Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.

Диссертация посвящена сравнительному исследованию действия ионизирующей
радиации и перекиси водорода на структурную целесность ДНК, показатели
активности антиоксидантной системы и структурно-функционального
состояния митохондрий в тимоцитах и гепатоцитах крыс in vitro.

Выявлено однотипные изменения структурного состояния ДНК в тимоцитах и
гепатоцитах при 5-часовой инкубации клеток в присутствии 0,1 мМ Н2О2 –
содержание продуктов межнуклеосомной деградации ДНК повышалось до 37% та
42% от общего содержания ДНК в клетках соответственно. Через 1 ч после
инкубации в присутствии перекиси водорода наблюдалось повышение величины
электрокинетического потенциала клеток, усиливалось поглощение кислорода
клетками, увеличивалась супероксиддисмутазная активность. В этот период
выявлено повышение содержания как диеновых конъюгатов, так и шиффовых
оснований в митохондриальной фракции, а также нарушение стационарного
состояния адениловой системы – содержание АТФ и АДФ падает в гепатоцитах
на 22% та 41%, а в тимоцитах — на 62% та 70% относительно контроля
соответственно, повышается содержание аденозина и аденина. В присутствии
2 мкМ циклоспорина А в среде инкубации клеток, которые подвергались
действию Н2О2, наблюдалось значительное угнетение фрагментации ДНК (на
82% и 75% в тимоцитах и гепатоцитах соответственно).

Полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение
окислительно-антиоксидантного равновесия и структурно-функционального
состояния митохондрий в клетках предшествует фрагментации ДНК и играет
важную роль в инициации апоптоза под действием перекиси водорода.

Установлены различия в ответе клеток на действие ионизирующего излучения
в дозе 4,5 Гр. Через 5 час после рентгеновского облучения суспензии
тимоцитов количество жизнеспособных клеток уменьшается на 45%
сравнительно с контролем, наблюдается межнуклеосомная фрагментация ДНК,
содержание ПДН увеличивается до 56% от общего содержания ДНК, тогда как
после облучения суспензии гепатоцитов эти показатели не меняются.

В ранний период после облучения тимоцитов изменений активности
супероксиддисмутазы не выявлено, наблюдается меньшее по величине, по
сравнению с выявленным после действия перекиси водорода, увеличение
величины электрокинетического потенциала клеток и содержания шиффовых
оснований в митохондриальной фракции. Выявленное через 1 час после
облучения падение содержания АТФ и АДФ в тимоцитах (на 30% та 38%
относительно контроля сооответственно) на фоне незначительного усиления
поглощения кислорода клетками указывает на возможность мягкого
разобщения процессов окисления и фосфорилирования, направленного на
угнетение генерации супероксида в митохондриях после действия радиации.
В присутствии 2 мкМ циклоспорина А в среде инкубации облученных
тимоцитов фрагментация ДНК угнеталась на 36%. Полученные результаты
указывают на разные пути вовлечения митохондрий в инициацию апоптоза в
популяциях исследуемых клеток в условиях окислительного стресса и
действия радиации.

Ключевые слова: тимоциты, гепатоциты, ионизирующая радиация, перекись
водорода, апоптоз, межнуклеосомная фрагментация ДНК,
супероксиддисмутаза, электрокинетический потенциал, поглощение
кислорода, ПОЛ, система АТФ-АДФ-АМФ, митохондрии, циклоспорин А.

SUMMARY

DVORSCHENKO K.O. Influence of ionizing radiation and hydrogen peroxide
on parameters of oxidative-antioxidative balance and energy exchange in
thymocytes and hepatocytes in vitro. — Manuscript.

Dissertation for candidate degree in biology by speciality 03.00.04 —
biochemistry. Kyiv Taras Shevchenko National University, Kyiv, 2004.

Dissertation is devoted to the comparative study on ionizing radiation
and hydrogen peroxide effects on the DNA integrity, parameters of
antioxidative system and mitochondria functional state in rat thymocytes
and hepatocytes in vitro.

The same kind of DNA structure injury in thymocytes and hepatocytes
incubated with 0,1 mM H2O2 are revealed — the content of
internucleosomal DNA fragmentation products was increased. At 1 h after
exposure to H2O2 the value of cell electrokinetic potential was
increased, the rate of oxygen uptake and superoxid dismutase activity
were enhanced, dien conjugates and Schiff bases content in mitochondrial
fraction were higher than in control. The early decrease of ATP level
and disturbance of adenyl system were observed. At the presence of 2 ?M
cyclosporin A in the incubation medium DNA fragmentation in cells,
exposed to H2O2, the was inhibited.

The distinct effects of X-ray irradiation in a dose of 4,5 Gy on
incubated thymocytes and hepatocytes are revealed — the content of DNA
fragments in irradiated thymocytes was increased, the early changes of
antioxidant and adenyl systems parameters were similar to those in cells
exposed to H2O2, but less expressed, while in irradiated hepatocytes
these parameters were not changed. The results obtained demonstrate
different ways of mitochondria implication into apoptosis initiation in
thymocytes and hepatocytes populations after oxidative stress and
X-irradiation.

Key words: thymocytes, hepatocytes, X-irradiation, hydrogen peroxide,
apoptosis, DNA fragmentation, superoxid dismutase, electrokinetic
potential, oxygen uptake, lipid peroxidation, ATP-ADP-АMP system,
mitochondria, cyclosporin A.

PAGE 14

Похожие записи