НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Олійник Ольга Олександрівна

УДК: 57.043:612.111:352.462

Вплив інгібіторів аніонного транспорту і модифікаторів мембрани на
постгіпертонічний лізис еритроцитів

03.00.19 — кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2004 р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Валерій Антонович, Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріофізіології клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Розанов Леонід Федірович, Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу
низькотемпературного консервування;

доктор біологічних наук, професор

Перський Євген Єфроїмович, Харківський національний університет ім.
В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ
України, кафедра біохімії.

Захист відбудеться “ 18 ” січня 2005 р. о “13.30” годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків,
вул. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий “ 15 ”грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Протягом останніх років активно вивчається явище постгіпертонічного
лізису еритроцитів (ПГЛ), яке полягає в руйнуванні клітин при їхньому
перенесенні з гіпертонічних розчинів солей і неелектролітів у середовища
з нормальною фізіологічною тонічністю [Божок Г.А., 1996, Пересецкая
Н.М., 1996, Нипот Е.Е., 1997]. Подібний характер ушкодження клітин має
важливе значення з позицій кріобіології, тому що в реальних умовах
заморожування клітини піддаються циклічній експозиції в середовищах з
високою тонічністю з наступним поверненням в умови ізотонії. Первинною
фазою модифікації стану клітин є зміна розподілу іонів і води, що, у
свою чергу, супроводжується зменшенням клітинного об’єму. В той же час,
при наступному поверненні клітин у ізотонічні умови збільшення їхнього
об’єму (“об’ємний зсув”) стає фактором, що обумовлює втрату структурної
стабільності і лізис клітин.

Актуальність теми. На сьогодні доведено, що зміна об’єму супроводжується
складним комплексом перебудов структурних елементів і зміною
функціонального стану клітини [Bonangelino C.J. et al., 2001, Cicha I.
et al., 2003]. У залежності від глибини об’ємних змін клітина може
виявляти пасивну відповідь на зовнішні впливи, що може розглядатися як
фактор, що викликає порушення її структури, або активну відповідь, що
може розглядатися як адаптація [Pedersen S.F. et al., 2001]. Системи, що
формують активну відповідь клітини, — це, насамперед, системи іонного
транспорту, тому важливе значення має вивчення їхньої ролі в явищі ПГЛ.
У свою чергу, пасивна відповідь клітин значною мірою визначається станом
цитоскелета, що вимагає вивчення ролі цитоскелетних білків у реакції
дегідратованих клітин на наступну регідратацію.

Особливість ПГЛ полягає в тому, що лізис клітин розвивається при
відновленні їхнього об’єму з дегідратованого стану, при якому відсутні
будь-які прояви гіпертонічного ушкодження, пов’язаного з підвищенням
осмолярності середовища і зменшенням об’єму клітин на етапі осмотичної
дегідратації [Farrant J., Woolgar A. E., 1972]. Однак сам факт розвитку
ПГЛ дозволяє говорити про те, що на етапі осмотичної дегідратації
усередині клітин відбуваються зміни, які сенсибілізують їх до повернення
у фізіологічне середовище і виявляються при об’ємному зсуві. В даний час
залишається неясним, які зміни структури цитоскелета і мембрани, стану
транспортних систем можуть розглядатися як фактори, що сенсибілізують
клітини до наступної регідратації з гіпертонічних середовищ. У процесі
гіпертонічної інкубації відбувається активація процесів, що ініціюють
надходження електролітів усередину клітини [Lang F. et al., 1998]. У
фазі збільшення клітинного об’єму відбувається перерозподіл іонів хлору
і калію з клітини в позаклітинне середовище [Lang F. et al., 1998]. При
порушенні механізмів, що регулюють клітинний об’єм, може розвитися
вторинна осмотична реакція клітин на регідратацію, що виявляється у
збільшенні об’єму до критичного, розриві мембрани і лізисі клітин. У
зазначених умовах головною мішенню дії несприятливих факторів, що
супроводжують об’ємний зсув, є цитоскелет-мембранний комплекс, що змінює
свій стан не тільки на рівні окремих компонентів, але і на рівні
цілісної структури, проявом чого є утворення в ньому структурних
дефектів [Bellary S. et al., 1995]. Це означає, що характер розвитку ПГЛ
еритроцитів у значній мірі повинен залежати від стану систем транспорту
іонів, складу середовища, а також від характеру модифікації структурного
стану мембрани і цитоскелета.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріофізіології клітини
ІПКіК НАН України по темі: “Фактори і механізми регуляції стійкості
клітин до змін температурного і осмотичного параметрів середовища” (шифр
теми 2.2.6.86, № держ. реєстрації 0101U003472), де автор виконувала
самостійні розділи.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – дослідити вплив модифікаторів
мембрани і цитоскелета, інгібіторів транспорту аніонів, а також складу
середовища на чутливість еритроцитів до постгіпертонічного лізису
(ПГЛ).

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

Оцінити вплив складу середовища регідратації на рівень
постгіпертонічного лізису еритроцитів, що інкубуються у гіпертонічних
середовищах, які містять 1,5 і 3 Моль/л хлориду натрію.

Дослідити вплив нігерицина, який полегшує трансмембранний транспорт
іонів натрію, на рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів, що
інкубуються у гіпертонічному середовищі, яке містить 1,5 Моль/л хлориду
натрію.

Вивчити вплив інгібітору транспорту аніонів ДІДС на рівень
постгіпертонічного лізису еритроцитів при регідратації в середовищах, що
містять електроліт (цитрат) і неелектроліт (сахароза).

Вивчити вплив сульфгідрильних реагентів (ЙАА, ПХМБ, N-ЕМ) і геміна на
рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів при регідратації в
неелектролітних і електролітних середовищах.

На основі оцінки зміни рівня поляризації флуоресценції дослідити
зв’язування інгібітору аніонного транспорту діпірідамола з аніонним
переносником при інкубації нативних тіней і тіней, отриманих у
результаті постгіпертонічного лізису, у середовищах, що містять хлорид і
сульфат.

Об’єкт дослідження – постгіпертонічний лізис еритроцитів.

Предмет дослідження – реакція еритроцитів на перенесення в ізотонічні
середовища з гіпертонічних середовищ у залежності від аніонного складу
регідратуючого середовища, при дії інгібітору аніонного транспорту ДІДС,
під впливом модифікаторів мембрани (ЙАА, ПХМБ, N-ЕМ, гемін), іонофорів
(нігерицин).

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові дані про вплив
різних аніонів, включених у середовище регідратації, на чутливість
еритроцитів до ПГЛ. Встановлено, що в ряду
“хлорид-піруват-сульфат-сахароза-цитрат”, рівень ПГЛ не залежить від
того, чи є присутнім в середовищі регідратації електроліт або
неелектроліт, а залежить від здатності аніонів проникати в клітини на
етапі відновлення клітинного об’єму. Встановлено, що фактором, який
сприяє підвищенню рівня ПГЛ, є перерозподіл іонів у клітини на етапі
інкубації в гіпертонічних середовищах. Уперше показано, що блокування
вихідних потоків аніонів хлориду за допомогою інгібітору аніонного
транспорту ДІДС і включення в клітини іонів натрію на етапі дегідратації
при обробці клітин нігерицином супроводжується збільшенням рівня ПГЛ.
Виявлено, що модифікація мембрани ЙАА/ПХМБ не впливає на чутливість
еритроцитів до ПГЛ в сахарозному та цитратному середовищах. Показано, що
гіпертонічна обробка не порушує транспортної функції аніонного
переносника еритроцитів – білка смуги 3.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в
роботі, можуть бути використані при розробці нових підходів, спрямованих
на підвищення осмотичної і температурної стійкості клітин, з
використанням модифікації стану структури цитоскелет-мембранного
комплексу, систем транспорту аніонів і зміни складу середовища.
Результати роботи можуть бути рекомендовані для використання в
навчальному процесі в різних галузях біології.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням
здобувача. Автором сформульовані мета і визначені задачі роботи,
проведені і проаналізовані експерименти, статистично оброблені
результати, сформульовані висновки роботи, які засновані на
експериментальних даних. Спільні публікації відбивають результати
спільного планування, проведення експериментів і обговорення
результатів.

Апробація результатів. Результати проведених досліджень були
представлені на IV з’їзді гематологів і трансфузіологів України (Київ,
2001), конференції молодих вчених молекулярних біологів і генетиків
(Київ, 2001), Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і перспективи
розвитку кріобіології і кріомедицини” (Харків, 2001), міжгалузевій
конференції молодих вчених (Київ, 2002), конференції молодих вчених
ІПКіК (Харків, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 9 робіт, з
них у фахових наукових журналах – 7, у збірниках матеріалів конференцій
– 2.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках
машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури,
результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів
досліджень, висновків і переліку використаної літератури. Список
використаної літератури містить 217 джерел і розміщений на 22 сторінках.
Робота ілюстрована 4 таблицями, 22 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Одержання еритроцитів. Еритроцити отримували із свіжоконсервованої
донорської крові, заготовленої на глюгіцировому консерванті.

Постгіпертонічний лізис еритроцитів. ПГЛ здійснювали за допомогою
перенесення еритроцитів з гіпертонічних розчинів, що містили 1,5 Моль/л
(час інкубації 45 хвилин) або 3,0 Моль/л хлориду натрію (час інкубації
10 секунд), в ізотонічні середовища, що містили натрієві солі хлориду,
пірувату, сульфату, цитрату і сахарозу.

Гіпотонічний гемоліз еритроцитів. Еритроцити переносили в гіпотонічні
середовища хлориду натрію із рН 5,8; 6,6; 7,4. Осмолярність середовищ
добиралась таким чином, щоб рівень гемолізу при рН 7,4 складав 50 %.

Гіпертонічний кріогемоліз еритроцитів. Еритроцити з кінцевим
гематокритом 2 % додавали в розчини, що містили 0,86 Моль/л сахарозу (рН
5-9) або 1,2 Моль/л хлориду натрію (рН 7,4), інкубували 0-60 хвилин при
37 ?C і охолоджували на крижаній бані 5 хвилин.

Визначення рівня гемолізу еритроцитів спектрофотометричним методом.
Клітини осаджували за допомогою центрифугування протягом 3 хв. при 1500
g. Вміст гемоглобіну, що вийшов у супернатант, вимірювали за допомогою
СФ-4А з проточною кюветою на довжині хвилі 543 нм. За 100 % рівень
гемолізу приймали поглинання проби, у яку додавали детергент тритон
Х-100 у концентрації 0,1 %.

Визначення рівня та динаміки гемоліза еритроцитів. У роботі була
використана установка для виміру кутового світлорозсіювання клітинних
суспензій, створена на базі монохроматора СФ-4А. Рівень гемолізу
еритроцитів реєстрували методом світлорозсіювання, тобто рівень гемолізу
визначали шляхом реєстрації зміни оптичної щільності суспензії
еритроцитів при довжині хвилі 720 нм. Про зміну форми еритроцитів судили
за розмахом флуктуацій оптичної щільності (ширині “шумової” доріжки).

Обробка еритроцитів нігерицином. Обробка клітин даним реагентом
проводилася паралельно з гіпертонічною інкубацією в 1,5 Моль/л розчині
хлориду натрію. Клітини інкубували у гіпертонії в присутності нігерицину
(50 мкМоль/л) протягом 45 хвилин при температурі 22 ?С.

Модифікація еритроцитів сульфгідрильними реагентами і геміном. Для
обробки модифікаторами цитоскелета еритроцити із 20 % гематокритом
суспендували в середовищі, що містило 90 мМоль/л KCl, 45 мМоль/л NaCl,
44 мМоль/л сахарози, 10 мМоль/л трис (рН 7,4, 37 С) [Haest C.W.M. et
al., 1981]. У роботі використовували наступні модифікатори: йодоацетамід
(ЙАА), (15 мМоль/л, час інкубації 1 година), парахлормеркурійбензоат
(ПХМБ) (1 мМоль/л, час інкубації 1 година), N-етилмалеімід (N-ЕМ),
(12 мМоль/л, час інкубації 1 година), гемін (300 мкМоль/л, час інкубації
10 хвилин). При комбінованій обробці ЙАА/ПХМБ обробка ЙАА проводилась 15
хвилин з наступним додаванням ПХМБ до кінцевої концентрації 1 мМоль/л на
1 годину.

Модифікація еритроцитів інгібіторами аніонного транспорту. У роботі
використовували інгібітори аніонного транспорту ДІДС (5 мкМоль/л) і
діпірідамол (20 мкМоль/л). Для одержання еритроцитів, модифікованих
ДІДС, клітини (20 % гематокрит) інкубували протягом 60 хвилин у
присутності ДІДС (50мкМоль/л) при 37 ?С у середовищі, що містило
0,15 Моль/л NaCl, 10 мМоль/л трис (рН 7.4).

Одержання білих тіней еритроцитів. Білі тіні еритроцитів одержували за
допомогою лізису клітин на крижаній бані в середовищі, що містило 1
мМоль/л ЕДТА, 5 мМоль/л трис (рН 8) протягом 10 хвилин. Тіні відмивали
лизуючим середовищем до повного видалення гемоглобіну.

Визначення зв’язування діпірідамола мембранами еритроцитів. Зв’язування
діпірідамола оцінювали за ступенем флуоресцентної поляризації
інгібітора, що тестували при титруванні 1мкМоль/л реагенту тінями
еритроцитів у спектрометричній кюветі спектрофлуориметра Hitachi MPF-2А.

Визначення кількості білка в білих тінях еритроцитів. Вміст білка
визначали за допомогою методу Лоурі в модифікації із застосуванням
дезоксіхолату [Lowry O.H., 1951].

Вивчення транспорту сульфату в еритроцити. У кювету, що термостатується,
вміщували 2 мл розчина 0,1 мМоль/л Na2SO4 (37 ?С), 50 мкл еритромаси з
кінцевим 2 % гематокритом, інгібітор аніонного транспорту діпірідамол у
різних концентраціях (5-100 мкМоль/л) і реєстрували зміну рН за
допомогою рН-електрода на самописі Ендим (ГДР).

Статистична обробка результатів.

Отримані результати обробляли за методом Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив гіпертонічної інкубації і складу середовища регідратації на
чутливість еритроцитів до постгіпертонічного лізису. Інкубація
еритроцитів у гіпертонічних розчинах електролітів і наступне перенесення
клітин до ізотонічних розчинів призводить до розвитку постгіпертонічного
лізису [Farrant J., Woolgar A.E., 1972]. В зв’язку з тим, що розвиток
ПГЛ пов’язаний з надходженням іонів і води в клітини при їхньому
поверненні в ізотонічне середовище, становить інтерес з’ясувати, як
залежить рівень ПГЛ від аніонного складу середовища регідратації.

На рис. 1 представлені дані про рівень гемолізу дегідратованих
еритроцитів (у присутності 1,5 Моль/л хлориду натрію) при їх
регідратації в середовищах різного складу. Видно, що при заміщенні в
регідратуючому середовищі аніонів хлориду на аніони пірувату рівень ПГЛ
знижується до 65%, при заміщенні на аніони сульфату – до 50 %, а при
заміщенні аніонів хлориду на аніони цитрату і сахарозу постгіпертонічний
гемоліз практично відсутній.

Особливості, що спостерігаються, у характері впливу на ПГЛ заміщення
аніонів хлориду на інші аніони і сахарозу можна пояснити, прийнявши, що
головним фактором, що викликає ушкодження клітин на етапі регідратації,
є об’ємний зсув [Бондаренко В.А., 1988]. У цьому випадку, при швидкому
надходженні іонів і води в клітину порушується узгодженість між об’ємним
відновленням мембрани, з одного боку, і цитоскелета, з іншого, що
призводить до формування дефектів у ділянках, де послабляється
стабілізуючий вплив цитоскелета на мембрану. Наявність у середовищі
регідратації аніонів (сульфат, цитрат) з низькою проникаючою здатністю,
що зменшують амплітуду і швидкість об’ємного зсуву, очевидно, забезпечує
більш високу узгодженість процесів об’ємного відновлення мембрани і
цитоскелета, що перешкоджає формуванню дефектів і збільшенню клітинного
об’єму до критичного, коли відбувається розрив мембрани.

На рис. 2 представлені дані про рівень ПГЛ при перенесенні еритроцитів у
сахарозне і цитратне середовища після інкубації протягом 45 хвилин в
розчинах, що містили 1,5 Моль/л хлориду натрію, у присутності іонофора
нігерицина. Видно, що рівень гемолізу регідратованих еритроцитів після
гіпертонічної інкубації в розчині хлориду натрію в сахарозному і
цитратному середовищах не відрізняється і складає близько 5 %.
Присутність нігерицина в гіпертонічному середовищі призводить до
збільшення чутливості еритроцитів до регідратації в порівнянні з
контролем: при цьому рівень гемолізу складає від 35 до 45 %. Рівень ПГЛ
в обох випадках вище в порівнянні з контролем (без обробки нігерицином).
Це дозволяє зробити висновок, що включення катіонів натрію в еритроцити
на етапі гіпертонічної інкубації (“осмотичне навантаження”) підвищує
їхню чутливість до наступної регідратації, що можна пов’язати зі
збільшенням надходження води в клітини, більшою амплітудою об’ємного
зсуву і набряканням клітин до критичного гемолітичного об’єму.

Вплив інгібіторів аніонного транспорту на чутливість еритроцитів до ПГЛ.
Білок смуги 3 відіграє важливу роль у регуляції об’єму клітин, величини
внутрішньоклітинного рН, концентрації аніонів хлориду. З урахуванням
цього, а також структурної ролі білка смуги 3, можна говорити про нього,
як про фактор, що контролює чутливість клітин до змін осмотичних і
температурних параметрів середовища. Відповідно, модифікація
транспортної функції білка смуги 3 може в значній мірі відбитися і на
чутливості еритроцитів до осмотичної дегідратації і наступної
регідратації в умовах ізотонії.

На рис. 3 представлені дані про вплив інгібітора аніонного транспорту
ДІДС на чутливість еритроцитів до регідратації після інкубації клітин у
гіпертонічних розчинах хлориду натрію. Регідратація еритроцитів у
середовищі, що містило 0,1 Моль/л цитрату натрію, сприяє запобіганню
постгіпертонічного ушкодження клітин, що виявляється у відсутності змін
рівня оптичної щільності суспензії клітин (рис. 3, крива 1). Включення в
середовище регідратації ДІДС призводить до зниження рівня оптичної
щільності, що вказує на лізис еритроцитів (рис.3, криві 2-6). Додавання
ДІДС в сахарозне регідратуюче середовище, яке запобігає ПГЛ, також
викликає постгіпертонічні ушкодження. В той же час, ДІДС практично не
впливає на рівень ПГЛ в середовищі, що містить 125 мМоль/л хлорид
натрія/50 мМоль/л сахароза (таблиця 1).

/Cl—обміну [Lang F. et al., 1998]. У фазі регідратації еритроцити
починають різко збільшувати свій об’єм у результаті проникнення в
клітину компонентів позаклітинного розчину і надходження води. З
урахуванням зазначеного вище, можна зробити висновок, що присутність
аніонів хлориду в регідратуючому середовищі впливає на стійкість клітин
до ПГЛ. Інгібітор транспорту аніонів ДІДС блокує транспорт хлориду через
еритроцитарну мембрану, що є чинником, який перешкоджає виходу цих
аніонів на етапі регідратації, тобто блокується механізм, що запобігає
збільшенню клітинного об’єму до критичного. Відомо також, що ДІДС діє не
тільки як інгібітор аніонного транспорту, але індукує структурні зміни
білків цитоскелета [Van Dort H.M. et al.,1998]. Це дозволяє говорити про
те, що зміни структурного стану цитоскелета також можуть відігравати
важливу роль в ефектах ДІДС, що спостерігаються.

Вплив SH-реагентів і модифікаторів цитоскелета на чутливість еритроцитів
до ПГЛ. Той факт, що об’ємний зсув може супроводжуватися порушенням
узгодженості у відновленні просторової структури цитоскелета і мембрани,
дозволяє говорити, що модифікація структурного стану білків мембрани і
цитоскелета також може виявлятися в зміні чутливості еритроцитів до ПГЛ.
Така модифікація може носити специфічний характер, пов’язаний з хімічною
модифікацією функціональних груп білків, наприклад SH-груп, і
неспецифічний, пов’язаний зі зміною характеру взаємодії цитоскелета з
мембраною.

На рис. 4 представлені дані про зміну рівня оптичної щільності
суспензії регідратованих еритроцитів в цитратному середовищі після
їхньої інкубації в середовищах, які містили 1,5 і 3,0 Моль/л хлориду
натрію. Модифікацію білків цитоскелета і мембрани здійснювали за
допомогою сульфгідрильних реагентів (ЙАА, ПХМБ, N-ЕМ) і геміна. Видно,
що обробка хімічними модифікаторами викликає збільшення чутливості
клітин до ПГЛ, про що свідчить зниження оптичної щільності суспензії
еритроцитів. У випадку послідовної модифікації еритроцитів за допомогою
ЙАА і ПХМБ зміни оптичної щільності не спостерігаються (рис. 4, крива
4), що свідчить про відсутність реакції клітин на регідратацію. У свою
чергу, модифікація еритроцитів геміном викликає практично повний гемоліз
клітин (рис. 4, крива 6). Отримані дані показують також, що в цитратному
середовищі мають місце визначені розходження в поводженні модифікованих
регідратованих еритроцитів після інкубації в розчинах, що містили 1,5 і
3,0 Моль/л хлориду натрію. У цьому випадку зміни оптичної щільності
більш виражені після інкубації еритроцитів у середовищі, що містило 3,0
Моль/л хлориду натрію. Аналогічна картина виявилась і в випадку, коли
використовувалось сахарозне регідратуюче середовище.

E

i

4 t F

n

?

*

,

AE

E

4 B

?????

?????B

D

F

e

? ????? ????

??????????? ????? ????? ? ???

uieaaeaaUUeUaUUaUUUaaII

ся в більш високій стійкості еритроцитів до ПГЛ після обробки ЙАА/ПХМБ,
може бути зняття структурних обмежень на процеси об’ємного відновлення
цитоскелета і мембрани в ділянках, де їхня асоціація контролюється
цитоплазматичним доменом білка смуги 3 і анкірином. Комбінована обробка
ЙАА/ПХМБ призводить до зміни конформації цитоплазматичного фрагмента
білка смуги 3 [Кудоковцева Е.В., Рамазанов В.В. і др., 1998] і при цьому
змінюється його взаємодія з анкірином та спектрином. У той же час, дана
модифікація не впливає на здатність еритроцитів регулювати свій об’єм за
допомогою викиду аніонів хлору через білок смуги 3, що спостерігається у
випадку з ДІДС.

Білок смуги 4.1 контролює механічні властивості мембрани і цитоскелета,
модулюючи взаємодії між спектрином і актином, і впливає на взаємодію
білка смуги 3 з анкірином [Takakuwa Y.,2000]. Гемін викликає також зміну
олігомерного стану спектрина в напрямку тетрамер-дімер, що є одним із
ключових факторів, що знижують структурну стабільність мембрани [Wyse
J.W., 1989].

З даних, представлених на рис. 4 (крива 6), видно, що після обробки
геміном еритроцити цілком утрачають здатність до об’ємного відновлення,
причиною чого може бути втрата здатності білкового скелета стабілізувати
мембрану і контролювати її бар’єрну функцію.

Вплив рН середовища регідратації на чутливість еритроцитів до ПГЛ.
Відомо [Рамазанов В.В., 1993], що рівень гіпертонічного кріогемоліза
залежить від рН середовища інкубації, причому рН-залежність усуваться
інгібітором аніонного транспорту ДІДС. Ці дані вказують на взаємозв’язок
процесів, пов’язаних з перерозподілом аніонів хлору через мембрану, із
процесами, що лежать в основі розвитку гіпертонічного кріогемоліза.
Оскільки аніон хлору котранспортується з протоном [Jackson P., Morgan
D.B. 1982], при зміні позаклітинного рН може змінюватись спрямованість
іонних потоків, що генеруються білком смуги 3.

З таблиці 1 видно, що гіпотонічний лізис характеризується досить
вираженою рН-залежністю з максимумом при рН 5,8. ДІДС у більшій мірі, а
діпірідамол у меншій мірі сприяють нівелюванню рН-залежності
гіпотонічного гемолізу. Регідратація в ізотонічних розчинах, що містили
125 мМоль/л хлорид натрія/50 мМоль/л сахарози, дегідратованих
еритроцитів (1,5 і 3,0 Моль/л хлорид натрію) рН-залежності не виявляє. У
роботі [Пателарос С.В., 1998] також показано, що ПГЛ характеризується
слабко вираженою рН-залежністю в інтервалі рН 4-9. При регідратації
дегідратованих еритроцитів ДІДС і діпірідамол трохи збільшують рівень
гемолізу при рН 7,4, однак рН-залежність у цьому випадку не виявляється
(таблиця 1). Ми вивчали вплив попередньої інкубації еритроцитів перед їх
перенесенням до гіпертонічних середовищ. Було показано, що склад
середовищ попередньої інкубаціії не впливає на чутливість еритроцитів до
ПГЛ при різних рН середовища регідратації.

Вплив високої концентрації електроліту на функціонування аніонного
каналу. На відміну від сульфгідрильних реагентів (ЙАА, ПХМБ, N-ЭМ) і
геміна, інгібітори аніонного транспорту впливають на осмотичну
чутливість клітин, у першу чергу, через зміну стану аніонного
переносника – білка смуги 3. Інгібітор аніонного транспорту діпірідамол
здатний блокувати транспорт хлориду, сульфату і фосфату через мембрану
еритроцитів, зв’язуючись з білком смуги 3 у депротонованій незарядженій
формі. Для зв’язування діпірідамола необхідна нейтралізація хлоридним
аніоном позитивного заряду в каналі доступу діпірідамола до
транспортного сайту, що сприяє відкриванню гідрофобної кишені і
вбудовуванню в нього інгібітора [Legrum B., Passow H.,1989]. Умови
гіпертонії можуть порушити процес зв’язування діпірідамола з
транспортним сайтом аніонного переносника, що може бути обумовлено
змінами в структурі самого переносника. У даній роботі про ефективність
зв’язування інгібітору з білком смуги 3 судили, оцінюючи рівень
поляризації флуоресценції діпірідамола в присутності тіней еритроцитів.

На рис. 5 представлені дані про рівень поляризації флуоресценції
діпірідамола в присутності білих тіней еритроцитів у середовищах, що
містили 0,15 і 0,1 Моль/л хлориду і сульфату натрію, відповідно. Видно,
що в середовищі, що містило 3,0 Моль/л хлориду натрію, поляризація
флуоресценції збільшується (рис. 5 А, крива 3) у порівнянні з розчинами
хлориду натрію, що містили 0,15 і 1,5 Моль/л (рис. 5 А, криві 1, 2). У
свою чергу, у середовищі, що містило 0,1 і 0,5 Моль/л сульфату натрію,
спостерігається зниження поляризації флуоресценції. Різке збільшення
даного параметра спостерігається в середовищі, що містить 1,0 Моль/л
сульфату натрію.

Низькі значення поляризації флуоресценції діпірідамола в середовищах, що
містять 0,1 і 0,5 Моль/л сульфату натрію, можна пов’язати з розсіюванням
тіней [Legrum B., Passow H.,1989]. Це також підтверджують дані,
представлені на рис. 5 В, що відбивають рівень поляризації флуоресценції
діпірідамола при зв’язуванні з білком смуги 3 у тінях, отриманих з
еритроцитів, оброблених ДІДС. Видно, що поляризація флуоресценції
діпірідамола у всіх використаних середовищах низька і

не перевищує 0,1. Відомо, що ДІДС знижує спорідненість хлориду до
транспортного сайту [Falke J.J., Chan S.I.,1986] і запобігає зв’язуванню
діпірідамола з аніонним каналом.

Звертає на себе увагу (рис. 5 Б) високий рівень поляризації
флуоресценції діпірідамола в гіпертонічному сульфатному середовищі, що
свідчить про зв’язування діпірідамола аніонним каналом. Враховуючи це,
можна припустити, що зменшення об’єму і зміна форми еритроцитів в умовах
осмотичної дегідратації, а також пряма дія високої концентрації
електроліту на мембрану є чинником, що призводить до зміни конформації
білка смуги 3. Унаслідок цього вже не потрібна нейтралізація позитивного
заряду в каналі доступу для зв’язування діпірідамола з транспортним
сайтом білка смуги 3.

На рис. 6 представлені дані про рівень поляризації флуоресценції
діпірідамола при різних рН у присутності тіней, отриманих з ізотонічних
і постгіпертонічних еритроцитів. Видно, що зі збільшенням концентрації
мембран поляризація флуоресценції зростає як у випадку ізотонічних, так
і постгіпертонічних тіней, причому не спостерігається різниці в рівні
поляризації флуоресценції при зміні рН. Важливо відзначити, що
зв’язування діпірідамола з мембранами як у випадку ізотонічних, так і
постгіпертонічних тіней, не відрізняється.

Зв’язування діпірідамола з мембранами змінюється в присутності ДІДС
(рис. 6 В). Додавання ДІДС до суспензії тіней призводить до витиснення
діпірідамола з ділянок зв’язування з аніонним каналом, що виявляється в
різкому зменшенні поляризації флуоресценції діпірідамола. Додавання в
кювету детергента додецилсульфату натрію знижує поляризацію
флуоресценції. Таким чином, в умовах гіпертонії зберігається нормальна
структура аніонного переносника, що виявляється в збереженні його
здатності ефективно зв’язувати молекули інгібітору (діпірідамол, ДІДС),
а також збільшувати чутливість еритроцитів до ПГЛ.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлене теоретичне і експериментальне
узагальнення наукової проблеми, що відноситься до розкриття механізмів
постгіпертонічного лізису клітин і розробки підходів, спрямованих на
зменшення пошкодження клітин при зміні осмолярності середовища як шляхом
підбора компонентів середовища, що забезпечують мінімальне ушкодження
клітин, так і шляхом зміни функціонального стану аніонного транспортера,
що контролює чутливість клітин до зміни осмотичних параметрів
середовища.

Рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів, які спочатку інкубували в
гіпертонічних середовищах (1,5 і 3,0 Моль/л хлорид натрію), залежить від
складу середовища регідратації. Установлено, що в середовищах
регідратації, які містять електроліт (хлорид, піруват, сульфат і
цитрат), рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів складає 80, 60, 45
і 3 %, відповідно, тоді як у середовищах, що містять неелектроліт
(сахароза) рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів складає 4 %.
Зазначені розходження узгоджуються зі здатністю електролітів і
неелектролітів проникати в еритроцити: чим вище проникаюча здатність,
тим вищим є рівень постгіпертонічного лізису.

Обробка еритроцитів іонофором нігерицином, що полегшує транспорт іонів
натрію усередину клітин на етапі гіпертонічної інкубації (1,5 Моль/л
хлорид натрію), призводить до різкого збільшення рівня
постгіпертонічного лізису еритроцитів у середовищах регідратації, що
містять як електроліт (цитрат), так і неелектроліт (сахароза).

У середовищі регідратації, що містить сахарозу (0,3 Моль/л), інгібітор
транспорту аніонів ДІДС викликає збільшення рівня постгіпертонічного
лізису еритроцитів після інкубації їх у середовищах 1,5 і 3,0 Моль/л
хлориду натрію. При регідратації в середовищі, що містить цитрат, ДІДС
призводить до збільшення рівня постгіпертонічного лізису еритроцитів,
тоді як у середовищі, яке містить хлорид, ДІДС практично не впливає на
рівень постгіпертонічного лізису. Зазначені розходження відбивають
здатність ДІДС інгібувати вихідні потоки хлориду у фазі регідратації.

Обробка еритроцитів сульфгідрильними реагентами (ЙАА, ПХМБ, N-ЕМ), а
також геміном на етапі ізотонічної інкубації перед перенесенням у
гіпертонічні середовища (1,5 і 3,0 Моль/л хлорид натрію), призводить до
зміни чутливості клітин до постгіпертонічного лізису в залежності від
складу середовища регідратації і характеру модифікації. Під впливом
зазначених модифікаторів спостерігається збільшення рівня
постгіпертонічного лізису при регідратації клітин у середовищі, що
містить хлорид. Водночас, при комбінованій обробці еритроцитів ЙАА і
ПХМБ рівень постгіпертонічного лізису не змінюється при регідратації в
середовищі, що містить цитрат і сахарозу.

Рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів, які спочатку інкубувались
у гіпертонічних середовищах, що містять 1,5 і 3,0 Моль/л хлориду натрію,
не залежить від рН при регідратації клітин у комбінованих середовищах,
які містять електроліт (хлорид натрію) і неелектроліт (сахароза). Склад
вихідного ізотонічного середовища перед перенесенням еритроцитів у
гіпертонічні середовища також не змінює реакцію еритроцитів на зміну рН
середовища регідратації.

Установлено, що при інкубації тіней еритроцитів в ізотонічному
середовищі (0,15 Моль/л хлорид натрію) відбувається зв’язування
інгібітору транспорту аніонів діпірідамола з аніонним переносником, що
визначається за збільшенням поляризації флуоресценції молекул
діпірідамола. У той же час, у сульфатному ізотонічному середовищі не
спостерігається змін поляризації флуоресценції, що вказує на відсутність
зв’язування діпірідамола з аніонним переносником. При інкубації тіней у
гіпертонічних середовищах зв’язування діпірідамола з аніонним
переносником відбувається як у хлоридному (3,0 Моль/л), так і в
сульфатному (1,0 Моль/л) середовищах. Не виявлено розходжень у
зв’язуванні діпірідамола з тінями, отриманими з нативних еритроцитів, і
тінями, отриманими із клітин, підданих постгіпертонічному лізису.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Олейник О.А., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Постгипертонический
лизис эритроцитов при изменении рН и состава регидратирующей среды //
Проблемы криобиологии.- 2002.- № 3.- С. 30-36. (Дисертантом проведене
дослідження чутливості еритроцитів до постгіпертонічного лізису в
залежності від умов дегідратації та регідратації).

2. Олейник О.А., Абу-Аль Асаль Ф., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А.
Влияние различных анионов на постгипертонический лизис эритроцитов //
Проблемы криобиологии.- 2003.- № 2.- С. 22-30. (Дисертантом проведене
вивчення впливу заміни аніонів хлоріду на інші аніони на рівень
постгіпертонічного лізісу еритроцитів, оцінка впливу інгібіторів
транспорту аніонів на рівень постгіпертонічного лізісу еритроцитів).

3. Олейник О.А., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Постгипертонический
лизис модифицированных эритроцитов в цитратной среде // Проблемы
криобиологии.- 2003.- № 3.- С. 21-29. (Дисертантом проведені
експерименти по вивченню вплива модифікації цитоскелету на
постгіпертонічну чутливість еритроцитів).

4. Рамазанов В.В., Нардид Я.О., Олейник О.А., Бондаренко В.А. Влияние
полиэтиленгликоля-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом
эритроцитов // Проблемы криобиологии.- 2003.- № 4.- С. 12-19.
(Дисертантом вивчено зміну рівня полярізації флуоресценції діпірідамолу
під впливом кріопротектору ПЕГ-1500).

5. Рамазанов В.В, Олейник О.А., Абу Аль-Асаль Ф.М., Бондаренко В.А.
Гипертонический криогемолиз эритроцитов человека при изменении рН среды
// Тезисы докладов Всеукраинской научной конференции “Успехи и
перспективы развития криобиологии и криомедицины”.- Проблемы
криобиологии.- 2001.- № 3.- С. 12-13. (Дисертантом проведене дослідження
впливу рН на рівень гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів в
електролітному та неелектролітному середовищі).

6. Олейник О.А., Абу-Аль Асаль Ф., Рамазанов В.В. Влияние ингибиторов
анионного канала на постгипертонический лизис эритроцитов // Тезисы
докладов конференции молодых учених.- Проблемы криобиологии.- 2002.- №
1.- С. 117-119. (Дисертантом досліджено вплив інгібіторів аніонного
транспорту на рівень постгіпертонічного лізісу еритроцитів, зв’язування
діпірідамолу тінями еритроцитів).

7. Олійник О.О. Вплив модифікацій складу середовища регідратації на
постгіпертонічний лізис еритроцитів людини // Тези міжгалузевої
конференції молодих науковців „Актуальні проблеми фундаментальної та
прикладної біохімії”.-Український біохімічний журнал.- 2002,- 74, № 4.-
С. 154.

8. Синчикова О.П., Олійник О.О., Сиромятникова О.А., Алмазова О.Б,
Бондаренко В.А. Обгрунтування принципів застосування амфіпатичних сполук
для захисту клітин крові в умовах осмотичного та температурного стресу
// Матеріали ІV з`їзду гематологів та трансфузіологів України.- Київ.-
2001.- С. 200. (Дисертантом проведені експерименти по вивченню ролі
білка смуги 3 у контролі постгіпертонічної чутливості еритроцитів
людини).

// Materials of conference for students, PhD students and young
scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001,
Kyiv, Ukraine.- Р. 25. (Дисертантом вивчено вплив інгібіторів аніонного
транспорту на транспорт протонів).

АНОТАЦІЇ

Олійник О.О. Вплив інгібіторів аніонного транспорту і модифікаторів
мембрани на постгіпертонічний лізис еритроцитів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, Харків, 2004.

Дисертація присвячена вивченню впливу модифікаторів мембрани і
цитоскелета, інгібіторів транспорту аніонів та складу середовища на
чутливість еритроцитів до постгіпертонічного лізису (ПГЛ).

Хімічну модифікацію еритроцитів здійснювали шляхом обробки клітин ЙАА,
ПХМБ, N-ЕМ, геміном. Зміну внутрішньоклітинного складу іонів здійснювали
за допомогою іонофора нігерицину. Модифікацію іонного транспорту
здійснювали за допомогою інгібіторів аніонного транспорту ДІДС та
діпірідамолу. Iзотонічнi середовища регідратації містили натрієві солі
хлориду, пірувату, сульфату, цитрату та сахарози.

Отримані в роботі результати свідчать про те, що стійкість еритроцитів
до ПГЛ залежить від складу середовища регідратації, тобто від здатності
аніонів проникати в клітини на етапі регідратації, коли відбувається
відновлення клітинного об’єму. Встановлено, що перерозподіл іонів на
етапі гіпертонічної інкубації у значній мірі відповідає за чутливість
еритроцитів до ПГЛ. Виявлено, що модифікація мембрани ЙАА/ПХМБ не
впливає на чутливість еритроцитів до ПГЛ в сахарозному та цитратному
середовищах. Показано, що гіпертонічна обробка не порушує транспортної
функції аніонного переносника еритроцитів – білка смуги 3.

Ключові слова: еритроцит, постгіпертонічний лізис, осмолярність
середовища, модифікатори цитоскелету і мембрани, інгібітори транспорту
аніонів.

Олейник О.А. Влияние ингибиторов анионного транспорта и модификаторов
мембраны на постгипертонический лизис эритроцитов.- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.19 – криобиология. Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, Харьков, 2004.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния модификаторов
мембраны и цитоскелета, ингибиторов транспорта анионов и состава среды
на чувствительность эритроцитов к постгипертоническому лизису (ПГЛ).

Химическую модификацию эритроцитов осуществляли путём обработки клеток
ИАА, ПХМБ, N-ЭМ, гемином. Изменение внутриклеточного состава ионов
осуществляли с помощью ионофора нигерицина. Модификацию ионного
транспорта проводили с помощью ингибиторов анионного транспорта ДИДС и
дипиридамола. В составе изотонических сред регидратации использовали
натриевые соли хлорида, пирувата, сульфата, цитрата и сахарозу.

Установлено, что присутствие различных анионов неодинаковым образом
влияет на уровень ПГЛ. Показано, что при замещении в регидратирующей
среде анионов хлорида на анионы пирувата уровень ПГЛ снижается до 65%,
при замещении на анионы сульфата – до 50 %, а при замещении анионов
хлорида на анионы цитрата и сахарозу постгипертонический гемолиз
практически отсутствует.

Показано, что уровень гемолиза регидратированных эритроцитов после
гипертонической инкубации в растворе хлорида натрия в сахарозной и
цитратной средах не отличается и составляет около 5 %. Присутствие
нигерицина в гипертонической среде приводит к увеличению
чувствительности эритроцитов к регидратации по сравнению с контролем:
при этом уровень гемолиза составляет от 35 до 45 %.

Установлено, что включение в цитратную и сахарозную среды регидратации
ДИДС приводит к лизису эритроцитов. При этом было показано, что ДИДС
практически не изменяет уровень ПГЛ в хлоридсодержащей среде (125
мМоль/л хлорид натрия/50 мМоль/л сахароза).

Эффект обработки химическими модификаторами вызывает изменение
чувствительности клеток к ПГЛ. Наиболее выраженное модифицирующее
влияние оказывает обработка гемином и комбинированная обработка ИАА и
ПХМБ. В случае последовательной модификации эритроцитов с помощью ИАА и
ПХМБ отсутствует реакция клеток на регидратацию в сахарозной и цитратной
средах, в то время как в хлоридсодержащей среде (125 мМоль/л хлорид
натрия/50 мМоль/л сахароза) данная обработка способствует увеличению
постгипертонической чувствительности эритроцитов. Модификация клеток
гемином вызывает практически полный лизис как в хлоридсодержащей среде,
так и в сахарозной и цитратной средах.

Варьирование рН среды регидратации не изменяет чувствительность
эритроцитов к ПГЛ, при этом ингибиторы анионного транспорта ДИДС и
дипиридамол несколько повышают уровень постгипертонического повреждения,
но рН-зависимость при этом не выявляется. Следует также отметить, что
предварительная изотоническая инкубация эритроцитов в различных средах
перед переносом их в гипертонические среды также не оказывает влияния на
чувствительность эритроцитов к ПГЛ при разных рН сред регидратации.

Для связывания дипиридамола необходима нейтрализация хлоридным анионом
положительного заряда в канале доступа дипиридамола к транспортному
сайту, что способствует открыванию гидрофобного кармана и встраиванию в
него ингибитора. Показано, что в гипертоническом растворе сульфата
натрия (бесхлоридная среда), в отличие от изотонического, инициируется
связывание ингибитора анионного транспорта дипиридамола с мембранами
эритроцитов, о чём свидетельствует изменение уровня поляризации
флуоресценции дипиридамола, который увеличивается при титровании
мембранами эритроцитов. Связывание дипиридамола в одинаковой степени
происходит как с изотоническими мембранами, так и с
постгипертоническими. Причём не наблюдаются различия в уровне
поляризации флуоресценции при изменении рН среды. Связывание
дипиридамола с мембранами изменяется в присутствии ДИДС. Добавление его
к суспензии теней приводит к снижению уровня поляризации флуоресценции.
Последовательное добавление детергента додецилсульфата натрия ещё больше
снижает уровень поляризации флуоресценции. Таким образом, в условиях
гипертонии сохраняется нормальная структура анионного переносчика, что
проявляется в сохранении его способности эффективно связывать молекулы
ингибитора (дипиридамол, ДИДС).

Ключевые слова: эритроцит, постгипертонический лизис, осмолярность
среды, модификаторы цитоскелета и мембраны, ингибиторы транспорта
анионов.

Oliynyk O.A. The effect of anion transport inhibitors and membrane
modifiers on posthypertonic lysis of erythrocytes.- Manuscript.

Thesis for obtaining the scientific degree of candidate of biological
scieces (PhD equivalent) on the specialty 03.00.19 – cryobiology.
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedecine of the National
Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2004.

Thesis is dedicated to the study of the effect membrane and cytoskeleton
modifiers, anion transport inhibitors and medium composition on the
erythrocytes sensitivity to posthypertonic lysis of erythrocytes.

The chemical modification of erythrocytes was perfomed using cell
treatment with IAA, PCMB, N-EM, hemin. The modification of intracellular
ionic composition was perfomed using ionophor nigericin. Ionic transport
modification was carried-out by anion trasport inhibitors (DIDS,
dipyridamole). Isotonic medium contained the sodium salts of chloride,
pyruvate, sulfate, citrate and succrose.

Obtained results testify that eythrocytes stability to posthypertonic
lysis depends on composition of rehydrating medium, that is stability
depends on the anions ability to penetrate into cells, when recovery of
cell volume occurs. It has been shown that ion redistribution during the
regidratation phase is responsible for erythrocytes sensitivity to
posthypertonic lysis of erythrocytes. It has been found that membrane
modification by IAA/PCMB does not change the sensitivity of erythrocytes
to posthypertonic lysis in citrate and succrose medium. It has been
shown that hypertonic treatment does not break the transport function of
erythrocyte anion carrier – band 3.

Key words: erythrocyte, posthypertonic lysis, medium osmolarity,
membrane and cytoskeleton modifiers, anion transport inhibitors.

Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук

Підписано до друку 7.12.2004. Формат 60х84 1/16. Папір офсетний.

Друк різограф. Ум. друк. Арк. 0,9. Наклад 100 прим.

61166, м. Харків, пр. Леніна, 36, оф. 420. Тел. (057) 717-60-02,
717-58-26

PAGE 6

PAGE 17

Похожие записи